Генетика пластид

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетика пластид



Оглавление

1. Формальная генетика пластид

2. Геном пластид

Литература



1. Формальная генетика пластид

Пластиды - органеллы, локализованные только в клетках высших растений и водорослей. Они ответственны за фотосинтез, хранение разнообразных продуктов метаболизма, а также за синтез многих ключевых молекул растительных клеток. Как следует из названия (от греч. plastikos - изменчивый, пластичный), пластиды различны по размеру, форме, содержанию и функциям. Пластиды обладают также удивительной способностью дифференцироваться, дедифференцироваться и повторно редифференцироваться.

Всем пластидам свойствен ряд общих черт. Они имеют собственный геном, одинаковый у всех представителей одного вида растений, собственную белоксинтезирующую систему; от цитозоля пластиды отделены двумя мембранами - наружной и внутренней. Для некоторых фототрофных организмов число пластидных мембран может быть больше. Например, пластиды эвглен окружены тремя, а у золотистых, бурых, желто-зеленых и диатомовых водорослей они имеют четыре мембраны. Это связано с происхождением пластид. Предполагают, что симбиотический процесс, результатом которого стало формированием пластид, в процессе эволюции происходил неоднократно (Алехина и др., 2005).

История открытия пластид, вероятно, начинается с их первого описания итальянским натуралистом А. Компаретти в 1791 году. Позже, с развитием световой микроскопии, появились первые рисунки пластид. Впервые в 1858 году их зарисовал А. Трекул. Эти наблюдения затрагивали описание пластид в разных тканях и видах растений, а также и их сравнение между собой. Уже в это время стало ясно, что пластиды, расположенные в цитоплазме клеток растений, являются их обязательным составным компонентом.

Наблюдения за пластидами позволили показать, что они способны реагировать на свет, перемещаться в клетке даже против тока цитоплазмы, изменять свой цвет, размеры и количество в клетке. В конце XIX века русский исследователь А.С. Фомицин, а затем и его ученик К.С. Мережковский выдвинули гипотезу, согласно которой пластиды являются самостоятельными клеточными органеллами и сами по себе являются клетками, локализованными внутри растительной клетки. Таким образом, им принадлежит приоритет в создании симбиотической теории происхождения эукариотической клетки.

Известны три основных типа пластид: лейкопласты, хлоропласты и хромопласты. Разновидность лейкопластов - амилопласты, содержат значительное количество крахмала в виде крахмальных зерен, например, в клубнях картофеля. Хлоропласты содержат необходимые пигменты фотосинтеза и поэтому окрашены главным образом в зеленый цвет. На рисунке 1. приведена микрофотография хлоропласта из мезофилла листа подсолнечника.

Хромопласты содержат разнообразные пигменты, придающие им яркую окраску (желтую, красную и др.) Кроме пигментации эти пластиды различаются между собой также и по размерам и тонкой ультраструктуре.

Пластиды в растительной клетке никогда не возникают de novo, а возникают из неструктурированных клеточных органелл - пропластид, которые, постепенно дифференцируясь, превращаются в разные типы пластид. Не все клеточные органеллы обладают такой непрерывностью в ряду клеточных поколений. Беспрерывны в клетке только пластиды и митохондрии. Благодаря развитию техники электронной микроскопии было показано, что все типы пластид способны взаимно превращаться друг в друга.



Рис. 1. Ультраструктура хлоропласта на срезах листьев подсолнечника инбредной линии 3629.

ТМ - тилакоидные мембраны гран; К - крахмал.

Таким образом, из пропластид формируются остальные типы пластид - амилопласты, лейкопласты, этиопласты, хлоропласты, хромопласты. Набор пластид в конкретной клетке зависит от типа ее дифференцировки (рис. 2).

Например, когда при превращении бесцветного корнеплода в окрашенный, происходит трансформация лейкопластов в хромопласты. В процессе позеленения семядолей при выходе их на поверхность из почвы при прорастании семян лейкопласты превращаются в хлоропласты.

То же самое происходит при позеленении клубней картофеля на свету.

Обратный процесс, т.е. превращение хлоропластов в лейкопласты можно наблюдать при утрате зеленой окраски органов растений в отсутствие света.

Хлоропласты могут превращаться в хромопласты при старении листьев осенью или превращении зеленого венчика в ярко окрашенный. Хромопласты превращаются в хлоропласты, например, при позеленении корнеплодов моркови на свету.

Таким образом, при определенных условиях все типы пластид могут превращаться друг в друга.



Рис. 2. Схема взаимопревращений пластид (из Алехиной и др., 2005)

Следует отметить, что растительные клетки без пластид не существуют. Даже те растения, которые в процессе эволюции утратили способность к фотосинтезу, во всех своих клетках содержат лейкопласты, без которых невозможен обмен, накопление и транспорт углеводов.

Окончательные доказательства общего происхождения всех типов пластид были получены с развитием современных молекулярно-генетических методов уже в наше время, когда было продемонстрировано, что геномы разных типов идентичны друг другу.

Впервые удвоение пластид перед началом деления клетки было описано К. Негели еще в 1846 г. Однако, только к середине XX века, благодаря электронной микроскопии, удалось показать, что пластиды делятся путем перешнуровки органелл.

Гены пластид, а также и митохондрий у большинства растений наследуются однородительски - по материнской линии. Это означает, что гены органелл отцовских родителей не участвуют в оплодотворении. Ультраструктурные исследования, проведенные в ряде лабораторий, позволили разделить высшие растения по принципу распределения и передачи отцовских пластид на четыре основных типа: тип Lycopersicon, тип Solanum, тип Triticum и тип Pelargonium:

Тип Pelargonium (герань) - только для типа Pelargonium типична передача отцовских пластид в зиготу; при этом отцовские пластиды, через мужскую генеративную клетку попадая в зиготу, перемешиваются с материнскими пластидами и распределяются в дочерних клетках случайным образом. Растения этого типа потенциально могут демонстрировать двуродительское наследование пластид, однако это происходит не всегда, т.к. кроме непосредственно пластид важна главным образом судьба их генов, а отцовская ДНК пластид не всегда сохраняется в зиготе.

Тип Licopersicon (томаты) - во время первого пыльцевого митоза из-за неравномерного распределения пластиды не попадают в генеративную клетку, а все они локализуются в вегетативной клетке. Таким образом, отцовские пластиды не попадают в зиготу при оплодотворении.

Тип Solanum (картофель) - сразу после первого деления генеративная мужская клетка содержит несколько пластид, которые быстро деградируют еще до оплодотворения. Т.е. и в этом случае отцовские пластиды не попадают в зиготу.

Тип Triticum (пшеница) - пластиды обнаруживаются во всех клетках мужского гаметофита, однако при оплодотворении они не передаются в яйцеклетку. То же, очевидно, происходит и с митохондриями этих растений. В результате растения этого типа обычно наследуют только материнские органеллы.

Однако отсутствие передачи пластид вовсе не означает отсутствие передачи пластидной ДНК. Методами флуоресцентной микроскопии было исследовано 235 видов высших растений, и у 20% видов была выявлена передача пластидной ДНК с пыльцой. Интересно отметить, что у голосеменных растений, передача пластид с пыльцой отмечена практически для каждого семейства, тогда как у покрытосеменных она встречается гораздо реже.

У тех видов, у которых пластиды попадают в яйцеклетку, первоначальное (стартовое) соотношение материнских и отцовских пластид может быть самым разнообразным - от 1:2 до 1:31. Однако это первоначальное стартовое соотношение в процессе последующих клеточных делений может быть изменено в силу того, что отцовские и материнские пластиды могут обладать разной скоростью деления.

Виды с материнским, или изредка встречающимся отцовским типом наследования пластид: арабидопсис, соя, ячмень, пшеница, лен, ночная красавица, овес, просо, пшеница, свекла, капуста, кофе, клевер, бобы, кукуруза, подсолнечник. К этой группе относится большинство как однодольных, так и двудольных растений, и данный список примеров можно было бы существенно расширить.

Виды со стабильным двуродительским наследованием пластид: земляника, герань, рожь, ослинник.

Существуют виды, у которых в потомстве обнаруживают только отцовские пластиды и не обнаруживают материнских: Daucus сarota (морковь), Medicago sativa (люцерна). Но даже у видов со стабильным преимуществом отцовских пластид - обычно первоначально в зиготе наблюдается преимущество материнских пластид, которые затем вытесняются отцовскими.

Таким образом, дело не в количестве пластид, вносимых в зиготу отцовской и материнской формами, а в разнообразных механизмах ограничения наследования одного из двух типов пластид. Тип наследования клеточных органелл у растений могут определять различные генетические системы: ядерные гены материнского организма, как у Pelargonium, отцовского, как у Petunia или же генотипы обоих родительских форм, как у Medicago.

На трансмиссию пластид может также влиять их собственный геном и ядерно-цитоплазматические взаимодействия.

Несмотря на многочисленные исследования, проведенных на сотнях видов растений, вопрос о наследовании клеточных органелл все еще остается не решенным.

Даже вопрос об эволюционном преимуществе однородительского наследования цитоплазматических геномов достаточно спорен, поскольку наряду с материнским наследованием пластид довольно часто встречается и двуродительская передача органелл потомству. Определенно можно заключить, только то, что оба эти типа трансмиссии органелл возникали и закреплялись в процессе эволюции растений неоднократно.

Рис 3. Схема строения клетки хламидомонады: 1 - хлоропласт, 2 - митохондрии, 3 - ядро, 4 - жгутики

Следует отметить, что основные закономерности пластидной наследственности впервые были установлены американским генетиком Рут Сэджер в экспериментах с зеленой одноклеточной водорослью хламидомонадой Chlamydomonas reinhardtii. Этот одноклеточный организм содержит всего один хлоропласт на клетку (рис. 1.4), и при слиянии гаплоидных клеток (оплодотворении) их хлоропласты сливаются в один хлоропласт.

Жизненный цикл хламидомонады включает диплоидную и гаплоидную фазы (рис. 4).

Рис. 4 Жизненный цикл Chlamydomonas reinhardi.

-, + - половой фактор (тип скрещивания).



Зигота, являясь диплоидной клеткой и всегда гетерерозиготной, делится посредством мейоза. В результате этого образуются 4 зооспоры - гаплоидные клетки. Две из них имеют половой фактор mt+, т.е. являются женскими, а две другие имеют половой фактор mt-, т.е. являются мужскими. Зооспоры являются одновременно и организмами, и гаметами. Оплодотворение происходит при помощи слияния мужских и женских гамет. Гаметы с одинаковыми половыми факторами участвовать в оплодотворении не могут.

Менделевские гены, находящиеся в хромосомах ядра, наследуются следующим образом: зоспоры A (mt+) и a (mt-) сливаются. Образуется зигота Аа (mt+mt-). После мейоза возникает четыре зооспоры : 2 с генотипом А и 2 с генотипом а. Следовательно, по ядерным генам всегда наблюдается расщепление 2:2. Естественно, что при митотическом размножении зооспор никакого расщепления не происходит. Расщепление 2:2 не изменяется в зависимости от того, мужская или женская зооспора несет рецессивный фактор, т.е. различий в реципрокных скрещиваниях не наблюдается.

Р. Сэджер у хламидомонады выделила и индуцировала при помощи мутагенов большое количество мутантов. Многие из этих мутантных признаков наследовались совершенно иным образом, чем менделевские гены. Это были мутации устойчивости к антибиотикам, дефекты фотосинтеза, чувствительность к температуре, медленно растущие, зависимые от тех или иных метаболических добавок. Впоследствии было доказано, что многие полученные ею мутанты были пластидными, т.е. связанными с мутациями пластогенов.

Рассмотрим, например, одну из таких мутаций, а именно: мутацию устойчивости к антибиотику стрептомицину.

S (дикий тип, чувствительный к стрептомицину);

s (мутант, устойчивый к стрептомицину).

При слиянии двух зооспор S(mt+) и s(mt-), образуется зигота и после мейотического деления - четыре чувствительные к антибиотику зооспоры (дикого типа), такие же, как их материнская форма. Другими словами в этом случае имеет место однородительское материнское наследование.

Если поставить реципрокное скрещивание и слить зооспоры s(mt+) и S(mt-), то после образования зиготы и мейотического деления образуются четыре зооспоры мутантного типа опять с такими же, как и материнская форма. Таким образом, в данном случае наблюдается строго материнское наследование, при отклонении от менделевских правил расщепления: различия в реципрокных скрещиваниях.

Следовательно, несмотря на то, что пластиды и отцовской и материнской формы попадают в зиготу и даже сливаются в одну общую пластиду, у хламидомонады пластидные гены наследуются почти строго однородительски, по материнской линии.

Это правило имеет исключение, на котором основан весь рекомбинационный анализ хлоропластной группы сцепления. Иногда, приблизительно с частотой около 1% возникают так называемые цитогеты - цитоплазматические гетерозиготы, т.е. зигота получает оба пластома (хлоропластных геномов) и 1% зооспор содержит как отцовские, так и материнские пластогены. В результате митотических делений такие зооспоры расщепляются на отцовские и материнские маркеры в соотношении примерно 1:1. Таким образом, наблюдается соматическое расщепление по цитогенам, тогда как ядерные гены, поскольку находятся в зооспорах в гаплоидном состоянии, не расщепляются. Это свидетельствует о том, что небольшое количество отцовской ДНК все же сохраняется в пластидах.

Р. Сэджер поставила и ряд других, теперь уже ставших классическими, опытов. В частности она показала, что если перед слиянием зооспор материнские формы облучать ультрафиолетовыми лучами, то количество цитогет можно довести до 50%. Этот факт свидетельствует, вероятно, о том, что УФ облучение нарушает некий механизм узнавания и уничтожения отцовской пластидной ДНК.

Наличие цитогет дало принципиальную возможность картирования генов хлоропластной ДНК. Для этого были использованы разнообразные цитоплазматические мутанты.

Например: acl (нуждается в ацетате), sd (нуждается в стрептомицине).

При скрещивании дикого типа (mt+) с двойным пластидным мутантом acl, sd(mt-) зигота и получившиеся в результате ее деления все зооспоры дикого типа, за исключением 1%. При УФ облучении материнских форм mt+ - до 50% двойных мутантов. Зооспоры-двойные мутанты при размножении расщепляются на 4 класса: два родительских (дикий тип и двойной мутант) и два рекомбинантных (только с первой acl или только со второй sd мутацией). По частоте встречаемости рекомбинантных особей можно судить о частоте рекомбинаций, а она, в свою очередь, будет свидетельствовать о расстоянии между генами на "хромосомной" карте.

Результаты наследования пластогенов у хламидомонады показали, что характер наследования не зависит от количества пластид, вносимых отцовским и материнским формами, а зависит от процессов, которые происходят с ДНК отцовских и материнских пластид в зиготе.

Таким образом, уже к 70-м годам XX века у хламидомонады удалось не только получить множество пластидных мутаций, но картировать пластидные гены, построив кольцевую карту, соответствующую кольцевой молекуле ДНК пластид. Однако до сих пор ни на одном высшем растении, даже у тех из них, где пластиды наследуются двуродительски, рекомбинаций по хлоропластным генам не удается получить. Естественно, что это тормозит развитие генетики хлоропластов у высших растений.

У высших растений, к сожалению, мы не можем привлечь такого большого количества маркеров пластидных генов, как у хламидомонады, поскольку у них достаточно сложно использовать микробиологические методы, такие, как например метод селективных сред. Основная информация о пластидных генах была получена при изучении так называемых пестролистных растений или растений с теми или иными дефектами фотосинтеза.

Впервые генетическая природа пестролистности была исследована Карлом Корренсом в 1908 году на растении ночная красавица Mirabilis jalapa. Корренс брал пыльцу с цветков, растущих на белых, зелёных и пестролистных побегах растения Mirabilis jalapa и наносил её на пестики цветков, также растущих на трех типах побегов (рис. 5). Оказалось, что свойства проросших из таких семян растений характеризуются неменделевским типом наследования и определяются исключительно характером материнского цветка и не зависят от свойств цветка, с которого была взята пыльца.

Рис. 5. Вариации по содержанию хлорофилла в побегах Mirabilis jalapa

Такие мутанты возникают как спонтанно, так и индуцированно под действием различных мутагенов и описаны к настоящему времени у большинства известных видов высших растений. Они имеют белую, желтую или бледно-зеленую окраску листьев (рис. 6).

Дефекты фотосинтеза у растений могут быть вызваны не только пластидными генами, но также в редких случаях и митохондриальными, но чаще всего ядерными генами. Только у ячменя Д. Веттштейном было описано 83 ядерных мутантных локуса, расположенных во всех 7 парах хромосом. Эти мутации вызывают те или иные дефекты фотосинтеза и пигментации пластид.

Кроме того, дефекты пластид могут возникать иногда и в случае отдаленной гибридизации, что, вероятно, свидетельствует о несовместимости или несогласованности действия ядерных и пластидных генов, привнесенных в гибрид от разных видов или удаленных форм одного вида.

Рисунок 6. Пестролистная форма подсолнечника Helianthus annuus l.

Наличие как пластидно, так и ядерно обусловленных мутаций, приводящих к дефектам фотосинтеза, свидетельствует, что биогенез хлоропластов находится под двойным генетическим контролем ядра и собственно органеллы.

Отличить мутации окраски листьев, вызванные ядерными генами, от мутаций, вызванных пластидными генами, не всегда легко. Чаще всего ядерные мутанты не проявляют соматического расщепления, и мы имеем либо чисто альбиносные формы, либо нормально окрашенные в менделевских пропорциях. В большинстве случаев пластидные мутанты чаще всего возникают первоначально как пестролистные химеры, соматически расщепляющиеся на три класса - пестрые, белые (летальные) и зеленые в неменделевских пропорциях. Однако описаны случаи, когда ядерные гены за счет различий в экспрессии в разных тканях могут обуславливать пеструю окраску листьев со стабильным рисунком.

В табл. 1 приведены результаты расщепления в потомстве после самоопылении пестролистных растений мутантных линий var подсолнечника из генетической коллекции внеядерных мутантов НИИ биологии ЮФУ. Видно, что пестролистные растения всех изучаемых линий расщепляются в потомстве на три типа проростков: зелёные, пёстрые и летальные (белые, жёлтые или желто-зеленые). Последние погибают на стадии развития первой пары настоящих листьев.

Таблица 1. Расщепление в потомстве пестролистных растений мутантых линий var подсолнечника

Линия	Количество растений в потомстве	Количество мутантных растений, %
	зелёных	пёстрых	белых, жёлтых
Var - 1	27	8	5	32,5
Var - 2	24	14	9	51,0
Var - 3	30	4	0	11,8
Var - 4	19	17	7	55,8
Var - 6	17	5	4	36,0
Var - 7	24	7	0	29,2
Var - 8	18	10	1	37,9
Var - 9	25	6	8	35,9
Var - 10	69	6	14	22,5
Var - 11	32	40	25	67,0
Var - 12	23	26	42	74,2
Var - 13	14	4	0	28,6
Var - 14	56	29	8	39,8
Var - 15	14	12	8	58,8
Var - 17	33	4	9	28,3
Var - 20	33	6	3	21,4
Var - 23	25	14	12	51,0
Var - 24	10	10	8	64,3
Var - 25	32	27	13	55,6
Var - 27	16	12	5	51,5
Var - 28	22	8	4	35,3
Var - 29	11	13	5	62,1
Var - 30	29	6	0	20,7
Var - 32	54	6	6	18,2
Var - 33	22	10	8	45,0
Var - 35	9	12	5	65,4
?	688	316	209
%	57,8%	42,2%

Хотя числовые отношения при расщеплении непостоянны, однако они носят устойчивый, регулярно повторяющийся (на протяжении уже более 35 лет) характер, подтверждая генетическую непрерывность пластид в ряду клеточных поколений (табл. 2).

Таблица 2. Расщепление в потомстве пестролистных растений мутантных линий var подсолнечника после самоопыления

Год наблюдения	Количество изученных семей	Количество растений в потомстве	Количество мутантных растений, %
		зеленых	пестрых	белых (желтых)
1967	50	432	199	88	39,9
1968	60	1128	536	491	47,7
1969	53	1404	584	537	44,4
1970	59	1126	457	310	40,5
1972	69	1006	385	347	42,1
1973	61	1145	325	268	34,1
1974	72	1154	428	259	37,3
1976	51	1404	431	778	46,3
1977	66	927	261	772	52,6
2000*	15	556	267	192	45,2
2001*	15	547	227	162	41,6
2003*	15	461	283	126	47,1
2004*	15	395	201	179	49,0

Примечание: * - приведены результаты только по тем линиям пестролистных растений, которые были получены в 1967 году.

Наличие соматического расщепления только позволяет отличить ядерные пестролистные мутанты от внеядерных. Сам факт соматического расщепления указывает на органеллы цитоплазмы, но не позволяет связать этот признак с конкретными органеллами. Для доказательства пластидной обусловленности пестролистности растений можно использовать довольно простой цитологический тест на наличие так называемых гетеропластидных клеток. Суть его сводится к тому, что если мы регистрируем клетки, содержащие одновременно как нормальные, так и дефектные пластиды, то это означает, что фактор (ген), вызывающий этот дефект, локализован внутри пластид (рис. 7).

Рис. 7. Гетеропластидная клетка пестролистного мутанта подсолнечника.

МП - мутантная пластида. НП - нормальный хлоропласт клеток листовой ткани растений. ТС - тилакоиды стромы. ТГ - тилакоиды гран. Р - рибосомы.

Следует заметить, что гетеропластидные клетки у растений с неядерным наследованием дефектов пластид в силу тех или иных причин удается выявить не всегда. Более того, среди неядерных мутантов существуют такие, которые не проявляют даже соматического расщепления. Это непестролистные бледно-зеленые мутанты, как например мутации типа chlorina, описанные у подсолнечника (рис. 8). Эти мутации были индуцированы нами при помощи алкилирующего мутагена нитрозометилмочевины. Наследование признака по материнской линии указывает на нехромосомную природу данной мутации, в то же время отсутствие соматического расщепления и отсутствие гетеропластидных клеток не позволяет связать данную мутацию с пластидными генами.

Рис. 8. Внеядерный мутант en:chlorina подсолнечника



Пластидная природа мутаций типа chlorina у подсолнечника была доказана при помощи молекулярных методов исследований. Была исследована пластидная ДНК у нескольких мутантов, полученных из одной и той же линии дикого типа, а также несколько полных и частичных ревертантов, полученных из одной и той же мутантной линии. Оказалась, что мутанты имеют отличия от нормальной исходной линии по своим хлоропластным, но не митохондриальным ДНК. У полных ревертантов, у которых наблюдалось полное восстановление, как функции фотосинтеза, окраски листьев, так и восстановление мощности растений, происходило и полное восстановление структуры ДНК (истинная реверсия). У частичных ревертантов, для которых характерно восстановление мощности растений, но не восстановление окраски листьев было обнаружено, что восстановление структуры ДНК пластид не происходило, но наблюдались некоторые изменения в структуре ДНК митохондрий. Последний факт позволяет предполагать, что мутации в одних органеллах (митохондриях) могут быть компенсаторными по отношению к другими органеллам (пластидам).

Однако отсутствие соматического расщепления для пластидных мутаций у высших растений скорее исключение, чем правило.

Почему в процессе роста растений, в которых находятся клетки одновременно с мутантными и нормальными пластидами, возникают клетки, а затем и участки ткани и даже целые растения, содержащие только один тип пластид: либо только мутантные, либо только нормальные пластиды? Ответить на этот вопрос попытался чл.-корр. НАН Беларуси О.Г. Давыденко (Давыденко, 2001). Он предложил в начале рассуждений исходить из следующих простых представлений.

Первоначальная клетка содержит только два типа пластид: мутантные и нормальные. В качестве таких первоначальных клеток могут быть либо зиготы у видов с двуродительским наследованием пластид, либо стартовая клетка, в которой произошла мутация пластид. И в том и в другом случае мы можем получить гетеропластидную клетку.

Пропорции между мутантными и нормальными пластидами либо равные, либо преобладает один из двух типов.

Мутантные и нормальные пластиды обладают равной скоростью деления.

Мутантные и нормальные пластиды перемешиваются в стартовой клетке и во всех последующих клетках перед делением случайно и распределяются в дочерних клетках случайно.

Во всех клетках стабильное общее количество пластид.

При этих допущениях, исходя из чисто математических представлений, наступает несколько следствий:

Количество различных сочетаний мутантных и нормальных пластид в клетках тем больше, чем больше общее количество пластид на клетку.

Частота встречаемости клеток одновременно с двумя типами пластид, т.е. гетеропластидных или сортирующихся клеток, зависит от общего количества органелл, а не от стартовой пропорции мутантных и нормальных органелл.

Количество клеточных делений, приводящих к полной рассортировке мутантных и нормальных пластид на чисто мутантные и чисто нормальные ткани, равно 10 в степени n, где n - общее количество пластид. Если в клетке 2 пластиды, то через 100 клеточных делений вероятность обнаружения гетеропластидных клеток будет близка к 0.

Стадия полного завершения сортировки зависит от общего количества пластид в клетке и не зависит от стартовой пропорции нормальных и мутантных пластид. Следовательно, даже если в зиготу попадает одна отцовская на 100 материнских пластид мутантный участок ткани выщепится - хотя и небольшой.

Исходя из предложенной модели, мы вправе ожидать, что и соматическое расщепление, и наличие гетеропластидных клеток должно быть достаточно легко зарегистрировано, по крайней мере, в первом поколении после возникновения стартовой гетеропластидной клетки. В большинстве случаев наблюдения за пестролистными растениями показывают достаточно хорошее совпадение теоретически ожидаемых и практически полученных наблюдений, однако достаточно часто уже на ранних стадиях развития сортировка может заканчиваться значительно быстрее, чем, если бы мы исходили из простой математической модели. В результате этого гетеропластидные клетки иногда не удается обнаружить вообще, как и различные участки ткани. Происходит это потому, что те допущения, из которых мы исходили, не всегда справедливы.

В ряде случаев было показано, что мутантные и нормальные пластиды могут реплицироваться с разной скоростью и обладать разной жизнеспособностью, что неизбежно приведет к вытеснению одного из типов пластид из клеток и тканей. Разная реакция на свет или разная способность активно передвигаться внутри цитоплазмы клеток у мутантных и нормальных пластид может также приводить к неравномерному перемешиванию пластид перед делением клетки и неравномерному их распределению в дочерних клетках. Кроме того, количество пластид в клетках может изменяться значительно, возрастая и уменьшаясь в сотни раз в зависимости от этапа развития той или другой ткани.

Факторы внешней среды и эндогенные факторы также могут оказывать влияние на эти процессы. К числу эндогенных факторов относится, в первую очередь, действие ядерных генов. Измерить относительную скорость репликации мутантных и нормальных пластид непосредственно достаточно сложно. Однако можно использовать косвенные методы. Так, например, соотношение площадей мутантной и нормальной ткани (белой и зеленой соответственно) у потомков от скрещивания белых побегов с зелеными будет характеризовать относительную скорость размножения белых и зеленых пластид. Если при действии какого-то фактора это соотношение будет значительно и достоверно сдвинуто в ту или другую сторону, то это будет свидетельствовать о том, что данный фактор способствует репликации тех или иных пластид.

Такие опыты были проведены на герани (Pelargonium) Р.А.Е. Тилней-Бассетом в 70-е годы. Поскольку герань относится к растениям с двуродительским типом наследования пластид, использование белых и зеленых побегов пестролистных растений позволяло провести такие эксперименты. Оказалось, что пропорции между площадями белой и зеленой ткани не зависят от того, белый или зеленый побег используется в качестве материнской формы, но зависят от того, на каком ядерном генотипе происходит скрещивание. Т.е. генотип одних сортов увеличивал пропорции материнских хлоропластов, а других - наоборот - отцовских.

Таким образом, было показано, что скорость репликации тех или иных хлоропластов может зависеть от ядерных генов - одни гены способствуют более быстрой репликации материнских пластид, другие - отцовских. В результате пропорции между двумя плазматипами могут сдвигаться.

Среди разнообразных мутаций дефектов фотосинтеза описаны еще и такие, у которых дефектные пластиды наследуются как пластидные мутации, проявляя все характерные критерии нехромосомного наследования, а фактор, вызывающий эти мутации, наследуется как ядерный ген. Ядерные гены, являющиеся причиной возникновения пластидных мутаций, были названы пластидными мутаторами и обозначены как рm (от английского plastid mutator).

Наличие таких генов довольно распространено среди высших растений. Впервые они были описаны М. Роудсом у кукурузы еще в 30-х годах XX века, а впоследствии были открыты и на других растениях (ослинник, арабидопсис, петуния, рис и др.). У всех описанных видов ядерный ген мутатор наследуется как простой менделевский рецессивный ген. Рецессивные гомозиготы pmpm обычно выглядят как пестролистные растения. При их самоопылении или опылении их зелеными или пестрыми растениями возникает три типа потомков: чисто белые (они погибают на ранних стадиях развития, как неспособные к фотосинтезу), пестрые и чисто зеленые. В дальнейшем путем скрещивания можно изменять генотип пестрых растений на доминантные гомозиготы РMРМ или гетерозиготы РМрm, при этом пестролистность и способность давать три типа потомков у них сохраняется независимо от ядерного генотипа.

С другой стороны, скрещивая два зеленых растения, одно из которых гетерозиготно по генам РМрm, а другое гомозиготно pmpm, мы получаем 1/2 гетерозигот, все из которых являются зелеными и 1/2 гомозигот по рецессивным генам рm, которые могут быть как чисто зелеными, так чисто белыми, так и пестролистными (мозаичными). Такой ситуации не может быть при чисто пластидном наследовании пестролистности. Таким образом, фактор, вызывающий пластидные мутации, наследуется как менделевский рецессив, и, следовательно, расположен в ядре клетки, а сами пластидные мутации наследуются как нехромосомные гены, и скорее всего, расположены в пластидах. Как действуют гены рm, каким образом они вызывают мутации в пластидах?

Наиболее логичным предположением, которое было выдвинуто после открытия в пластидах собственной ДНК, явилось предположение о том, что ген РМ является геном пластидной ДНК полимеразы. Этот ген находится в ядре клетки, а его продукт экспортируется в пластиды. Мутантный аллель этого гена в гомозиготном состоянии производит нефункциональную ДНК полимеразу, которая вызывает ошибки при репликации пластидной ДНК, что приводит к дефектам в ДНК пластид, а затем и пластидных белках, ответственных за фотосинтез. Дальнейшие молекулярные исследования в целом подтвердили справедливость данной гипотезы. В действительности, оказалось, что в геноме хлоропластов отсутствует один из генов, кодирующих субъединицу ДНК полимеразы, необходимый для репликации ДНК пластид. Этот ген находится в ядре клетки. Кроме того, исследования пластидной и митохондриальной ДНК пестролистных мутантов показали, что в большинстве случаев гены рm вызывают разнообразные изменения именно пластидной ДНК, хотя есть пример и изменения митохондриального генома у арабидопсиса под действием этого гена. В последнем случае гены рm вызывали необратимые изменения в ДНК митохондрий, а уже изменение функционирования митохондрий приводило к дефектам фотосинтеза хлоропластов.

В целом у высших растений, несмотря на то, что исследования были ограничены главным образом только мутациями хлорофиллдефектности, удалось накопить достаточно обширный материал, позволивший охарактеризовать особенности наследования пластид и пластидных генов и даже предвосхитить некоторые открытия, сделанные впоследствии при изучении молекулярной организации генома пластид.

Одно из важнейших обобщений, которое можно было сделать при изучении формальной генетики пластид у высших растений, заключается в том, что фенотип пластид контролируется как ядерными, так и цитоплазматическими генами. Кроме взаимного контроля над фотосинтезом ядерные гены способны оказывать влияние на трансмиссию пластид в ряду клеточных поколений и половом процессе, влиять на частоту мутаций пластидных генов.

2. Геном пластид

В 1961 году X. Рис и В. Плаут обнаружили, что участок хлоропласта в одноклеточной водоросли хламидомонады окрашивается положительно по Фельгену. При электронно-микроскопическом исследовании выяснилось, что он электронно-прозрачный и содержит тонкую сеть фибрилл толщиной 25-30 А. При обработке ДНК-азой фибриллы исчезали. Это свидетельствовало о присутствии ДНК в пластидах.

Естественно, что эта основополагающая работа вызвала большой интерес и стимулировала соответствующие исследования, вследствие которых ДНК-содержащие фибриллы были обнаружены в разных типах хлоропластов, а затем и в митохондриях. Было показано наличие ДНК в хлоропластах бурых, красных водорослей, динофлагеллят, высших и низших растений. Сегодня уже молекулы ДНК выявлены более чем у тысячи видов. Затем было продемонстрировано наличие ДНК и у других типов пластид - амилопластов и хромопластов. При этом использовали разнообразные методы: радиоавтография, цитохимия, электронная микроскопия, ферментативный гидролиз и т.д.

ДНК в хлоропластах располагается в электронно-прозрачных участках. В развитых хлоропластах обычно имеется несколько таких участков (от 3-х до 8-ми), обычно они располагаются вблизи тилакоидов и часто даже ограничены тилакоидными мембранами. В лейкопластах и хромопластах эти участки более расплывчаты. В пропластидах чаще всего один такой участок и часто небольшой.

Интересно, что у динофлагеллят участок хлоропласта, содержащий ДНК, очень большой - 1,5 нм, а в покоящихся цистах он даже окружен двойной мембраной, образованной из ламелл хлоропластов и содержит маленькое концентрическое тельце, похожее на ядрышко. И это ядрышко имеет скопления рибосом.

ДНК-содержащие участки пластид похожи на нуклеоиды бактерий и не похожи на ядерный хроматин. По крайней мере, если судить по внешнему виду. В этих участках происходит синтез ДНК, РНК, рибосом.

Существует определенная связь между местом образования крахмального зерна, липидными включениями и нуклеоидом хлоропластов. Обычно синтез крахмального зерна и липидных включений происходит как раз в том месте, где имеется ДНК-содержащий участок.

У некоторых водорослей вместо нескольких нуклеоидов наблюдается длинная трубчатая структура в виде баранки, располагающаяся по периферии всего хлоропласта. Таким образом, все нуклеоиды соединены в кольцо.

У высших растений нуклеоиды чаще сферичны или линзообразны. Под действием света начинается дифференцировка пластид и вместе с этой дифференцировкой размер таких нуклеоидов увеличивается в несколько раз и содержание ДНК в них повышается. Деление нуклеоида хлоропласта протекает синхронно с делением самого хлоропласта. Нуклеоид, как и сама пластида, вытягивается, приобретает гантелевидную форму и намечается место перешнуровки. Синтез ДНК непосредственно предшествует этому процессу.

Интересно отметить, что репликация пластидной ДНК не синхронизирована с репликацией ядерной ДНК. Репликация пластидной ДНК может быть индуцирована светом.

Так же, как и у бактерий, молекулы ДНК связаны с мембраной хлоропласта. ДНК при помощи специального белка присоединена к мембране тилакоида или к окружающей мембране хлоропласта.

Когда хлоропласты разрушают при помощи осмотического шока, фракция ДНК всегда оказывается связанной с мембранами хлоропласта и освободить ее можно, только разрушив эти мембраны детергентами или обработав проназой. Вероятнее всего, что прикрепление ДНК к мембране позволяет распределять молекулы ДНК вдоль всего хлоропласта по мере роста и развития этих мембран. По аналогии с бактериальной клеткой предполагается, что мембранное прикрепление ДНК служит для сегрегации реплицирующихся молекул, в этом же месте мембраны находятся ферменты, участвующие в репликации ДНК.

Хлоропласты, как высших растений, так и водорослей содержат ДНК столько же, сколько и бактериальная клетка: 10-14 - 10-15 мг ДНК на 1 хлоропласт. В ядре клетки растений, для сравнения, ДНК на четыре порядка больше, т.е. в ядре ДНК больше в десять тысяч раз. Но поскольку ядро в клетке только одно, а хлоропластов может быть много, то общее соотношение ядерной ДНК к пластидной примерно 100 к 1. Это соотношение зависит от стадий жизненного цикла растений, т.к. в диплоидных клетках количество ядерной ДНК неизменно, а количество хлоропластной может изменяться. При старении клеток количество ДНК в пластидах может уменьшаться. Иногда находят пластиды вообще без ДНК. При переходе хлоропластов в хромопласты при осеннем старении листьев наблюдается сокращение количества ДНК на пластиду. Как функционируют пластиды, потерявшие ДНК при дифференцировке, неизвестно. Возможно, они используют генные продукты тех пластид, которые имеют ДНК.

Число копий молекул ДНК на пластиду колеблется. У одноклеточной водоросли хламидомонады, например, 24 - 26 копий в генеративной и вдвое больше в вегетативной клетке. У эвглены приходится около 30 копий на пластиду, а на клетку около 400 копий хлоропластной ДНК. В клетках мезофилла высших растений может содержаться от 1900 до 50 000 хпДНК (табл. 3).

Таблица 3. Максимальные количества хпДНК в листьях растений

Растение	% от тотальной ДНК	Число геномов на клетку	Число геномов на пластиду
Горох	12	10000	270
Соя	17	13000	-
Шпинат	23	13000	200
Свекла	11	1900	100
Картофель	8	3000	22*
Пшеница	17	50000	900

* Поскольку у картофеля анализировали только зрелые листья, не исключено, что данный показатель у молодых листьев намного больше чем 22.

На вопрос, каков биологический смысл такого значительного количества копий хлоропластной ДНК, можно привести следующие соображения:

1. Для обеспечения репликации пластид.

Для обеспечения консерватизма генов, обеспечивающих фотосинтез.

Для быстрого запуска процесса фотосинтеза и поддержания его эффективности.

Хлоропластная ДНК и ядерная ДНК отличаются по своим физико-химическим параметрам даже у одного и того же вида.

Различия по физико-химическим свойствам ДНК свидетельствуют о различиях в их нуклеотидном составе. Определить нуклеотидный состав ДНК можно, как известно, несколькими способами. Например, прямым биохимическим анализом или определением плотности ДНК в градиенте хлористого цезия при центрифугировании или по температуре плавления. Чем выше плотность или температура плавления, тем выше процентное содержание в молекуле ДНК Г+Ц пар.

Сравнивая плавучую плотность или температуру плавления ядерной и хлоропластной ДНК, можно заключить, что процент Г+Ц пар ДНК пластид может отличаться от ядерной в одну сторону у одних видов, в другую - у других, а у третьих вообще не обнаруживают различий между хлоропластной и ядерной ДНК по этому показателю. Это, возможно, свидетельствует о том, что эволюция хлоропластной и ядерной ДНК протекает относительно независимо друг от друга. У большинства высших растений содержание Г+Ц пар находится в пределах 37-39%, однако у мха печеночника и водоросли эвглены оно значительно ниже - 32% и 25%, соответственно. В разных участках молекулы пластидной ДНК содержание Г+Ц пар также может быть различным и значительно колебаться (от 23% до 44%), что свидетельствует о внутренней гетерогенности молекулы.

Ранее считали, что хлоропластная ДНК не содержит метилированных оснований, в частности 5-метилцитозина, который содержится в митохондриальной ДНК. Сейчас известно, как минимум, два случая наличия этого редкого основания. А в хромопластной ДНК зрелых томатов, например, до 1/3 всего цитозина замещено на 5-метилцитозин. Вероятно, это механизм блокировки фотосинтеза в плодах, ускоряющий созревание плодов и семян.

При анализе кривых плавления ДНК хлоропластов было показано, что у большинства растений хлоропластная ДНК плавится как сравнительно гомогенная молекула, не содержащая различных по нуклеотидному составу участков. У некоторых водорослей определенная гетерогенность молекул ДНК хлоропластов все же обнаруживается.

Геном пластид, как водорослей, так и наземных растений представлен, как правило, кольцевой двунитевой молекулой ДНК, содержащей от 70 до 400 тысяч пар оснований (рис. 9). Хотя в основном геном пластид высших растений представлен 120-217 тысяч пар оснований.

Рис. 9. Электронная микрофотография кольцевой молекулы хпДНК подсолнечника (инбредная линия 3629).

Пластидные ДНК таких размеров способны потенциально кодировать (информационная емкость пластома) от 70 до 150 различных полипептидов. Так как хлоропласты содержат несколько сот различных белков, то большинство белков этих органелл кодируется не пластидной ДНК, а ядерной.

Изучение хлоропластного генома различных видов растений показало, что структура хлоропластного генома весьма консервативна, а генетический материал организован скорее по прокариотическому, чем эукариотическому типу.

ДНК хлоропластов не содержит большого количества высокоповторяющихся нуклеотидных последовательностей, что отличает ее от ДНК ядра. Таким образом, хлоропластный геном высоко конденсирован по сравнению с геномом ядра эукариот. В самом крайнем случае в хлоропластном геноме риса содержится не более 32% некодирующих последовательностей, а в хлоропластном геноме других видов высших растений и того меньше, в то время как в ядерной ДНК высших растений более 90% составляют некодирующие последовательности.

ДНК хлоропластов содержит рибонуклеотидные вставки. Их длина составляет от 10 до 20 нуклеотидов. У гороха, например, имеется 19 таких вставок. С помощью ДНК-ДНК гибридизации установлено, что даже у неродственных видов растений, по крайней мере, 30 % последовательности хлоропластной ДНК гомологичны. Даже геном хлоропластов эвглены, который имеет целый ряд уникальных характеристик, содержит почти полный набор тех же самых генов, что и большинство наземных растений. Консервативные последовательности распределены по молекуле вместе с дивергирующими, что, вероятно, отражает наличие кодирующих и некодирующих последовательностей. Именно кодирующие последовательности чаще всего и являются наиболее консервативными.

Обнаружено, что хлоропластная ДНК из листьев шпината существует по крайней мере в виде 4-х определенных форм с молекулярной массой моно-, ди-, три- и тетрамера.

Однако в какой бы форме не обнаруживали хлоропластную ДНК, основу ее организации составляют длинные кольцевые молекулы, содержащие всю полноту генетической информации пластид.

Хлоропластная ДНК содержит инвертированный (обратный) повтор (10-76 т.п.н.), несущий гены рРНК. Этот повтор сохраняется на протяжении более чем 400000000-летней эволюции растений. Некоторые виды бобовых Pisum sativum, Vicia faba имеют только одну его копию, а у других - Geranium - он представлен в 3-х копиях.

Рис. 10. Генетическая карта хлоропластной ДНК табака.



Геном состоит из большого - 8686 п.н. и малого -18571 п.н. однокопийных районов и двух инвертированных повторов размером 25431 п.н. каждый. Гены, изображенные внутри круга, транскрибируются по часовой стрелке, гены, изображенные снаружи - против.

В хлоропластной ДНК пшеницы, риса и клевера было обнаружено семейство диспергированных повторов. Причем, если для хпДНК злаковых описаны короткие повторы, то клевер Trifolium subterraneum является уникальным среди известных растений, размеры его повторов достигают сотен пар нуклеотидов. Интересно, что хлоропластный геном этого вида, имеющий продолжительные повторяющиеся последовательности, характеризуется и наличием многочисленных структурных перестроек.

Однако у подавляющего большинства видов высших растений хлоропластный геном несет два инвертированных повтора, между которыми расположены два однокопийных района - большой и малый (рис. 10).

В хлоропластных геномах некоторых видов обнаружены так называемые "горячие точки" - места, где перестройки последовательности ДНК происходят наиболее часто. В этих районах находят инверсии, инсерции и делеции. Если точковые мутации, чаще всего, существенно не влияют на функционирование хлоропластов, то протяженные инсерции/делеции не только влияют, но и служат, в определенной мере, дополнительным фактором видообразования. Так, при исследовании 3-х видов табака было выявлено, что вид Nicotiana acuminata имеет пластидный геном размером 171 т.п.н., другой вид - N. tabacum пластидный геном размером 160,5 т.п.н., а третий вид N. knightiana пластидный геном размеров 160,0 т.п.н. Исследования показали, что делеция 11 т.п.н. пластидного генома N. acuminata дала начало пластидному геному N. tabacum, а вторая делеция 0,5 т.п.н. у N. tabacum привела к образованию пластидного генома N. knightiana.

Было установлено, что у табака мутации происходят, в основном, в большой однокопийной области, граничащей с правым сегментом инвертированного повтора, частота же мутаций внутри повтора, как правило, невысока. Однако у Oenothera именно там обнаруживаются структурные изменения. Но это скорее исключение, чем правило.

Сходные результаты были получены и при изучении хлоропластных геномов у видов пшениц Triticum и Aegilops. В этом случае удалось показать, что делеции в геноме одного из видов Aegilops crassa привели к возникновению хлоропластных геномов двух других видов: Ае. squarrosa и Triticum aestivum. Последний вид является важнейшим хлебным злаком - мягкой пшеницей.

К середине 80-х годов целый ряд хлоропластных нуклеотидных последовательностей был идентифицирован и секвенирован. В 1986 году впервые у двух видов растений табака и маршанции японские исследователи полностью определили всю последовательность хлоропластной ДНК. В настоящее время хлоропластная ДНК полностью секвенирована у несколько десятков видов видов. Данные о полном сиквенсе геномов пластид у разных видов растений демонстрируют большое сходство их общей организации.

пластида генетика органелла мутантный

Рис. 11. Размеры и расположение основных областей хлоропластных ДНК у разных видов

R - инвертированный повтор с генами рибосомальной РНК; LSC - большая однокопийная область; SSC - малая однокопийная область.



Больше всего различий находят в размерах инвертированных повторов. У сосны черной они крайне редуцированы и составляют всего 495 пар нуклеотидов, тогда как у покрытосеменных они достигают размера от 12 т.п.о. до 25 т.п.о., что даже больше, чем размер малого однокопийного района. Инвертированные повторы у некоторых видов (эвглена, горох, бобы, люцерна) вообще отсутствуют, а у водоросли Porfira purpurea вместо инвертированного повтора присутствует прямой повтор.

Соотношение размеров большого и малого однокопийных районов также весьма изменчиво: у кукурузы, например, они различаются почти в 7 раз, тогда как у сосны черной только на 20%.

Сам по себе полный сиквенс еще не позволяет выявить гены, кодируемые ДНК пластид. До того как был сделан полный сиквенс пластидной ДНК, были построены физические карты при помощи разрезания молекулы ДНК рестриктазами и определения последовательности расположения рестриктных фрагментов. Затем на физической карте было определено положение генов, кодирующих молекулы рибосомальных и транспортных РНК пластид. Это было сделано при помощи использования меченых молекул РНК и их гибридизации с определенными рестриктными фрагментами ДНК.

Для локализации хлоропластных генов, кодирующих белки пластид, использовали определение порядка аминокислот в молекуле белка, затем синтезировали искусственный полинуклеотид, который можно использовать как зонд в гибридизации для определения участка молекулы ДНК, которая кодирует этот белок. Поскольку большинство генов, кодирующих белки пластид, достаточно консервативны, то, определив положение гена у одного вида, можно затем установить его и у другого вида. Затем, накопив достаточно большую информацию о разных генах, можно использовать компьютерную базу данных о тех или иных генетических последовательностях хпДНК и анализировать данные по полному сиквенсу ДНК.

Данные о геноме хлоропластов были получены благодаря огромному количеству самых разных экспериментов. Согласно этим данным хпДНК содержит две основных группы генов. Одна из них - это так называемые "генетические" гены, а вторая - "фотосинтетические" гены.

К первой группе относятся гены, связанные с работой генетического и белоксинтезирующего аппарата пластид.

Гены, кодирующие последовательности 4-х различных хлоропластных рибосомальных РНК.

Гены, кодирующие последовательности 30-31 хлоропластной транспортной РНК.

Гены 19 белков хлоропластных рибосом.

Полимеразные гены.

5. Гены, связанные с регуляцией экспрессии генома пластид: факторы инициации, транскрипции, элонгации.

Ко второй группе фотосинтетических генов относятся:

1. Ген большой субъединицы рибулезобифосфаткарбоксилазы/ оксигеназы.

Гены белков фотосистемы I и II.

Гены комплексов цитохромов b/f.

Гены АТФ-синтетазы.

Еще одна, третья группа генов, обнаруженная в геноме пластид, - это нуклеотидные последовательности, гомологичные последовательностям NADH-дегидрогеназе митохондрий. Показано, что эта группа генов кодирует 11 белков, входящих в состав дыхательной цепи митохондрий. Выявлено, что эти гены транскрибируются. Однако до сих пор не доказано, что в пластидах имеется полноценная дыхательная цепь.

Кроме того, в геноме пластид обнаружено около 30 неидентифици-рованных, открытых рамок считывания размером от 31 до 2136 п.н. Вероятно, это неидентифицированные гены хлоропластного генома.

Многие из кодируемых хлоропластным геномом полипептидов входят в состав сложных комплексов, в которых, по меньшей мере, один из компонентов кодируется ядром. Так, большая субъединица рубулозобифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (основного белка фотосинтеза) кодируется хлоропластным геномом, а малая - ядерным. Из восьми субъединиц АТФ-азного комплекса геномом хлоропластов кодирует только 5, а три - ядерным геномом. Из 30 полипептидов, которые идентифицированы как белки фотосистемы I и II и цитохромного комплекса, хпДНК кодирует 13, а ядерная - 6. Какая ДНК кодирует еще 21 белок, пока неизвестно.

Способность хлоропластного генома кодировать, только небольшую часть необходимых белков связана с переносом части функций в ядерный геном и установлением с ним интегративных связей.