Ушкодження ДНК в радіаційному старінні насіння

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

УШКОДЖЕННЯ ДНК У РАДІАЦІЙНОМУ СТАРІННІ НАСІННЯ

03.00.01 - радіобіологія

Соколов Микита Володимирович

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, м. Київ.

Науковий керівник: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор Гродзінський Дмитро Михайлович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач відділу біоізики та радіобіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Дружина Микола Олександрович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ провідний науковий співробітник відділу біофізики канцерогенезу

доктор біологічних наук Яворська Вікторія Казимирівна, Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, м. Київ, завідуюча відділом фізіології росту і розвитку рослин

Провідна установа: Інститут гідробіології НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “18” лютого 2002 р. о 16⁰⁰ годині на засіданні cпеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “13” грудня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

АНОТАЦІЇ

Соколов М.В. Ушкодження ДНК в радіаційному старінні насіння. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 - радіобіологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено дослідженню виходу ушкоджень ДНК за радіаційного старіння насіння люпину. Вперше проведено кількісний біохімічний аналіз динаміки нагромадження ушкоджень ДНК у сухому насінні та в паростках за умов променевого старіння насіння. Обговорюються аналітичні форми залежностей виходу ушкоджень ДНК досліджуваних об'єктів від тривалості променевого старіння насіння. Дістала подальший розвиток гіпотеза про значну роль балансу деструктивних та відновно -компенсаторних процесів у механізмах формування віддалених наслідків опромінення. Встановлено, що за умов дії радіації відбувається як неспецифічне прискорення процесів старіння насіння, так і збільшення “біологічного віку” насіння по типу зсуву у часі у зв'язку з первинними радіаційно - індукованими ушкодженнями ДНК. Виявлено, що низькоінтенсивне опромінення в малих дозах модифікує перебіг процесів променевого старіння насіння. Встановлено, що променеве старіння супроводжується впорядкованою фрагментацією ДНК у насінні. Проведені дослідження по вивченню кінетики елімінації ушкоджень ДНК за умов переходу насіння від спокою до активної життєдіяльності у зв'язку з радіаційним старінням. Продемонстровано уповільнення елімінації ушкоджень ДНК під час розвитку променевого старіння за умов опромінення насіння в дозах, які викликають гормезис.

Ключові слова: іонізуюче випромінювання, радіаційно - індуковане старіння, насіння, паростки, ушкодження ДНК, Lupinus polyphyllus Lindl.

Соколов Н.В. Повреждения ДНК в радиационном старении семян. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 - радиобиология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению выхода повреждений ДНК при радиационном старении семян люпина. Продемонстрировано, что ускоренное старение облученных семян является полезной системой в изучении закономерностей формирования и развития отдаленных последствий облучения. Радиационно - индуцированное старение семян сопровождается накоплением повреждений ДНК в сухих семенах и в проростках, формирующихся из этих семян. Показано, что выход повреждений ДНК в сухих семенах при лучевом старении удовлетворительно описывается линейно - квадратичными зависимостями от продолжительности старения. Количество повреждений ДНК определяется значениями дозы облучения, режима и продолжительности ускоренного старения. Для выхода повреждений ДНК в проростках, развивающихся из жизнеспособных семян при радиационно - индуцированном старении, не отмечено прямой зависимости от количества повреждений ДНК в семенах. Методом контролируемой щелочной денатурации ДНК установлены сложные и разнообразные по характеру зависимости выхода повреждений ДНК в проростках от продолжительности ускоренного старения облученных семян, а именно - кривые с порогами, экстремумами, плато, а также зависимости, которые описываются линейными и линейно -квадратичными функциями. Форма кривых зависит от продолжительности, режима старения и дозы облучения семян. Установлено, что хроническое низкоинтенсивное облучение семян люпина в период их формирования на материнском растении в кумулятивной дозе в 0,23 Гр является фактором формирования радиоадаптации и фактором ускорения прохождения отдельных этапов радиационного старения после дополнительного острого облучения семян. Ускоренное старение семян сопровождается упорядоченной высокомолекулярной фрагментацией ДНК на фрагменты размерами 50 - 60 и 300 т.п.н. Радиационное старение семян трудно объяснить исключительно с позиций свободнорадикальной гипотезы, поскольку даже после периода распада индуцированных облучением свободных радикалов осуществляются процессы, приводящие к увеличению выхода повреждений ДНК в облученных семенах по сравнению с контролем. Показано, что в радиационно -индуцированном старении семян могут существовать такие комбинации доз и режимов/ продолжительности старения, при которых не наблюдается эффективной элиминации повреждений ДНК. Увеличение нерепарабельной компоненты повреждений ДНК может лежать в основе процессов ускорения темпов радиационного старения в семенах с возрастанием дозы облучения.

Ключевые слова: ионизирующее излучение, радиационно - индуцированное старение, семена, проростки, повреждения ДНК, Lupinus polyphyllus Lindl.

Sokolov N.V. DNA damages in radiation - induced seed aging. - Manuscript.

Thesis on PhD degree on speciality 03.00.01 - radiation biology. - T. Shevchenko National University, Кyiv, 2002.

The dissertation is devoted to research of the yield of DNA damages in radiation - induced lupine seed aging. For the first time the biochemical analysis of DNA lesions dynamics of accumulation in seeds and seedlings during the radiation aging of seeds has been carried out. Analytical forms of dependencies of the yield of DNA lesions from duration of radiation - induced seed aging in researched objects are discussed. It has been established that there observes both a nonspecific acceleration of the processes of seed aging and an unitary augmentation of “biological age” of seeds after irradiation and in connections with initial radiation - induced DNA lesions. It has been revealed that low intensity radiation modifies a course of processes of radiation seed aging induced by the acute irradiation. It was established that accelerated aging was accompanied with ordered DNA fragmentation in seeds. Researches on kinetics of DNA damages elimination on a background of an activation of metabolitic processes were carried out in connection with radiation aging of seeds. Retardation of DNA repair has been shown in the radiation - induced aging caused by the irradiation of seeds in doses invoking hormesis. The hypothesis about a significant role of balance between the destructive and reparation processes in mechanisms of formation of the remote consequences of irradiation has received a further development.

Key words: ionizing irradiation, radiation - induced aging, seeds, seedlings, DNA damage, Lupinus polyphyllus Lindl.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Радіобіологічні реакції проявляються в різні строки після впливу радіації, у зв'язку з чим розрізняють близькі та віддалені наслідки опромінення. Одним із віддалених ефектів опромінення є індуковане скорочення тривалості життя (Александров, 1978).

Відомо кілька гіпотез, за допомогою яких намагаються пояснити механізми формування віддалених наслідків опромінення, зокрема, радіаційно - індукованого старіння (Кузин, 1978). У більшості з цих гіпотез зміни в генетичному апараті клітин розглядаються як визначальні події у розвитку віддалених ефектів радіаційного впливу на живі організми, проте унітарної концепції, яка б усебічно розкривала суть цих ефектів, ще й досі не створено.

Розкриття механізмів формування віддалених ефектів опромінення є досить складним завданням, оскільки, по - перше, для проведення дослідів, як правило, потрібні тривалі терміни часу, по-друге, нашарування метаболічних процесів вторинних, опосередкованих змін на прямі механізми формування віддалених наслідків опромінення істотно заважає інтерпретацію результатів досліджень. Саме ці обставини й обумовлюють певні обмеження стосовно вибору експериментальних систем для досліджень віддалених ефектів опромінення. На нашу думку, перспективним у вивченні закономірностей радіаційно - індукованого старіння може бути використання моделі прискореного старіння опроміненого насіння.

Встановлено, що в ході зберігання в насінні накопичуються ушкодження ДНК, зниження життєздатності насіння корелює з інтенсивністю цього процесу (Cheah, Osborne, 1978). Крім того, загальмований перебіг метаболічних реакцій у сухому насінні уможливлює вивчення формування віддалених ефектів опромінення, так би мовити, “у чистому вигляді”. Залежності радіостійкості насіння від різних факторів свідчать про те, що процеси, які індукуються опроміненням у насінні, є типовими для різних об'єктів з погляду загальної радіобіології (Гродзинський, 2000). Ці обставини виступають на користь використання насіння як об'єкта у вивченні закономірностей радіаційно - індукованого старіння.

З урахуванням зручності застосування насіння як системи у вивченні механізмів променевого старіння, дослідження динаміки накопичення ушкоджень ДНК у насінні, що підпадало радіаційно - індукованому старінню, встановлення закономірностей виходу ушкоджень ДНК в насінні під час активації метаболічних процесів при замочуванні насіння, а також оцінка виходу ушкоджень ДНК у паростках становить суттєвий інтерес. Проте, з огляду на з'ясування механізмів індукції прискореного старіння, до цього часу такі експерименти практично не проводились. Зазначене вище дає підстави сформулювати основну мету й задачі дослідження.

Мета й завдання дослідження. Головна мета роботи полягала у вивченні закономірностей нагромадження ушкоджень ДНК за умов радіаційно - індукованого старіння насіння. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

оцінити вихід ушкоджень ДНК у насінні, що зазнавало радіаційного старіння після опромінення в різних дозах;

з'ясувати закономірності виходу ушкоджень ДНК у паростках, що формувались з насіння, яке зазнавало радіаційно - індукованого старіння;

вивчити особливості виходу ушкоджень ДНК у променевому старінні насіння під час активації метаболічних процесів.

Об'єкт дослідження - радіаційно - індуковане старіння насіння.

Предмет дослідження - вихід ушкоджень ДНК у радіаційному старінні насіння.

Методи дослідження: радіобіологічні, фізіологічні, біохімічні (контрольована лужна денатурація ДНК із розділенням фракцій одно- та двониткової ДНК на гідроксилапатиті, гель-електрофорез ДНК у нейтральному та лужному середовищах, пульс - електрофорез, спектрофотометрія).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі біофізики та радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України згідно з планом науково - дослідних робіт Інституту за темою “Хронічне опромінення рослин як фактор формування нестабільності їх геному” (№ державної реєстрації 0195U003785, шифр 02.12\5590).

Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано нову систему для вивчення закономірностей формування віддалених наслідків опромінення. У результаті проведених досліджень показано, що за умов радіаційного старіння в насінні накопичуються ушкодження ДНК. Дістало подальший розвиток уявлення про роль ушкоджень ДНК у механізмах віддалених наслідків опромінення.

Уперше проведено кількісний біохімічний аналіз динаміки виходу ушкоджень ДНК у насінні за умов променевого старіння. Показано, що вихід ушкоджень ДНК в опроміненому насінні описується лінійно-квадратичними залежностями від тривалості старіння. Вихід ушкоджень ДНК у паростках характеризується різноманітними складними залежностями від тривалості старіння опроміненого насіння, а саме - кривими з порогами, екстремумами та плато, лінійними та лінійно - квадратичними. Установлено, що вихід ушкоджень ДНК у паростках є функцією дози опромінення та режимів прискореного старіння насіння. Дістала подальший розвиток ідея про значну роль балансу деструктивних та відновно - компенсаторних процесів у механізмах формування віддалених наслідків опромінення.

Показано, що формування насіння за умов хронічного низькодозового опромінення може виступати фактором, що зумовлює радіоадаптацію. Уперше виявлено, що низькоінтенсивне опромінення в малих дозах модифікує перебіг процесів променевого старіння насіння.

Уперше встановлено, що прискорене старіння опроміненого насіння супроводжується впорядкованою фрагментацією ДНК, характер фрагментації ДНК залежить від тривалості старіння.

Уперше проведені дослідження по вивченню кінетики елімінації ушкоджень ДНК за умов активації метаболізму у зв'язку з радіаційним старінням насіння. Уперше виявлено уповільнення елімінації ушкоджень ДНК у зв'язку з старінням за умов опромінення насіння в дозах, які викликають гормезис.

Практичне значення одержаних результатів. Показано доцільність використання системи прискореного старіння опроміненого насіння для виявлення закономірностей розвитку віддалених наслідків опромінення. Знайшла підтвердження гіпотеза про роль нагромадження ушкоджень ДНК у механізмах розвитку радіаційного старіння. Отримані результати можуть слугувати науковим обгрунтуванням розробки методів корекції та попередження формування віддалених ефектів опромінення, зокрема, променевого скорочення тривалості життя. Установлені факти обгрунтовують розробку нових геропротекторних впливів, засобів гальмування та упередження розвитку процесів старіння, прогнозування та керування цими процесами тощо.

Матеріали проведених досліджень використовуються в навчальному процесі на кафедрі радіобіології Київського національного університету імені Тараса Шевченка у спецкурсі і спецпрактикумі "Клітинна радіобіологія".

Особистий внесок здобувача. Дисертант опрацював необхідну за темою наукову літературу, оволодів необхідними аналітичними та статистичними методами досліджень, особисто планував експериментальні роботи і готував матеріали до друку. Конкретний внесок дисертанта у роботу полягав у розробці концепції та виконанні всіх експериментальних робіт, обговоренні одержаних результатів. Основні ідеї, наукові положення й висновки розроблені дисертантом самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені на 12^th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology (Будапешт, 2000), міжнародній науково - практичній конференції “15 років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання” (Київ, 2001), 31^th European Radiation Research Conference (Дрезден, 2001), наукових семінарах відділу біофізики та радіобіології тощо.

Публікації. Головні результати досліджень викладені в 4 статтях та 3 тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію побудовано за загальноприйнятою структурою. Дисертація викладена на 190 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 35 рисунками та 5 таблицями, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних, висновків, додатків та списку використаних джерел, який містить 265 літературних джерел (із них 140 вітчизняних та 125 іноземних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали й методи дослідження. Як об'єкт для дослідження закономірностей нагромадження ушкоджень ДНК в радіаційному старінні використовували насіння Lupinus polyphyllus Lindl. врожаю 1998 року. В роботі в залежності від поставлених задач використовували насіння з м. Бровари Київської обл. (контроль), а також насіння, зібране поблизу с. Янів у 10 - км Зоні відчуження ЧАЕС. Розрахункова максимальна кумулятивна доза для насіння за період формування на материнській рослині складала біля 23 сГр (Янів). Були використані рослинні об`єкти різних рівнів організації та метаболізму: повітряно - сухе насіння, набубнявіле насіння та паростки. Вологість повітряно - сухого насіння складала 12 - 13 %. Насіння опромінювали на установці "Исследователь - Со⁶⁰" у дозах 10, 50, 100, 200 та 300 Гр із потужністю дози 4,1 сГр/с.

Процес старіння насіння моделювали, витримуючи опромінене насіння в герметичному посуді протягом 20 діб за різних температур: 37 ⁰С, 50 ⁰С та 60 ⁰С. Такі умови експозиції насіння раніше були описані в літературі (Лихачев, 1984; Орлова, 1967). Насіння, що зазнавало впливу прискореного старіння протягом різних проміжків часу, регулярно пророщували у темряві на зволоженому дистильованою водою фільтрувальному папері в чашках Петрі у термостаті при температурі 22 ^оС. Насіння скарифікували згідно (Николаева, 1984). Схожість та енергію проростання насіння обчислювали у відповідності з рекомендаціями Міжнародних правил аналізу насіння. Протягом усього періоду досліджень схожість насіння 1998 р. знизилась на 5 - 6 %.

Сумарну ДНК із досліджуваних об'єктів виділяли згідно (Драйпер, 1991). Аналіз ДНК методом гель - електрофорезу в нейтральному середовищі проводили за (Маниатис, 1989). Електрофорез ДНК здійснювали в 0,6 % агарозному гелі за напруженості поля 2 В/см протягом 3,5 год. Гелі фарбували розчином бромистого етидію (20 мкг/мл), фотографували на фотоплівку Мікрат - 300, використовуючи транс - люмінатор (Pharmacia LKB, Швеція) із довжиною хвилі 312 нм.

Аналіз ДНК методом гель - електрофорезу в пульсуючих полях здійснювали з метою детекції подвійних розривів високомолекулярної ДНК. Для одержання нативної ДНК процедуру екстракції ДНК із рослинного матеріалу, що був гомогенізований у середовищі рідкого азоту, проводили в присутності низькоплавкої агарози (Guidet,1992), депротеїнізацію проводили згідно (Cheung, 1995). Електрофоретичне розділення ДНК здійснювали за допомогою приладу "Диапульс" (Росія) за напруженості поля 4,2 В/см, сили струму 299 мА протягом 24 год (8 ⁰С). Тривалість пульс - інтервалів знаходилась в межах 5 - 120 с.

Для якісного аналізу виходу однониткових, подвійних розривів та лужнолабільних сайтів ДНК у насінні, що зазнавало прискореного старіння, використовували гель - електрофорез ДНК у лужному середовищі (Маниатис, 1989). Електрофорез ДНК проводили в 1,5 % агарозному гелі за напруженості поля 1 В/см, сили струму 30 мА протягом 18 год при температурі 4 ^оС.

З метою проведення кількісного аналізу виходу ушкоджень ДНК застосовували метод контрольованої лужної денатурації ДНК із розділенням фракцій однониткової та двониткової ДНК на гідроксилапатиті (Позур, 1998). Кількість ДНК визначали спектрофотометрично згідно (Спирин, 1958). Доля однониткової ДНК в загальному вмісті біополімеру відображала ступінь ушкодженості цієї макромолекули, і була виражена у відносних одиницях: N=M/M_k, де M - відношення кількості однониткової ДНК до загальної кількості ДНК зразку, M_k - відношення кількості однониткової ДНК у контролі до загальної кількості ДНК у контролі.

Достовірність числових відмінностей у роботі оцінювали за критерієм Стьюдента. Статистично обробку експериментальних даних проводили за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel 97. Різницю вважали статистично достовірною при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Вплив гострого гамма - опромінення та прискореного старіння насіння на показники його життєздатності. Старіння насіння супроводжується втратою його життєздатності, з чим корелюють зміни ступеню цілісності генетичного матеріалу. Тому при вивченні різноманітних аспектів проблеми старіння насіння контроль показника життєздатності є важливим етапом досліджень. Аналіз радіочутливості насіння показав, що за показниками схожості ЛД₅₀ для насіння контролю становило 280 Гр, для насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС дорівнювало 315 Гр. Існує зворотна кореляція між дозою опромінення та показниками життєздатності насіння. Найбільш чітко ця закономірність спостерігалась при опроміненні насіння в дозах вище 50 Гр (контроль) та 100 Гр (10 - км Зона відчуження ЧАЕС). Протилежний ефект виявлявся в діапазонах доз 10 - 50 Гр (насіння контролю) та 10 - 100 Гр (насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС), в яких показники схожості та енергії проростання перевищували такі неопроміненого контролю, що може свідчити про стимулюючу дію опромінення в цих дозових інтервалах. Порівнюючи отримані нами дані, зауважимо, що насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС характеризується більшою радіорезистентністю у порівнянні з насінням, яке формувалось в умовах природного радіаційного фона. Результати свідчать на користь того, що хронічне опромінення насіння люпину в кумулятивній дозі в 23 сГр під час його формування викликає радіоадаптивну відповідь клітин насіння, що знаходить свій прояв підвищенням стійкості насіння до пошкоджуючого впливу додаткового гострого гамма - опромінення.

Оскільки прояв та динаміку розвитку променевого старіння ми вивчали, використовуючи модель прискореного старіння опроміненого насіння, наступний етап роботи полягав в аналізі закономірностей впливу умов такого старіння на життєздатність насіння. Зазначимо, що показники схожості насіння на початковому етапі прискореного старіння змінювались складним, немонотонним чином. Зауважимо, що в перші 14 діб старіння проростання насіння істотно не змінювалось, тобто насіння не втрачало життєздатність, а зміни схожості протягом першої декади старіння були зумовлені зміною співвідношення нормальних та аномальних паростків, котрі на 7 - 8 добу від початку замочування насіння виявлялись нежиттєздатними.

Однією з причин складного характеру залежності схожості від тривалості прискореного старіння насіння може бути порушення зв'язку між нагромадженням ушкоджень ДНК під час старіння насіння та процесами їх елімінації під час активації метаболізму при проростанні за певних тривалостей прискореного старіння. На користь цієї думки свідчить той факт, що зміни виходу ушкоджень ДНК у паростках, що формувались з життєздатного насіння, яке зазнавало прискореного старіння, варіювали в противофазі зі змінами показників схожості. Отримані дані вказують на те, що старіння насіння є не лише процесом поступового накопичення ушкоджень ДНК, але воно супроводжується складними реакціями клітин у відповідь на виникнення таких ушкоджень.

Аналіз порушень структурної цілісності ДНК в насінні в зв'язку з радіаційним старінням. Результати пульс - електрофорезу ДНК з насіння, що зазнавало прискореного старіння при 50 ⁰С протягом різних термінів, вказують на те, що старіння насіння супроводжується фрагментацією ДНК, при чому цей процес має упорядкований характер, бо з часом утворюються дві групи дискретних фрагментів із розмірами порядку 50 - 60 і 300 т.п.н. Така упорядкованість фрагментації свідчить про періодичність розташування ділянок розщеплення ДНК (Андрєєв, 1996). Нами встановлені зміни характеру розщеплення ДНК у насінні залежно від термінів прискореного старіння. Так, фрагментація ДНК може здійснюватися як на два типи дискретних фрагментів, так і на фрагменти тільки одного типу, що може свідчити або про зміну характеру упаковування ДНК у складі хроматину в насінні, яке підпадало різним термінам прискореного старіння, або про неоднакову ефективність ферментів, що здійснює розщеплення ДНК.

Раніше вважали, що під час старіння біооб'єктів нагромаджуються ушкодження ДНК, які розподілені вздовж молекул випадково (Виленчик, 1987 та ін.). Ми отримали результати, які свідчать на користь того, що в процесі прискореного старіння насіння відбувається упорядкована високомолекулярна фрагментація ДНК. Проте не виключена можливість, що упорядкованої фрагментації ДНК в природному старінні насіння може і не спостерігатись.

Старіння насіння, індуковане хронічним низькодозовим опроміненням, впливає не стільки на інтенсивність процесу високомолекулярної фрагментації ДНК, скільки на його характеристики залежно від тривалості прискореного старіння. В насінні з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС спостерігався зсув прояву у часі ефектів порушення цілісності структури ДНК відносно цих же ефектів в неопроміненому насінні. Результати експериментів свідчать на користь того, що ушкодження ДНК, індуковані під час формування насіння в умовах хронічного опромінення, здатні сприяти більш швидкому проходженню етапів старіння насіння. Отримані нами експериментальні дані підкріплюють гіпотезу про те, що променеве старіння принципово не відрізняється від природного старіння (Кузин, 1978, Кутлахмедов, 1984).

Зауважимо, що характер високомолекулярної фрагментації ДНК в насінні за променевого старіння нагадує профіль порушення структурної цілісності ДНК у клітинах, що зазнають апоптозу (Levine, 1996, Solov'yan, 1997). Методом гель - електрофорезу установлена дезінтеграція ДНК на фрагменти розмірами приблизно 900 та 1100 п.н. (кратні розміру нуклеосом) у насінні, яке формувалось в умовах 10 - км Зони відчуження ЧАЕС та зазнавало прискореного старіння протягом 17 діб після додаткового опромінення в дозі 100 Гр. Відомо, що утворення на електрофореграмах ДНК так званої “драбини”, що зумовлюється впорядкованою міжнуклеосомною фрагментацією хроматину в разі запрограмованої клітинної загибелі, може вважатись одним із біохімічних маркерів апоптозу. Зазначимо, що характер фрагментації ДНК у насінні, що підпадає старінню, залежить від вологості цього насіння (Osborne, 2000, Boubriak, 2000). Вологість насіння в нашому експерименті складала 12 - 13 %, можливо, цього рівня оводненості достатньо для активації нуклеаз(и), що розщеплює ДНК у лінкерних ділянках нуклеосом.

Зазначимо, що методи гель - електрофорезу ДНК дозволяють аналізувати характер порушення структурної цілісності ДНК, вивчати ушкодженість молекул ДНК здебільшого на якісному рівні. Тому наступним етапом наших досліджень було вивчення виходу ушкоджень ДНК у радіаційно - індукованому старінні насіння на кількісному рівні, для вирішення цієї задачі ми використали метод контрольованої лужної денатурації ДНК.

Аналіз закономірностей виходу ушкоджень ДНК за умов гострого опромінення насіння. Метод контрольованої лужної денатурації ДНК дозволяє кількісно оцінити сумарний вихід таких ушкоджень ДНК, як одно - та двониткові розриви ДНК, лужнолабільні сайти тощо. Відомо, що зазначені ушкодження елімінуються ферментами інцизійно - ексцизійної репарації, тому ми не оцінювали окремо вихід кожного з цих ушкоджень. Результати експериментів показали, що залежність виходу ушкоджень ДНК у насінні від дози опромінення в діапазоні 10 - 300 Гр задовільно апроксимується лінійно - квадратичною функцією, що може вказувати на відсутність ефективної елімінації радіаційно - індукованих ушкоджень ДНК. Дещо інша картина спостерігалась при аналізі закономірностей виходу ушкоджень ДНК у паростках, які формувались з опроміненого насіння.

Опромінення насіння в дозах 10 та 50 Гр викликало деяке зменшення виходу ушкоджень ДНК в паростках в порівнянні з неопроміненим контролем, збільшення кількості ушкоджень ДНК у паростках спостерігалось при опроміненні насіння в дозах 100 Гр та вище. Застосування доз в 200 та 300 Гр практично не викликало подальшого зростання виходу ушкоджень ДНК у паростках, можливо, це зумовлено дією клітинного добору.

Оскільки одна з найбільш поширених гіпотез пояснює ефект зберігання/старіння опроміненого насіння розпадом у пострадіаційний період довгоживучих вільних радикалів (Conger, 1964, Гудков, 1973), ми вирішили дослідити зв'язок між виходом ушкоджень ДНК у насінні та тривалістю прискореного старіння насіння в так званий “пізній” пострадіаційний період (період після розпаду індукованих опроміненням вільних радикалів). Проводили експерименти з насінням, яке зазнавало впливу гострого гамма - опромінення в дозах 10, 50, 100, 200 та 300 Гр, після чого зберігалось в лабораторних умовах протягом 6 місяців, й на завершення підпадало прискореному старінню (режими 37 ^oC, 50 ^oC та 60 ^oC). Дослідження ефектів зберігання насіння після опромінення протягом 6 місяців уможливило виокремлення вільнорадикальної компоненти старіння насіння.

Дослідження виходу ушкоджень ДНК у сухому насінні за умов радіаційно - індукованого старіння. Вихід ушкоджень ДНК у сухому опроміненому насінні контрольних рослин, яке підпадало старінню в “близький” та “пізній” пострадіаційні періоди, а також у насінні з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС за умов променевого старіння залежно від дози опромінення та режимів прискореного старіння задовільно апроксимується лінійно - квадратичними функціями. Відносно простий тип кривих може бути пояснений кумуляцією ушкоджень ДНК у насінні в стані спокою. Скоріше за все квадратична компонента віддзеркалює процеси взаємодії ушкоджень один з одним. Зазначимо, що з метою виокремити в загальному виході ушкоджень ДНК компоненту саме радіаційно - індукованого старіння при аналізі експериментальних результатів ми використовували нормування значень всіх показників на відповідні значення в контролях.

Дані експериментальних досліджень, що наведені наочно демонструють схожий характер динаміки виходу ушкоджень ДНК у насінні за радіаційно - індукованого старіння після опромінення в діапазоні доз 10 - 100 Гр, та зростання виходу ушкоджень ДНК в інтервалі доз 200 - 300 Гр.

Проте ЛД₅₀ для насіння люпину знаходилось в діапазоні доз 280 - 320 Гр, тому логічно припустити, що тенденція зростання виходу ушкоджень ДНК за умов опромінення насіння в дозах 200 - 300 Гр відображала скоріше не прискорення темпів радіаційно - індукованого старіння, а накопичення ушкоджень ДНК у насінні, яке вже втратило життєздатність. Встановлено, що режим старіння насіння істотно не впливав на характер залежностей виходу ушкоджень ДНК від тривалості старіння, проте спричиняв вплив на кількісні характеристики накопичення ушкоджень ДНК в насінні за променевого старіння.

В діапазоні доз 10 - 100 Гр зі збільшенням дози опромінення спостерігалось повільне зростання виходу ушкоджень ДНК за радіаційного старіння насіння. Отримані нами дані свідчать на користь того, що іонізуюче випромінювання впливає як на неспецифічне прискорення старіння опроміненого насіння, так й на збільшення біологічного віку насіння по типу “зсуву у часі” за рахунок радіаційно - індукованих первинних ушкоджень ДНК.

Дані на свідчать на користь того, що в “пізній” пострадіаційний період характер залежності виходу ушкоджень ДНК в насінні від тривалості прискореного старіння в порівнянні з таким у “близький” пострадіаційний період не змінювався, проте швидкість накопичення ушкоджень ДНК збільшувалась. Такий само ефект спостерігався й за прискореного старіння насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС. Старіння насіння контролю в “пізній” період після опромінення та старіння насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС відбувалось більш швидкими темпами в порівнянні з такими за умов прискореного старіння насіння контролю в “близькій” пострадіаційний період. Можливо, в цьому явищі відображається взаємодія компонентів ушкоджень ДНК, які виникли під час формування насіння за умов підвищеного радіаційного фону, або під час взаємодії індукованих опроміненням довгоживучих вільних радикалів з ДНК протягом “близького” пострадіаційного періоду, з компонентами ушкоджень ДНК, обумовлених температурним старінням насіння.

Дослідження виходу ушкоджень ДНК у паростках за умов радіаційно - індукованого старіння насіння. При аналізі динаміки накопичення ушкоджень ДНК в паростках, котрі формувались з насіння, яке зазнавало променевого старіння, привертає увагу складний характер залежностей виходу ушкоджень ДНК у паростках від тривалості прискореного старіння опроміненого насіння.

Вихід ушкоджень ДНК в паростках описується кривими з екстремумами, з плато, із порогами, а також лінійними та лінійно - квадратичними функціями залежно від дози опромінення та режиму прискореного старіння насіння. При опроміненні насіння в дозах 10 Гр та 50 Гр спостерігався нерівномірно - коливальний характер виходу ушкоджень ДНК (криві з екстремумами). Опромінення насіння в дозі 100 Гр супроводжувалось появою плато на графіку залежності виходу ушкоджень ДНК у паростках від тривалості старіння насіння. Опромінення насіння в дозах 200 Гр та 300 Гр викликало монотонне зростання виходу ушкоджень ДНК у паростках за всіх тривалостей старіння насіння.

Не зважаючи на складність отриманих залежностей, в останніх виявляються деякі спільні риси, в яких відображаються особливості розвитку процесів, що лежать в основі формування реакції клітин у відповідь на нагромадження ушкоджень ДНК при старінні насіння. При опроміненні насіння в одній і тій саме дозі, але за різних режимів старіння на кривих, що відображують динаміку нагромадження ушкоджень ДНК, помітний зсув прояву ефектів у часі, а саме - за більш “жорстких” умов старіння насіння “випадають” початкові етапи старіння, які властиві цьому ж насінню за більш “м'яких” умов старіння. Розвиток ознак синдрому старіння паростків за критерієм виходу ушкоджень ДНК можна досягти в експерименті або збільшенням дози опромінення насіння або прискоренням темпів старіння. Це свідчить про адитивність або синергизм дії факторів радіаційного впливу та старіння насіння на нагромадження ушкоджень ДНК, які сумісні з реплікативними процесами та проявляються згодом, в паростках, у вигляді збільшення виходу ушкоджень ДНК. Отримані результати свідчать про принципову подібність елементарних подій радіаційного впливу та старіння насіння.

Нелінійний та немонотонний характер залежностей може бути пояснений на підставі припущення про зміни в співвідношенні процесів нагромадження ушкоджень ДНК в сухому насінні в радіаційно - індукованому старінні та репарації ДНК у насінні за умов активації метаболічних процесів. Ми припускаємо, що системи репарації за певних тривалостей та режимів старіння, а також доз опромінення або зовсім не індукуються, або функціонують із меншою ефективністю та ініціюються в пізні терміни часу, коли в біологічному об'єкті вже накопичилась відповідна кількість ушкоджень ДНК. Використовуючи ці уявлення, можна дійти висновку, що криві з екстремумами, з плато, із порогами належать до одного і того ж типу кривих, відмінності яких відображають співвідношення між процесами ушкодження та відновлення.

У “пізній” пострадіаційний період спостерігалось зростання виходу ушкоджень ДНК у порівнянні з такими у ранній період. Це свідчить на користь того, що після розпаду радіаційно-індукованих довгоживучих вільних радикалів темпи старіння опроміненого насіння зростають.

Проте за умов прискореного старіння опроміненого насіння як в “близький”, так й у “пізній” періоди не виявлено суттєвих якісних відмінностей характеру залежностей виходу ушкоджень ДНК у паростках від тривалості прискореного старіння опроміненого насіння. Це підтверджує думку про те, що елементарні події радіаційного старіння насіння є однаковими в усьому часовому інтервалі. Встановлені дані свідчать про те, що, базуючись тільки на вільнорадикальній гіпотезі старіння, дуже складно пояснити механізми радіаційно - індукованого старіння насіння як на рівні сухого насіння, так й на рівні паростків, які формуються з цього насіння. Напевно, за умов прискореного старіння опроміненого насіння в “пізній” пострадіаційний період як індукція систем репарації ДНК, так й “виснаження” їх ємності відбувається за менших доз опромінення або (та) у більш ранні терміни старіння в порівнянні зі старінням насіння в “близький” період після опромінення.

Існують певні відмінності між закономірностями виходу ушкоджень ДНК у паростках, котрі формувались з насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС, та паростках, які розвивались з насіння контрольних рослин. Зокрема, на графіках, що описують накопичення ушкоджень ДНК в паростках із хронічно опроміненого насіння під час старіння практично відсутні криві з екстремумами та порогами.

В цілому спостерігалась тенденція до зростання виходу ушкоджень ДНК у паростках із зростанням дози опромінення та тривалості старіння насіння. Практично за всіх досліджених доз додаткового гострого опромінення та режимів старіння хронічно опроміненого насіння індукція систем репарації ДНК у паростках відбувалась з перших діб старіння насіння. Це може вказувати на те, що системи репарації ДНК в насінні з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС знаходились “у стані готовності” до елімінації додаткових ушкоджень молекул ДНК, що, ймовірно, лежить в основі феномену радіоадаптації, який був виявлений нами для цього насіння при оцінці ЛД₅₀.

Лінійні (10 доба старіння) та лінійно - квадратичні (20 доба старіння) дозові залежності виходу ушкоджень ДНК в паростках, які розвивались з хронічно опроміненого насіння за умов радіаційного старіння, вказують на те, що за всіх доз опромінення в основі механізмів променевого старіння насіння лежать споріднені процеси. Ймовірно, зазначені дозові залежності відображають нерепарабельну компоненту променевого ураження насіння, яка відтворюється в багатьох генераціях клітин, що беруть початок від клітин ембріональної меристеми. Ми схиляємося до думки, що в основі механізмів зростання темпів радіаційно - індукованого старіння зі збільшенням дози опромінення лежить збільшення нерепарабельної компоненти ушкоджень ДНК.

Вплив радіаційно - індукованого старіння на вихід ушкоджень ДНК в насінні у зв'язку з переходом насіння від спокою до активної життєдіяльності. Не всі ушкодження ДНК, які накопичуються в насінні під час променевого старіння, “консервуються” та реалізуються в паростках, що формуються з цього насіння. Значна частина ушкоджень елімінується системами репарації ДНК за умов, які не обмежують функціонування останніх (Elder, 1993, Бубряк, 1994). Відтак становило інтерес дослідити особливості впливу променевого старіння на вихід ушкоджень ДНК у набубнявілому насінні. Існують повідомлення про те, що репарація ДНК відбувається протягом 1,5 - 2 годин від початку замочування насіння (Бубряк, 1998, Boubriak, 2000). Проте ці відомості поодинокі, їх не досить для того, щоб скласти цілісне уявлення про те, який характер має кінетика репарації ДНК під час набубнявіння насіння. Нез'ясованим залишається також питання про особливості кінетики репарації ДНК у насінні, що зазнало променевого старіння, за умов активації життєвих процесів. Для вирішення цих питань ми замочували насіння, яке зазнавало впливу різних доз опромінення та тривалості старіння при 50 ⁰С, протягом різних інтервалів часу (10 хвилин, 1 година та 12 годин).

Результати, що їх було отримано нами під час замочування насіння, яке підпадало старінню, вказують на складний характер кінетики репарації ДНК залежно від тривалості старіння. Спостерігались як складні часові залежності з екстремумами (10 хвилин та 1 година замочування) так й S - подібні криві (12 годин замочування насіння). З'ясування кінетики елімінації ушкоджень ДНК в опроміненому насінні за умов його замочування виявило, що найбільш ефективно елімінація радіаційно - індукованих ушкоджень ДНК у насінні відбувалась за умов опромінення в дозі 50 Гр.

Підсумовуючи результати дослідів із замочування насіння, яке зазнавало радіаційного старіння, відмітимо, що ушкодження ДНК ефективно та швидко вилучались репаративними системами в доволі широкому діапазоні доз та тривалостей променевого старіння (перші 20 діб прискореного старіння насіння після опромінення в дозах 10, 50 Гр, перші 10 та 5 діб штучного старіння після опромінення в дозах 100 та 200 Гр відповідно. Проте при відносно низькому рівні ушкоджень ДНК в насінні (перші доби старіння після опромінення насіння в дозі 10 Гр) елімінація ушкоджень ДНК відбувалась більш повільно в порівнянні з старінням після опромінення насіння в дозі 50 Гр. Ймовірно, в насінні за умов переходу від спокою до активного метаболізму відбувається “каскадна” активація репаративних систем, при цьому для індукції додаткових елементів систем репарації ДНК, можливо, необхідне досягнення певної порогової кількості ушкоджень ДНК. Якщо цього не відбувається, індуцибельні системи репарації не функціонують і для елімінації ушкоджень ДНК за умов початкових етапів прискореного старіння опроміненого у відносно невеликих дозах (10 Гр) насіння потребуються значні проміжки часу (до 12 годин).

Отримані нами результати засвідчують, що для насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС за умов його променевого старіння в цілому не спостерігалися складні за характером залежності виходу ушкоджень ДНК під час замочування від дози опромінення та тривалості старіння насіння. Результати експериментів із замочування хронічно опроміненого насіння свідчать на користь того, що для них практично не потрібен тривалий час для початку функціонування репаративних систем у радіаційно-індукованому старінні. За виключенням доз в 10 та 50 Гр (за яких були відсутні статистично достовірні відмінності в ефективності елімінації ушкоджень ДНК в променевому старінні від такої в контролях), за всіх інших доз додаткового гострого опромінення та за всіх тривалостей замочування насіння з 10 - км Зони відчуження ЧАЕС після 5 - 7 доби прискореного старіння спостерігались прямі кореляційні залежності виходу ушкоджень ДНК у набубнявілому насінні від дози опромінення.

Формування насіння за умов підвищеного радіаційного фону може викликати зсув умов, що уможливлюють індукцію систем репарації ДНК у променевому старінні насіння, в діапазон більш низьких доз додаткового гострого опромінення або меншої тривалості променевого старіння або меншої тривалості замочування насіння.

Таким чином, ушкодження ДНК мають неоднозначний вплив на розвиток радіаційно - індукованого старіння насіння, а саме: їх нагромадження може виступати чинником, який прискорює променеве старіння насіння, і разом із тим фактором, котрий індукує репаративні системи. Проте, на нашу думку, ці аспекти потрібно розглядати не окремо один від одного, а з позицій причинно - наслідкових зв'язків. Ймовірно, індукція додаткових “потужностей” репаративних систем можлива саме за умов прискореного променевого старіння насіння. Наразі невідомо, чи спрацьовують системи репарації ДНК у природному старінні та радіаційно - індукованому старінні насіння, що відбувається за “природних” умов. Проте ми отримали дані, які свідчать на користь припущення про те, що в основі прискорення процесів радіаційного старіння зі збільшенням дози опромінення біологічного об'єкта може лежати нерепарабельна компонента радіаційного ураження.

радіаційний старіння насіння днк

ВИСНОВКИ

1. Прискорене старіння опроміненого насіння є корисною системою у вивченні закономірностей формування та розвитку віддалених наслідків опромінення.

2. Радіаційно - індуковане старіння насіння супроводжується накопиченням ушкоджень ДНК у сухому насінні та паростках, які формуються з цього насіння.

3. Вихід ушкоджень ДНК у сухому насінні за умов променевого старіння задовільно описується лінійно - квадратичними залежностями від тривалості старіння. Кількість ушкоджень ДНК відображає значення дози опромінення, характер режиму та тривалості прискореного старіння.

4. Для кількості ушкоджень ДНК в паростках, які розвивались з опроміненого насіння, котре зазнавало старіння та не втрачало життєздатності, не відмічено прямої залежності від виходу ушкоджень ДНК у сухому насінні. Радіаційно - індуковане старіння являє собою не поступовий кумулятивний процес накопичення ушкоджень ДНК, а складну багатостадійну реакцію клітин у відповідь на виникнення ушкоджень ДНК. Це знаходить вираз в різноманітних за характером залежностях виходу ушкоджень ДНК у паростках від тривалості прискореного старіння опроміненого насіння, а саме - кривих з порогами, екстремумами, плато, а також залежностях, які описуються лінійними та лінійно - квадратичними функціями.

5. Хронічне низькоінтенсивне опромінення насіння люпину під час його формування в кумулятивній дозі в 0,23 Гр може виступати фактором формування радіоадаптації та чинником прискорення проходження окремих етапів променевого старіння насіння після додаткового гострого опромінення.

6. Прискорене старіння насіння супроводжується впорядкованою високомолекулярною фрагментацією ДНК на фрагменти розмірами 50 та 300 т.п.н. Характер порушення структурної цілісності ДНК залежить від тривалості прискореного старіння опроміненого насіння.

7. У променевому старінні насіння існують такі комбінації доз й режимів та тривалостей старіння, за яких не спостерігається ефективної елімінації ушкоджень ДНК.

8. Тривалість замочування насіння є важливим модифікуючим чинником, що впливає на вихід ушкоджень ДНК в радіаційно - індукованому старінні насіння.

9. В основі прискорення темпів радіаційного старіння при зростанні дози та тривалості старіння може лежати збільшення нерепарабельної компоненти ушкоджень ДНК.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Н.В. Соколов, Д.М. Гродзинский, Б.В. Сорочинский. Роль повреждений ДНК в процессе старения семян люпина (Lupinus polyphyllus Lindl.), индуцируемого хроническим низкодозовым облучением // Доповіді НАН України. - 2000. - № 8. - С. 166 - 171.

2. Исаенков С.В., Соколов Н.В., Сорочинский Б.В. Биологические эффекты ионизирующего излучения в малых дозах. Анализ современных подходов и концепций // Пробл. Чорнобильської Зони відчуження. - 1998. - № 5. - C. 102 - 112.

3. Н.В. Соколов, Б.В. Сорочинский. Влияние ускоренного старения на характер деградации ДНК клеток зародышей семян люпина, сформированных в условиях хронического облучения в зоне отчуждения ЧАЭС // Физиология и биохимия культурных растений. - 2001. - Т. 33, № 2. - С. 127 - 134.

4. М.В.Соколов, Д.М.Гродзінський, Б.В.Сорочинський. Порушення структурної цілісності ДНК насіння люпину (Lupinus polyphyllus Lindl.) під час старіння, індукованого хронічним опроміненням // Доповіді НАН України. - 2001. - № 4. - С. 155 - 160.

5. N.V. Sokolov, D.M. Grodzinsky, B.V. Sorochinsky. The role of DNA lesions in process of lupine seed senescence induced with chronic irradiation of low intensity // Abstracts of 12^th Congress of FESPP. Plant physiology and Biochemistry. V. 38. - Budapest. - 2000. - S 04 - 08.

6. N.V. Sokolov, D.M. Grodzinsky, B.V. Sorochinsky. How does low dose chronic irradiation under the condition of 10 - km Chernobyl Exclusion zone influence on processes of seed aging? // Abstracts of International Conference “Fifteen years after the Chernobyl Accident. Lessons learned”. - Kyiv. - 2001. - 2 - 117.

7. N.V. Sokolov. DNA damage in radiation - induced seed aging // Abstracts of 31^th European Radiation Research Conference. - Dresden. - 2001. - P. 112.

Размещено на Allbest.ru