Властивості Са2+-помпи мембран ацинарних секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

удк 612.014.42:612.31:591.431.2

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Властивості Са²⁺-помпи мембран ацинарних секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Вац Юліана Олександрівна

Львів - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка Міністерства освіти і науки Украйни.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник,

Тугай Василь Андрійович,

провідний науковий співробітник

Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України.

кандидат біологічних наук,

Давидовська Тамара Леонідівна,

доцент кафедри біофізики

Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, м. Київ. Захист відбудеться “17” червня 2004 року о 15⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 Львівського національного університету імені Івана Франка (79005, м. Львів, вул.. Грушевського, 4, біологічний факультет, ауд. № 333).

Поштова адреса: 79005, м. Львів, вул.. Грушевського, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17. Автореферат розісланий “14” травня 2004 року.

Виконуючий обов'язки вченого секретаря

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Манько В.В.

Загальна характеристика роботи

кальцій слинний залоза мембрана

Актуальність проблеми. Дослідження ролі Са²⁺-АТФаз у Са²⁺-залежній регуляції функціонування секреторних клітин є особливо актуальним з огляду на те, що у екзокринних клітинах за рахунок процесів внутрішньоклітинної Ca²⁺-сигналізації забезпечується спряження між стимулом і секрецією. Секреторні клітини характеризуються унікальною полярною будовою і завдяки цьому специфічним просторово-часовим перебігом внутрішньоклітинних процесів, зокрема Са²⁺-сигналізації та екзоцитозу (Gerasimenko et al., 1996, Petersen et al., 1999). Викликане вивільненням Са²⁺ з ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) підвищення його концентрації у цитозолі приводить до активації Са²⁺-помпи плазматичної мембрани (ПМ) (Tepikin et al., 1992). При спустошенні Са²⁺-депо після стимуляції клітин Са²⁺ входить через депо-керовані канали базальної мембрани і закачується Са²⁺-помпою в ЕПР. Таким чином, Са²⁺-помпи ПМ та ЕПР відіграють важливу роль у підтриманні внутрішньоклітинного Са²⁺-гомеостазу секреторних клітин, що було доведено з використанням специфічних блокаторів цих систем на панкреацитах (Petersen & Cancela, 2000), клітинах слинних залоз ссавців (Liu et al., 1998) та личинок хірономід (Федірко, Клевець, 2000), гепатоцитах (Zhuang et al., 2002). З фізіологічної точки зору Са²⁺-помпи - це системи енергозалежного транспорту Са²⁺, проте слід наголосити, що їх робота забезпечується ферментами - Са²⁺-АТФазами, що здійснюють спряження гідролізу АТФ та транспорту Са²⁺ через мембрану. Як і кожен фермент, вона характеризується кінетичними та каталітичними властивостями, з'ясування яких є необхідним для розуміння як закономірностей функціонування Са²⁺-помп за фізіологічних умов, так і механізму порушення їх функцій при патологіях. Враховуючи це, актуальною проблемою сучасної фізіології клітини є комплексне вивчення функціонування Са²⁺-помп та їх ролі у регуляції функціональних відповідей клітин (з використанням фізіологічних методів на цілісних клітинах та їх функціональних угрупуваннях - ацинусах) і ферментативної активності Са²⁺-АТФаз (з використанням біохімічних методів на мембранних везикулах) на одному об'єкті, що дасть змогу сформувати цілісне уявлення про роль Са²⁺-помп у Са²⁺-залежній регуляції функцій ацинарних клітин. У зв'язку з цим не підлягає сумніву актуальність та доцільність ідентифікації, вивчення властивостей та особливостей модифікації функціонування цих систем секреторних клітин та їх ролі у регуляції функціональних відповідей клітин слинних залоз, чому і присвячена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідних тем БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100 O 001452, БЛ-114Б “Механізми Са²⁺- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872, а також за сприяння Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні властивостей Са²⁺-помп мембран секреторних клітин слинної залози на основі аналізу змін внутрішньоклітинної концентрації іонізованого Са²⁺ ([Са²⁺]_і), сумарного вмісту кальцію у ацинарних клітинах, кінетичних та каталітичних характеристик Са²⁺-АТФаз мембранних везикул. Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні завдання:

З'ясувати роль Са²⁺-помп у Са²⁺-залежній регуляції функціонування клітин підщелепної слинної залози щурів та визначити питомі активності Са²⁺-АТФаз у фракції мембранних везикул.

Провести аналіз кінетичних та каталітичних властивостей Cа²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР клітин слинної залози щурів, як основні типологічні показники, що визначають функціональну роль Са²⁺-помп.

Дослідити роль іоногенних груп залишків амінокислот у функціонуванні Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР клітин слинної залози щурів.

З'ясувати внутрішньоклітинні Са²⁺-залежні механізми порушення функціонування секреторних клітин слинних залоз за умов ксеростомії.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі виявлених змін сумарного вмісту та [Са²⁺]_і під впливом специфічних блокаторів Са²⁺-помп вперше доведено роль Са²⁺-помп в здійсненні Са²⁺-залежної регуляції функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів. Визначено кінетичні та каталітичні характеристики Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР ацинарних клітин, механізми модуляції їх функціонування та роль окремих іоногенних груп у регуляції їх роботи Показано неконкуретний механізм інгібування сульфгідрильними реагентами Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР, що супроводжується зниженням спорідненості їх центрів до АТФ. На основі значень рК та інгібіторного аналізу постулюється важлива роль імідазольної групи гістидину, SH-групи цистеїну, СОО^-_груп глутамінової та аспарагінової кислот у функціонуванні Са²⁺-АТФаз. Вперше показано, що за умов ксеростомії відбувається пригнічення функціонування Са²⁺-АТФаз, що і є однією із причин розвитку порушень слиновиділення та травлення у ротовій порожнині у пацієнтів, що страждають на ксеростомію.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати можуть бути теоретичною основою для подальших досліджень Са²⁺-гомеостазу в секреторних клітинах, причин розвитку патологій травних залоз та розробки методів їхньої фармакологічної корекції. Вони використовуються при читанні загального курсу з фізіології людини і тварин, біофізики та спецкурсу із фізіології травлення у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором разом з доцентом кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка к.б.н. Федірко Н.В. та науковим керівником розроблено методики одержання фракції мембранних везикул клітин слинної залози, визначення питомих активностей Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР секреторних клітин та проведено планування досліджень. Автором самостійно здійснено проведення переважної більшості експериментів, поданих у даній роботі, їх статистичну обробку, аналіз, узагальнення, висновки. Деякі експерименти було проведено спільно з іншими дослідниками з приблизно однаковим внеском: дослідження внутрішньоклітинної Са²⁺-сигналізації в ацинарних клітинах слинних залоз за умов модифікації роботи Са²⁺-помп - з к.б.н. Федірко Н.В. та старшим науковим співробітником Інституту фізіології імені О.О. Богомольця НАН України к.б.н. Войтенко Н.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації та основні положення були представлені на: наукових семінарах кафедри фізіології людини і тварин (2000-2003 рр.), міжнародній школі-семінарі “Мембрани і сигнали” (Київ, 2000 р.), З'їзді Британського фізіологічного товариства (Ліверпуль, 2001 р.), 23^му Міжнародному Конгресі фізіологічних наук (Крайсчерч, 2001 р.), 4^тій Конференції Чеського Нейрофізіологічного товариства (Прага, 2001 р.), Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинна сигналізація в рослинних та тваринних системах” (Київ, 2001 р.), 16^му З`їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002 р.), III з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002 р.), Міжнародній конференції пам'яті проф. Шостаковської І.В. (Львів, 2002 р.), 47^му з'їзді Американського Біофізичного товариства (Сан-Антоніо, 2003 р.), 3^му Конгресі FEPS (Ніца, 2003 р.), щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2000-2002 рр.) та міжкафедральному семінарі біологічного факультету у жовтні 2003 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 6 статей у фахових наукових журналах та 9 тез доповідей у матеріалах міжнародних та українських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 187 сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: „Вступ”, „Огляд літератури”, „Методи досліджень”, „Результати досліджень”, „Обговорення результатів досліджень”, „Висновки” та „Список використаних джерел”, який містить 349 посилань. Робота ілюстрована - 49 рисунками та 4 таблицями.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

Вимірювання сумарного вмісту кальцію. Дослідження ролі Са²⁺-помп у підтриманні Са²⁺-гомеостазу та функціонуванні секреторних клітин проводили на ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів. Клітини ізолювали з використанням колагенази (тип І, активність - 270 од/мг). Зовнішньоклітинний розчин, який використовували для інкубації клітин містив (в ммоль/л): NaCl - 140,0; KCl - 4,7; CaCl₂ - 1,3; MgCl₂ - 1,0; HEPES - 10; глюкоза - 10,0 (рН =7.4). Сумарний вміст кальцію у клітинах визначали після відмивання зовнішньоклітинного розчину та гомогенізації з використанням арсеназо ІІІ і виражали у нмолях в перерахунку на 1 мкг білка. Секрецію загального білка виражали у процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті та супернатанті, який визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951).

Вимірювання [Ca²⁺]_і в ацинарних клітинах. [Ca²⁺]_і в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів реєстрували з використанням флуоресцентного барвника фура-2/АМ. Флуоресцентний сигнал реєстрували на довжинах хвиль 360 та 390 нм. Реєструючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати [Ca²⁺]_і у клітинах за формулою, яка була запропонована Грінкевичем і співавт. у 1985 р. (Grynkiewicz et al., 1985):

[Ca²⁺]_i = K_d b (R - R_min)/(R_max - R).

Значення констант, що входять у рівняння, одержані внаслідок калібрування: R_min=0,9, R_max=19, b=26. Параметр K_d, взятий з роботи Грінкевича і співавт. (Grynkiewicz et al., 1985), становив 224 нмоль/л.

Одержання фракції мембранних везикул. Гетерогенну фракцію мембранних везикул підщелепної слинної залози щурів одержували методом диференційного центрифугування (Kribben et al., 1983; Thiyagarajah et al., 1986). Залозу гомогенізували у буферному розчині, який містив в ммоль/л: сахароза - 250,0; ЕДТА - 1,0; трис-Сl - 10,0 (рН = 7.1, t = 4єС); оуабаїн - 1,0; NaN₃ - 1,0. Супернатант, збагачений фрагментами ПМ та ЕПР, одержаний після серії центрифугувань (10 хв при 1600 g та 10 хв при 10000 g), зберігали при t = -20⁰С. Топологію мембранних фрагментів визначали після їх обробки розчином дигітоніну (0,1 %). Електронно-мікроскопічно показано, що фракція мембранних фрагментів підщелепної слинної залози представлена замкнутими в площині везикулами діаметром 0,5 ± 0,04 мкм (n=89).

Визначення активності Са²⁺-АТФаз. Аліквоти мембранних везикул переносили у розчин, близький за складом до внутрішньоклітинного (РБВ), який містив в ммоль/л: NaCl - 50,0; KCl - 100,0; трис-Сl - 20,0 (рН = 7.4, t = 37єС); MgCl₂ - 3,0; CaCl₂ - 0,01. АТФ-гідролазну реакцію ініціювали додаванням 3 ммоль/л АТФ. Проби інкубували 1,5 хв (t = 37єС) і реакцію зупиняли додаванням 200 мкл 20 % ТХО після чого вміст пробірок відцентрифуговували (10 хв при 1600 g). В одержаному безбілковому супернатанті фотоелектроколориметрично визначали вміст Р_і за модифікованим методом Фіске-Суббароу (Hurley et al., 1984). Питому активність АТФазних систем виражали у мкмоль Р_і/год·мг білка. При цьому враховували вміст ендогенного фосфору та Р_і, вивільненого в процесі неферментативного гідролізу АТФ. Вміст білка мембранного препарату визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951). Активність Са²⁺-АТФаз розраховували як різницю між активністю АТФазних систем в Са²⁺-вмістному та безкальцієвому середовищах. Сумарну Са²⁺-АТФазну активність розділяли на складові: тапсигаргін-нечутливу Са²⁺-АТФазу ПМ та тапсигаргін-чутливу Са²⁺-АТФазу ЕПР.

Метод отримання експериментального діабету. Діабет викликали внутрішньоочеревинною ін'єкцією стрептозотоцину, розчиненого в 0,9 % розчині NaCl, з розрахунку 80 мг на 1 кг маси тіла тварини. Стрептозотоцин-ін'єктовані та контрольні тварини того ж віку утримували на однаковій дієті протягом всього періоду розвитку захворювання. Тварин використовували в експерименті через 3-5 тижнів після ін'єкції стрептозотоцину. Концентрація глюкози в плазмі крові здорових тварин знаходилася в межах 5 - 9 ммоль/л, у хворих на стрептозотоцин-індукований діабет - 14 - 28 ммоль/л.

Оригінальні записи [Са²⁺]_і, опрацьовували за допомогою програми Tida версії 5.0 (Batelle, Germany). Концентрацію вільного Са²⁺ в інкубаційних середовищах розраховували за допомогою програми “Win MAXC v2.10, Chris Patton” (Stanford University, USA). Для порівняння і визначення достовірності відмінностей між одержаними даними, використовували t-тест Стьюдента (Деркач, 1977). Опрацювання результатів проводили за допомогою персонального комп'ютера ІВМ РС АТ. Уявні константи, що характеризують спорідненість Са²⁺-АТФаз до реагентів (К_АТФ, К_Са, К_Mg) та ефекторів (К_і для інгібіторів) розраховували, виходячи із ліанеризованих рівнянь Хілла. Значення коефіцієнтів кореляції (r) лінеаризованих графіків становили 0,95-0,99.

Результати досліджень

Функціональне підтвердження ролі Са²⁺-помп в здійсненні Са²⁺-залежної регуляції функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів

Нами показано, що внаслідок додавання в середовище інкубації ацинарних клітин еозину Y (10 мкмоль/л) сумарний вміст кальцію достовірно зростав на 41 ± 7 % (р<0,05, n=6). Додавання ж до середовища тапсигаргіну та рутенієвого червоного не викликало достовірних змін показника. Отже, очевидно, що у підтриманні низької [Cа²⁺]_і у досліджуваних клітинах відіграє узгоджена робота Са²⁺-помп ПМ та ЕПР. Підтвердженням цього є зареєстровані нами [Cа²⁺]_і-транзиєнти, які виникали при аплікації (15 с) блокаторів Са²⁺-помп ПМ та ЕПР: еозину Y (5 мкмоль/л) - з амплітудою 74 ± 8 нмоль/л (р<0,05, n=6), циклопіазонієвої кислоти (5 мкмоль/л) - 45 ± 6 нмоль/л (р<0,05, n=6), тапсигаргіну - 43 ± 7 нмоль/л (р<0,05, n=6).

Внаслідок інкубації ацинарних клітин у присутності 10 мкмоль/л ніфедипіну сумарний вміст у них кальцію достовірно зменшувався на 28 ± 4 % (p<0,05, n=10). Сумісна дія ніфедипіну та еозину Y не викликала достовірних змін показника. Це свідчить, на нашу думку, про взаємодію між надходженням Са²⁺ в стані спокою Са²⁺-каналами та викачуванням його з цитозолю Са²⁺-помпами.

2. Кінетичні та каталітичні властивості Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів

Активність сумарної Са²⁺-АТФази мембран ацинарних клітин становила 7,4 ± 0,1 мкмоль Р_і/год на 1 мг білка, тапсигаргін-нечутливої її складової - 4,6 ± 0,1 мкмоль P_i/год на 1 мг білка та тапсигаргін-чутливої - 1,1 ± 0,1 мкмоль P_i/год на 1 мг білка (n=89). Отже, мембранні везикули секреторних клітин підщелепної слинної залози здійснюють Са²⁺-залежний гідроліз АТФ, який каталізується Са²⁺-АТФазами ПМ та ЕПР. При дослідженні топології мембранних фрагментів показано їх переважну inside-out орієнтацію, оскільки після їх обробки дигітоніном не спостерігалося змін активності Mg²⁺-, та Na⁺,K⁺-АТФаз, які, як відомо, тестують цитоплазматичний бік ПМ (Невилл, 1979; Daniel, 1985).

Шляхом лінеаризації кривої залежності активності сумарної Са²⁺-АТФази мембрани ацинарних клітин від часу інкубації розраховано величини початкової швидкості (V₀), максимальної кількості продукту реакції (Р_max) та характеристичного часу реакції Ca²⁺-залежного гідролізу АТФ (ф). Виявилось, що реакція Ca²⁺-залежного гідролізу АТФ, що каталізується Са²⁺-АТФазами мембран секреторних клітин відповідає за кінетикою реакції першого порядку. Нами виявлено двофазний характер залежності активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР клітин слинних залоз від концентрації АТФ. Шляхом лінеаризації одержаних експериментальних кривих в координатах Хілла ми показали наявність високо- та низькоафінних центрів зв'язування АТФ, які відрізняються за своїми каталітичними властивостями. Показано однакову спорідненість обох Са²⁺-АТФаз до субстрату ферментативної реакції (на основі подібності їх констант Міхаеліса (К_АТФ) в обох центрах). Встановлено, що високоафінний центр Са²⁺-АТФази ПМ зв'язує АТФ з негативною кооперативністю, а Са²⁺-АТФази ЕПР - з позитивною. Виявилось, що коефіцієнти Хілла (n_н) низькоафінних центрів обох Са²⁺-АТФаз є значно вищі за одиницю.

Залежність активності Са²⁺-АТФз мембран клітин слинних залоз від [Са²⁺]_і також є двофазною. Са²⁺-АТФаза ПМ є більш чутливою до Са²⁺ у високоафінному центрі зв'язування, ніж у Са²⁺-АТФаза ЕПР. Високі значення n_н високоафінних центрів свідчать про позитивну кооперативність зв'язування Са²⁺ цими ділянками Са²⁺-АТФаз. Залежність активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР від концентрації іонізованого Mg²⁺ ([Mg²⁺]_i) мала виражений дзвоноподібний характер. Розраховані нами К_Mg і n_н для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР становили 3,9 10^-5 моль/л і 0,8 ± 0,1 та 3,8 10^-5 моль/л і 0,6 ± 0,04 (n=6) відповідно.

Спорідненість Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин до двовалентних катіонів та нуклеозидтрифосфатів

Встановлено, що здатність Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР секреторних клітин гідролізувати АТФ в присутності Mg²⁺ та Ме²⁺ (10^-3 моль/л) відповідає таким послідовностям: Са²⁺=Ba²⁺>Sr²⁺ та Са²⁺=Ba²⁺=Sr²⁺ відповідно. Здатність Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР секреторних клітин гідролізувати АТФ в присутності Са²⁺ та Ме²⁺ (10^-3 моль/л) зменшується в таких рядах: Mg²⁺>Mn²⁺>Co²⁺>Cu²⁺ та Mg²⁺=Mn²⁺>Cu²⁺>Co²⁺ відповідно. Са²⁺-АТФази мембран клітин підщелепної слинної залози щурів характеризуються високою спорідненістю до АТФ. Ефективність гідролізу різних нуклеозидтрифосфатів Са²⁺-АТФазами ПМ та ЕПР клітин слинних залоз зменшується відносно АТФ в послідовностях: АТФ (100 %) > ГТФ (46 %) > УТФ (32 %) > ЦТФ (29 %) та АТФ (100 %) > ГТФ (50 %) > ЦТФ (40 %) > УТФ (33 %) відповідно.

4. Модуляція роботи Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз

Вплив блокаторів, температури та зміни рН середовища на Са²⁺-АТФази ПМ та ЕПР ацинарних клітин слинних залоз. З'ясувалось, що еозин Y пригнічує Са²⁺-АТФази ПМ та ЕПР з константою інгібування (К_і) 2,9 ± 0,2 · 10^-5 та 4,7 ± 0,1 · 10^-5 моль/л (n=6), а La³⁺ - з К_і 1,9 ± 0,01 · 10^-3 та 4,5 ± 0,1 · 10^-4 моль/л відповідно. Показано, що для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР оптимуми рН складають 7.3 та 7.0 відповідно. Зниження рН від 7.4 до 6.0 приводило до пригнічення роботи Са²⁺-АТФаз з рК_а - 6.7 та 6.0 для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР відповідно. Залужнення середовища від 7.4 до 8.0 також призводило до зниження активностей Са²⁺-АТФаз (рК_b для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР - 8.44 та 7.22 відповідно). Температурні оптимуми для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР ацинарних клітин становлять 42єС та 37єС, а енергія активації складає 33 та 39 кДж/моль відповідно.

Роль SH-груп в функціонуванні Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів. Для з'ясування ролі SH-груп в функціонуванні Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР ми додавали до середовища інкубації парахлормеркурійбензоат (ПХМБ) в різних концентраціях (1-1000 мкмоль/л). ПХМБ пригнічував досліджувані АТФази з К_і 0,6 ± 0,1 · 10^-3 та 1,4 ± 0,1 · 10^-3 моль/л для Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР відповідно. Хелатор SH-груп дитіотреітол (ДТТ) збільшував активність Са²⁺-АТФази ПМ на 10 ± 2 % (при 0,01 ммоль/л ДТТ, р<0,05, n=4), а мембрани ЕПР на 60 ± 12 % (при 0,1 ммоль/л ДТТ, р<0,05, n=4). ДТТ зворотно реактивув пригнічену ПХМБ активність Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР (максимальне підвищення їх активності складало 180 ± 34 % та 280 ± 39 % (р<0,05, n=7) порівняно до ефектів ПХМБ), проте не повністю їх відновлював. Нами встановлено неконкуретний спосіб взаємодії ПХМБ з SH-групами Са²⁺-АТФаз, оскільки вираженість його пригнічуючого впливу не залежала від тривалості преінкубації з ним мембранних везикул. Для з'ясування механізму впливу ПХМБ на функціонування Са²⁺-АТФаз мембран ацинарних клітин ми провели аналіз залежності їх активності від [АТФ] та [Са²⁺]_і в присутності ПХМБ. Нами встановлено, що при [АТФ], нижчих за 0,5 ммоль/л, ПХМБ (150 мкмоль/л) повністю пригнічував Са²⁺-AТФази. При додаванні до середовища, яке містило ПХМБ, АТФ у концентраціях 1 - 3 ммоль/л активність обох Са²⁺-АТФаз поступово збільшувалась, хоча була значно нижчою, ніж у контролі. З'ясувалось, що ПХМБ викликає підвищення K_АТФ в середньому на 30 ± 3 % та 42 ± 5 % (р<0,05, n=7) для Са²⁺-AТФаз ПМ та ЕПР відповідно, що свідчить про зниження спорідненості АТФ-зв'язуючого центру Са²⁺-АТФаз до АТФ.

Вплив трифлуоперазину на активність Са²⁺-АТФаз мембран ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів. В результаті проведених досліджень нами не було виявлено достовірних змін активності Са²⁺-АТФази ПМ при додаванні до реакційного середовища екзогенного кальмодуліну (1-100 мкг/мл). Проте виявилось, що його інгібітор трифлуоперазин (100 мкмоль/л) знижував активність Са²⁺-АТФази ПМ секреторних клітин на 24 ± 5 % (р<0,05, n=6) порівняно до контролю. ці дані свідчать про важливу роль кальмодуліну у регуляції роботи Са²⁺-АТФази ПМ ацинарних клітин.

Зміни функціонування Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР за умов ксеростомії

Ксеростомія (сухість в роті) є наслідком зниженої функціональної активності клітин слинних залоз (Chisholm & Mason, 1975). Однак сьогодні субклітинні механізми зниження функціональної активності клітин слинних залоз залишаються не вивченими. Нами вперше показано, що при стрептозотоцин-індукованому діабеті (як експериментальній моделі ксеростомії) порушується робота Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР. Зменшення їх активності складало 88 ± 3 % та 53 ± 6 % (р<0,05, n=9) порівняно із здоровими тваринами. Показано також, що за умов цукрового діабету знижується величина всіх кінетичних параметрів роботи Са²⁺-АТФаз: Р_max - на 52 ± 6 % і V₀ - на 50 ± 7 % (p<0,05, n=7). Отже, за умов експериментально-індукованого діабету ефективність роботи Са²⁺-АТФаз виражено знижується. Нами показано, що за умов діабету зазнають змін і каталітичні параметри, що характеризують роботу Са²⁺-АТФаз. Зокрема за цих умов відбувається зменшення V_max високоафінного центру зв'язування АТФ Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР в середньому на 22 ± 2 % та 48 ± 7 % (p<0,05, n=6), а низькоафінного центру - на 45 ± 7 % та 83 ± 8 % (p<0,05, n=7) відповідно, порівняно до показників, одержаних на здорових тваринах. Причому нами виявлено підвищення K_АТФ високоафінного центру зв'язування АТФ Са²⁺-АТФази ПМ (в середньому на 74 ± 6 % (p<0,05, n=7)). Однак нами не було виявлено змін K_АТФ низькоафінного центру зв'язування та n_н обох центрів Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР секреторних клітин слинних залоз. Показано також, що за умов експериментального діабету відбувається достовірне зменшення величин V_max, K_Са низькоафінного центру зв'язування Са²⁺ в молекулах Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР в середньому на 50 ± 5 %, 84 ± 7 % та 27 ± 4 %, 74 ± 7 % (p<0,05, n=6) відповідно. З'ясувалось, що за умов експериментального діабету відбувається зростання кооперативності низькоафінного центру зв'язування Са²⁺ Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР в середньому на 63 ± 6 % та 58 ± 5 % (p<0,05, n=6) відповідно. Таким чином, нами вперше показано, що за умов цукрового діабету відбуваються зміни внутрішньоклітинного Са²⁺-гомеостазу, викликані зменшенням ефективності роботи Са²⁺-АТФаз, що є ймовірною причиною порушення секреторної функції слинних залоз.

Обговорення результатів

В експериментах на суспензії ацинусів підщелепної слинної залози щурів нами доведено важливу роль узгодженого функціонування Са²⁺-помп ПМ та ЕПР для регулювання Са²⁺-сигналізації. Наші дані сповна узгоджуються із результатами Петерсена і співавт. (Petersen et al., 1999) та Сміта і співавт. (Smith et al., 1994), які з використанням селективних флуоресцентних зондів довели важливий вклад Са²⁺-помп у регуляцію цих процесів у панкреацитах. Нами також виявлено, що підтримання внутрішньоклітинного Ca²⁺-гомеостазу забезпечується не лише Са²⁺-помпами, а є збалансоване з входом Са²⁺ із зовнішньоклітинного середовища. Таким чином, ще до стимуляції відбувається підготовка клітин слинних залоз до повноцінної секреторної відповіді при дії секретагогів, яка була б неможливою при “[Са²⁺]_і-перевантаженні” чи недостатньо заповненому ЕПР, що забезпечується роботою Са²⁺-помп. Аналізуючи властивості Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР клітин підщелепної слинної залози щурів можна зробити висновок, що вони за своїми кінетичними та каталітичними параметрами (К_АТФ, К_Са, n_H, К_Mg) подібні до систем АТФ-залежного накопичення Са²⁺ везикулами ПМ досліджуваних клітин (Hurley & Ryan, 1988), привушної слинної залози (Low et al., 1987), Са²⁺-АТФаз ПМ гепатоцитів (Pavoine et al., 1987) та мембран клітин прищитоподібної залози (Dawson-Hughes et al., 1983). Виявилось, що досліджувані нами Са²⁺-АТФази характеризуються високою спорідненістю до Mg²⁺, як необхідного компоненту хелатного комплексу Mg·АТФ, та АТФ, оскільки інші нуклеотидтрифосфати (ГТФ, ЦТФ, УТФ) зменшують їх активність. Інгібіторний аналіз показав, що Са²⁺-АТФази мембран клітин слинної залози ефективно пригнічуються еозином Y та La³⁺. Причому Са²⁺-АТФаза ПМ є більш чутливою до еозину Y, ніж Са²⁺-АТФаза ЕПР. Проте вони є менш чутливі до еозину Y, ніж Са²⁺-АТФаза ПМ гладком'язових клітин (Черниш, Слінченко, 1999). К_і по La³⁺ для Са²⁺-АТФази ЕПР були близькими до розрахованих для АТФ-залежного транспорту Са²⁺ в панкреацитах (Kribben et al., 1983). Оскільки La³⁺ утворює стійкі комплекси з СОО^--групами, які, як відомо, містяться в Са²⁺-зв'язуючому (Adebayo et al., 1995) та, ймовірно, в АТФ-зв'язуючому центрах молекули ферменту, то пригнічення роботи Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин La³⁺ викликане блокування саме цих груп. З'ясувалось, що оптимуми рН для Са²⁺-АТФаз мембран досліджуваних клітин знаходяться в фізіологічних межах, характерних для цитоплазми клітин та близькі до наведених для АТФ-залежного накопичення ⁴⁵Са²⁺ везикулами ПМ інших типів секреторних клітин (Kasson & Levin, 1981; Low et al., 1987; Evers et al., 1988). На основі рК_а ми припускаємо, що носіями іоногенних груп в складі АТФ-зв'язуючого центру є залишки амінокислоти гістидину у молекулах обох Са²⁺-АТФаз. Згідно даних літератури ця амінокислота керує структурною перебудовою конформаційного переходу Е₁-Е₂ (Винокуров и др., 1998). На основі величини рК_b ми припускаємо важливу роль амінокислотних залишків цистеїну у молекулах досліджуваних АТФаз. Підтвердженням цього також є виявлене нами пригнічення Са²⁺-АТФаз при дії ПХМБ. Причому, ймовірно, що у молекулах Са²⁺-АТФаз наявні як поверхневі, так і приховані SH-групи, оскільки ДТТ, як з'ясувалось, тільки частково відновлював пригнічені ПХМБ активності Са²⁺-АТФаз. Причому ПХМБ зв'язується з SH-групами у неконкурентний спосіб, оскільки нами не виявлено залежності його пригнічуючого ефекту від тривалості преінкубації з ним мембранних везикул секреторних клітин. На основі того, що ПХМБ приводить до підвищення К_АТФ для Са²⁺-АТФаз і не впливає на К_Са ми вважаємо, що ймовірним механізмом його дії є зниження спорідненості молекул ферменту до АТФ, внаслідок інгібування SH-груп АТФ-зв'язуючого центру. Така поширена патологія як ксеростомія (сухість в роті) є наслідком зниження здатності клітин слинних залоз продукувати та секретувати слину (Navazesh & Ship, 1983). Як модель ксеростомії ми використовували стрептозотоцин-індукований діабет. Виявилось, що у тварин із цукровим діабетом робота обох Са²⁺-АТФаз пригнічена. Подібні результати було отримано і на гепатоцитах (Струтинська і співавт., 2002), синаптосомах (Janicki et al., 1995), кардіоміоцитах (Rupp et al., 1994), клітинах крові (Balasubramanyan et al., 2001; Spieker et al., 1994). Ми припускаємо, що за умов цукрового діабету зменшується ефективність роботи Са²⁺-АТФаз секреторних клітин слинних залоз за рахунок змін кальцієвої та субстратної регуляції активності ферменту. На нашу думку, ймовірною причиною цього є зниження спорідненості Са²⁺-АТФази ПМ до АТФ (на основі підвищення К_АТФ) і, крім того, зниження кількості обертів молекул обох Са²⁺-АТФаз (на основі зниження V_max). Компенсація пригніченої за умов діабету функції Са²⁺-АТФаз здійснюється за рахунок зростання спорідненості до Са²⁺ та кооперативності його зв'язування. Проаналізувавши власні результати та дані літератури, ми пропонуємо гіпотетичну схему ролі функціонально важливих груп у роботі Са²⁺-АТФаз (рис. 6). За основу ми взяли модель будови Са²⁺-АТФази, запропоновану Лі та Істом (Lee & East, 2001).

Висновки

Оскільки дані щодо властивостей Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз є малочисельні, у дисертації із використанням комплексу методів проведено всебічне дослідження Са²⁺-помп клітин слинних залоз щурів, що включає ідентифікацію активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР, вивчення їх властивостей, механізмів модифікації та ролі у внутрішньоклітинній Са²⁺-сигналізації.

Узгоджене функціонування Са²⁺-помп мембран ацинарних клітин слинних залоз відіграє важливу роль у підтриманні внутрішньоклітинного Са²⁺-гомеостазу та Са²⁺-залежної базальної секреції.

Основні кінетичні параметри роботи Са²⁺-АТФаз клітин підщелепної слинної залози становлять: початкова швидкість V₀ - 0,1 ± 0,01 мкмоль Р_і/хв на 1 мг білка, максимальна кількість продукту реакції Р_max - 0,8 ± 0,1 мкмоль Р_і/мг білка, характеристичний час ферментативної реакції ф - 6,8 ± 0,4 хв.

Ідентифіковано високо- та низькоафінні центри зв'язування АТФ та Са²⁺ з Са²⁺-АТФазами мембран досліджуваних клітин. Показано участь високоафінного АТФ-зв'язуючого центру у ферментативній реакції, а в транспорті Са²⁺ - низькочутливої компоненти Са²⁺-залежного гідролізу АТФ.

Здатність двовалентних катіонів заміняти Са²⁺ у функціонуванні Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР знаходиться у послідовності: Са²⁺=Ba²⁺>Sr²⁺ та Са²⁺=Ba²⁺=Sr²⁺. Нами вперше показано пригнічення активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР клітин слинної залози при заміні Mg²⁺ (Mg²⁺>Mn²⁺>Co²⁺>Cu²⁺ та Mg²⁺=Mn²⁺>Cu²⁺>Co²⁺). Здатність інших нуклеотидів заміняти АТФ у роботі Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР зменшується у послідовності: АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ та АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ відповідно.

Са²⁺-АТФази мембрани секреторних клітин пригнічуються еозином Y, La³⁺ та ПХМБ. На основі значень рК та інгібіторного аналізу постулюється важлива роль імідазольної групи гістидину, SH-групи цистеїну, СОО^-_груп глутамінової та аспарагінової кислот у функціонуванні Са²⁺-АТФаз.

Сульфгідрильний реагент ПХМБ знижує спорідненість Са²⁺-АТФаз до АТФ, проте не впливає на спорідненість до Са²⁺. Виявлено в складі їх молекул як поверхневих, так і прихованих SH-груп. Показано неконкурентний спосіб взаємодії ПХМБ з каталітичним центром Са²⁺-АТФаз.

Показано, що при експериментальному діабеті (як моделі розвитку ксеростомії) порушується робота Са²⁺-АТФаз мембрани ацинарних клітин слинних залоз, в основі чого, очевидно, є зменшення кількості обертів молекули і зміни кальцієвої та субстратної регуляції активності ферменту.

Список опублікованих робіт за темою дисертації

Fedirko N., Klevets M., Vats Ju. Isolated acini as an object for the investigation of the Ca²⁺-transporting system of the secretory cell membranes. // Neurophysiology. - 2000. - Vol. 32. - P. 183-184. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання експериментальних даних.)

Федірко Н.В., Клевець М.Ю., Кругліков І.А., Вац Ю.О. Зміни концентрації катіонів кальцію у секреторних клітинах ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів під впливом ацетилхоліну та норадреналіну // Вісн. Харк. ун-ту, Біофізичний вісник. - 2001. - № 525. - С. 54-57. (Здобувач провів дослідження змін сумарного вмісту кальцію в ацинарних клітинах під впливом медіаторів, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

Федірко Н.В., Вац Ю.О., Клевець М.Ю. Ідентифікація Са²⁺-активованої, Mg²⁺-залежної АТФ-ази мікросомальної фракції мембран секреторних клітин ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів. // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2002. - Вип. 28. - С. 303-310. (Здобувач провів дослідження, статистичне опрацювання результатів, аналіз експериментальних даних, взяв участь у написанні та оформленні статті.)

Вац Ю.А., Федирко Н.В., Клевець М.Ю., Войтенко Н.В. Роль SH-групп в функционировании кальцийтранспортных АТФаз, регулирующих кальциевый гомеостаз и экзоцитоз.// Нейрофизиология // Neurophysiology. - 2002. - Т. 34, № 1. - С. 7-17. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

Fedirko N., Vats Ju., Klevets M., Kruglikov I., Voitenko N. Neuronal control of the exocytosis and calcium homeostasis // Neurophysiology. - 2002. - Vol. 34, Nо. 2/3. - P.144-147. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та перекладі статті.)

Федирко Н.В., Вац Ю.О., Кругликов И.А., Войтенко Н. В. Изменения функционирования Са²⁺-АТФаз экзокринных клеток крыс при экспериментальном диабете. // Нейрофизиология / Neurophysiology. - 2003. - Т. 35, № 5. - 12 с. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних та написанні статті.)

Fedirko N., Klevets M., Vats Yu. Caffeine-induced Changes of Steady-state Ca²⁺ Content in the Secretory Cells of Rat Submandibular Salivary Gland. // XXXIV International Congress of Physiological Sciences, July, 25 - August, 1, 2001, Christchurch, New Zealand. Programme and Abstracts. - http: // iups.esc.auckland.ac.nz/cgi-in/get_registrant.cgi?registrants.id =1996. (Здобувач провів дослідження та аналіз експериментальних даних.)

Fedirko N., Vats Ju., Klevets M. Noradrenaline-activated Са²⁺ influx into the secretory cells of submandibular salivary gland // International Symposium “Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems (ISPAS)”, 9-14 September, 2001, Kyiv, Ukraine, 2001. Programme and Abstracts of International Symposium. - P. 59. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні, перекладі тез доповіді та представляв стендову доповідь на конференції.)

Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Vats Ju.A., Klevets M.Yu. Possible mechanism of steady-state Ca²⁺ increase in the acinar secretory cells of rat submandibular salivary glands // Fourth Conference of the Czech Neuroscience Society, October 23-25, 2001, Prague. - Abstract. - 2001. - P. 68. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та перекладі тез доповіді.)

Vats Ju., Klevets M., Fedirko N. Involvement of SH-groups in the regulation of PMCA and SERCA functional activity // Proceedings of the Physiological Society Meeting, Liverpool, July 8-12, 2002. - J Physiol (Lond). - 2001. - Vol. 543. - P. 66. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді, представляв стендову доповідь на конференції.)

Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Дослідження Ca²⁺-, Mg²⁺-ATФазних активностей плазматичної та ендоплазматичної мембран секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів// 16-й з`їзд українського фізіологічного товариства. 28-30 травня, 2002 р., Вінниця. - Фізіол. журн. - 2002. - Т. 48, № 2. - С.130-131. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді та представляв стендову доповідь на конференції.)

Федірко Н.В., Вац Ю.О., Пасович О.Б., Копач О.В., Клевець М.Ю. Дослідження механізмів підтримання Са²⁺-гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.// III з'їзд Українського біофізичного товариства. 8-11 жовтня 2002 р., Львів. Тези доповідей. - С. 68. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Залежність функціональної активності Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз від концентрації АТФ.// Матеріали міжнародної конференції. присвяченої пам'яті професора Шостаковської І.В. 11-12 жовтня 2002 р., Львів, С. 14. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

Fedirko N.V., Vats Ju., Klevets M.Yu. Role of Endoplasmic Ca²⁺-stores in Cholinergic Ca²⁺ Signaling in Rat Salivary Acinar Cells // 47^th Annual Meeting of the Biophysical Society, 2-7 March 2003, San-Antonio, Texas, USA. - Biophysical J. - 2003. - Vol. 84, № 2. - P. 228. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, перекладі тез доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

Fedirko N., Vats J., Voitenko N. Effect of streptozotocin-induced diabetes on salivary secretory cells Ca²⁺-ATPase // 3^rd FEPS Congress, 28 June-2 July, 2003, Nice, France. - Abstract book. - P. 16. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та перекладі тез доповіді.)

Анотації

Вац Ю.О. Властивості Са²⁺-помпи мембран ацинарних секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2004.

Дисертація присвячена комплексному вивченню властивостей Са²⁺-АТФаз плазматичної та ретикулярної мембран клітин підщелепної слинної залози щурів.

На ізольованих ацинусах показано, що Са²⁺-гомеостаз у клітині підтримується за рахунок узгодженої роботи Са²⁺-помп та каналів плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз.

В інтегральній фракції inside-out орієнтованих везикул слинної залози ідентифіковано тапсигаргін-нечутливу Са²⁺-АТФазу плазматичної та тапсигаргін-чутливу Са²⁺-АТФазу ретикулярної мембран. Ідентифіковано високо- та низькоафінні центри зв'язування АТФ та Са²⁺ з Са²⁺-АТФазами. Здатність катіонів заміняти Са²⁺ та Mg²⁺, та інших нуклеотидів заміняти АТФ у роботі Са²⁺-АТФаз плазматичної та ретикулярної мембран знаходиться у послідовності: Са²⁺=Ba²⁺>Sr²⁺ та Са²⁺=Ba²⁺=Sr²⁺; Mg²⁺>Mn²⁺>Co²⁺>Cu²⁺ та Mg²⁺=Mn²⁺>Cu²⁺>Co²⁺; АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ та АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ відповідно. Інгібітори пригнічують Са²⁺-АТФази: еозин Y > ПХМБ > La³⁺. Виявлено, важливу роль імідазольної групи гістидину та SH-групи цистеїну АТФ-зв'язуючого центру у роботі Са²⁺-АТФаз.

Ключові слова: Са²⁺-АТФаза, [Са²⁺]_і-сигналізація, мембранні везикули, секреторні клітини, слинні залози.

Вац Ю.О. Свойства Са²⁺-насоса мембран ацинарных секреторных клеток подчелюстной слюнной железы крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2004.

Диссертация посвящена комплексному изучению свойств Са²⁺-АТФаз плазматической и ретикулярной мембран клеток подчелюстной слюнной железы крыс.

На изолированных ацинусах показано, что Са²⁺-гомеостаз в клетке поддерживается за счёт согласованной работы Са²⁺-насосов и каналов плазматической мембраны секреторных клеток слюнных желез.

В интегральной фракции inside-out ориентированных везикул слюнной железы идентифицировано тапсигаргин-нечувствительную Са²⁺-АТФазу плазматической и тапсигаргин-чувствительную Са²⁺-АТФазу ретикулярной мембраны. Идентифицировано высоко- и низкоаффинные центры связывания АТФ и Са²⁺ с Са²⁺-АТФазами. Способность катионов заменять Са²⁺ и Mg²⁺, и других нуклеотидов заменять АТФ в работе Са²⁺-АТФаз плазматической и ретикулярной мембран находится в последовательности: Са²⁺=Ba²⁺>Sr²⁺ и Са²⁺=Ba²⁺=Sr²⁺; Mg²⁺>Mn²⁺>Co²⁺>Cu²⁺ и Mg²⁺=Mn²⁺>Cu²⁺>Co²⁺; АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ и АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ соответственно. Ингибиторы угнетают Са²⁺-АТФазы: эозин Y > ПХМБ > La³⁺. Установлено важную роль имидазольной группы гистидина и SH-группы цистеина АТФ-связывающего центра в работе Са²⁺-АТФаз.

Ключевые слова: Са²⁺-АТФаза, [Са²⁺]_і-сигнализация, мембранные везикулы, секреторные клетки, слюнные железы.

Vats Ju.A. Properties of Ca²⁺ pumps of acinar secretory cells from rats submandibular salivary gland. - Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree on specialty 03.00.13 - Human and Animals Physiology. - Ivan Franko National University of Lviv. Lviv, 2004.

Dissertation is devoted to the study of the properties of plasma and endoplasmic reticulum membranes Ca²⁺-activated Mg²⁺-dependent ATPases of rat submandibular salivary gland cells.

In the experiments using isolated acini secretory cells was shown that intracellular Ca²⁺ homeostasis and spontaneous secretion are maintained by coordinated functioning of both Ca²⁺ pumps and plasma membrane channels.

We showed that integral fraction of inside-out oriented membrane vesicles is enriched with thapsigargin-insensitive plasma membrane Ca²⁺-ATPase and thapsigargin-sensitive endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase molecules. Ca²⁺-activated Mg²⁺-dependent ATP hydrolysis reaction is characterized by the following kinetic parameters: V₀ - 0.1 ± 0.01 mcmoles Р_і/min per 1 mg protein, Р_max - 0.8 ± 0.09 mcmoles Р_і/mg protein, ф - 6.8 ± 0.4 min. High- and low-affinity ATP- and Ca²⁺-binding sites in the molecules of plasma and endoplasmic reticulum membranes Ca²⁺-ATPases were revealed. It was established that high-affinity ATP-binding site of both Ca²⁺-ATPases directly participates in enzymatic reaction. Whereas with respect to Ca²⁺, low-sensitive component of Ca²⁺-ATPase is responsible for Ca²⁺ -transporting function of molecules of both enzymes.

The ability of other bivalent metal cations and nucleotides to suppress the activity of plasma and endoplasmic reticulum membrane Ca²⁺-ATPases decreased in the following sequences: Са²⁺=Ba²⁺>Sr²⁺ and Са²⁺=Ba²⁺=Sr²⁺; Mg²⁺>Mn²⁺>Co²⁺>Cu²⁺ and Mg²⁺=Mn²⁺>Cu²⁺>Co²⁺; ATP> GTP>UTP>CTP and ATP>GTP>CTP>UTP correspondingly. Plasma and endoplasmic reticulum membrane Ca²⁺-ATPases are inhibited by eosin Y (К_і=2.9±0.2 · 10^-5 and 4.7±1.0 · 10^-5 mole/l), La³⁺ (К_і =1.9±0.1· 10^-3 and 4.5±0.1 · 10^-3 mole/l) and p-chloromercuribenzoate (К_і =0.6±0.1 · 10^-3 and 1.4±0.1 · 10^-3 mole/l). Using dithiotreitol it was shown that the molecules of both Ca²⁺-ATPases of salivary cells are enriched with mobile and masked SH-groups. The activation energy of plasma and endoplasmic reticulum membranes Ca²⁺-ATPases are 33 and 39 kJ/mol correspondingly. The temperature and pH optimum for plasma and endoplasmic reticulum membranes Ca²⁺-ATPases are 42 and 37єC, 7.3 and 7.0 correspondingly. It was found that in the regulation of both Ca²⁺-ATPases important role belong to imidazole group of histidine and SH-group of cysteine consisting of ATP-binding sites. We suppose that decrease of enzyme molecule rotation as well as regulation of Ca²⁺-ATPases by Ca²⁺ and ATP could underlie the development of xerostomia.