Мінливість геному тирличів (gentiana) у природі та в культурі in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

УДК 575.22: 582.923.1 + 576.5

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МІНЛИВІСТЬ ГЕНОМУ ТИРЛИЧІВ (GENTIANA L.) У ПРИРОДІ ТА В КУЛЬТУРІ IN VITRO

Твардовська Мар'яна Остапівна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Кунах Віктор Анатолійович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу генетики клітинних популяцій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Тищенко Олена Миколаївна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, виконуюча обов'язки завідувача відділу генетичної інженерії

кандидат біологічних наук, Парій Мирослав Федорович, Національний університет природокористування і біобезпеки України, Українська лабораторія якості та безпеки продукції АПК, старший науковий співробітник відділу молекулярно-діагностичних досліджень

Захист дисертації відбудеться “26” березня 2009 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: Д03680, м. Київ, вул. Акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: Д03680, м. Київ, вул. Акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано “ 25 ” лютого 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед глобальних проблем цивілізації, з якими людство вступило в нове тисячоліття, збереження біологічної різноманітності залишається однією з найактуальніших. Масштабний наступ людини на природу призвів до того, що дедалі більша кількість рослин стає неспроможною протистояти цьому тиску і опиняється під загрозою зникнення. В останні десятиріччя в Україні спостерігається збіднення природних екосистем і зниження їхньої стійкості, втрата генофонду рослинного і тваринного світу (Крічфалушій, 2003). У зв'язку з цим, зростає важливість вивчення фітогенофонду взагалі і рідкісної його частини зокрема, а також опрацювання і впровадження ефективних заходів їхньої охорони.

Види роду Тирлич (Gentiana L.) на території України зростають переважно в Карпатах. Тирличі є цінними лікарськими або декоративними рослинами. Скорочення ареалів цих видів, зменшення чисельності та порушення структури їхніх популяцій внаслідок антропогенного впливу (інтенсивне викопування рослин місцевим населенням з лікувальною метою, неконтрольоване випасання худоби, витоптування і зривання генеративних пагонів) зумовило занесення багатьох з них до Червоної книги України (Червона книга України, 1996). Це, в свою чергу, обмежує їхнє використання як сировини для потреб фармацевтики.

Для забезпечення ефективних заходів охорони тирличів необхідним є не лише всебічне вивчення цих видів (у т. ч. і генофонду), а й використання новітніх біотехнологій, зокрема отримання їхніх культур клітин, тканин, органів in vitro.

Практичне застосування культури тканин рослин обмежується високим рівнем генетичних змін, які у деяких рослин за масштабами прирівнюються до міжвидових. Зважаючи на мінливість геному клітин у процесі культивування in vitro, для використання культури тканин тирличів як з метою збереження генофонду, так і для отримання біологічно активних речовин, необхідним є з'ясування на хромосомному та молекулярному рівнях особливостей поведінки їхніх клітин в ізольованій культурі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою «Порівняльне вивчення геномної мінливості рослин в природі та в культурі in vitro» (№ держреєстрації 0105U005344, 2006-2010 рр.), а також у рамках наукової програми ДФФД Міністерства освіти і науки України, проект № Ф25.5/009 «Особливості геномної мінливості рідкісних лікарських рослин роду Тирлич (Gentiana L.) флори України в природі та в культурі in vitro» (2007-2008 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчити особливості мінливості геному на хромосомному та молекулярному рівнях представників видів роду Gentiana флори України у природі і культурі in vitro.

Конкретними завданнями даного дослідження були:

Отримати культуру тканин G. cruciata, G. pneumonanthe, G. verna та підібрати оптимальні умови для її проліферації.

Встановити хромосомні числа видів роду Gentiana флори України.

Провести цитогенетичний аналіз культури тканин тирличів (кількості хромосом, змін плоїдності клітин, наявності анафазних аберацій).

Дослідити RAPD-поліморфізм ДНК рослин і культивованих тканин видів роду Gentiana.

Виявити особливості геномної мінливості в культурі тканин тирличів.

Об'єктом дослідження була геномна мінливість видів роду Gentiana флори України. тирлич геномний pneumonanthe проліферація

Предмет дослідження - особливості змін геному тирличів у природі та в культурі in vitro.

Методи дослідження: методи роботи з культурами рослинних тканин та клітинна селекція in vitro, цитогенетичний аналіз, виділення ДНК, RAPD-ПЛР, електрофорез ДНК в агарозному гелі, методи статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше використано комплексний підхід для дослідження особливостей мінливості геному Gentiana на хромосомному і молекулярному рівнях у природі та в культурі in vitro. Встановлено хромосомні числа для 7 видів роду Gentiana з різних місць зростання в Україні (G. lutea, G. punctata, G. acaulis, G. asclepiadea, G. cruciata, G. pneumonanthe, G. verna) та виявлено міксоплоїдію у корінцях проростків G. cruciata. Вперше проведено цитогенетичний аналіз культури тканин тирличів флори України та показано домінування (за винятком G. punctata) клітин з диплоїдним і/або близьким до диплоїдного набору числом хромосом, а також незначну кількість або відсутність анафазних аберацій. Вперше досліджено RAPD-поліморфізм ДНК G. acaulis, G. cruciata і G. punctata та встановлено різний рівень мінливості зразків цих видів як у природі, так і в культурі тканин. Показано, що зміни геному тирличів, які відбувалися в процесі культивування in vitro, не виходять за межі внутрішньовидової мінливості.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень вказують на можливість застосування одержаних культур тканин тирличів, а також підібраних умов культивування для збереження in vitro генофонду цих видів.

Комплексне дослідження геномної мінливості тирличів за допомогою цитогенетичного методу та RAPD-аналізу показало, що даний підхід може бути використаний для ідентифікації видів роду Gentiana, а також при паспортизації їхніх клітинних штамів, що може мати суттєве практичне значення в ботанічних та біотехнологічних дослідженнях.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням Твардовської М.О. Наведені в рукописі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні експериментів. Роботу з одержання та підтримання культури тканин проведено у співробітництві із працівниками лабораторії екології та біотехнології Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка під керівництвом к.б.н. Страшнюк Н.М. Результати цитогенетичного і молекулярно-біологічного аналізу тирличів отримані разом з к.б.н. Мельником В.М. та к.б.н. Страшнюк Н.М.

Автором особисто відібрано і критично проаналізовано великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за темою проведеного наукового дослідження. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно із науковим керівником - д.б.н., професором, членом-кореспондентом НАН України Кунахом В.А., а також з к.б.н. Страшнюк Н.М. і к.б.н. Мельником В.М., з якими автор має спільні публікації.

Автор висловлює щиру подяку за допомогу та моральну підтримку під час виконання роботи всім співробітникам відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, а також лабораторії екології і біотехнології Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на 8-ми конференціях: ІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, Україна, 2006); ІІІ Міжнародній конференції молодих вчених «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» (Одеса, Україна, 2007); Міжнародній науковій конференції «Різноманіття фітобіоти: шляхи відновлення, збагачення і збереження. Історія та сучасні проблеми» (Кременець, Україна, 2007); ІІІ Міжнародній конференції «Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти» (Львів, Україна, 2007); щорічній науковій зустрічі “Bridges in Life Sciences” Консорціуму кооперації регіонів для здоров'я, науки, технологій (RECOOP HST) (Печ, Угорщина, 2007); І і ІІ конференції молодих вчених Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ (Київ, Україна, 2007, 2008), V Міжнародній конференції «Геном рослин» (Одеса, Україна, 2008), а також доповідалися на наукових семінарах відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ НАН України.

Публікації. Результати досліджень наведено у вигляді 6 статей, опублікованих у фахових наукових журналах, а також 8 тез доповідей у збірниках матеріалів наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із наступних розділів: перелік умовних скорочень, вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень та їх обговорення, підсумки, висновки, список використаних джерел, що містить 178 посилань. Робота викладена на 133 сторінках, включає 15 таблиць та 21 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури подано морфофізіологічну характеристику, поширення, фармакологічну цінність та застосування у медицині деяких видів роду Gentiana флори України, а також дані щодо особливостей їхнього культивування в умовах ізольованого росту на штучних живильних середовищах. Особливу увагу приділено мінливості геному тирличів у природі та в культурі in vitro. Розглянуто також особливості змін геному рослин у культурі in vitro.

Матеріали та методи досліджень. У роботі використовували дикорослі рослини різних видів роду Gentiana: тирлич жовтий (G. luteа), т. крапчастий (G. punctata), т. безстебловий (G. acaulis), т. ваточниковидний (G. asclepiadea), т. звичайний (G. pneumonanthe), т. хрещатий (G. cruciata), т. весняний (G. verna); рослини цих видів, вирощені з насіння в стерильних умовах (асептичні рослини), а також отримані від них калюсні культури кореневого походження. В експериментах з одержання культури тканин G. cruciata, G. pneumonanthe та G. verna вихідним матеріалом слугувало насіння, яке стерилізували у розчині Н2О2 і висаджували на середовище Мурасіге-Скуга (МС) (Murashige, Skooog, 1962). Для індукції калюсоутворення використовували отримані з насіння асептичні 1,5-2 місячні рослини, які ділили на експланти і висаджували на різні типи середовищ: MС, МС з половинним вмістом макро- та мікросолей (MС/2) та Гамбурга-Евелай (B5) (Gamborg, Eveleigh, 1968), доповнені комбінаціями різних концентрацій 6-бензиламінопурину (БАП), 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Д) та 1-нафтилоцтової кислоти (НОК). Культури вирощували в темряві при +25 - 26,5С, субкультивування проводили через кожні 4 тижні.

Для цитологічного аналізу використовували корінці проростків довжиною 0,5 - 0,8 см, які з метою накопичення і синхронізації мітозів перед фіксацією витримували протягом 1 доби при температурі +3 - 4С або протягом 2-х годин в 0,1%-му розчині колхіцину при кімнатній температурі. Калюсні тканини тирличів досліджували на 7-му добу росту (у період найвищої мітотичної активності). Зразки фіксували в суміші етанол : льодяна оцтова кислота у співвідношенні 3:1 протягом 1 доби. Зафіксований матеріал зберігали у 70 етанолі при кімнатній температурі. Зразки фарбували 1%-им ацетоорсеїном і виготовляли давлені препарати.

Матеріалом для виділення ДНК були листки дикорослих рослин, асептичні рослини, а також калюсні тканини тирличів на 20-25-ий день росту. У роботі за основу було взято метод виділення ДНК S.O. Rogers i A.J. Bendich (Rogers, Bendich, 1985).

Молекулярно-генетичний аналіз проводили методом полімеразної ланцюгової реакції із праймерами довільної послідовності (RAPD-ПЛР). У роботі використано 27 праймерів. Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20 мкл містила: 20 нг ДНК, 0,2 мМ dNTP, 1,25 од. Taq-полімерази, 0,25 мкМ праймера, 1ЧПЛР-буфер з 1,5 мM MgCl2. На реакційну суміш нашаровували 15 мкл мінеральної олії. ПЛР проводили за програмою: 94°С - 2 хв, 5 циклів (94°С - 30 с, tгібр 37°С - 30 с, 72°С - 1 хв), 35 циклів (94°С - 20 с, tгібр 37°С - 20 с, 72°С - 40 с), 72°С - 2 хв 30 с. Температура гібридизації (tгібр) для праймерів А16 та А17 становила 38°С, для інших - 37°С. Реакцію з кожним праймером повторювали щонайменше двічі, враховували тільки відтворювані амплікони.

Продукти ампліфікації розділяли за допомогою горизонтального електрофорезу в 1,3%-му агарозному гелі з додаванням 0,5 мкг/мл бромистого етидію, у 1ЧТВЕ буфері при напруженості поля 3 - 4 В/см. Для визначення розміру фрагментів користувалися ДНК-маркером "100 bp +1,5 Kb" (СибЭнзим, Росія).

Для кількісної оцінки RAPD-поліморфізму електрофоретичні спектри ПЛР-продуктів записували у вигляді матриці бінарних ознак, у якій наявність або відсутність фрагментів у спектрі позначали як "1" або "0". Поліморфізм спектрів ампліконів оцінювали методом попарного незваженого кластерування з арифметичним усередненням (UPGMA), використовуючи програму POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999). Дендрограму генетичних відстаней за Неєм, Лі (Nei, Li, 1979) між проаналізованими об'єктами будували з використанням програми MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Введення в культуру in vitro та особливості росту культивованих тканин Gentiana. Першим етапом роботи був підбір умов in vitro для одержання та культивування калюсів G. cruciata, G. pneumonanthe та G. verna. На середовищах різного складу (B5, МС та МС/2, доповнених комбінаціями різних концентрацій ауксинів і цитокінінів) усі типи експлантів (стеблові, кореневі, листкові) формували калюс. Проте, інтенсивність калюсогенезу залежала від типу експланта та складу живильного середовища. На середовищі B5 калюсоутворення було незначне, висаджені експланти темніли і гинули уже через 1-2 тижні. Тестування середовищ МС і МС/2 показало, що процеси дедиференціації у досліджених видів мало залежать від концентрації макро- і мікросолей - обидва середовища індукували калюсоутворення. Інтенсивність калюсогенезу G. cruciata, G. pneumonanthe та G. verna значною мірою визначалася концентраціями та співвідношенням фітогормонів у живильних середовищах. Введення у середовище комбінації БАП+НОК було менш сприятливим для калюсоутворення, ніж БАП+2,4-Д. Отриманий у першому випадку калюс наростав повільно і через один-два пасажі відмирав. У той же час комбінація фітогормонів БАП+2,4-Д стимулювала формування калюсу блідо-жовтого забарвлення, пухкої консистенції, який швидко наростав.

Результати досліджень показали, що оптимальний склад (зокрема, концентрації фітогормонів) живильного середовища для введення в культуру іn vitro залежить від виду, умов зростання рослин кожної із популяцій досліджених видів, типу вихідного експланта. Процес калюсоутворення на усіх типах експлантів рослин G. cruciata найкраще відбувався на середовищі МС/2 (на МС - лише для стеблових експлантів з рослин медоборської популяції), доповненому 0,1 мг/л БАП і 1,0 мг/л 2,4-Д. Вдвічі менша концентрація 2,4-Д (0,5 мг/л) необхідна для ефективної індукції калюсогенезу на усіх типах експлантів G. pneumonanthe та G. verna. Для проліферації та тривалого вирощування калюсних тканин усіх досліджених видів використовували середовище МС/2, доповнене 0,1 мг/л БАП і 0,5 мг/л 2,4-Д.

Цитогенетичні дослідження видів роду Gentiana

Аналіз кількості хромосом в інтактних рослинах. У літературі наводяться різні числа хромосом для видів роду Gentiana з багатьох гірських масивів та рівнинних територій Європи, Азії, Америки та Африки. Цитогенетичні дослідження тирличів з території України до цього часу не проводилися. Одним із завдань нашої роботи було встановлення хромосомних чисел для рослин видів роду Gentiana з різних популяцій в Україні.

Цитогенетичний аналіз корінців рослин тирличів показав, що диплоїдний набір для представників виду з різних популяцій не відрізнявся і становив: для G. lutea та G. punctata - 2n=40, G. acaulis та G. аsclepiadea - 2n=36, G. cruciata - 2n=52, G. pneumonanthe - 2n=26 і для G. verna - 2n=28. Визначені нами хромосомні числа підтверджують дані, наведені іншими дослідниками для цих видів, і свідчать про їхню каріотипову консервативність. Деякі типові метафази представлені на рис. 1.

Отримане нами для G. asclepiadea хромосомне число 2n=36 збігається із встановленим диплоїдним набором для однієї із цитологічних рас цього виду.

Деякі з досліджених корінців проростків G. cruciata (заповідник “Медобори”) виявились міксоплоїдними - поряд із диплоїдними клітинами (2n=52), знайдено кілька клітин з 26 та 36 хромосомами. Міксоплоїдія для видів роду Gentiana до цього часу не була описана.

Хромосомна мінливість в культурі тканин тирличів. Проведений цитогенетичний аналіз культури тканин показав, що кількість хромосом в метафазах варіює як між калюсами, отриманими від рослин різних видів, від рослин одного й того ж виду з різних популяцій, так і в межах однієї калюсної культури. Спостерігали широкий розмах мінливості числа хромосом, який для різних видів був різним (рис. 2). Ступінь прояву міксоплоїдності клітинних популяцій залежав від видової приналежності рослин. Найбільший розмах мінливості числа хромосом характерний для культури тканин G. punctata. Дещо меншим він був у калюсах G. lutea, G. acaulis, G. cruciata, G. asclepiadea та G. pneumonanthe. Найменшу варіабельність кількості хромосом у клітинах проявила культура тканин G. verna. Модальним класом у всіх досліджених калюсах (за винятком G. punctata (г. Брескул)) були диплоїдні та гіподиплоїдні клітини.

Досліджені клітинні популяції характеризувалися наявністю значної кількості анеуплоїдних клітин. Найвищий рівень анеуплоїдії було виявлено в культурі тканин G. lutea, G. cruciata та G. asclepiadea (г. Велика Мигла). Найменшою кількістю анеуплоїдних клітин характеризувалися калюси G. punctata (г. Брескул) та G. pneumonanthe (Корюківське лісництво).

Генетична варіабельність клітинних популяцій тирличів залежала і від генотипів вихідних рослин. Різна популяційна приналежність останніх є, очевидно, причиною різного рівня змін числа хромосом в однакових за тривалістю та умовами вирощування культурах. Найбільше за кількістю поліплоїдних та анеуплоїдних клітин відрізнялися калюси G. punctata і G. asclepiadea, отримані від рослин з різних популяцій.

Результати анафазного аналізу, отримані паралельно з підрахунком кількості хромосом у метафазах, показали порівняно невисокий для культивованих клітин (до 10%) рівень мутацій. Найвищою частка хромосомних аберацій була у калюсах G. punctata (г. Брескул - 10% і г. Трояска - 8,3%) та G. acaulis (г. Ребра) - 8%. 90% усіх виявлених аберацій складали мости без фрагментів (серед них - більше 2/3 одиночні мости).

Перевага у досліджених калюсах тирличів (за винятком G. punctata) клітин з диплоїдним і/або білядиплоїдним наборами хромосом та низький рівень або відсутність анафазних аберацій свідчить про відносну стабільність геному видів роду Gentiana. Поряд з цим, для усіх культур тканин тирличів встановлено видову специфічність мінливості геномів та залежність характеру цитогенетичної варіабельності клітинних популяцій in vitro від популяційної приналежності вихідних рослин.

У кожній з досліджених клітинних популяцій вивчено по 100 метафаз.

Мінливість числа хромосом та рівень хромосомних аберацій у культурі тканин G. acaulis за різної тривалості вирощування. Проведені цитогенетичні дослідження культури тканин G. acaulis різної тривалості вирощування показали значний розмах мінливості за числом хромосом як на 11-му, так і на 71-му пасажах - 16-107 та 18-110 хромосом відповідно. Спектр плоїдності клітин у дослідженому калюсі варіював від n до 6n (рис. 3).

Встановлено, що в 11-му пасажі (однорічна культура тканин) модальним класом були клітини з диплоїдним та білядиплоїдним наборами хромосом, а в 71-му (шестирічна культура) - клітини з триплоїдним та білятриплоїдним наборами хромосом. Цитогенетичний аналіз калюсу G. acaulis показав, що із збільшенням тривалості культивування зростає відсоток поліплоїдних клітин та структурних перебудов хромосом (рис. 4). Серед анафазних аберацій хромосом, рівень яких був у межах 2-15%, переважали одиночні мости без фрагментів.

Цікавою особливістю дослідженої культури тканин G. acaulis було те, що високий відсоток анеуплоїдних клітин спостерігався вже в 11-му пасажі і залишався практично незмінним у процесі тривалого вирощування до 71-го пасажу.

Дослідження геномної мінливості видів роду Gentiana методом RAPD-ПЛР

Міжвидова мінливість. Для оцінки міжвидової мінливості геному тирличів було використано 27 десятинуклеотидних праймерів, які ініціювали синтез 844 ампліконів довжиною 300-2700 п.н. Зразки характеризувалися специфічними RAPD-спектрами, які відрізнялися за кількістю та розміром фрагментів (від 13 до 45) (рис. 5). У досліджених видів виявлено різну кількість унікальних фрагментів - видоспецифічних ампліконів, відсоток яких коливався від 13,2% (G. lutea) до 25,6% (G. cruciata).

Фрагментів, спільних для усіх досліджених тирличів, нами не виявлено. Дев'ять спільних ампліконів знайдено для чотирьох видів - G. lutea, G. punctata, G. acaulis та G. asclepiadea. Найбільшу кількість спільних фрагментів за усіма використаними праймерами виявлено для G. lutea та G. punctata (121), меншу - для G. cruciata та G. pneumonanthe (72), G. lutea та G. asclepiadea (64) і G. punctata та G. acaulis (64).

На основі результатів проведеного RAPD-аналізу розраховано генетичні відстані за Неєм, Лі (DNL) та побудована дендрограма, яка відображає генетичні взаємовідношення між дослідженими видами (рис. 6).

Вибірки розподілилися на два основних кластери: перший формували G. cruciata і G. pneumonanthe, другий - решта видів, які, у свою чергу, утворювали два субкластери. До одного з них входили G. lutea, G. punctata і G. asclepiadea, до іншого - G. acaulis і G. verna. Найбільш близькими за топологією на дендрограмі були G. lutea та G. punctata.

Отже, використання методу RAPD-ПЛР дозволило диференціювати на молекулярно-генетичному рівні види тирличів флори України та встановити генетичні взаємозв'язки між ними. Отримані результати загалом свідчать про віддаленість окремих таксонів роду Gentiana, міжвидова варіабельність в межах якого складала 0,54. Це підтверджується відсутністю фрагментів, спільних для усіх видів, а також невеликою кількістю ампліконів, спільних для певних груп видів у межах дослідженої вибірки.

Отримані нами результати оцінки міжвидового поліморфізму представників роду Gentiana узгоджуються з основними класифікаціями роду, що ґрунтуються на анатомо-морфологічних, онтогенетичних та еколого-географічних критеріях (Кузнєцов, 1894; Цвельов, 1978; Ho, Liu, 1990; Tutin, 1972). Винятком є розташування на дендрограмі генетичної подібності G. asclepiadea (секція Pneumonanthe) наближено до видів секції Gentiana, а також генетична подібність між видами різних секцій - G. рneumonanthe і G. cruciata та G. acaulis і G. verna. Однак, ці суперечливі, на перший погляд, результати RAPD-аналізу тирличів підтверджуються даними інших авторів, отриманими на основі молекулярно-генетичних досліджень різних ділянок ядерного та пластидного геному (Yuan et al., 1996; Gielly, Taberlet, 1996).

Геномна мінливість у природі та в культурі in vitro. Враховуючи результати цитогенетичного аналізу тирличів, для дослідження внутрішньовидової та сомаклональної варіабельності методом RAPD-ПЛР були відібрані найбільш цікаві, на наш погляд, види: G. acaulis, G. cruciata та G. punctata.

Для аналізу рівня генетичної варіабельності тирличів у природі було проведено RAPD-ПЛР геномів восьми рослин G. acaulis із трьох популяцій (чотири рослини - реберської, по дві - туркульської і бребенескульської), шість рослин G. cruciata (по три рослини з двох популяцій - медоборської і креничської) та шість рослин G. punctata із трьох популяцій (три рослини - брескульської, дві - трояської та одна - пожижевської). Проводили також дослідження мінливості культури тканин цих видів шляхом порівняння із рослиною-донором, яка була використана і для вивчення внутрішньовидового поліморфізму.

Для дослідження геномного поліморфізму кожного виду використано 21 праймер, які забезпечували утворення фрагментів розміром 250-3000 п.н. Загальна кількість чітких відтворюваних ампліконів для G. acaulis становила 313 (у середньому 18,4 на праймер), G. cruciata - 315 (15,0 на праймер), G. punctata - 329 (17,3 на праймер).

G. acaulis. Для всієї вибірки праймерів відсоток поліморфних локусів (Р) у досліджених рослин G. acaulis становив 63,26%. RAPD-спектри рослини-донора та отриманої від неї культури тканин (г. Туркул) були подібними, але не ідентичними (рис. 7). Рівень генетичного поліморфізму за Р між цими зразками був відносно невисоким і складав 11,5%.

На основі результатів проведеного RAPD-аналізу побудована дендрограма генетичної подібності зразків G. acaulis (рис. 8). З наведеної дендрограми видно, що досліджені об'єкти формують два кластери. До першого належать зразки, які походять із популяції, локалізованої на г. Ребра, до другого - об'єкти з двох інших популяцій цього виду - туркульської та бребенескульської. У межах першого кластера можна виділити субкластер, сформований дикорослими рослинами з реберської популяції, та дві окремі гілки, представлені асептичними рослинами з тієї ж популяції. Всередині другого кластера спостерігали чіткий розподіл на два субкластери: один - зразки з г. Туркул, інший - рослини з г. Бребенескул. Значення генетичних відстаней між окремими генотипами цих популяцій були приблизно однаковими. Зразки з туркульської популяції, у свою чергу, розподілилися на окрему гілку, представлену дикорослою рослиною, та два підкластери, перший з яких формували рослина-донор та отримана від неї культура тканин 7-го пасажу, другий - калюс 30-го та 72-го пасажів від іншої рослини, яка у даній роботі не досліджувалася. Як видно з дендрограми (рис. 8), саме зразки тривало культивованого калюсу були найбільш генетично близькими. Представлені результати показують більшу генетичну спорідненість зразків G. acaulis з туркульської та бребенескульської популяцій, які на дендрограмі формують один кластер, та віддаленість від них реберської - утворюють окремий кластер.

G. cruciata. Для всієї вибірки праймерів показник Р у досліджених рослин G. cruciata складав 29,84%. Порівняння RAPD-спектрів рослин-донорів та отриманих від них культур тканин показало, що рівень генетичного поліморфізму між ними становив 9,52% - для медоборської і 12,38% - для креничської популяцій.

На основі даних RAPD-аналізу за 315 локусами були розраховані значення генетичних відстаней за Неєм, Лі між рослинами G. cruciata (табл.), які лежали у діапазоні від 0,0455 до 0,2152 і не виходили за межі встановленого раніше показника міжвидової варіабельності тирличів (0,54), а також генетичної дистанції до найближчого на дендрограмі виду - G. pneumonanthe (0,4976). При порівнянні культури тканин і вихідної рослини з креничської популяції виявлено, що генетична відстань між ними становила 0,1322; з медоборської популяції - 0,1001.

Таблиця - Генетичні відстані за Неєм, Лі (Nei, Li, 1979)

між зразками G. cruciata за результатами RAPD-аналізу

G. punctata. Показник Р у досліджених рослин G. punctata становив 38,91%. Рівень генетичного поліморфізму за цим показником між вихідною рослиною трояської популяції та її культурою тканин був відносно невисоким і складав 14,6%. Дещо нижчим (10,6%) значення Р було між рослиною та культурою тканин (г. Пожижевська).

На основі результатів проведеного RAPD-аналізу побудована дендрограма генетичної подібності досліджених зразків G. punctata (рис. 9). Як видно з наведеної дендрограми, досліджені зразки G. punctata формують два кластери. До першого з них належать об'єкти G. punctata (г. Трояска), до другого - представники двох інших популяцій цього виду - брескульської та пожижевської. У межах другого кластера можна виділити два субкластера: один формують три рослини з г. Брескул, а інший - зразки з г. Пожижевська. Тобто, на дендрограмі генетичної подібності розподіл об'єктів G. punctata відповідає їхній популяційній приналежності. Найбільш генетично близькими є дві рослини з брескульської популяції.

Порівняння результатів RAPD-аналізу зразків G. acaulis, G. cruciata, G. punctata показало, що вони характеризуються різним рівнем мінливості як у природі, так і в культурі in vitro. Відсоток поліморфних ампліконів для трьох видів був відносно високим: G. acaulis - 63,26%, G. punctata - 38,91% та G. cruciata - 29,84%. Загалом, групування досліджених нами об'єктів на дендрограмах генетичної подібності відповідало їхній популяційній приналежності, що може свідчити про відносну генетичну ізоляцію цих локалітетів.

Нами також виявлено зміни в культурі тканин досліджених тирличів, які були значно меншими, порівняно з внутрішньовидовою варіабельністю. Найвищий рівень сомаклональної мінливості за Р характерний для G. punctata (г. Трояска) - 14,6%, найнижчий - для G. cruciata (заповідник «Медобори») - 9,52%. За часткою поліморфних ампліконів варіабельність культури тканин нижча за внутрішньовидову мінливість для G. acaulis - у 5,5 рази, G. cruciata - 2,4-3,1, G. punctata - у 2,7-3,7.

У вибірці об'єктів G. acaulis найбільш генетично близькими були зразки одного і того ж калюсу, відібрані на 30-му і 72-му пасажах культивування. Це може свідчити про відносну генетичну стабільність цього калюсу впродовж третього-шостого років вирощування in vitro. Підтвердженням такого припущення можуть бути результати цитогенетичних досліджень, які засвідчили, що рівень анеуплоїдних клітин у шестирічному калюсі, порівняно з однорічним, практично не змінювався (Твардовська та ін., 2006).

Порівняльний аналіз хромосомних змін та перебудов ДНК у культурі тканин тирличів. Проведене комплексне дослідження культури тканин G. acaulis, G. cruciata та G. punctata з використанням цитогенетичного методу та RAPD-ПЛР дозволило виявити зміни в усіх досліджених калюсних тканинах як на хромосомному рівні, так і на рівні ДНК, які залежали від вихідного генотипу і були видоспецифічними.

Цитогенетичний аналіз культури тканин G. acaulis (г. Туркул) показав, що модальним класом були гіподиплоїдні клітини. Калюсна культура характеризувалася наявністю незначної кількості поліплоїдних клітин та низьким рівнем анафазних аберацій. Незначними були і зміни на молекулярному рівні, про що свідчать порівняно малий відсоток (11,5%) поліморфних локусів і значення генетичної відстані (0,1222) між рослиною-донором та отриманим від неї калюсом. При цьому сомаклональна мінливість за масштабами не виходила за межі внутрішньовидової.

Результати проведених цитогенетичних досліджень G. cruciata показали, що культивовані тканини, отримані від рослин креничської і медоборської популяцій, несуттєво відрізнялися між собою: модальним класом у них були гіподиплоїдні клітини; 2/3 обох клітинних популяцій складали анеуплоїдні клітини. Поряд з цим, калюси відрізнялися за кількістю поліплоїдних клітин та наявністю анафазних аберацій. Ці показники були більше, ніж у 2 рази, вищими для культури тканин від рослини медоборської популяції. У той же час за результатами RAPD-аналізу цих культур встановлено, що рівень мінливості у калюсі від рослини креничської популяції (відсоток поліморфних локусів 12,38%, генетична відстань 0,1322) був дещо вищим, порівняно з медоборською (9,52% та 0,1001 відповідно). При цьому, генетична варіабельність на рівні ДНК обох досліджених калюсних тканин G. cruciata за масштабами не виходила за межі внутрішньовидової.

Аналіз культури тканин G. punctata (трояська популяція) показав, що модальним класом були гіподиплоїдні клітини, які складали більше, ніж третину проліферативного пулу. У цьому калюсі високим був відсоток поліплоїдних (33%) та анеуплоїдних (51%) клітин. Проте, за результатами RAPD-аналізу встановлено, що рівень генетичного поліморфізму між рослиною-донором та її культурою тканин був відносно невисоким (відсоток поліморфних локусів 14,6%, генетична відстань 0,1577).

Цитогенетичні дослідження культури тканин G. acaulis (г. Туркул) 11-го та 71-го пасажу показали, що із збільшенням тривалості вирощування зростає відсоток поліплоїдних клітин та рівень структурних перебудов хромосом. Цікавою особливістю цього калюсу було те, що високий відсоток анеуплоїдних клітин спостерігався вже в 11-му пасажі і залишався практично незмінним у процесі тривалого культивування до 71-го пасажу. Проведений нами RAPD-аналіз цього калюсу на 30-му і 72-му пасажі дозволив встановити значну генетичну подібність між відібраними зразками, що свідчить про невисокий рівень змін в культурі тканин у процесі тривалого вирощування.

Загалом, отримані результати свідчать про те, що культивування in vitro G. acaulis, G. cruciata та G. punctata призводить до геномних змін, які виявляються як на хромосомному рівні, так і на рівні послідовностей ДНК. Співставлення хромосомних змін та перебудов ДНК дозволяє припустити обернену залежність між ними для G. cruciata та G. punctata. У культурі тканин G. acaulis у процесі тривалого вирощування на фоні суттєвого зростання відсотка поліплоїдних клітин та рівня структурних перебудов хромосом, практично незмінною залишалася кількість анеуплоїдних клітин, незначно відрізнялися і RAPD-спектри.

ВИСНОВКИ

У результаті проведення комплексу експериментальних робіт досліджено особливості мінливості геному деяких видів роду Gentiana на хромосомному та молекулярному рівнях у природі та в культурі in vitro.

1. Підібрано умови індукції калюсоутворення для різних типів експлантів рослин G. cruciata, G. pneumonanthe та G. verna, а також отримано культуру тканин цих видів, здатну до тривалого вирощування в умовах in vitro.

2. Вперше встановлено хромосомні числа для семи видів роду Gentiana флори України (G. lutea, G. punctata, G. acaulis, G. asclepiadea, G. cruciata, G. pneumonanthe, G. verna). Відмінностей щодо кількості хромосом у рослин цих видів з різних популяцій не виявлено. Визначене хромосомне число для G. asclepiadea (2n=36) збігається з таким, описаним для однієї з хромосомних рас цього виду. Вперше виявлено міксоплоїдію в корінцях проростків G. cruciata.

3. Проведено цитогенетичний аналіз калюсних тканин тирличів, який показав домінування у досліджених калюсах (за винятком G. punctata) клітин з диплоїдним і/або близьким до диплоїдного наборами хромосом та невисокий рівень анафазних аберацій. Встановлено видову специфічність змін геному та залежність характеру цитогенетичної варіабельності клітинних популяцій in vitro від популяційної приналежності вихідних рослин.

4. Для G. acaulis виявлено тенденцію до зростання кількості поліплоїдних клітин та структурних перебудов хромосом з віком культури тканин. Рівень анеуплоїдних клітин у цій культурі був високим і практично не змінювався за умов тривалого (близько шести років) вирощування.

5. Виявлено міжвидовий поліморфізм та встановлено взаємозв'язки між видами Gentiana флори України з використанням методу RAPD-ПЛР. Показано значну генетичну гетерогенність роду та віддаленість його окремих таксонів. Результати RAPD-аналізу тирличів загалом узгоджуються з існуючими класифікаціями та дослідженнями інших авторів. Виявлено унікальні амплікони, що можуть бути використані для видової ідентифікації генотипів Gentiana.

6. Дослідження внутрішньовидової і сомаклональної мінливості G. acaulis, G. cruciata та G. punctata, проведені методом RAPD-ПЛР, показали, що для цих видів властивий різний рівень генетичної гетерогенності як в природі, так і в культурі in vitro. Кластеризація об'єктів на дендрограмах відповідала їхній популяційній приналежності, що свідчить про відносну генетичну ізоляцію локалітетів. У культурі тканин досліджених тирличів виявлено зміни, які були значно меншими, порівняно з внутрішньовидовою варіабельністю.

7. Отримані результати свідчать про те, що культивування in vitro G. acaulis, G. cruciata та G. punctata призводить до геномних змін, які виявляються як на хромосомному рівні, так і на рівні послідовностей ДНК. Співставлення хромосомних змін та перебудов ДНК дозволяє припустити обернену залежність між ними для G. cruciata та G. punctata. У культурі тканин G. acaulis у процесі тривалого вирощування на фоні суттєвого зростання відсотка поліплоїдних клітин та рівня структурних перебудов хромосом, практично незмінною залишалася кількість анеуплоїдних клітин, незначно відрізнялися і RAPD-спектри.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Страшнюк Н.М. Введення в культуру in vitro видів тирличу хрещатого (Gentiana cruciata L.) та тирличу звичайного (Gentiana pneumonanthe L.) / Н.М. Страшнюк, М.О. Твардовська, В.М. Мельник // «Наукові записки» Тернопільського національного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. - 2006. - №2 (29). - С. 100-107. (Здобувачем проаналізовано літературу, отримано культуру тканин, здійснено обговорення результатів досліджень, взято участь у написанні статті).

2. Мінливість числа хромосом та рівень хромосомних аберацій у культурі тканин тирличу безстеблового (Gentiana acaulis L.) / М.О. Твардовська, Н.М. Страшнюк, В.М. Мельник, В.І. Адонін, В.А. Кунах // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2006. - Т.4, №2. - C. 204-209. (Здобувачем проведено цитогенетичний аналіз культури тканин, зроблено фотографії метафазних пластинок у клітинах культури тканин, здійснено статистичну обробку та інтерпретацію отриманих результатів, написано основну частину статті).

3. Аналіз генетичної мінливості культури тканин деяких видів роду Gentiana L. / М.О. Твардовська, Н.М. Страшнюк, В.М. Мельник, В.А. Кунах // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2007. - Т.5, №1-2. - C. 104-111. (Здобувачем проведено цитогенетичний аналіз і статистичну обробку даних, побудовано діаграми розподілу клітин за рівнем плоїдності, написано основну частину статті).

4. Введення в культуру in vitro рідкісного виду Українських Карпат Gentiana verna L. / Н.М. Страшнюк, Н.Б. Кравець, І.І. Конвалюк, М.О. Твардовська, В.М. Мельник // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія біологія. - 2008. - Вип. 22. - C. 49-53. (Здобувачем проаналізовано літературу, отримано культуру тканин, взято участь в аналізі результатів і написанні статті).

5. Хромосомна мінливість в культурі тканин рідкісних видів роду Тирлич (Gentiana L.) / М.О. Твардовська, Н.М. Страшнюк, В.М. Мельник, В.І. Адонін, В.А. Кунах // Цитология и генетика. - 2008. - Т.42, №4. - C. 12-17. (Здобувачем проведено цитогенетичний аналіз культури тканин, зроблено фотографії метафазних пластинок, проаналізовано отримані результати і написано основну частину статті).

6. Страшнюк Н.М. Каріологія європейських видів роду Gentiana L. (Gentianaceae) / Н.М. Страшнюк, М.О. Твардовська, В.М. Мельник // Український ботанічний журнал. - 2008. - Т.65, №6. - C. 836-848. (Здобувачем проаналізовано літературу, взято участь у написанні статті).

7. Хромосомна мінливість деяких видів роду Тирлич (Gentiana L.) при культивуванні в умовах in vitro / М.О. Твардовська, Н.М. Страшнюк, В.М. Мельник // Молодь і поступ біології: тези ІІ Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів. - Львів, Україна, 21-24 березня 2006 р. - Львів, 2006. - С. 160-161. (Здобувачем проведено цитогенетичний аналіз культури тканин, написано основну частину тексту).

8. Cytogenetic studies on the Gentiana cruciata L. tissue culture / M. Twardovska, N. Strashniuk, V. Mel'nyk // ІІІ International Young Scientists Conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.». Odesa, Ukraine, 15-18 May 2007. - Odesa, 2007. - P. 230. (Здобувачем проведено цитогенетичний аналіз культури тканин, написано основну частину тексту).Мінливість числа хромосом тирличу хрещатого (Gentiana cruciata L.) у природі та в культурі in vitro / М.О. Твардовська, Н.М. Страшнюк, Г.М. Оніщенко, В.М. Мельник, В.А. Кунах // Матеріали Міжнародної наукової конференції, присвяченої 200-річчю заснування Кременецького ботанічного саду “Різноманіття фітобіоти: шляхи відновлення, збагачення і збереження. Історія та сучасні проблеми”. - Кременець, Україна, 18-23 червня 2007. - Кременець-Тернопіль, 2007. - С. 151. (Здобувачем проведено цитогенетичний аналіз інтактних рослин та культури тканин, написано основну частину тексту).

9. Особливості росту в культурі in vitro рідкісного виду тирличу весняного (Gentiana verna L.) / Н. Телеп, С. Баранчук, Н. Страшнюк, М. Твардовська, В. Мельник // Тези ІІІ Міжнародної конференції, присвяченої 100-річчю заснування кафедри фізіології та екології рослин у Львівському національному університеті імені Івана Франка “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти”. - Львів, Україна, 4-6 жовтня 2007. - Львів, 2007. - С. 45. (Здобувачем взято участь в аналізі результатів і написанні тез).

10. Biotechnologies of in vitro culture and preservation perspectives of Gentiana L. species / V.M. Mel'nyk, N.M. Strashniuk, M.O. Twardovska, I.I. Konvalyuk, V.A. Kunakh // Meeting of the Regional Cooperation for Health, Science and Technology (RECOOP HST) Consortium. - 5 October 2007, Pecs, Hungary. Bridges in Life Sciences Annual Scientific Review. - October 2007. - Vol.1, №1. - P. 26. (Здобувачем взято участь у написанні тез).

11. Cytogenetic studies on the Gentiana pneumonanthe L. tissue culture / M.O. Twardovska, N.M. Strashniuk, V.M. Mel'nyk // Conference of young scientists, dedicated to the 185th anniversary of Gregor Mendel. Kyiv, Ukraine. - In: Biopolymers and cell. - 2007. - V.23, №4 (Suppl.). - P. 291. (Здобувачем проведено цитогенетичний аналіз культури тканин, написано основну частину тексту).Interspecies polymorphism of Gentiana L. genus members: the results of RAPD-analysis / M.O. Twardovska, I.I. Konvaliuk, N.M. Strashniuk, O.M. Bublyk, V.M. Mel'nyk // Conference of Young Scientists, dedicated to the 35th Anniversary of Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine. Kyiv, Ukraine. - In: Biopolymers and cell. - 2008. - V.24, №5 (Suppl.). - P. 365. (Здобувачем проведено RAPD-аналіз і написано основну частину тексту).Мінливість геному тирличів у природі і в культурі in vitro / М.О. Твардовська, І.І. Конвалюк, В.М. Мельник, Н.М. Страшнюк, І.О. Андрєєв, К.В. Спірідонова, О.М. Бублик, В.А. Кунах // Геном рослин: Матеріали V Міжнародної наукової конференції. - Одеса, Україна, 13-16 жовтня 2008. - Одеса, 2008. - С. 222-225. (Здобувачем проведено RAPD-аналіз і написано основну частину тексту).

АНОТАЦІЯ

Твардовська М.О. Мінливість геному тирличів (Gentiana L.) у природі та в культурі in vitro - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, Київ, 2009.

Підібрано умови індукції калюсоутворення для різних типів експлантів рослин G. cruciata, G. pneumonanthe та G. verna, а також отримано культуру тканин цих видів, здатну до тривалого вирощування в умовах in vitro. Встановлено хромосомні числа для 7 видів роду Gentiana. Показано домінування у досліджених калюсах (за винятком G. punctata) клітин з диплоїдним і/або близьким до диплоїдного наборами хромосом та невисокий рівень анафазних аберацій. Встановлено видову специфічність змін геному та залежність характеру цитогенетичної варіабельності клітинних популяцій in vitro від популяційної приналежності вихідних рослин. Виявлено міжвидовий поліморфізм та встановлено взаємозв'язки між видами Gentiana флори України з використанням RAPD-методу. Показано значну генетичну гетерогенність роду та віддаленість його окремих таксонів. Порівняння результатів RAPD-аналізу зразків G. acaulis, G. cruciata, G. punctata показало, що вони характеризуються різним рівнем мінливості як у природі, так і в культурі in vitro. Зміни в культурі тканин тирличів не виходили за межі внутрішньовидової мінливості. Встановлено, що культивування G. acaulis, G. cruciata та G. punctata in vitro призводить до геномних змін, які виявляються як на хромосомному рівні, так і на рівні послідовностей ДНК.

Ключові слова: види роду Gentiana L., культура тканин, цитогенетичний аналіз, RAPD-ПЛР, геномна мінливість.

АННОТАЦИЯ

Твардовская М.О. Изменчивость генома горечавок (Gentiana L.) в природе и в культуре in vitro - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2009.

Подобраны оптимальные условия для индукции каллусообразования на разных типах эксплантов и продолжительного выращивания каллусных культур видов G. cruciata, G. pneumonanthe и G. verna. Показано, что оптимальный состав (в частности, концентрация фитогормонов) питательной среды для культивирования іn vitro зависит от вида, условий роста растений каждой популяции, типа исходного экспланта.

Установлены хромосомные числа для 7 видов рода Gentiana. В частности, для G. lutea (2n=40), G. punctata (2n=40), G. acaulis (2n=36), G. asclepiadea (2n=36), G. pneumonanthe (2n=26), G. cruciata (2n=52), G. verna (2n=28). Для G. asclepiadea выявленное хромосомное число 2n=36 совпадает с установленным диплоидным набором одной из цитологических рас этого вида. Обнаружена миксоплоидия в апикальных меристемах корешков проростков G. cruciata (заповедник «Медоборы») - наряду с диплоидными (2n=52) выявлены клетки с гаплоидным и гиподиплоидным наборами хромосом.

Цитогенетический анализ культуры тканей горечавок показал, что несмотря на значительную миксоплоидность клеточных популяций исследованных видов, модальным классом в них, за исключением каллуса G. punctata (брескульская популяция), были клетки с диплоидным или близким к диплоидному наборами хромосом. Это свидетельствует о сравнительно незначительном уровне хромосомной изменчивости и сохранении культурами тканей цитогенетических особенностей исходных видов. Все исследованные каллусные ткани характеризовались наличием полиплоидных клеток. Наибольшее количество (80%) полиплоидных клеток обнаружено в каллусе G. punctata (г. Брескул). В культуре тканей этого же вида с трояской популяции процент таких клеток также довольно большой (33%). Очевидно, высокая способность к полиплоидизации в условиях in vitro является видовой особенностью G. punctata. В каллусе G. verna полиплоидные клетки отсутствуют. Все изученные клеточные популяции характеризовались наличием значительного количества анеуплоидных клеток. Высокую склонность к анеуплоидии проявили культуры тканей G. lutea, G. cruciata и G. asclepiadea (г. Большая Мыгла). Результаты анафазного анализа показали сравнительно невысокий для культивированных клеток (до 10%) уровень аберраций. Наряду с этим, для всех исследованных культур тканей установлено видовую специфичность изменчивости геномов и зависимость характера цитогенетической вариабельности клеточных популяций in vitro от популяционной принадлежности.

Обнаружен значительный размах изменчивости по числу хромосом в каллусе G. acaulis (2n=36) различной продолжительности культивирования: в 11-ом пассаже - 16-107 хромосом, в 71-ом - 18-110. Установлено, что в 11-ом пассаже (одногодичная культура тканей) модальным классом были клетки с диплоидным и околодиплоидным наборами хромосом, а в 71-ом (шестилетняя культура) - клетки с триплоидным и околотриплоидным наборами. В шестилетней культуре, сравнительно с одногодичной, обнаружено увеличение количества полиплоидных клеток в 4,3 раза, процент анеуплоидных клеток практически не изменился. Среди анафазных аберраций хромосом, уровень которых был в пределах 2-15%, преобладали одиночные мосты без фрагментов.

RAPD-анализ видов рода Gentiana дал возможность дифференцировать на молекулярном уровне горечавки флоры Украины и установить генетические взаимосвязи между ними. Полученные результаты свидетельствуют об отдаленности отдельных таксонов рода Gentiana, межвидовая вариабельность в пределах которого составляла 0,54. Это подтверждается отсутствием фрагментов, общих для всех видов, а также небольшим количеством ампликонов, общих для определенных групп видов в пределах исследованной выборки. Выявлены уникальные ампликоны, которые могут использоваться для видовой идентификации генотипов Gentiana. Полученные нами результаты оценки межвидового полиморфизма горечавок согласуются с основными классификациями рода, основанными на анатомо-морфологических, онтогенетических и эколого-географических критериях. Исключением является расположение на дендрограмме генетического сходства G. asclepiadea (секция Pneumonanthe) близко к видам секции Gentiana, а также генетическое сходство между видами разных секций - G. рneumonanthe и G. cruciata, G. acaulis и G. verna. Однако, эти противоречивые, на первый взгляд, результаты RAPD-анализа горечавок подтверждаются данными других авторов, полученными на основе молекулярно-генетических исследований разных участков ядерного и пластидного генома.

Сравнение результатов RAPD-анализа образцов G. acaulis, G. cruciata, G. punctata показало, что они характеризуются разным уровнем изменчивости как в природе, так и в культуре in vitro. Процент полиморфных ампликонов, характеризующий уровень внутривидовой изменчивости, составлял для G. acaulis, G. punctata и G. cruciata - 63,26, 38,91 и 29,84% соответственно. Кластеризация объектов на дендрограммах отвечала их популяционной принадлежности, что свидетельствует об относительной генетической изоляции этих локалитетов. В культуре тканей исследованных горечавок выявленные изменения не выходили за пределы внутривидовой вариабельности.