Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

СУБОДИНИЧНИЙ СКЛАД НІКОТИНОВИХ ХОЛІНОРЕЦЕПТОРІВ НЕЙРОНІВ НИЖНЬОГО БРИЖОВОГО ГАНГЛІЯ МОРСЬКОЇ СВИНКИ

03.00.13 - фізіологія людини та тварин

КОВАЛЬ ОЛЬГА МИХАЙЛІВНА

Київ - 2003

Науковий керівник:академік НАН України, доктор біологічних наук, Скок Володимир Іванович, завідувач відділу фізіології вегетативної нервової системи Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, професор Шуба Ярослав Михайлович провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

доктор біологічних наук Янчук Петро Іванович старший науковий співробітник відділу фармако-фізіології НДІ фізіології ім. академіка Петра Богача біологічного факультету національного університету імені Тараса Шевченка, м. Київ

Провідна установа:Інститут геронтології АМН України, м. Київ

Захист відбудеться “ 13” січня 2004 р. о 14 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “11” грудня 2003 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук З. О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що практично всі внутрішні органи ссавців інервовані симпатичним відділом периферичної нервової системи (ПНС). Нижній брижовий ганглій (НБГ), поряд із іншими симпатичними гангліями, є важливою і досить самостійною ланкою по відношенню до центральної нервової системи (ЦНС). Роботи по вивченню провідних шляхів НБГ кота (Ноздрачев и соавт., 1970; Скок В., 1970; Булыгин, Калюнов, 1971) та досліди з використанням методики відведення внутрішньоклітинної активності окремих нейронів даного ганглія у морської свинки (Булыгин, и соавт., 1971; Crowcroft et al., 1971) показали, НБГ є не просто місцем перемикання нервових імпульсів з прегангліонарних волокон на постгангліонарні, як це було встановлено Ленглі (Langley, 1894), а являє собою складний інтегративний центр, залучений у регуляцію діяльності внутрішніх органів на основі реалізації власних периферичних рефлексів (King et al., 1984; Gola et al., 1993; Miolan et al., 1996).

Досліди із застосуванням холінолітиків (Browning et al., 1999; Пасічніченко, 2000) показали, що швидка синаптична передача у НБГ, як і в інших вегетативних гангліях, є нікотиновою холінергічною і, відповідно, здійснюється за рахунок виділення ацетилхоліну з пресинаптичних нервових терміналей та активації нікотинових холінорецепторів (НХР), що містяться на мембрані основних (релейних) нейронів НБГ. Ці рецептори являють собою молекули пентамерних білків, які вміщують різні набори - та -субодиниць (Lindstrom, 1996). На сьогодні ідентифіковано дев'ять типів -(2-10) та три типи -(2-4) субодиниць нейронних НХР (Sargent, 1993; Changeux and Edelstein, 2001). Холінорецептори різного субодиничнго складу мають специфічні кінетичні та фармакологічні властивості. Це, вірогідно, визначає їх дещо відмінні функції в клітинах центральної та периферичної нервових систем (Wang et al., 2002). На нейронах вегетативних вузлів та сплетень виявлені холінорецептори, які мають у своєму складі ₃-, ₄-, ₅- та ₇-субодиниці, але субодиничні композиції НХР відрізняються не тільки у різних вегетативних гангліях, а навіть у різних нейронів того самого ганглія (Skok V., 2002).

Актуальним на сьогодні є припущення про те, що холінорецептори з різним субодиничним складом забезпечують синаптичну передачу у нервових шляхах, які відрізняються за модальністю (вазомоторні, секреторні та ін.) (Skok V., 2002). Показано, що релейні нейрони НБГ морської свинки, які посилають свої аксони до нижньої брижової артерії, суттєво відрізняються за електрофізіологічними характеристиками та місцями їх локалізації в ганглії від нейронів, що інервують нижню брижову вену (Browning et al., 1999). Ймовірно, що такі клітини можуть відрізнятися і за субодиничним складом їх холінорецепторів. Отже, проблема відповідності між субодиничним складом НХР, морфологічними та топографічними особливостями гангліонарних клітин та їх функціональними характеристиками є дуже актуальною. В той же час, інформація стосовно цієї проблеми залишається досить обмеженою.

Беручи до уваги сказане вище, вивчення субодиничного складу та структурно-функціональних особливостей НХР нейронів вегетативних гангліїв є важливим аспектом фундаментальної фізіології.

На сьогодні різними групами дослідників вже встановлено та проаналізовано субодиничний склад НХР на нейронах ВШГ щура (Sivilotti et al., 1997), циліарного ганглія курчати (Сonroy et al., 1992), інтракардіальних гангліїв собаки (Bibewski et al., 2000) та ін. Проте, особливості техніки експериментів в різних лабораторіях світу та використання принципово відмінних шляхів ідентифікації субодиничного складу НХР на нейронах (генетичний, імунологічний або фармакологічний) істотно ускладнюють можливість порівняння одержаних результатів. Тому, ми вважали за доцільне провести комбіноване вивчення субодиничного складу НХР на нейронах НБГ. З одного боку, застосовуючи методику внутрішньоклітинного відведення потенціалів, ми реєстрували характеристики збуджуючих постсинаптичних потенціалів (ЗПСП) нейронів у контролі та у присутності специфічних блокаторів, а з іншого, використовуючи метод імуногістохімічного забарвлювання, вивчали топографію та кількість нейронів НБГ, які виявляли імунореактивність до специфічних міток. Як специфічні блокатори синаптичної передачі та імунологічні мітки ми використовували моно- та поліклональні антитіла до синтетичних пептидів, що відповідають агоністзв'язуючому фрагменту нуклеотидного ланцюга різних - та -субодиниць НХР. З використанням такого підходу ми сподівалися одержати нову інформацію щодо субодиничного складу НХР та їх ролі у реалізації синаптичної передачі через НБГ в умовах, які є досить близькими до нормальних фізіологічних.

Зв'язок із науковою тематикою організації. Роботу було виконано в рамках наукових програм відділу фізіології вегетативної нервової системи Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України: “Вивчення субодиничного складу гангліонарних холінорецепторів імуногістохімічними методами, а також дослідження дії антитіл, специфічних для окремих підтипів рецепторів, на ацетилхолін-індуковані мембранні струми та на збуджуючі постсинаптичні потенціали. Дослідження механізмів модуляції холінорецепторів гангліонарних нейронів вторинними посередниками" і "Вивчення зв'язку між субодиничним складом нікотинових холінорецепторів нейронів вегетативних гангліїв та сплетень і їх фізіологічними функціями".

Мета та завдання роботи. Мета роботи полягала у визначенні субодиничного складу НХР нейронів НБГ морської свинки із застосуванням комплексного методичного підходу, а також у подальшому поглибленні уявлень про можливі функції холінорецепторів різної субодиничної композиції у вегетативних гангліях. Для досягнення мети у наших експериментах були застосовані антитіла, специфічні до синтетичних пептидів, що відповідають агоністзв'язуючому мембранному компоненту ₃-, ₄-, ₅- та ₇-субодиниць НХР (амінокислотні залишки 181-192) та поліклональні афінноочищені антитіла проти ₂- та ₄-субодиниць (амінокислотні залишки 183-192).

Перед нами були поставлені такі завдання:

1. З використанням внутрішньоклітинного відведення потенціалів в умовах блокування встановити субодиничний склад НХР, які забезпечують швидку синаптичну передачу через НБГ морської свинки в нервовому шляху прегангліонарний нерв (міжбрижовий тракт) - нейрони ганглія.

2. Методом імунопероксидазних забарвлень дослідити кількості релейних нейронів НБГ, що виявляють імунореактивність до антитіл проти ₃-, ₄-, ₅-, ₇- а також ₂- та ₄- субодиниць НХР.

3. На препаратах НБГ, що підлягали імуногістохімічній обробці, дослідити місця переважного розташування гангліонарних клітин, які є імунопозитивними до антитіл проти різних підтипів - та -субодиниць НХР.

4. Провести порівняльний аналіз даних, отриманих електрофізіологічним методом з даними, отриманими методом імуногістохімічних забарвлювань.

Наукова новизна отриманих результатів.

1. Вперше було застосовано комплексне дослідження субодиничного складу НХР нейронів НБГ морської свинки. В роботі застосовували антитіла, специфічні до різних підтипів - та - субодиниць НХР. Проведено порівняння результатів відносно субодиничного складу НХР на нейронах досліджуваного ганглія, та встановлено, що дані, отримані із застосуванням електрофізіологічного методу є адекватними таким, що були отримані при імуногістохімічних забарвлюваннях.

2. В результаті проведених експериментів показано, що холінорецептори нейронів НБГ, які містять ₃-, ₅- та ₄- субодиниці, забезпечують синаптичну передачу через ганглій та, найвірогідніше, залучені до здійснення периферичних рефлексів, які замикаються на рівні цього ганглія. Методом непрямих імуногістохімічних забарвлювань також встановлено, що релейні нейрони НБГ виявляють імунореактивність саме до зазначених підтипів антитіл. 3. В електрофізіологічних експериментах із почерговим застосуванням ₃-, ₅- та ₄-специфічних антитіл виявлено, що для нейронів досліджуваного ганглія характерною рисою є гетерогенність НХР, тобто кожна клітина містить кількісний та якісний набір НХР, характерний лише для неї.

4. Встановлено, що ₄- та ₂- вмісні НХР не залучені до синаптичної передачі через НБГ морської свинки..

5. Вперше виявлено, що у досліджуваному ганглії холінорецептори, до складу яких належить ₇-субодиниця, виявляють опосередкований вплив на синаптичну передачу, оскільки досліди із застосуванням ₇-специфічних блокаторів - метиллікаконітину (МЛА) та ₇-специфічних антитіл, не пригнічували, а збільшували амплітуду ЗПСП нейронів НБГ.

6. Показано, що холінорецептори різного субодиничного складу містяться не лише на основних нейронах ганглія, а також на дрібних клітинах, які за своїми морфологічними ознаками близькі до ознак малих інтенсивно-флюоресціюючих клітин верхнього шийного чи підчеревного гангліїв щура.

Теоретичне та практичне значення роботи. Результати дисертаційної роботи перш за все представляють фундаментальний інтерес. Дані освітлюють особливості субодиничного складу НХР нейронів НБГ, що дозволяє порівняти субодиничні комбінації холінорецепторів досліджуваного ганглія із такими інших симпатичних та парасимпатичних вегетативних вузлів та сплетень.

Наша робота показує важливість комплексного підходу у дослідженнях фізіології вегетативних гангліїв. Результати наших досліджень можуть зацікавити фізіологів та фармакологів, оскільки дають нову інформацію про субодиничний склад НХР на нейронах НБГ, який є важливою ланкою у регуляції фізіологічних процесів шлунково-кишкового тракту та органів сечовидільної системи. Дані можуть бути використані як основа для винайдення нових фармакологічних препаратів, які б застосовувались для лікування розладів вісцеральних органів, до інервації яких залучений НБГ.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз наукової літератури та розроблено методологію дослідів. Всі експерименти, описані у дисертаційній роботі, аналіз та узагальнення експериментального матеріалу був виконаний особисто автором. У розробці концепції роботи, обговоренні її результатів та написанні опублікованих статей брали участь керівник та співробітники відділу фізіології вегетативної нервової системи.

Апробація результатів дисертації. ІІ конференція Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001), І симпозіум Богомолець-Ненскі "Molecular and physiological approaches to neuronal plasticity" (Сулейов, Польща 2001), міжнародна конференція "Molecular Biology of cellular Interactions" (Гієнз, Франція, 2001), XVI з'їзд Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002), ІІ симпозіум Богомолець-Ненскі “Intracellular signaling in excitable cells” (Київ 2002), Всеукраїнська наукова конференція, присвячена 160-річчю кафедри фізіології людини і тварин Київського національного Університету ім. Тараса Шевченка "Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі та патології" (Київ, Україна, 2002), Second International Symposium "Smooth Muscle Physiology and Biophisics" (Київ, Україна, 2003).

Публікації. Основні матеріали роботи опубліковано в 3-х журнальних статтях і 5-ти тезах доповідей.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація викладена на 129 сторінках і містить список скорочень, вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, розділ результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки та список використаних джерел. Робота ілюстрована 4 таблицями та 25 рисунками. Перелік використаної літератури включає 196 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність проблеми визначення субодиничного складу НХР на нейронах вегетативних гангліїв, а також сформульовані мета та задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну цінність та вказані апробації отриманих результатів.

Розділ 1 "Огляд літературних даних" присвячений висвітленню відомих аспектів щодо структурних та функціональних властивостей НХР різного субодиничного складу, а також особливості експресії таких рецепторів на різних вегетативних гангліях ссавців.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Результати електрофізіологічних експериментів та імуногістохімічних забарвлювань були отримані на ізольованих препаратах НБГ морських свинок (60 тварин обох статей, масою 180-220 г). Піддослідних тварин наркотизували ефіром та декапітували. Серединним розрізом по білій лінії черева (від мечоподібного відростка до лобкового сполучення) відкривали черевну порожнину. Під контролем бінокулярного мікроскопа PZO (Польща), за допомогою офтальмологічних пінцетів та мікроножиць вилучали ганглій, намагаючись залишати якнайдовшим прегангліонарний нерв (міжбрижовий тракт). Ізольований НБГ очищали від сполучнотканинних оболонок і розміщували у камері для електрофізіологічних експериментів або у чашці Петрі для імуногістохімічного забарвлювання. Денця камери та чашки Петрі мали силгардове покриття ("Sylgard-stand 184" WPI), до якого тонкими голочками прикріплювали препарат.

Реєстрація синаптичних відповідей нейронів НБГ. Для вивчення субодиничного складу НХР, які забезпечують синаптичну передачу у нервовому шляху прегангліонарний нерв (міжбрижовий тракт) - нейрони ганглія, використовували стандартну методику реєстрації синаптичних відповідей нейронів при подразненні прегангліонарного нерва. Препарат розміщували у робочій камері, виготовленій із плексигласу, що мала об'єм 1,5 мл. Камера перфузувалася проточним розчином Тіроде (швидкість протоку 2-2,5 мл/хв.), насиченим карбогеном (95% О₂ + 5% СО₂). Температуру розчину підтримували на постійному рівні 37,0 0,5 ^о за допомогою ультратермостата (1 ТЖ-0-03). Склад фізіологічного розчину був наступним (мМ): Na⁺ - 151; K⁺ - 4,7; Mg⁺⁺ - 1,2; Ca⁺⁺ - 2,0; Cl^- - 144,4; H₂PO₄ - 1,3; HCO₃ - 16,3; глюкоза - 8,8; ( рН 7,2 - 7,4).

Першим кроком у проведенні наших електрофізіологічних експериментів була внутрішньоклітинна реєстрація відповідей поодиноких нейронів на пряме електричне подразнення. Подача стимулу та відведення електричних сигналів від клітин ганглія проводили за допомогою скляних мікроелектродів, заповнених розчином хлориду калію (2,5 М). Опір електродів становив від 80 до 150 МОм. Мікроелектроди підводили до ганглія вертикально, за допомогою масляного мікроманіпулятора, який входить у комплект стереотаксичної установки "СЕЖ-3".

Прегангліонарний нерв всмоктували у подразнюючий електрод (скляну піпетку, внутрішній діаметр якої був близьким до діаметра прегангліонарного нерва; в середині піпетки знаходився хлор-срібний електрод). Процедуру стимуляції реалізували через комп'ютер - задавали тривалість та амплітуду подразнюючого імпульсу, - та цифрово-аналоговий перетворювач (ЦАП). Подразнення здійснювали прямокутними поштовхами деполяризуючого струму тривалістю від 0,1 до 0,5 мс, напругою 2,5 - 4,0 В. У кожному окремому випадку показники подразнюючих імпульсів підбирали експериментальним шляхом так, щоб синаптична відповідь нейрона не призводила до генерації потенціалу дії, тобто застосовували допорогові подразнення. Референтний електрод розміщували у розчині камери. Синаптичні сигнали нейронів відводили за допомогою внутрішньоклітинного електрода, який через підсилювач та аналогово-цифровий перетворювач з'єднувався з ЕОМ. Вихідні значення амплітуди ЗПСП різних нейронів варіювали від 14 до 20 мВ, а величина мембранного потенціалу спокою (МПС) становила -61,2 3,1 мВ (n=15).

Управління електрофізіологічними експериментами та обрахунки первинних даних (зміни амплітуди ЗПСП та МПС нейронів) здійснювали за допомогою спеціалізованої комп'ютерної програми, розробленої інженером відділу фізіології вегетативної нервової системи О.В. Ріхальським.

Гістохімічні забарвлювання. Імуногістохімічне забарвлювання для виявлення різних підтипів - та -субодиниць НХР на мембранах нейронів. Субодиничний склад НХР ідентифікували з використанням непрямого імуногістохімічного методу, застосовуючи мишачі моноклональні антитіла до ₃- та ₅- субодиниць, а також кролячі поліклональні афінноочищені антитіла до ₄-, ₇-, ₂- та ₄-субодиниць НХР. Виявлення продуктів імунного зв'язування проводили за допомогою обробки іншими антитілами - кон'югатами антимишачих та антикролячих імуноглобулінів з пероксидазою хрону; як хромоген використовували 3,3'-диаміно-бензидин-тетрагідрохлорид (ДАБ) згідно з методом Грема та Карновські.

Для контролю специфічності імунного зв'язування антитіл із відповідними субодиницями НХР були проведені досліди із застосуванням нормальних антимишачих та антикролячих сироваток. Ці сироватки гарантовано не містили імуноглобулінів, специфічних щодо синтетичних пептидів, котрі відповідали фрагментам 181-192 мембранного компонента пептидних ланцюгів - субодиниць та фрагментам 183-192 -субодиниць НХР (замість антитіл до НХР).

Забарвлення для виявлення моноаміноксидази (МАО). Для фенотипічної ідентифікації нейронів НБГ була використана методика гістохімічного забарвлювання, що дозволяє виявити МАО; цей прийом забезпечує адекватне цитоплазматичне забарвлення гангліонарних нейронів. Виявлення МАО - ферменту мітохондріальної мембрани, що забезпечує окислювальне дезамінування катехоламінів та 5-гідрокситриптаміну, - проводили за методом Гленнера у модифікації Ель-Бадаві та Шенка.

При виконанні морфометричних розрахунків сумарне збільшення залишалось постійним (х380); відповідно, сталою була і площа зору. Для одержання усереднених характеристик, розрахунки проводили у п'яти ділянках, чотири з яких розташовувались по обох боках вузла, а одна у його центрі. Аналізовані ділянки препаратів приблизно співпадали, вони прилягали до нервових трактів, що містять у собі прегангліонарні та постгангліонарні волокна.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

нікотиновий холінорецептор ссавець ганглій

Морфометричні характеристики препаратів НБГ. Анатомо-морфометричні дослідження поводились на препаратах НБГ, забарвлених для виявлення МАО. НБГ морської свинки складався з двох вузлів - рострального та каудального, які були сполучені міжвузловими комісуральними трактами. Розміри каудального вузла статистично вірогідно перевищували такі рострального. Гангліонарні вузли містили великі нейрони та дрібні клітини, які досить чітко відрізнялися за розмірами. Середні значення великого та малого діаметрів сом великих (релейних) нейронів НБГ становили відповідно 53,8 1,8 та 33,6 1,4 мкм (n=20). Середня кількість великих нейронів у полі зору в наших умовах складала 15,7 1,3 одиниць (n=10).

У дрібних гангліонарних клітин середнє значення великого діаметра їх сом дорівнювало 14,1 0,5, а малого - 7,5 0,4 мкм (n=50). Встановлені нами загальні анатомічні ознаки нейронів НБГ морської свинки в цілому відповідали характеристикам, про які повідомлялося Журжевським та Міллером, 1994.

Виявлення різних підтипів - та - субодиниць НХР на нейронах НБГ морської свинки. З метою перевірки специфічності зв'язування антитіл проти різних підтипів - та - субодиниць НХР із відповідними для них антигенами, нами проведена контрольна серія електрофізіологічних експериментів, в яких замість зазначених антитіл були застосовані неспецифічні імуноглобуліни кроля (Sigma). Не зареєстровано вірогідних змін ЗПСП та МПС досліджених нейронів (n=4).

Перед початком електрофізіологічних досліджень із антитілами експериментальним шляхом були встановлені їх насичуючі концентрації, які становили від 20 до 40 мкг/мл.

Виявлення ₃-субодиниці НХР. Результати імуногістохімічних забарвлень. Під час мікроскопічного аналізу препаратів НБГ, оброблених із застосуванням ₃-специфічних антитіл, було встановлено наявність "пероксидазного" забарвлення як на мембранах великих нейронів, так і дрібних гангліонарних клітин.

Мічені дрібні клітини були присутні і в каудальному, і в ростральному вузлах. Імунопероксидазне забарвлення виявлялося лише на сомах таких клітин, а їх відростки в жодному разі не мали чіткого імунного мічення. ₃-Мічені дрібні клітини нерівномірно розподілялися у вузлах ганглія: в окремих ділянках препарату їх чисельність коливалась від 42 до 150 одиниць у полі зору. Ділянки найщільнішої локалізації таких клітин, як правило, співпадали з зонами переважного розташування ₃- імунореактивних великих нейронів. Результати електрофізіологічних експериментів. Дію ₃-специфічних антитіл досліджували на 20 нейронах. При концентрації блокатора 20 мкг/мл відносна інтенсивність пригнічення синаптичних відповідей у різних нейронів коливалась від 15 до 45 %, а середня величина зменшення амплітуди ЗПСП у 17 з 20 клітин становила 29,71,8 %, тоді як 3 нейрони були не чутливими до дії даного типу антитіл.

Антитіла проти ₃-специфічних антитіл не викликали вірогідних змін МПС досліджуваних нейронів.

Виявлення ₅- субодиниці НХР на нейронах НБГ морської свинки. Результати імуногістохімічних забарвлень. На препараті НБГ було проведено обрахування відносних кількостей імунореактивних клітин, а також встановлення їх топографії. Дрібні гангліонарні клітини мали інтенсивне ₅-специфічне забарвлення, яке виявлялося не лише на їх сомах, а також на розгалужених відростках, які формували щільну мережу у тканині ганглія. Розташування дрібних клітин по площині препарату було досить рівномірним. У ростральному вузлі їх середня кількість у полі зору складала 161 9 (n=5), а в каудальному - 140 13 (n=5) одиниць.

Результати електрофізіолгічних експериментів. Дослідження ефекту ₅-специфічних антитіл проведено на 20 нейронах. Робоча концентрація антитіл у суперфузуючому розчині становила 20 мкг/мл.

Лише один нейрон виявився не чутливим до дії даного блокатора, амплітуда ЗПСП 19 інших зменшувалась під дією ₅- специфічних антитіл у межах від 26 до 52 %. Підвищення концентрації антитіл, проти ₅- субодиниці НХР, у суперфузуючому розчині до 40 мкг/мл спричинювало додаткове зменшення амплітуди ЗПСП у 5 з 19 нейронів до 60 %. Однак, дані антитіла у концентрації 60 мкг/мл додаткових впливів вже не викликали.

Подібно до ₃- специфічних антитіл, зазначені антитіла не спричинювали помітних зрушень МПС у досліджуваних нейронів.

Вивчення сумісної дії антитіл, специфічних до ₃- та ₅-субодиниць НХР, на синаптичну передачу через НБГ морської свинки.

В дослідах із почерговим застосуванням ₃- та ₅-специфічних антитіл (тобто після дослідження ефекту, спричиненого ₅- специфічними антитілами, та його відмивання, проводили послідовне суперфузування препарату антитілами проти ₃-субодиниці НХР) було досліджено 19 нейронів, а блокатори застосовували в однакових концентраціях, а саме 20 мкг/мл. У даній серії експериментів були отримані наступні результати. 10 нейронів виявляли однаково високу чутливість до обох типів антитіл. Під дією ₅-специфічних антитіл їх синаптичні відповіді зменшувались на 41,2 3,2 %, а під дією ₃- специфічних антитіл - на 38,4 3,5 %. 6 Нейронів виявляли вищу чутливість до ₅-специфічних антитіл, ніж до ₃. Амплітуда їх ЗПСП під дією ₅- специфічних антитіл зменшувалась на 38 2 %, а під впливом ₃- специфічних антитіл лише на 15,6 1,2 %.

3 Нейрони були більш чутливими до ₃- специфічних антитіл, ніж до ₅. Перший тип антитіл викликав пригнічення синаптичних відповідей клітин на 39,7 3,4 %, тоді як ₅- специфічні антитіла - на 18 5%.

При суперфузуванні ₅- специфічних антитіл на тлі ефекту, викликаного ₃- специфічними антитілами (без проміжного відмивання), спостерігали повне - 100 % - пригнічення амплітуди ЗПСП досліджуваних нейронів. Під час відмивання синаптичні відповіді частково відновлювались.

Виявлення ₄- субодиниці НХР на нейронах НБГ. Результати імуногістохімічних забарвлень. Забарвлювання препаратів НБГ антитілами до ₄- субодиниці НХР показало, що ані в ростральному, ані у каудальному вузлах жоден з великих нейронів не виявляв специфічного імунного мічення, ₄- специфічне забарвлення спостерігалося тільки на дрібних гангліонарних клітинах.

У ростральному вузлі препарату дві ділянки - в місці відходження ободового нерва та міжвузлових комісур - вміщували значну кількість (162 20) інтенсивно забарвлених дрібних клітин. Імунне мічення виявлялося не лише на сомах, а і на відростках. У трьох інших ділянках рострального вузла, у місці входу міжбрижового тракту та поперекового L₂-нерва, кількість дрібних клітин, імунореактивних до ₄-специфічних антитіл, була значно меншою і становила в середньому 81 3 одиниць. У каудальному вузлі лише одна ділянка (біля міжвузлових комісур) характеризувалась густим зосередженням на ній імунозабарвлених дрібних клітин (до 215 одиниць у полі зору). У чотирьох інших ділянках (в місцях відходження ободового, а також обох підчеревних нервів) кількість таких клітин дорівнювала в середньому 70,7 15,1 одиниць.

Результати електрофізіологічних експериментів. Дослідження дії антитіл, специфічних до ₄- субодиниці НХР, проведено на 10 нейронах. В експериментах з ₄- антитілами застосовували такі їх концентрації - 30 та 60 мкг/мл. Проте, не зафіксовано ні змін амплітуди ЗПСП, ні змін МПС досліджуваних клітин.

Виявлення ₇-субодиниці НХР на нейронах НБГ. Результати імуногістохімічних забарвлень. ₇-Специфічне імуномічення було виявлено на сомах та відростках тільки дрібних гангліонарних клітин. Середні значення кількості ₇-імунних клітин у ростральному вузлі дорівнювали 91 13, а у каудальному - 90,3 12,4 одиниці. Соми незабарвлених великих нейронів були щільно оточені забарвленими сомами та "обплетені" відростками дрібних клітин. Таким чином, відносна кількість таких "обплетених" великих гангліонарних нейронів у ростральному та каудальному вузлах препарату становила в середньому 17,4 6,9 та 42,1 8,7 %, відповідно, а по всьому НБГ у цілому - 29,7 6,9 %.

Результати електрофізіологічних експериментів. На 15 нейронах НБГ досліджували дію ₇-специфічних антитіл, робоча концентрація яких була рівна 30 мкг/мл. Дані антитіла викликали полегшення синаптичної передачі у ганглії - амплітуда ЗПСП досліджуваних нейронів збільшувалась на 37 6 % у порівнянні з її контрольним значенням, хоч МПС нейронів під час дії блокатора залишався стабільним. Підвищення концентрації антитіл у суперфузуючому розчині до 60 мкг/мл не виявляло додаткового впливу на зазначені характеристики клітин.

Дослідження дії метиллікаконітину (МЛА). Імуногістохімічні дослідження. Для того, щоб визначити чи співпадають місця зв'язування молекул МЛА та молекул антитіл проти ₇-субодиниці НХР на ₇- вмісному холінорецепторі, нами було проведено пероксидазне забарвлювання нейронів НБГ ₇-специфічними антитілами після інкубації препарату у розчині МЛА. Другий препарат НБГ був контрольним: його забарвлювання проводили паралельно, однак без інкубації у розчині МЛА. Результати показали, що загальні риси контрольного препарату були аналогічними таким попередніх препаратів, які зазнавали пероксидазної обробки з антитілами проти ₇-субодиниць НХР.

Мікроскопічний аналіз препарату НБГ, який зазнавав обробки в розчині МЛА, показав, що ганглій повністю зберіг свої морфологічні характеристики - можна чітко розрізнити великі нейрони, дрібні клітини, їх відростки, а також численні нервові волокна. Проте, жоден із перерахованих структурних елементів не виявляв ₇-специфічного мічення. Таким чином, нейрони НБГ після інкубації препарату у розчині МЛА втрачали здатність до пероксидазного забарвлювання ₇- специфічними антитілами.

Результати електрофізіологічних експериментів. В експериментах із специфічним блокатором ₇-вмісних НХР - МЛА - було досліджено 10 нейронів при цьому МЛА використовували у концентрації 1х10^-8 М/л. Як і в дослідах із використанням ₇- специфічних антитіл, спостерігали збільшення амплітуди ЗПСП досліджуваних клітин на 32 5%. МЛА не викликав змін МПС нейронів.

Також були проведені досліди, в яких на тлі ефекту, спричиненого ₇-специфічними антитілами у концентрації 30 мкг/мл, досліджували дію МЛА у концентрації, яка специфічно блокує ₇-вмісні НХР. Результати показали, що не залежно від почерговості додавання зазначених блокаторів у суперфузуючий розчин, (без проміжного відмивання викликаного впливу), ефективним був лише перший. Тобто на тлі блокади, спричиненої ₇- специфічними антитілами, розчин МЛА не викликав змін амплітуди ЗПСП та МПС досліджуваних нейронів.

Виявлення ₂- та ₄- субодиниць на нейронах НБГ. Результати імуногістохімічних забарвлень. На препаратах НБГ, забарвлених із використанням в₂- специфічних антитіл, ні у ростральному ні у каудальному вузлах не було виявлено жодного великого гангліонарного нейрона, який би виявляв імунореактивність до зазначеного типу антитіл. Що стосується дрібних гангліонарних клітин, то нами була виявлена не велика їх популяція - близько 20 одиниць - у каудальному вузлі ганглія, а саме в області відродження ободового нерва. в₂-Специфічне мічення мали не лише соми цих клітин, а також їх відростки, які переплітались між собою та формували щільну мережу у даній області препарату.

в₄-Специфічне імунне мічення також виявлялось на сомах дрібних гангліонарних клітин, які щільно прилягали до сом великих гангліонарних нейронів. Однак, відростки таких клітинне мали специфічного імунного мічення. Дрібні клітини, які були забарвлені в₄- специфічними антитілами, розташовувались нерівномірно, їх кількість була близькою до такої виявленої на препараті, обробленому б₃-специфічними антитілами і становила в різних ділянках від 50 до 130 одиниць у полі зору.

Місця переважного розташування в₄- імунореактивних нейронів були близькими таким для великих клітин, які мали специфічне забарвлення до б₃-специфічних антитіл.

Результати електрофізіологічних експериментів. В електрофізіологічних експериментах, в яких в₂- та в₄-специфічні антитіла використовували у якості селективних блокаторів, було досліджено 10 нейронів. Аплікацію обох типів антитіл проводили почергово на кожну клітину, здійснюючи проміжне відмивання ефекту, спричиненого першим із блокаторів. Робоча концентрація антитіл у суперфузуючрму розчині становила 30 мкг/мл, її підвищення вдвічі (до 60мкг/мл) не підсилювало первинного ефекту.

Були отримані наступні дані. в₂- Специфічні антитіла не були ефективними. Вони не викликали вірогідних змін амплітуди ЗПСП чи МПС жодного із досліджуваних нейронів.

Приблизно на 7-9 хв. від початку аплікації в₄- специфічних антитіл ми починали фіксувати зменшення амплітуди ЗПСП досліджуваної клітини. В середньому, величина пригнічення синаптичних відповідей 10 проаналізованих нейронів склала 25,5 ± 1,8 % у порівнянні з контролем. Як і попередні підтипи антитіл, в₄-специфічні антитіла не змінювали МПС нейронів НБГ. Дослідження особливостей розташування ₃-, ₅- та ₄- імунореактивних нейронів, а також ₄- та ₇-імунореактивних дрібних клітин.

Схематичне зображення НБГ морської свинки дає можливість зрозуміти морфологічні особливості препарату, а також наглядно оцінити принципи локалізації ₃-, ₅- та ₄- імунореактивних нейронів, а також ₄-, ₇- позитивних дрібних клітин.

Ділянки переважного зосередження великих гангліонарних нейронів, які мали ₃-, ₅- та ₄-специфічне забарвлення, були досить близькими і прилягали до основ головних нервових трактів НБГ. У ростральному вузлі ₃-, ₅- та ₄- мічені нейрони переважно локалізувалися в місцях відходження міжбрижового та ободового нервових трактів, біля міжвузлових комісур та поперекового L₂-нерва. В каудальному вузлі ділянки найщільнішого зосередження ₃-, ₅- та ₄- позитивних нейронів знаходились біля ободового та обох підчеревних трактів, а також в основі поперекового L₄- нерва.

На препаратах НБГ, оброблених із використанням ₄- специфічних антитіл, виявлено, що дрібні клітини розташовувались нерівномірно, переважно в основі міжвузлових комісуральних трактів; в меншій кількості - в місцях відходження ободового та підчеревних нервів.

₇- Імунореактивні дрібні клітини у ростральному вузлі розташовувалися здебільшого в місці відходження міжбрижового тракту, біля ободового нерва та міжвузлових нервових комісур, а в каудальному - біля поперекового L₄, обох підчеревних нервів, а також ободового нервового тракту. Так, місця переважної локалізації ₄- та ₇-забарвлених дрібних клітин суттєво відрізнялися.

Не численна популяція дрібних клітин (близько 20ти одиниць), які виявляли імунореактивність до ₂- специфічних антитіл, була виявлена у каудальному вузлі препарату НБГ, у місці відходження ободового нерва.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Головне завдання нашої роботи полягало у визначенні субодиничного складу НХР нейронів НБГ морської свинки. Адже на сьогодні показано, що у цьому ганглії замикаються периферичні рефлекторні шляхи, які проходять у складі міжбрижового тракту, підчеревних та ободового нервів (Пасічніченко, 2000). Така рефлекторна передача є чутливою до аплікації холінергічних блокаторів (Булигін, 1983). Вважалось актуальним визначити субодиничний склад холінорецепторів, які забезпечують синаптичну передачу через НБГ у нервовому шляху прегангліонарний нерв (міжбрижовий тракт) - нейрони ганглія.

Для виконання поставленого завдання нами були застосовані антитіла проти ₃-, ₄-, ₅-, ₇ -, а також ₂- та ₄-субодиниць НХР, оскільки на нейронах різних вегетативних гангліїв вже показано наявність рецепторів, які мають у своєму складі перераховані підтипи субодиниць.

Попередньо були проведені контрольні морфометричні дослідження НБГ, а також зареєстровано синаптичні відповіді нейронів ганглія, а саме збуджуючі постсинаптичні потенціали (ЗПСП) у відповідь на подразнення прегангліонарного нерва.

Виявлення ₃-субодиниці НХР на нейронах НБГ. ₃- Субодиниця є найбільш поширеною в автономних гангліях, а ₃₄- вмісний НХР називають “рецептором гангліонарного типу”, оскільки, наявність такого показано на нейронах багатьох вегетативних гангліїв, зокрема, ВШГ щура (Sivilotti et al., 1997), циліарному ганглії курчати (Jacob 1988; Vernalis et al., 1993) та ін. Встановлено (Skok M. et al., 1999), що відсоткові співвідношення ₃- імунореактивних нейронів у ВШГ та інтракардіальних гангліях щура, складають 100 % та 32 %, відповідно. З іншого боку, АХ-індуковані потенціали та АХ-струми клітин вищеназваних гангліїв зазнають пригнічення під час дії ₃-специфічних антитіл (Skok M., et al., 1999; Skok V., et al., 2000). Так, за результатами наших досліджень, синаптичні відповіді 85 % нейронів НБГ виявились чутливими до дії ₃- специфічних антитіл. Імуногістохімічно встановлено, що більше половини (біля 58 %) великих нейронів виявляли імунореактивність до антитіл, проти ₃-субодиниці НХР. Такі дані свідчать про наявність ₃-вмісних холінорецепторів на мембранах великих гангліонарних нейронів та про їх безпосередню участь у здійсненні синаптичної передачі через НБГ морської свинки.

Хоч у різних дослідах робоча концентрація антитіл була сталою (30мкг/мл), відносна інтенсивність пригнічення синаптичних відповідей у різних нейронів коливалась у межах від 15 до 45 %. Даний факт може свідчити про рецепторну гетерогенність нейронів у межах одного ганглія, тобто кожна клітина містить набір НХР, які відрізняються за їх субодиничним складом (Skok V., 2002).

Виявлення ₅-субодиниці НХР та вивчення сумісної дії ₃- та ₅- специфічних антитіл на нейронах НБГ. НХР, до складу яких належить б₅- субодиниця, також є широко представленими у вегетативних гангліях (Lindstrom and Nelson, 1999), зокрема на нейронах верхнього шийного та інтракардіальних гангліїв щура (Skok M., et al., 1999), циліарному ганглії курчати (Conroy, et al., 1992), а також на симпатичних нейронах курчачих ембріонів (Role, 1998) Нами встановлено, що дія антитіл, специфічних до ₅- субодиниці НХР, також виявлялась у пригніченні амплітуди ЗПСП 95 % досліджуваних нейронів.

Досліди із послідовним додаванням ₃- та ₅- специфічних антитіл та проміжним відмиванням ефекту, спричиненого першим із блокаторів, показали, що величини пригнічення синаптичних відповідей, викликаних різними типами антитіл, у 50 % досліджуваних нейронів були близькими і вірогідно не відрізнялись. Такі результати можуть свідчити з одного боку про те, що ці клітини містять приблизно однакову кількість ₃- та ₅- вмісних НХР, а з іншого, що ці субодиниці є складовими частинами одного рецептора. На користь другого твердження може свідчити аналіз мікроскопічного дослідження препаратів НБГ, оброблених ₃- та ₅- специфічними антитілами, який показав, що місця розташування ₃- та ₅- імунореактивних нейронів приблизно співпадають, а відсоткові співвідношення ₃- та ₅- імунореактивних нейронів (58,3 10,2 % та 63,4 5,1 %, відповідно) також є досить близькими і не відрізняються вірогідно.

Дані про те, що одна частина нейронів більш інтенсивно блокувалась ₅-, ніж ₃- специфічними антитілами, а інша - навпаки, була більш чутливою до ₃- , ніж до ₅- специфічних антитіл, можна пояснити як різною чутливістю рецепторних ₃- та ₅- субодиниць до дії антитіл, так і різним складом досліджуваних НХР. Адже літературні джерела свідчать, що ₅- субодиниця може формувати функціональний холінорецептор лише в композиції ₃-, в₂-, та в₄- субодиницями (Lindstrom, 1996), а комплекси ₅- з б₃в₂- чи б₃в₄-субодиницями суттєво відрізняються за своїми кінетичними та фармакологічними властивостями (Lindstrom and Nelson, 1999).

Виявлення в₄-субодиниці НХР. У дослідженнях, проведених із застосуванням в₄-специфічних антитіл були одержані результати, обговорення яких хотілося б побудувати на основі їх порівняння із даними, отриманими для препаратів, оброблених із б₃- та б₅- специфічними антитілами. Так, на імуногістохімічних препаратах НБГ, забарвлених в₄-специфічними антитілами, відносна кількість імунореактивних нейронів складала 59,8 ±7,5 %, на б₃-оброблених препаратах - 58,3±10,2 %, а на б₅ - 63,4±5,1 %. Добре помітно, що ці величини вірогідно не відрізняються. Окрім того, місця переважного розташування в₄-, б₃- та б₅- імунореактивних нейронів на препаратах були дуже близькими. Чутливість до в₄-специфічних антитіл у електрофізіологічних експериментах виявляли 100 % досліджених нейронів, до б₃- 85, а до б₅- 90 %. На нейронах циліарного ганглія курчати встановлено, що більшість холінорецепторів мають б₃в₄б₃в₄б₅-субодиничний склад та незначна їх частина містить б₃в₄б₃в₂б₅-субодиниці (Conroy, et al., 1997). Приймаючи до уваги літературні дані, можна дійти висновку, що перераховані підтипи субодиниць можуть формувати б₃в₄б₅- вмісний або б₃в₄- вмісний НХР. Виявлення б₇-субодиниці НХР. Дані, отримані із використанням б₇- специфічних антитіл, свідчать про участь б₇-вмісних НХР у синаптичній передачі через НБГ морської свинки. Проте місця локалізації таких рецепторів вимагають подальшого детального вивчення. Гіпотетично можна припустити, що б₇- вмісні НХР, які містяться на дрібних гангліонарних клітинах, спроможні опосередковано модулювати синаптичну передачу у ганглії. Адже саме б₇- імунопозитивні дрібні клітини знаходились у особливо щільних контактах із основними нейронами НБГ.

Виявлення ₄- та в₂- субодиниць НХР. В наших електрофізіологічних експериментах ні ₄-, ані ₂- специфічні антитіла не впливали на показники синаптичної активності нейронів НБГ. Не було виявлено ₄- та ₂- специфічного забарвлення на мембранах клітин імуногістохімічно оброблених препаратів НБГ. Таким чином, не показано наявності ₄- та ₂- вмісних НХР на нейронах НБГ та найбільш імовірно, що такі НХР не беруть участі в реалізації синаптичної передачі в досліджуваному нервовому шляху. Відомо, що ₄- та ₂- вмісні НХР є більш характерними для центральної, а не периферичної нервової системи (Lindstrom, 1996; Lucas, еt al., 1999). Проте, методом імунопероксидазного забарвлення було показано, що близько 50 % інтракардіальних нейронів та нейронів ВШГ щура містили ₄- позитивні мітки (Skok M., еt al., 1999).

Особливості розташування ₃- , ₅- та ₄- імунореактивних нейронів на препаратах НБГ морської свинки. Як зазначалось вище, місця переважної локалізації ₃-, ₅- та ₄-імунопомічених нейронів найчастіше співпадали. В ростральному вузлі вони були розподілені рівномірно. В каудальному - переважна більшість великих гангліонарних клітин, які були імунопозитивними до ₃-, ₅- та ₄- специфічних антитіл, розташовувалась в областях люмбального, ободового та обох підчеревних нервових трактів. За даними Журжевського та ін., 1983, аксони нейронів, локалізованих в цих областях, залучені до формування нервових трактів у складі ободового та підчеревних нервів. Таким чином, приймаючи до уваги дані попередніх електрофізіологічних досліджень, можна дійти висновку, що саме ₃-_{, 5}- та ₄ - вмісні НХР цих нейронів відіграють вирішальну роль у реалізації синаптичної передачі в НБГ морської свинки та, ймовірно, залучені до здійснення основних периферичних рефлексів, які замикаються на рівні НБГ.

Твердження про те, що нейрони у вегетативних гангліях, як правило, зосереджені поблизу пре- та постгангліонарних нервових трактів, не є новим. Більш як 25 років тому на препараті ВШГ кота показано, що для цитоархітектоніки даного ганглія характерним є його розподіл на 25-30 великих скупчень нейронів, пов'язаних із входами прегангліонарних та виходами постгангліонарних нервових волокон. Такі клітинні скупчення розмежовані сполучнотканинними септами та гілками судин (Коваль Л., 1974).

Виявлення різних підтипів субодиниць НХР на дрібних гангліонарних клітинах. Основні характеристики дрібних гангліонарних клітин за розмірами сом, формою відростків та особливостями розташування є подібними до таких, встановлених для малих інтенсивно-флюоресціюючих (МІФ) клітин тазового ганглія морської свинки та ВШГ щура. Літературні дані не заперечують можливої наявності НХР на клітинах цього типу, зокрема, pобота Фурнеса та ін., 1974, виконана на парагангліях НБГ морської свинки показала, що мембрани сом та відростків даного типу клітин містять холінорецептори.

Проблема залучення дрібних клітин до синаптичної передачі у вегетативних гангліях була сформульована давно, однак, не є остаточно вирішеною. За даними (Mascorro, et al., 1994), МІФ клітини у вегетативних гангліях можуть виконувати роль гальмівних інтернейронів. Зокрема, у ВШГ щура та кроля, у сонячному сплетенні морської свинки МІФ-клітини отримують синаптичні входи, а також формують істинні синапси на дендритах та сомах основних гангліонарних нейронів. В нашій роботі на препаратах, оброблених ₇- специфічними антитілами, встановлено наявність неімунних великих гангліонарних нейронів, оточених ₇- імунореактивними сомами та відростками дрібних клітин. Цей результат дозволяє припустити наявність контактів між великими нейронами та дрібними клітинами в НБГ. Приймаючи до уваги дані наших електрофізіологічних досліджень, можна припустити, що ефект полегшення синаптичної передачі був спричинений залученням ₇-вмісних НХР, розташованих позасинаптично, наприклад, на сомах чи відростках дрібних гангліонарних клітин. Проте за свідченнями іншої публікації (Wonnacott, et al., 1990), пресинаптично можуть розташовуватись на тільки ₇-вмісні НХР. Зокрема, у ВШГ щура встановлено пресинаптичну локалізацію холінорецепторів, що містили ₃-субодиницю (Visi and Lendavi., 1999).

ВИСНОВКИ

1. Застосування антитіл, специфічних до б₃-, б₅- та в₄-субодиниць нікотинових холінорецепторів (НХР) (амінокислотні залишки 181-192 та 183-192 для в-субодиниць) селективно і ефективно інгібує синаптичні відповіді нейронів НБГ, викликані стимуляцією прегангліонарних волокон міжбрижового тракту. Це свідчить, що НХР, безпосередньо залучені у синаптичну передачу через досліджуваний ганглій, є б₃-, б₅- та в₄-вмісними.

2. Аплікація б₄- та в₂- специфічних антитіл не впливає на амплітуду збуджуючих постсинаптичних потенціалів (ЗПСП) у нейронах НБГ. Отже, НХР, які мають у своєму складі б₄- та в₂- субодиниці, не беруть участі у реалізації синаптичної передачі через НБГ морської свинки.

3. Аплікація б₇-специфічних антитіл або блокатора б₇-вмісних НХР метиллікаконітину (МЛА) призводила до збільшення амплітуди ЗПСП у нейронах НБГ. Отже, НХР, які містять у своєму складі б₇-субодиницю, спроможні опосередковано модулювати синаптичну передачу через НБГ.

4. Імуногістохімічне непряме забарвлювання препаратів НБГ показало, що 58,3, 63,4 та 59,8 % нейронів виявилися імунопозитивними до б₃-, б₅- та в₄-специфічних антитіл відповідно, тоді як б₄- та в₂- специфічні антитіла не спричинювали специфічного забарвлення мембран нейронів НБГ.

5. Чисельність популяцій та топографія б₃-, б₅- та в₄- імунореактивних нейронів були дуже близькими. Ці клітини переважно розташовувались у зонах відходження основних нервових трактів (міжбрижового, ободового та обох підчеревних нервів).

6. Співставлення наведених вище даних робить вірогідним припущення, що б₃-, б₅- та в₄- субодиниці можуть належати до складу одних і тих самих холінорецепторів, котрі відіграють основну роль у синаптичній передачі через НБГ.

7. Соми і відростки дрібних клітин НБГ демонстрували імунореактивність як до б₃-, б₅- і в₄-, так і до б₄-, б₇- та в₂- специфічних антитіл, однак місця переважного розташування дрібних гангліонарних клітин, імунопозитивних до різних підтипів антитіл, істотно відрізнялись. б₇-Імунореактивні дрібні клітини знаходились у особливо щільних контактах із незабарвленими сомами основних нейронів ганглія.

8. Результати визначення субодиничного складу НХР на нейронах НБГ морської свинки, отримані методом імуногістохімічного забарвлювання, досить добре узгоджуються із даними, отриманими у електрофізіологічних експериментах.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

1. Коваль О.М. Участь -субодиниць нікотинового холінорецептора в синаптичній передачі в нижньому брижовому ганглії морської свинки // Нейрофизиология / Neurophysiology - 2000. - Том 32, № 3. - С. 196 - 198.

2. Коваль О.М., Войтенко Л.П., Скок М.В., -Субодиничний склад нікотинових холінорецепторів нейронів нижнього брижового ганглія морської свинки: імуногістохімічні дослідження. // Нейрофизиология/ Neurophysiology - 2003.- Том 35, №2. - С. 99-107.

3. Коваль О.М., Скок М.В., Скок В.І. -Субодининий склад нікотинових холінорецепторів нейронів нижнього брижового ганглія морської свинки: електрофізіологічне дослідження // Нейрофизиология/ Neurophysiolgy.- 2003.- Том 35, № 1. - С. 9-19