Синтез мікробного екзополісахариду етаполану на суміші ростових субстратів

Встановлення складу і фізико-хімічних властивостей етаполану.

Вплив очищених препаратів етаполану на інфекційність вірусів рослин досліджували, додаючи їх у концентрації 10-1000 мкг/мл до суспензії вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ, штам U1) або Х-вірусу картоплі (місцевий ізолят) та інокулюючи сумішами листя рослин-індикаторів: дурману (Datura stramonium L.) та гомфрени (Gomphrena globosa L.). Здатність ЕПС індукувати у рослин стійкість щодо ВТМ-інфекції вивчали, ін'єкуючи водні розчини полісахариду (100-2000 мкг/мл) в листя надчутливого до цього вірусу сорту тютюну (Nicotiana tabacum L.) Імунний 580, N. sanderae hort або дурману за 2 доби до інокуляції. Ступінь пригнічення вірусної інфекції оцінювали за кількістю локальних некрозів на дослідній і контрольній (обробленій водою) половинках листка.

РОЗДІЛ 4. Особливості С₆-метаболізму штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ)

Встановлено, що Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 росте та синтезує ЕПС на широкому наборі вуглеводних субстратів (моно-, ди- та полісахаридах).

Ензимологічні дослідження показали, що катаболізм глюкози у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) здійснюється за шляхом Ембдена-Мєйєргофа-Парнаса (гліколіз, 1,6-фруктозобіфосфатний шлях) та Ентнера-Дудорова (КДФГ-шлях) (табл. 1), про що свідчила висока активність ключових ферментів (6-фосфофруктокінази та 6-фосфоглюконатдегідратази, відповідно). Піруват залучається до метаболізму за участю піруватдегідрогенази. Наявність -кетоглутаратдегідрогеназної активності свідчить про те, що в клітинах даних бактерій, очевидно, функціонує повний ЦТК. Поповнення пулу інтермедіатів для реакцій конструктивного метаболізму відбувається за участю піруваткарбоксилази (табл. 1).

Рис. 1. Накопичення біомаси та споживання субстратів при вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на суміші етанолу (0,5%, за об'ємом) і глюкози (0,5%, мас.): 1 - етанол; 2 - глюкоза; 3 - біомаса.

РОЗДІЛ 5. Енергетичні та біохімічні аспекти підвищення синтезу етаполану на суміші ростових субстратів

Раніше було показано, що окиснення етанолу та ацетальдегіду у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) каталізується НАД⁺- і НАДФ⁺-залежними ферментами (Пирог и др., 2002); катаболізм глюкози здійснюється за шляхом Ембдена-Мєйєргофа-Парнаса та Ентнера-Дудорова (див. розділ 4). Згідно “енергетичною” класифікацією субстратів Бабеля етанол є енергетично-надлишковим, а глюкоза - енергетично-дефіцитним субстратом. Наступний етап досліджень полягав у визначенні оптимального співвідношення концентрацій двох енергетично-нерівноцінних субстратів. При розрахунку концентрацій етанолу та глюкози нами були прийняті наступні припущення: 1) етанол використовується головним чином як джерело енергії, а на синтез біомаси та ЕПС витрачається вуглець глюкози; 2) 50% глюкози катаболізується за шляхом Ембдена-Мєйєргофа-Парнаса і 50% _ за шляхом Ентнера-Дудорова; 3) співвідношення Р/О дорівнює 2; 4) ЕПС містить 50% ацильованого полісахариду (АП) та 50% неацильованого полісахариду (НАП); 5) у складі повторюваної ланки АП міститься два залишки жирних кислот - лауринової (С12Н24О2) і пальмітинової (С16Н32О2); 6) НАДФН, що утворюється при катаболізмі етанолу та глюкози, є джерелом відновлювальних еквівалентів, які окиснюються до води через дихальний ланцюг.

На рис. 2. представлена передбачувана схема синтезу повторюваної ланки ацильованого полісахариду у випадку КДФГ-шляху катаболізму глюкози у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005. При утворенні етаполану енергія витрачається на синтез моносахаридів та жирних кислот, а генерується під час синтезу ПВК, глюкуронової кислоти та ацетил-КоА. Енергетичні потреби мікробного синтезу АП і НАП у перерахунку на моль використаної глюкози представлені в табл. 2.

Таким чином, генерація енергії при синтезі ЕПС з глюкози складає 1,42 моль АТФ/моль використаної глюкози (табл. 2).

Cинтез біомаси з ФГК (при використанні амонійного джерела азоту) можна представити у вигляді рівняння (Babel, 1979):

4 ФГК + NH₃ + 29 АТФ + 5,5 НАД(Ф)Н (С4H8O2N1)3, (1)

де (С₄H8O2N1)3 - формула моля біомаси.

Сумарні реакції перетворення етанолу та глюкози в ФГК відображаються наступними рівняннями:

З наведених вище рівняннь можна розрахувати, що при рості на глюкозі потреба в АТФ для синтезу біомаси (в розрахунку на моль глюкози) складає 17 молей. Ми припустили, що ця енергія може бути одержана з етанолу. З огляду на те, що при синтезі ЕПС з глюкози генерується 1,42 моль АТФ/моль використаної глюкози, за рахунок етанолу повинно бути отримано 17-1,42 = 15,58 моль АТФ. З рівняння перетворення етанолу в ФГК виходить, що для одержання такої кількості АТФ необхідно 3,12 моль етанолу. Отже, молярне співвідношення етанолу та глюкози в середовищі повинно складати 3,12:1 (наприклад, при концентрації глюкози в середовищі 1 мас. % концентрація етанолу повинна складати 1 % за об'ємом).

Таблиця 2

Енергетичні потреби синтезу ацильованого та неацильованого полісахаридів штамом Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 з глюкози

З даних табл. 3 видно, що при культивуванні продуцента на суміші субстратів кількість синтезованих ЕПС була вищою, ніж на моносубстратах. Але тільки при теоретично розрахованому співвідношенні концентрацій цих субстратів спостерігалось суттєве збільшення не тільки кількості синтезованих ЕПС, але й їхньго виходу по відношенню до біомаси та від субстрату.

При вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на суміші етанолу та глюкози відмічали також інтенсифікацію росту бактерій і синтезу ними ЕПС, про що свідчило підвищення рівня біомаси, ЕПС та в'язкості культуральної рідини через 24 год культивування.

Таким чином, у результаті проведених досліджень вперше показана можливість інтенсифікації синтезу мікробних ЕПС в умовах міксотрофного росту продуцента на суміші енергетично-нерівноцінних субстратів.

Примітки: 1) концентрація етанолу дана в % за об'ємом, концентрація глюкози - в мас.%; 2) як інокулят використовували культуру, вирощену на МПА.

РОЗДІЛ 6. Шляхи інтенсифікації синтезу етаполану на суміші етанолу та глюкози

Попередні дослідження показали, що при вирощуванні продуцента етаполану на суміші етанолу та глюкози часто спостерігали підвищення синтезу не тільки ЕПС, але й біомаси. Тому подальша робота була присвячена визначенню умов культивування бактерій, які забезпечують максимально повну конверсію вуглецю обох субстратів саме в ЕПС.

Раніше було показано, що Na⁺ є інгібітором ацетил-КоА-синтетази - ферменту, за участю якого ацетат залучається до метаболізму при вирощуванні Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) на етанолі (Пирог и др., 2002). Наші дослідження показали, що при культивуванні бактерій на середовищі з етанолом та глюкозою, яке не містить Na⁺, збільшувалась кількість синтезованих ЕПС, їхній вихід від субстрату та ЕПС-синтезуюча здатність. Дослідження способу приготування посівного матеріалу показало, що при використанні інокуляту, вирощеного на етанолі, спостерігали збільшення показників синтезу ЕПС у порівнянні з використанням посівного матеріалу, одержаного на МПА, глюкозі та суміші етанолу і глюкози. Відомо, що співвідношення концентрацій вуглецю та азоту в середовищі має суттєве значення для синтезу ЕПС. Як видно з наведених в табл. 4 даних, незалежно від вмісту етанолу та глюкози в середовищі, при зниженні концентрації азоту спостерігалось суттєве підвищення ЕПС-синтезуючої здатності, а також збільшення виходу ЕПС від субстрату.

Слід зазначити, що при збільшенні концентрації етанолу і глюкози спостерігається суттєве зниження виходу ЕПС від субстрату (табл. 4). На наш погляд, це може бути обумовлено двома причинами. По-перше, пригніченням активності ацетил-КоА-синтетази проміжними продуктами окиснення етанолу (НАДН і НАДФН), як було показано раніше (Пирог и др., 2003). По-друге, репресією синтезу цього ферменту глюкозою (Grundy et al., 1994; Kratzer, Schuller, 1995; Van den Berg et al., 1996; Kratzer, Schuller, 1997).

Дослідження активності ключових ферментів С2-метаболізму (алкоголь- та ацетальдегіддегідрогеназ, ацетаткінази, ацетил-КоА-синтетази) та С6-метаболізму (фосфофруктокінази та фосфоглюконатдегідратази) при вирощуванні Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) на суміші етанолу та глюкози показало, що їх значення були дещо нижчими у порівнянні з вирощуванням на відповідних моносубстратах. Більш значним було зниження на змішаному субстраті ізоцитратліазної та малатсинтазної активності (у порівнянні з культивуванням на етанолі) (табл. 5). Очевидно, ацетил-КоА, який утворюється з етанолу в ацетакіназній та ацетил-КоА-синтетазній реакціях, залучається до подальшого метаболізму переважно через ЦТК. Дійсно, при вирощуванні бактерій на суміші етанолу та глюкози активність ферментів ЦТК була вищою, ніж на етанолі (табл. 5). Таким чином, роль гліоксилатного циклу в метаболізмі штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) на змішаному субстраті є не такою значною, як на етанолі. Тим більше, що в умовах міксотрофного росту бактерій спостерігали підвищення активності піруваткарбоксилази - фермента анаплеротичної реакції, що забезпечує поповнення пулу С4-дикарбонових кислот при вирощуванні на вуглеводах. Разом з тим одночасне функціонування двох анаплеротичних шляхів (гліоксилатного циклу та піруваткарбоксилазної реакції) може свідчити про посилення глюконеогенезу в умовах міксотрофного росту бактерій. Дійсно, активність ФЕП-синтетази - ключового ферменту глюконеогенетичної гілки обміну речовин на змішаному субстраті була у 1,5 і 3 рази вищою, ніж на глюкозі та етанолі відповідно. Таким чином, результати ензимологічних досліджень свідчать про зміну направленності процесів біосинтезу на суміші С2-С6-субстратів в сторону утворення вуглеводів.

РОЗДІЛ 7. Фізико-хімічні властивості екзополісахаридів, синтезованих штамом Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на різних джерелах вуглецевого живлення

Встановлено, що, незалежно від природи субстрату (глюкоза, етанол, глюкоза+етанол),нативні ЕПС характеризувались практично однаковим вмістом вуглеводів (43-45%), піровиноградної (3,6-3,8%), уронових кислот (6,7-8,0%) і мінеральних компонентів (24-28%). Однак етаполан, синтезований на суміші етанолу та глюкози, містив більшу (в 1,5 рази) кількість жирних кислот, ніж той, що був одержаний на моносубстратах. Склад та співвідношення нейтральних моносахаридів у етаполані, синтезованому на середовищах з етанолом, глюкозою та на змішаному субстраті, був однаковим. Співвідношення глюкози, манози, галактози та рамнози в досліджуваних ЕПС складало 3:2:1:1.

Середня молекулярна маса етаполану, синтезованого на суміші етанолу і глюкози, була вищою, ніж на моносубстратах (1691 тис. та 1289-1437 тис., відповідно). Більш високе значення середньої молекулярної маси для такого ЕПС обумовлене зниженим вмістом у його складі компонентів до 2 млн. (22%).

Таблиця 5

Активність ферментів анаплеротичних шляхів, ЦТК та глюконеогенезу при вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) на етанолі, глюкозі та їх суміші

Дослідження реологічних властивостей ЕПС показало, що етаполан, синтезований на суміші етанолу та глюкози характеризувався більш високою в'язкістю у системі Cu²⁺-гліцин, ніж той, що був одержаний на моносубстратах (рис. 3). Аналогічні результати були одержані при дослідженні в'язкості розчинів ЕПС при переведенні в Н⁺-форму та у присутності 0,1 М КСl, причому на всіх етапах виділення та очистки етаполану.

Рис. 3. Відносне збільшення в'язкості 0,03 % розчинів ЕПС у системі Cu²⁺-гліцин:

1 - культуральна рідина до діалізу; 2 - культуральна рідина після діалізу; 3 - випарений концентрат; 4 - ЕПС після осадження та висушування

РОЗДІЛ 8. Антифітовірусна активність нативних та дезацильованих препарарів етаполану

З літератури відомо, що мікробні полісахариди різної будови мають антивірусні властивості. Найбільший інтерес представляють гетерополісахариди, в складі яких, поряд з нейтральними моносахаридами, присутні уронові кислоти. Такі полімери мають поліаніонну структуру і завдяки цьому здатні індукувати резистентність організму до вірусних інфекцій de novo. У зв'язку з тим, що у препаратах етаполану, поряд з нейтральними моносахаридами, була виявлена значна кількість уронових кислот, важливо було дослідити їхню антивірусну активність, зокрема, на моделях фітовірусів.

Випробуваня препаратів у контактних дослідах in vitro, показали, що незалежно від джерела вуглецю в середовищі культивування продуцента (етанол, глюкоза, етанол+глюкоза), ЕПС пригнічували інфекційність ВТМ та Х-вірусу картоплі в рослинах дурману (Datura stramonium) та гомфрени (Gomphrena globosa L.) в широкому діапазоні концетрацій. Причому, таку активність мали як нативні, так і дезацильовані препарати етаполану, що свідчить про те, що жирні кислоти не можуть бути, принаймні, головними детермінантами у визначенні антивірусних властивостей цього ЕПС.

Було показано також, що препарати етаполану в концентрації 500-2000 мкг/мл здатні індукувати стійкість надчутливих рослин тютюну сорту Імунний 580, Nicotiana sanderae та дурману до ВТМ- інфекції.

Ці дані свідчать про перспективність подальших досліджень препаратів етаполану як можливих засобів захисту рослин від вірусних та інших інфекційних хвороб.

ВИСНОВКИ

1. Вперше показана можливість інтенсифікації синтезу мікробного екзополісахариду етаполану на суміші енергетично-нерівноцінних ростових субстратів.

2. Аналіз шляхів С2-С6-метаболізму у штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) дозволяє класифікувати етанол як енергетично-надлишковий, а глюкозу - як енергетично-дефіцитний субстрати.

3. В результаті теоретичних розрахунків енергетичних потреб синтезу ЕПС та біомаси продуцентом етаполану встановлено оптимальне молярне співвідношення концентрацій етанолу та глюкози (3,1:1, відповідно), що дозволило збільшити кількість синтезованих ЕПС в 1,8-1,9 разів, їх вихід по відношенню до біомаси в 1,4-1,7 разів, вихід ЕПС від субстрату в 1,5-2 рази у порівнянні з вирощуванням продуцента на моносубстратах.

4. При культивуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на суміші етанолу та глюкози не спостерігається явища диауксії, обидва субстрати споживаються одночасно, при цьому підвищується в 1,3-1,9 рази максимальна питома швидкість росту.

5. Встановлено умови культивування продуцента етаполану на суміші етанолу та глюкози (а саме спосіб приготування посівного матеріалу, концентрація джерел вуглецевого та азотного живлення, відсутність катіонів натрію в середовищі), які забезпечують максимально повну конверсію вуглецю субстратів в ЕПС.

6. Активність ключових ферментів С2-С6-метаболізму при вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 (1 НГ) на суміші етанолу та глюкози була нижчою, ніж на відповідних моносубстратах. Одночасне функціонування двох анаплеротичних шляхів (гліоксилатного циклу та піруваткарбоксилазної реакції) та підвищення активності ФЕП-синтетази свідчать про посилення глюконеогенезу в умовах міксотрофного росту бактерій.

7. Екзополісахариди, синтезовані на змішаному та моносубстратах є ідентичними за вмістом вуглеводів, піровиноградної та уронових кислот, а також за молярним співвідношенням моносахаридів. Етаполан, одержаний на змішаному субстраті, характеризувався більш високим вмістом жирних кислот і вищою молекулярною масою, що супруводжувалось покращенням реологічних властивостей його розчинів.

8. Встановлено здатність етаполану пригнічувати інфекційність ВТМ та Х-вірусу картоплі у надчутливих рослинах дурману та гомфрени, а також індукувати у рослин тютюну та дурману стійкість до ВТМ-інфекції.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Коваленко М.О., Коваленко О.Г., Пирог Т.П. Антифітовірусна активність нативних та дезацильованих препаратів мікробного екзополісахариду етаполану // Вісник Київського Національного Університету ім. Т. Шевченка. - 2001. - Вип. 35. - С. 32-35.

2. Пирог Т.П., Коваленко М.А., Кузьминская Ю.В. Образование экзополисахаридов на углеводных субстратах штаммом Acinetobacter sp. и особенности его С₆-метаболизма // Микробиология. - 2002. - 71, № 2. - С. 215-221.

3. Пирог Т.П., Коваленко М.А., Кузьминская Ю.В., Криштаб Т.П. Интенсификация синтеза экзополисахарида этаполана на смеси ростовых субстратов // Микробиология. - 2003. - 72, № 1. - С. 26-32.

4. Пирог Т.П., Коваленко М.А., Кузьминская Ю.В. Энергетические и биохимические аспекты интенсификации синтеза экзополисахаридов Acinetobacter sp. на смеси этанола и глюкозы // Микробиология. - 2003. - 72, № 3. - С. 348-355.

5. Коваленко М.О., Коваленко О.Г., Пирог Т.П. Антивірусна активність полісахаридів, синтезованих Acinetobacter sp. на різних вуглецевих субстратах // 3-я Міжн. конф. "Біоресурси і віруси". (Київ, вересень, 2001.) - С. 12.

6. Пирог Т.П., Коваленко М.А. Энергетические и биохимические аспекты интенсификации синтеза экзополисахарида этаполана на смеси этанола и глюкозы // Міжн. конф. "Микробиология и биотехнология XXI столетия". (Мінськ, травень, 2002.) - С. 63-64.

7. Пирог Т.П., Коваленко М.А. Интенсификация синтеза микробного экзополисахарида этаполана на смеси энергетически неравноценных субстратов // VIIІ Український біохімічний з'їзд (Чернівці, жовтень, 2002.) - С. 74.

8. Пирог Т.П., Коваленко М.А. Энергетические и биохимические аспекты интенсификации синтеза экзополисахарида этаполана на смеси ростовых субстратов // 1-ий Міжн. конгрес "Биотехнология - состояние и перспективы развития". (Москва, жовтень, 2002.) - С. 240.

9. Пирог Т.П., Коваленко М.А., Лащук Н.В. Синтез екзополісахаридів на вуглеводних субстратах штамом Acinetobacter sp. та особливості його С₆-метаболізму // 69-та наук. конф. мол. вчених, аспірантів та студентів НУХТ. (Київ, травень, 2003.) - С. 69.

АНОТАЦІЯ

Коваленко М.О. Синтез мікробного екзополісахариду етаполану на суміші ростових субстратів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено дослідженню інтенсифікації синтезу мікробного екзополісахариду (ЕПС) етаполану (продуцент - штам Acinetobacter sp. ІМВ В-7005) на суміші енергетично-нерівноцінних ростових субстратів (етанол+глюкоза). На основі теоретичного розрахунку енергетичних витрат синтезу ЕПС та біомаси на змішаному субстраті розроблена технологія одержання етаполану, що дозволяє підвищити майже у 2 рази кількість синтезованих ЕПС, їхій вихід по відношенню до біомаси та вихід ЕПС від субстрату, а також скоротити тривалість культивування та покращити реологічні властивості розчинів ЕПС, що визначають його практичну цінність.

При вирощуванні штаму Acinetobacter sp. ІМВ В-7005 на суміші етанолу та глюкози не спостерігається явища диауксії, обидва субстрати споживаються одночасно, при цьому підвищується в 1,3-1,9 рази максимальна питома швидкість росту. Інтенсифікація синтезу ЕПС на суміші енергетично-нерівноцінних субстратів обумовлена посиленням глюконеогенезу, про що свідчило одночасне функціонування двох анаплеротичних шляхів (гліоксилатного циклу та піруваткарбоксилазної реакції) та підвищення в 1,5 рази активності фосфоенолпіруватсинтетази. Етаполан, синтезований на суміші етанолу та глюкози, характеризується підвищеним вмістом жирних кислот та більш високою молекулярною масою у порівнянні з одержаним на моносубстратах, що супроводжується покращенням його реологічних властивостей.

Вперше встановлено антифітовірусну активність полісахаридних препаратів етаполану, синтезованих на моно- та змішаних субстратах.

Коваленко М.А. Синтез микробного экзополисахарида этаполана на смеси ростовых субстратов. - Рукопись.

Диссертация посвящена исследованию интенсификации синтеза микробного экзополисахаридного препарата этаполана (продуцент - штамм Acinetobacter sp. ИМВ В-7005) на основе изучения биохимических и энергетических аспектов использования бактериями смеси энергетически-неравноценных субстратов и установления механизмов регуляции синтеза вторичных метаболитов на этих субстратах.

Исследование путей энергетического и конструктивного метаболизма С2-С6-соединений у штамма Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 (1 НГ) позволило классифицировать этанол как энергетически-избыточный, а глюкозу - как энергетически-дефицитный субстраты. В результате теоретических расчетов энергетических потребностей синтеза биомассы и экзополисахаридов (ЭПС) на энергетически-дефицитном субстрате определена "дополняющая" концентрация энергетически-избыточного субстрата, которая позволяет восполнить потери углерода глюкозы при окислении ее до СО2 с целью получения энергии для процессов конструктивного метаболизма. Введение этанола в среду с глюкозой в молярном соотношении 3,1:1 позволило увеличить количество синтезированного этаполана в 1,8-1,9 раза, его выход по отношению к биомассе - в 1,4 - 1,7 раза, выход ЭПС от субстрата - в 1,5 - 2 раза по сравнению с выращиванием продуцента на моносубстратах. Показано, что при культивировании штамма Acinetobacter sp. ИМВ В-7005 на смеси этанола и глюкозы не наблюдается явления диауксии, оба субстрата поглощаются одновременно, при этом увеличивается в 1,3-1,9 раз максимальная удельная скорость роста.

Установлены условия культивирования продуцента етаполана (способ приготовления посевного материала, концентрация источников углеродного и азотного питания, отсутствие катионов натрия в среде), позволяющие избежать непродуктивних потерь углерода и энергии, которые имеют место при использовании моносубстратов и обеспечивают максимально полную трансформацию углерода обоих субстратов в ЭПС.

Активность ключевых ферментов С2-метаболизма при выращивании бактерий на смеси субстратов снижалась, а ферментов цикла трикарбоновых кислот повышалась по сравнению с культивированием на этаноле. Наиболее заметным (более, чем в 4 раза) было снижение в таких условиях активности ферментов глиоксилатного цикла, что свидетельствует о незначительной его роли в метаболизме продуцента при выращивании на смеси С2-С6-субстратов. Установлено, что интенсификация синтеза ЭПС на смеси энергетически-неравноценных субстратов обусловлена усилением глюконеогенеза, о чем свидетельствовало одновременное функционирование двух анаплеротических путей (глиоксилатного цикла и пируваткарбоксилазной реакции) и повышение в 1,5 раза активности фосфоенолпируватсинтетазы.