Санитарно-бактериологический контроль производства биологически активных препаратов

Исходным материалом для приготовления биологически активных препаратов (гормональных и ферментных) является сырье, получаемое при убое сельскохозяйственных животных:

- эндокринное (гипофиз, паращитовидная железа, щитовидная железа, надпочечники, полове железы, плацента);

- ферментное (пилорическая часть желудка свиней, слизистая оболочка сычугов крупного рогатого скота, поджелудочная железа, слизистая оболочка толстого кишечника);

- специальное (кровь, желчь, печень, спинной мозг).

Перечисленное сырье нестерильно и в нем могут содержаться гнилостные бактерии, плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты и другие микроорганизмы. При получении высококачественных биологически активных препаратов строгий производственный и санитарно-микробиологический контроль осуществляется на всех стадиях технологического процесса и включает: проверку качества сырья, материалов, санитарно-гигиенического состояния производства.

Санитарно-гигиеническое состояние контролируют:

- оборудования, аппаратуры, спецодежды, рук рабочих по КМАФАнМ, БГКП;

- воздух по количеству в 1 м3 санитарно-показательных микроорганизмов (гемолитических стрептококков);

- воду по КМАФАнМ, БГКП по общепринятым методикам, приведенным в предыдущих лабораторных работах;

- микробным заболеваниям, которые возникают в поле и могут проявиться в разные периоды хранения.

Модуль 4. Санитарно-микробиологические исследования при пищевых токсикозах, токсикоинфекциях и остаточных количеств антибиотиков

4.1 Возбудители пищевых отравлений

Пищевые токсикоинфекции - острые кишечные заболевания, возникающие при употреблении в пищу продуктов, в которых произошло массовое размножение возбудителя и накопление токсина.

По типу пищевых токсикоинфекций протекают заболевания, вызываемые эшерихиями, салмонеллами, шигеллами, иерсиниями (энтеропатогенными). Клиничекий диагноз устанавливается после выделения из испражнений, рвотных масс, остатков пищи соответствующих возбудителей.

Пищевые токсикозы - отравления токсинами микроорганизмов (бактериальными - ботулизм, стафилококковый или грибными -микотоксикозы).

Отравления смешанной этиологии (миксотравления) - сочетание первых двух. Например, Bac. сereus+токсин стафилококка.

4.2 Микробиологическая диагностика пищевых отравлений

Для диагностики пищевых отравлений используют следующие методы:

- выделение чистой культуры и ее идентификация до серовара (фаговара);

- серологический (обнаружение антител в сыворотке заболевших) - чаще как ретроспективный;

- биологический - заражение лабораторных животных - при расшифровке токсикозов (стафилококкового и ботулизма).

Принципы расследования:

- материал для исследования (рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, кровь, моча от заболевших или патологический смыв в случае смерти; остатки пищи и исходные продукты,; смывы с посуды, инвентаря, от обслуживающего персонала- испражнения и мазок из зева на бактерионосительство).

- повторность исследований для подтверждения диагноза или обнаружения микроорганизмов;

- поиск одновременно в нескольких направлениях для обнаружения различных видов возбудителей пищевых токсикоинфекций и токсикозов.

Лабораторная работа №9. Санитарно-микробиологические исследования при пищевых токсикозах, токсикоинфекциях и остаточных количеств антибиотиков

Цель - научиться использовать принципы и методы обнаружения возбудителей пищевых отравлений токсикозов и остаточных количеств антибиотиков

Пищевые токсикозы чаще всего возникает после употребления в пищу продуктов, при изготовлении которых использовали молоко от коров, больных маститом, вызванным Streptococcus agalactiae, Staphilococcus aureus. Патогенные стрептококки в процессе жизнедеятельности выделяют:

- эритрогенный токсин,

- гемолизин,

- стрептолизин,

- токсин, обусловливающий пищевые отравления.

Патогенные стафилококки выделяют токсины:

- гемотоксин, лизирующий эритроциты,

- лейкоцидин, разрушающий лейкоциты,

- некротоксин, вызывающий некроз тканей,

- летальный токсин, вызывающий гибель животных,

- энтеротоксин, вызывающий пищевые отравления.

Патогенные и сапрофитные стафилококки идентифииируют по физиолого-биохимическим свойствам (первые выделит коагулазу, лецитиназу, гиалуронидазу, фибринолизин; способны ферментировать маннит, разжижать желатин, вызывать гемолиз на средах с кровью).

К возбудителям пищевого токсикоза относятся и Clostridium botulinum крупная, размером 4 х 8 мкм палочка, подвижная, образует спору овальной формы терминальнорасположенную; спора превышает диаметр вегетативной клетки, что придает ей вид теннисной ракетки; по Граму опрашивается положительно, облигатный анаэроб.



При пищевых токсикозах выделяют из патологического материала возбудитель или токсин. Clostridium botulinum продуцирует сильнодействующий экзотоксин, превосходящий по силе воздействия химические яды.

Пищевые токсикоинфекции - острые кишечные заболевания, возникающие при употреблении в пищу продуктов, в которых произошло массовое размножения микроорганизма-возбудителя и накопление токсина.

Сальмонеллы - мелкие короткие палочки с закругленными концами, подвижные, спор и капсул не образуют, грамотрицательные.

БГКП - бактерии группы кишечной палочки: рода Escherichiae (E.coli), Citrobacter (C.freundii), Enterobacter (E. аerogenes).

Бактерии представляют собой мелкие короткие палочки, подвижные, грамотрицательные, спор и капсул не образуют.

Дифференциальную БГКП проводят по тесту ТИМАЦ (табл. 13).

Таблица 13 - Характеристика бактерий группы кишечной палочки

ТЕСТЫ	E.coli	C.freundii	E. аerogenes
Т - температурный тест (ферментация углевода при 43 - 44°С)	+	+	-
И - образование индола	+	-	-
М - изменение желтого светлого цвета метилового красного в красный цвет при рН 5,04 и ниже	+	+	-
А - образование ацетоина при росте на среде с глюкозой	-	-	+
Ц - рост на цитратной среде Козера изменение цвета индикатора до синего	-	+

Бактерии рода: Proteus: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morgani, Proteus retderi - мелкие коккоподобные грамотрицательные палочки, иногда встречаются нитевидные формы, подвижные, спор и капсул не образует.

Clostridium perfringens - крупная грамположительная неподвижная палочка, образует спору и капсулу, факультативный анаэроб.

Микроорганизмы продуцируют токсины типов: А, В, С, Д, Е.

Bacillus cereus - крупная спорообразующая, грамположительная подвижная палочка, в виде цепочек или пакетообразных скоплений, аэроб. После употребления продукта, содержащего большое количество Bacillus cereus, возникает пищевое отравление. Схема проведения санитарно-микробиологических исследований при пищевых отравлениях приведена в таблице 14. Микробиологическому анализу одновременно подвергают материал от заболевших, остатки пищи, исходные продукты для приготовления пищи, смывы посуды и инвентаря пищеблока, мазки на бактерионосительство и испражнения работников пищеблока.

Таблица 14 - Схема исследования пищевых продуктов при пищевых отравлениях

Выделяемые микроорганизмы	Посевы, среды, сроки инкубирования	Результат
Salmonella	1 день - 25 г засевают в 225 мл забуференной пептонной среды; 2-ой день - 10 мл накопительной культуры в 100 мл хлормагниевой среды; 3-й (4-й)день - ср.Эндо (18 часов) ср.ВСА (48 часов) 5-й (8-й) день - ср. Олькеницкого 9-й день - большой "пестрый ряд"; серологические реакции	помутнение помутнение ср. Эндо -бесцветные или слегка розовые колонии; ср. ВСА - колонии с металлическим блеском, иногда зеленоватые, прокрашивающие в черный цвет среду под колонией; лактоза (-) глюкоза (+) Н2S (+) Мочевина(-)
Proteus	МПА Посев по Шукевичу	Вуалеобразный (ползучий рост)
Энтеропатогенные эшерихии	1-й день- ср. Эндо; ср. Кесслера (для определения коли-титра); 2-й день- оксидазный тест, окраска по Граму бродильная проба с глюкозой	Рост колоний красного цвета с металлическим блеском; Помутнение среды Оксидазоотрицательная Грамотрицательная; Глюкоза (+)
C. perfringens	1-й день- ср. Китта-Тароцци; 2-й день- ср.Вильсона-Блера; 3-й день - идентификация	Почернение среды Почернение среды
Enterococcus	1-й день Молочно-ингибиторная среда с полимиксином или теллуритом калия; 3-й день - скошенный МПА; ср. Гисса	Колонии правильной формы (1,5-2 мм) с зоной протеолиза или серой окраской; Каталаза (-) 40% желчный бульон (+) рафиноза(-) сорбит (+) маннит(+) гемолиз на кровяном агаре (+)
Патогенные стафилококки	1-й день - Молочно-солевой агар; Желточно-солевой агар; 2-й день - солевые бульоны с 6,5 и 10 % хлорида натрия	Колонии правильной формы (2-4 мм); цвет от белого до оранжево-желтого, на ЖСА - ореол коагулята; Диффузный рост
Bacillus cereus	1-й день - 0,1 мл пробы на ср. Донована; 2-й день - МПА скошенный; 3-й день - ср. Гисса	Крупныбелые колонии со слегка изрезанным краем, окруженные зоной матового коагулята; сплошной налет белого цвета, иногда с мучнистой поверхностью Окраска по Граму (+); Глюкоза (+ Маннит (+))

Определение остаточных количеств антибиотиков в молоке (экспресс-метод).

При лечении маститов у коров антибиотиками (пенициллин, тетрациклин, стрептомицин), они попадают в молоко, нарушают молочнокислое брожение, что в конечном итоге отражается на качестве продуктов.

Определение остаточных количеств антибиотиков в молоке проводят методом прямого микроскопирования, который основан на подавлении размножения test-бактерий и изменении их форм под влиянием антибиотиков.

В первую пробирку (I) наживают 10 мл исследуемого молока, закрывают пробкой и ставят на водяную баню при 80-85°С на 5 мин.

Затем быстро охлаждают до 40°С.

Вторая пробирка (2) -- контроль: 10 мл молока, которое заведомо не содержит антибиотиков.

В обе пробирки добавляют по 3-4 капли свежей культуры Streptococcus thermophilus чувствительной к антибиотикам, встряхивают, закрывает пробками, помещают на водяную баню при 40°С на I час.

Учет. Из пробирок I и 2 готовят фиксированные препараты, окрашивают метиленовым синим 3-5 мин и микроскопируют с иммерсионным объективом.

О присутствии антибиотиков в исследуемом молоке свидетельствует меньшее, по сравнению с контролем, количество клеток, наличие утолщенных форм клеток и их скопление.

Модуль 5. Санитарная экология

5.1 Санитарная микробиология воды

Вода является естественной средой обитания многих видов микроорганизмов, которые составляют постоянную водную микрофлору, способную жить и размножаться в воде, участвовать в превращении азотистых веществ, серы, железа, самоочищении водоемов.

Непостоянная или случайная микрофлора попадает в водоемы из почвы во время дождей, воздуха с оседающей пылью, с отбросами промышленных предприятий и сточными водами.

Основным источником загрязнения открытых водоемов органическими веществами и микроорганизмами, среди которых могут быть и патогенные являются сточные воды.

Питьевую и сточные воды очищают и обеззараживают. Качество и эффективность обеззараживания воды контролируют по микробиологическим показателям. Вода, используемая для питья и в пищевой промышленности, должна удовлетворять установленным санитарным нормам.

Количественный и качественный состав микроорганизмов природных вод зависит от содержания в воде органических веществ, заселенности прибрежных районов, времени года, метеорологических и прочих условий.

В морях, реках, озерах и других водоемах содержатся различные микроорганизмы. Постоянно в воде встречаются Ps. fluorescens, Васt. аquatilis communis, М. candicans, M. roseus, Sarcina lutea, Тоrula rоsеа; реже -- спорообразующие бактерии Вас. сеrеus, Вас. mycoides и др.

В структуре микробного сообщества чистой воды: доля кокковых форм составляет 80%, палочковидных - 20% от всех аэробных сапрофитных микробов. Количество сапрофитных микроорганизмов в воде от единиц до миллионов в 1 мл. При загрязнении водоемов содержание палочковидных и спорообразующих бактерий увеличивается.

Контаминация водоемов патогенными микроорганизмами и распространение возбудителей инфекционных болезней через воду. Сапробность.

Сточные воды городской канализации содержат миллиарды микробных клеток в 1 мл (БГКП, энтерококки, споровые аэробные и анаэробные палочки, лактобактерии, грибы и некоторые простейшие). От больных людей, животных и бактерионосителей, в воду попадают патогенные микроорганизмы - холерный вибрион, дизентерийная палочка, сальмонеллы, патогенные эшерихии; возбудители зооантропонозных заболеваний - сибирской язвы, туберкулеза, бруцеллеза, туляремии, сапа, рожи листериоза, лептоспироза; пастереллы, мытный стрептококк; патогенные анаэробы, вирус полиомиелита, гепатита, ящура. Они сохраняются и выживают в ней определенное время в зависимости от: биологических свойств возбудителей инфекционных болезней, дозы обсеменения, степени загрязненности воды, наличия бактериофагов, химического состава, рН, солнечной радиации, температуры.

Водоемы могут загрязняться вирусами, которые выделяются с содержимым и поражают человека (до 100 вирусов, в том числе инфекционного гепатита и полиомиелита).

Сапробность - степень загрязненности водоема характеризует особенности водоема - определенную концентрацию органических веществ, соответствующую стадию их минерализации, условия развития и состав микроорганизмов.

Различают три основные зоны сапробности:

Полисапробная зона (зона сильного загрязнения)-- вода загрязнена органическими веществами, число микроорганизмов достигает нескольких миллионов в 1 мл, преобладают кишечные и анаэробные гнилостные бактерии, обусловливающие процесс гниения и брожения;

Мезосапробная зона (зона умеренного загрязнения) - характеризуется минерализацией органических веществ с преобладанием окислительных процессов и выраженной нитрификацией. Количество бактерий в 1 мл воды составляет сотни тысяч, причем содержание коли-бактерий значительно уменьшается;

Олигосапробная зона (зона чистой воды) обычно не содержит органических веществ. Количество бактерий в I мл воды составляет десятки, сотни, преобладают серо- и железобактерии.

Активность процесса самоочищения водоема характеризует наличие определенного количественного и качественного состава микроорганизмов в различных зонах сапробности.

Самоочищение водоемов обусловливается факторами:: физическими (в результате разбавления ее чистой водой и свежими притоками); оседания в воде нерастворимых органических и неорганических частиц, а вместе с ними и бактерий; губительного действия ультрафиолетовых лучей; химическими - бактериостатическое и бактерицидное действие на микроорганизмы оказывают соли серебра, меди, галогенов рН, а также окисление органических и неорганических веществ в водоеме.

Основная роль в удалении из водоемов растворимых веществ принадлежит микробам, водной микрофлоре, количественный и качественный состав которой меняется в зависимости от содержания в воде органических веществ.

Санитарно-микробиологическое исследование воды

О безопасности воды в эпидемиологическом отношении судят по результатам санитарно-бактериологического исследования:

· КМАФАнМ в воде (определение микробного числа) - не более 100;

· -количества бактерий группы кишечных палочек БГКП

(коли-титр не менее 300, коли-индекса не выше 3).

Микробиологические показатели для питьевой (водопроводной воды, подвергаемой очистке и дезинфекции) нормированы ГОСТ 2874--73.

5.2 Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Микрофлора почв. Биологическая контаминация почвы и роль микроорганизмов в ее самоочищении.

Почва является естественной средой обитания микроорганизмов. В ней имеются все условия для благоприятного их развития (достаточное количество влаги, органических и минеральных веществ). Из природных субстратов почва наиболее обильно населена микроорганизмами, которые составляют ее постоянную микрофлору. Санитарно-гигиеническая роль этой микрофлоры огромна. Почвенные микроорганизмы участвуют в минерализации органических отбросов, самоочищении почвы, в круговороте биогенных элементов. Количественный и видовой состав микроорганизмов в почве обусловлен содержанием в ней органических веществ, влаги, рН, температурой, климатическими условиями, способом обработки и др.

Наиболее богаты микроорганизмами черноземные, каштановые почвы, сероземы и специально обработанные почвы. Количество бактерий в 1 г таких почв иногда достигает нескольких десятков миллиардов. Бедны микрофлорой песчаные, горные и лишенные растительности почвы.

Максимальное количество микробов в почве содержится на глубине 10--20 см. Начиная с глубины в 1--2 м, количество их резко сокращается, поскольку по мере углубления в почву уменьшается содержание органических веществ, кислорода, необходимого для жизнедеятельности аэробных бактерий.

B почве обитают простейшие микроскопические водоросли, плесневые и дрожжевые грибы, актиномицеты, бактерии. Среди последних постоянно обнаруживают гнилостные спорообразующие аэробы: Вас. mycoides, Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. megaterium, гнилостные неспорообразующие аэробы и факультативные анаэробы Рs. fluorescens, Рs. vulgaris, Васt. aquatilis, Васt. flavum, гнилост ные анаэробы С1. sporogenes, С1. putrificum, С1. perfringens, азотфиксирующие, нитрифицирующие, серо- и железобактерии.

Среди сапрофитных кокков встречаются М. а1bus, М. саndicans, М. сегеus flaus, Sarcina urеае и др.

Почва населенных мест загрязняется твердыми и жидкими отбросами, выделениями людей и животных, их трупами, остатками растений, хозяйственно-бытовыми и промышленными сточными водами. Вместе с органическими загрязнениями в почву попадает большое количество микроорганизмов. Особенно опасны в эпидемиологическом отношении сточные воды боен, мясокомбинатов, предприятий по переработке кожи, шерсти, которые могут содержать патогенных бактерий.

Основная роль в самоочищении почвы принадлежит почвенным микроорганизмам. Под действием ферментов бактерий сложные органические вещества, попавшие в почву, разлагаются на простые минеральные соединения (СО2, Н2О, NН3, и др.), доступные для питания автотрофных организмов. Одновременно с процессами распада органических веществ в почве происходят процессы синтеза (серо-, железо-, водород- и метан-окисляющие бактерии, ассимилируя СО2, синтезируют органические вещества собственных клеток). С помощью ферментов нитрифицирующих бактерий NН3 окисляется до нитритов и нитратов (процесс нитрификации). Растения используют азот нитратов для построения белков протоплазмы.

В почве беспрерывно совершаются процессы, обусловленные жизнедеятельностью микроорганизмов: аммонификация, нитрификация, денитрификация, разложение клетчатки, гумуса

Санитарно-гигиеническое значение имеют именно процессы распада и минерализации органических веществ. В процессе самоочищения почвы изменяется содержание в ней санитарно-показательных микроорганизмов. Так, при свежем фекальном загрязнении первые две недели в почве обнаруживают Е. coli - (61,6%) и Епt. аеrоgеnеs - (38,4%), а через 21 день количество Е. coli уменьшается, а Епt. аеrоgеnеs возрастает. Термофильные микроорганизмы в небольшом количестве содержатся в кишечнике человека и животных. В значительно большем количестве их обнаруживают в навозе и компостах, т. е. там, где скапливается значительное количество органических веществ, которые при распаде разогреваются до высоких температур (70°С и выше). В почву термофилы попадают с фекалиями, навозом и компостами. В незагрязненной почве -- их не обнаруживают.

Чем больше минерализуется органических веществ в почве, тем интенсивнее протекает процесс нитрификации и, следовательно, процесс самоочищения почвы.

В почву с выделениями больных, а также с трупами людей и животных, погибших от инфекционных болезней, со сточными водами могут попадать патогенные микроорганизмы.

Для большинства болезнетворных микроорганизмов почва не является благоприятной средой. Только листерии, возбудители рожи свиней и сибирской язвы способны сохраняться жизнеспособными в почве.

Продолжительность выживания патогенных микроорганизмов в почве зависит от биологии возбудителя, содержания влаги и соответствующих питательных веществ, рН, температуры, наличия микробов-антагонистов, бактериофагов.

Наиболее длительное время выживают в почве спорообразующие микроорганизмы. Споры возбудителей сибирской язвы, столбняка, ботулизма, газовой гангрены могут сохраняться в почве в течение многих лет. Неспорообразующие бактерии погибают сразу, как только израсходуют питательные вещества трупного материала.

Почва - фактор передачи возбудителей инфекционных болезней (сибирская язва, столбняк газовая гангрена и др.). Споры возбудителя сибирской язвы могут попадать в организм человека, животного с пищевыми продуктами, кормами, имевшими контакт с зараженной почвой. Столбняк, газовая гангрена возникает у человека при загрязнении ран землей, содержащей споры возбудителей указанных инфекций.

Санитарное состояние почвы оценивают по микробиологическим показателям.

Микробиологическое исследование проводят для санитарной оценки почвы, характеристики процессов самоочищения, оценки почвенного и биотермического методов обезвреживания отбросов, при определении пригодности участков для строительства, при эпидемиологических и эпизоотологических обследованиях с целью выяснения путей заражения почвы, продолжительности выживания в ней патогенных микробов и т. д.

В зависимости от поставленной задачи применяют краткий или полный санитарно-бактериологический анализ почвы.

Краткий анализ почвы включает определение двух микробиологических показателей: микробного числа (КМАФАнМ) и коли-титра.

Полный анализ - определение микробного числа (КМАФАнМ), коли-титра, титра анаэробов (С1. perfringens), протея, термофилов.

Почва как фактор распространения патогенных микроорганизмов при приготовлении овощных соков, пюре, мясных, рыбных продуктов.

Споры С1ostridium. botulinum вместе с частицами земли попадают в воду, в организм рыб, а также на сырье, предназначенное для изготовления консервов, колбас и других продуктов.

При силосовании возбудитель ботулизма может развиваться в силосуемой массе и выделять токсин, вызывающий иногда смертельное отравление у животных.

Наиболее опасной является почва, загрязненная фекалиями больных кишечными инфекциями: дизентерией, холерой, брюшного тифа, сальмонеллезов, энтеровирусных заболеваний. Они попадают в организм человека с загрязненными землей овощами, фруктами и другими пищевыми продуктами. Существует прямая зависимость между неудовлетворительным санитарным состоянием почвы, обусловленным плохой ее очисткой и уровнем заболеваемости населения кишечными инфекциями.

Почвенные грибы рода Fusarium, попадая на злаковые и другие растения, в процессе своего развития, вырабатывают токсические вещества, а рода Aspergillus (Asp. fumigatus, Asp.; flavus, Asp.. оrуzае), паразитирующие на земляных орехах, зерновых культурах и кормах, продуцируют афлатоксины..

5.3 Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Воздух не является благоприятной средой для развития микроорганизмов, поскольку в нем мало органических веществ, влаги, кроме того, солнечные лучи оказывают бактерицидное действие на них. Микрофлора воздуха не постоянна, микроорганизмы в нем находятся непродолжительное время, В состав микрофлоры воздуха входит до 100 различных видов сапрофитных микроорганизмов: споры гнилостных бактерий, плесневых грибов, дрожжей, актиномицетов; вегетативные формы микробов - пигментообразующие и беспигментные кокки и бактерии. Наиболее часто в воздухе встречаются следующие виды: Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. mycoides, Р. glaucum, Мucor mucedo,Torula alba, T.rosea, Асt. griseus, М. roseus, М. candicans, Staphylococcus citreus, Stph. albus и др.

Количественный и качественный состав микрофлоры атмосферного воздуха зависит от характера почвенного и водного покрова, общесанитарного состояния местности, сезонных, климатических и метеорологических факторов (интенсивность солнечной радиации, температура, атмосферные осадки и пр.).

Источником формирования воздушной микрофлоры являются почва, вода, поверхность растений, выделения больных людей и животных. Для профилактики аэрогенных инфекций и уменьшения микробной обсемененности воздуха закрытых помещений проводят его очистку и обеззараживание

Аэрогенным путем возможно распространение возбудителей инфекционных болезней человека и животных... Воздух может быть источником обсеменения микробами пищевых продуктов.

Санитарное состояние воздуха жилых помещений, а также производственных цехов в мясной и молочной промышленности оценивают по микробиологическим показателям.

Санитарная оценка воздуха по микробиологическим показателям

Санитарную оценку воздуха жилых помещений осуществляют по двум микробиологическим показателям: КМАФАнМ. количество санитарно-показательных (стрептококков -- зеленящего и гемолитического-- в 1 м³ воздуха)

На прямое обнаружение патогенных микробов воздух исследуют только при специальных показаниях.

В молочной промышленности санитарное состояние воздуха производственных помещений, оценивают по микробиологическим показателям: количество бактерий (микрококки, сарцины, палочковидные) на МПА; и количество плесневых грибов и дрожжей на СА,

Санитарное состояние воздуха производственных помещений оценивают: по четырехбалльной системе (отлично, хорошо, удовлетворительно и плохо) - молочная промышленность и трехбалльной системе (хорошо, удовлетворительно и неудовлетворительно) - мясная промышленность.

Предприятие	На 100 см2	Оценка
	Общее количество на МПА	Количество дрожжей, грибов на СА
Молочная промышленность	50	0	хорошее
Мясная промышленность, t 12?C		Не более 10	хорошее

Лабораторная работа №10. Санитарно-микробиологическое исследование объектов окружающей среды

Цель - ознакомиться с методами бактериологического контроля воды, воздуха, почвы научиться давать заключение об их соответствии санитарно-гигиеническим требованиям.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Оценку санитарного состояния почвы проводят по следующим показателям:

1) микробное число почвы (КМАФАнМ);

2) фекальное загрязнение и его давность определяют по коли-титру, перфрингенс-титру, титру энтерококков.

Определение микробного числа Микробиологическому анализу обычно подвергают усредненный образец субстрата. В условиях асептики взвешивают 10 г анализируемого образца и стерильно переносят навеску в колбу с 99 мл стерильной воды, встряхивают в течение 5-10 мин, дают отстояться 1 мин. Это - первое разведение 1:10. Из этого разведения стерильной пипеткой отбирают 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды, получают второе разведение 1:100 и т.д. (см. рис. 5).

Рис.5 - Схема приготовления разведений.

Далее 1 мл суспензии (рабочего разведения) используют:

- для посева на плотные агаризованные пластинки, которые заготовлены заранее следующим образом. Предварительно расплавленный и охлажденный до 40° С агар вливают в стерильные чашки Петри и оставляют их до застывания МПА. Каплю суспензии из рабочего разведения растирают по поверхности питательной среды шпателем Дригальского (стерильным);

- для посева глубинным способом - на дно стерильной чашки Петри выливают 1 мл суспензии, затем чашку заливают расплавленным МПА, равномерно распределяя его на поверхности дна чашки.

По окончании посева чашки Петри помещают в термостат при температуре 28-30°С. Время инкубации 48 часов. В этот период клетки, попавшие на питательную среду, начинают активно размножаться и образуют колонии, которые в дальнейшем и учитывают.

Учет. Подсчитывают колонии, выросшие на чашках Петри. Крышку чашки Петри при этом не снимают, для удобства подсчитанную колонию отмечаю точкой, пользуясь восковым карандашом. При очень густом посеве (что возможно из-за отсутствия определенных навыков) подсчет делают следующим образом: дно чашки делят на равные секторы, подсчитывают количество колоний в нескольких секторах, находят среднее арифметическое и умножают на количество секторов.

Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г навески определяют по следующей формуле:

где А - количество КОЕ в 1 г исследуемого образца;

б- количество колоний, выросших на чашке Петри;

в - количество капель в 1 мл (20);

г - разведение, из которого сделан посев;

д - навеска, г.

Например, среднее количество колоний в чашке Петри равно 45, рабочее разведение -1:10000, тогда



Определение коли-титра почвы

Из разведений 1:10, 1:100, 1:100 засевают по 1 мл в пробирки с 9 мл среды Кесслера. Присутствие в бродильной пробе кишечных палочек подтверждается высевом со среды Кесслера на среду Эндо. Посевы культивируют в термостате при 37?С.

Определение перфрингенс-титра почвы

Перфрингенс-титр определяют, используя для посева два параллельных ряда разведений почвы. Пробирки одного ряда прогревают при 80?С 15 минут. По 1 мл из обоих рядов разведений переносят в чашку Петри и заливают расплавленной средой Вильсона-Блера. Посевы культивируют в термостате при 37?С в течение 24 часов.

Учет. О наличии Clostridium perfringens судят по наличию колоний черного цвета в посевах. Титр определяют по последнему разведению, из посевов которого выделены колонии Clostridium perfringens.

Существуют следующие критерии оценки степени загрязнения почв по титру БГКП и перфрингенс-титру:

Сильно загрязненные почвы - коли-титр 0,009 и ниже,

перфрингенс-титр 0,00009 и ниже.

Чистые почвы - коли-титр- 1,

перфрингенс титр 0,01 и выше.

Санитарно-микробиологическое исследование воды

проводят по трем показателям:

- микробное число воды;

- коли-индекс, коли-титр;

обнаружение патогенных БГКП.

Для определения микробного числа воды используют метод разведений (1:10, 1:100, 1:1000) с последующим высевом на МПА в чашки Петри глубинным способом (см. выше). При исследовании водопроводной воды в 2-е параллельные чашки засевают по 1 мл воды.

Для определения коли-титра воды в колбы со средой Эйкмана и комочками ваты засевают:

3 объема по 100 мл воды,

3 объема по 10 мл воды,

3 объема по I мл воды.

Отмечают наличие помутнения или следов газа после инкубирования в течение 24 часов при температуре 37°С. Из таких объемов делают посев на среду Эндо (2-ая бродильная проба).

Выращивают 16-18 часов при температура 37°С. При наличии характерных колоний E.coli ставят оксидазный тест и проводят окраску по Граму. Для грамотрицательных и оксидазоотрицательных бактерий ставят 3-ю бродильную пробу с глюкозой. Инкубируют 4-5 часов при температуре 37°С.

Наличие кислоты и газа дает основание утверждать присутствие кишечной палочки.

Коли-титр показывает наименьшее количество воды, в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка.

Коли-индекс - число кишечных палочек в I л воды определяется по таблице15.

Таблица 15 -Определение коли-индекса при исследовании 333 мл воды

Количество положительных результатов	Коли-индекс	Коли-титр
3 флакона по 100 мл	3 флакона по 10 мл	3 флакона по I мл
0	0	0	Менее 3	Более 333
0	0	1	3	333
0	1	0	3	333
1	0	0	4	250
1	0	1	7	143
1	1	0	7	143
1	11.	1	11	91
1	2	0	11.	91
2	0	0	9	111
2	0	1	14	72
2	1	0	15	67
2	1	1	20	50
2	2	0	21	48
2	2	1	28	36
3	0	0	23	43
3	0	1	39	26
3	0	2	64	16
3	1	0	43	23
3	1	1	75	13
3	1	2	120	8
3	2	0	93	11
3	2	1	150	7
3	2	2	210	5
3	3	0	240	4
3	3	1	460	2
3	3	2	1100	0,9
3	3	3	Более 1100	Менее 0,9

Для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли-индекс.

Воды открытых водоемов с микробным числом не более 1000, коли-титром не менее 111, коли-индексом не более 9, могут применяться в пищевых производствах для технических целей (не питьевая) только после очистки и не должны иметь патогенных микроорганизмов.

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Загрязненность воздуха закрытых помещений определяют по следующим показателям:

- общая микробная обсемененность воздуха;

- качественный состав микрофлоры воздуха (санитарно-показательные микроорганизмы воздуха - свидетельство санитарного неблагополучия воздуха и спорообразующие микроорганизмы - показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы).

Для количественного учета микроорганизмов в воздухе используется метод Коха (метод "оседания"). Он достаточно прост и точен.

Этим методом обнаруживают микроорганизмы, загрязняющие воздух различных помещений. В основе его -- оседание микробных клеток вместе с пылевыми частицами на поверхность стерильных агаровых пластин.

Чашки Петри с МПА (мясо-пептонным агаром), 3-5% кровяным агаром, МСА (молочно-солевым агаром), ЖСА (желточно-солевым агаром) оставляют открытыми (поверхностный посев) в обследуемом помещении:

на 5 мин - для определения общей микробной обсемененности;

на 40 минут для учета кокковой флоры.

После окончания посева воздуха их закрывают крышками, на дне чашек восковым карандашом делают надпись о времени и месте посева. Чашки помещают в термостат при температуре 37°С для культивирования на 24 часа, затем при комнатной температуре еще на сутки.

Санитарно-показательные бактерии воздуха (б- и в-гемолитические стрептококки)обнаруживают по зонам гемолиза на 3-5% кровяном агаре после культивирования при температуре 37°С 24 часа и последующей выдержке еще сутки при комнатной температуре.

Обнаружение золотистых стафилококков проводят в аналогичной последовательности на чашках Петри с молочно-желточно-солевым агаром.

Каждая микробная клетка, попавшая на среду, образует в результате размножения колонию. О степени загрязнения воздуха судят по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов в 1 м³, наличию бактериальных и грибных организмов.

Сведения, необходимые для характеристики степени загрязнения воздуха (количество выросших колоний, наличие среди них бактериальных и грибных), заносят в таблицу 16.

Таблица 16 -Санитарно-бактериологическое исследование воздуха

Помещения, в котором анализируют пробы воздуха	Время отбора пробы	КОЕ в чашке Петри	Из них	КОЕ в 1 м3 воздуха
			Бактерии	грибы	Всего (пигментных, спорообразующих, плесеней)	КОЕ золотистых стафилококков
Ауд. П -8	9ч 30 мин	22	19	3	2900	0

Учет. Подсчитывают количество колоний, выросших на МПА, а затем, зная площадь дна чашки Петри, делают перерасчет на 1 м³ воздуха.

Считается, что на поверхность среды площадью 100 см² в течение 5 мин оседает такое количество микроорганизмов, которое содержится в 10 л воздуха (0,01 м3).

Пример расчета: в чашке Петри диаметром 10 см выросло 25 колоний. Площадь питательной среды в чашке Петри (S =7it2) равна:

S = 3,14 х52 = 78,5 см²

Вычисляют количество колоний на площади, равной 1 дм² (100см²):

Итак, на площади 1 дм имеется 32 колонии. Пересчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 м³ воздуха:

Следовательно, в 1 м3 воздуха содержится 3200 КОЕ микроорганизмов.

Для качественной характеристики микроорганизмов, выделенных из воздуха, описывают культуральные признаки, готовят фиксированный препарат, окрашивают его по Грамму, изучают морфологические признаки под микроскопом.

Вопросы к зачету (экзамену)

1. Роль, задачи санитарной микробиологии.

2. Санитарно-показательные микроорганизмы.

3. Группы опасности микроорганизмов. Порядок получения разрешений работы с ними и документы регламентирующие ее.

4. Требования к санитарно-показательным микроорганизмам

5.Микроорганизмы воздуха.

6. Микробиологические методы исследования атмосферного Воздуха.

7. Микробиологические методы исследования воздуха закрытых помещений.

8. Санитарно-показательные микроорганизмы воздуха.

9. Микроорганизмы воды.

10. Методы бактериологического исследования воды.

11. Санитарно-показательные микроорганизмы воды.

12. Методы индикации патогенных микроорганизмов.

13. Почвенные микроорганизмы.

14. Методы микробиологического исследования почвы.

15. Санитарно-показательные микроорганизмы почвы.

16. Пути обсеменения пищевых продуктов микроорганизмами

17. Специфическая микрофлора пищевых продуктов

18. Неспецифическая микрофлора пищевых продуктов

19. Факторы, определяющие степень загрязненности посторонней микрофлорой

21. Сравнительный анализ микроорганизмов мяса от здорового скота, павших больных и переутомленных животных.

22. Факторы, определяющие проникновение микроорганизмов вглубь мяса при его созревании?

23. Какие микроорганизмы преобладают в гниющем мясе?

24. Как приготовить препарат из мяса?

25. Как определить наличие в мясе анаэробов?

26. Фазы развития микроорганизмов в молоке (бактерицидная, фаза смешанной микрофлоры, фаза молочно-кислых стрептококков, дрожжево-плесневая фаза, фаза размножения гнилостоной флоры).

27. Какие показатели обеспечивают отсутствие микроорганизмов в содержимом свежеснесенных яиц здоровой птицы?

28. Какие микроорганизмы вызывают порчу яйца (процесс аммонификации белковых веществ)?

29. При каких условиях в яйце начинают развиваться плесневые грибы?

30. Как выглядит яйцо, если оно поражено плесневыми грибами?

31. Присутствие какого микроорганизма указывает на нарушение санитарных требований и указывает на необходимость проведения дополнительного бактериологического исследования? На какие группы микроорганизмов?

32. Каким образом определяют коли-титр в белке и желтке яиц?

33. Дать определение токсикоинфекции

34. Перечислить микроорганизмы, являющиеся возбудителями токсикоинфекций

35. Что такое токсикоз? Дать определение.

36. Перечислить микроорганизмы, являющиеся продуцентами токсинов и возбудителями токсикозов.

37. Принципы, положенные в основу санитарно-микробиологических исследований при пищевых токсикозах.

38. Материалы для проведения санитарно-микробиологических исследованиях при токсикоинфекциях.

39. Схема выделения энтнропатогенных кишечных палочек.

40. Схема выделения Salmonella.

41. Схема выделения Proteus.

42. Схема выделения Clostridium perfringens.

43.Схема выделения Bacillus cereus.

44. Обнаружение стафилококков (схема посевов, питательные среды).

45. Принципы отбора образцов для микробиологического анализа при пищевых отравлениях.

46. Основные принципы микробиологического контроля биологических препаратов и БАД.

47. Санитарно-микробиологический контроль кормов, продуктов растительного происхождения.

Тестовый контроль

Вариант 1

Напишите номер правильного ответа

Работу с микроорганизмами 1-2 группы опасности разрешает:

1. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

2. главные государственные врачи субъектов Российской Федерации

Дополнить

Санитарная микробиология - наука,………………

Вариант 3

Напишите номер правильного ответа

Работу с микроорганизмами 3-4 группы опасности разрешает:

1. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

2. главные государственные врачи субъектов Российской Федерации

Дополнить

В задачи санитарной микробиологии входят:……

Вариант 2

Напишите номер правильного ответа

Санитарно-показательными микроорганизмами для оценки воздуха являются:

1. БГКП,

2. энтерококки,

3. клостридии (C.perfringens)

4. термофилы

5. стрептококки,

6. стафилококки

Дополните

Методы санитарно-микробиологических исследований:

Вариант 4

Перечислить принципы санитарной микробиологии

Напишите номер правильного ответа

Санитарно-показательными микроорганизмами для оценки воды являются:

1. БГКП,

2. энтерококки,

3. клостридии (C.perfringens)

4. термофилы

5. стрептококки,

6. стафилококки

Дополните

Принципы санитарной микробиологии

Вариант 5

Напишите номер правильного ответа

Санитарно-показательными микроорганизмами для оценки пищевых продуктов являются:

1. БГКП,

2. энтерококки,

3. клостридии (C.perfringens)

4. термофилы

5. стрептококки,

6. стафилококки

7. бактерии группы протея

Дополните

В задачи санитарной микробиологии входят:……

Вариант 6

Напишите номер правильного ответа

Санитарно-показательными микроорганизмами для предметов обихода являются:

1. БГКП,

2. энтерококки,

3. клостридии (C.perfringens)

4. термофилы

5. стрептококки,

6. стафилококки

7. бактерии группы протея

Дополнить

В задачи санитарной микробиологии входят:……

Вариант 7

Напишите номер правильного ответа

Санитарно-показательными микроорганизмами для почвы являются:

1. БГКП,

2. энтерококки,

3. клостридии (C.perfringens)

4. термофилы

5. стрептококки,

6. стафилококки

7. бактерии группы протея

Дополнить

Требования к санитарно-показательным микроорганизмам:

Вариант 8

Напишите номер правильного ответа

Работу с микроорганизмами 3-4 группы опасности разрешает:

1. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

2. главные государственные врачи субъектов Российской Федерации

Дополнить

Санитарно-показательные микроорганизмы это -…..

Вариант 9

Дополнить

1.Шигеллы относятся к роду……., являются возбудителями………..

Напишите номер правильного ответа

2. Пищевые токсикоинфекции могут вызываться:

А салмонеллами

Б галофильными вибрионами

В термофилами

Вариант 10

Дополнить

1. Бактериальный токсикоз это- ………………………………

Напишите номер правильного ответа

2. Для развития пищевой токсикоинфекции необходимы следующие условия:

А достаточная доза возбудителя

Б соответствующие вирулентность и токсигенность возбудителя

В несоблюдение правил личной гигиены потребителем

Вариант 11

Дополнить

1.При пищевых отравлениях для микробиологического анализа берут……

Напишите номер правильного ответа

2. Возбудители пищевых токсикоинфекций продуцируют токсины в:

А организме человека

Б в пищевых продуктах

Вариант 12

Дополнить

1. Принципы санитарно-микробиологического анализа при пищевых отравлениях …………………………..

Напишите номер правильного ответа

2. Возбудителями токсикозов являются

А энтерококки

Б клостридиум перфрингенс

В стафиллококки

Вариант 13

Дополнить

1. Источником формирования воздушной микрофлоры являются:………

Напишите номер правильного ответа

2. Показаниями к проведению санитарно-микробиологических исследований при подозрении на пищевую токсикоинфекцию являются:

А признаки заболеваний у группы людей, употребивших одинаковые продукты

Б наличие симптомов заболевания ЖКТ

Вариант 14

Дополнить

1. Источником формирования водной микрофлоры являются:………

Напишите номер правильного ответа

2. При микробиологической диагностике пищевых отравлений используют следующие методы:

А Биологический

Б бактериологический

В микроскопический

Вариант 15

Дополнить

1. Обеззараживание воды проводят методами:………………..

Напишите номер правильного ответа

2. Бактерии рода Proteus :

а грамотрицательные палочки

б грамположительные спорообразующие

Вариант 16

Дополнить

1. Схема выделения салмонелл:……………………

Напишите номер правильного ответа

2. Возбудителями токсикозов являются

А зеленящий стрептококк

Б холерный вибрион

В мукор

Вариант 17

Дополнить

1. Схема выделения E. сoli:

Напишите номер правильного ответа

2. При пищевых отравлениях санитарно-микробиологическое исследование проводят

а одновременно в нескольких направлениях

б одновременно на возможно большее количество накопительных и элективных питательных сред

Вариант 18

Дополнить

1. Микотоксикоз - это…………………………………

Напишите номер правильного ответа

2.Материалом для исследования при отравлениях являются:

А смывы с оборудования и посуды пищеблока

Б смывы со стен помещения, в котором готовилась пища

Вариант 19

Дополнить

1. Основными показателями, используемыми для санитарно-микробиологической оценки состояния воды являются:………….

Напишите номер правильного ответа

2. Токсикоинфекция это:

а результат размножения в продуктах и сырье болезнетворных микроорганизмов

б размножения в продуктах , сырье болезнетворных микроорганизмов и накопления их токсинов

Вариант 20

Дополнить

1. Бактериальный токсикоз это- ………………………………

Напишите номер правильного ответа

2. Пищевые токсикоинфекции могут вызываться:

А салмонеллами

Б галофильными вибрионами

В термофилами

Вариант 21

Дополнить

1. Шигеллы относятся к роду……., являются возбудителями………..

Напишите номер правильного ответа

2. Для развития пищевой токсикоинфекции необходимы следующие условия:

А достаточная доза возбудителя

Б соответствующие вирулентность и токсигенность возбудителя

В несоблюдение правил личной гигиены потребителем

Вариант 22

Дополнить

1. Принципы санитарно-микробиологического анализа при пищевых отравлениях …………………………..

Напишите номер правильного ответа

2. Возбудители пищевых токсикоинфекций продуцируют токсины в:

А организме человека

Б в пищевых продуктах

Вариант 23

Дополнить

1. При пищевых отравлениях для микробиологического анализа берут……

Напишите номер правильного ответа

2. Возбудителями токсикозов являются

А энтерококки

Б клостридиум перфрингенс

В стафиллококки

Вариант 24

Дополнить

1. Источником формирования воздушной микрофлоры являются:………

Напишите номер правильного ответа

2. Показаниями к проведению санитарно-микробиологических исследований при подозрении на пищевую токсикоинфекцию являются:

А признаки заболеваний у группы людей, употребивших одинаковые продукты

Б наличие симптомов заболевания ЖКТ

Вариант 25

Дополнить

1. Обеззараживание воды проводят методами:………………..

Напишите номер правильного ответа

2. При микробиологической диагностике пищевых отравлений используют следующие методы:

А Биологический

Б бактериологический

В микроскопический

Вариант 26

Дополнить

1. Источником формирования водной микрофлоры являются:………

Напишите номер правильного ответа

3. Бактерии рода Proteus :

а грамотрицательные палочки

б грамположительные спорообразующие

Вариант 27

Дополнить

1. Схема выделения салмонелл:……………………

Напишите номер правильного ответа

2. Возбудителями токсикозов являются

А зеленящий стрептококк

Б холерный вибрион

В мукор

Вариант 28

Дополнить

1. Схема выделения E. сoli:

Напишите номер правильного ответа

2. При пищевых отравлениях санитарно-микробиологическое исследование проводят

а одновременно в нескольких направлениях

б одновременно на возможно большее количество накопительных и элективных питательных сред

Вариант 29

Дополнить

1. Микотоксикоз - это…………………………………

Напишите номер правильного ответа

2.Материалом для исследования при отравлениях являются:

А смывы с оборудования и посуды пищеблока

Б смывы со стен помещения, в котором готовилась пища

Вариант30

Дополнить

1. Основными показателями, используемыми для санитарно-микробиологической оценки состояния воды являются:………….

Напишите номер правильного ответа

2. Токсикоинфекция это:

а результат размножения в продуктах и сырье болезнетворных микроорганизмов

б размножения в продуктах, сырье болезнетворных микроорганизмов и накопления их токсинов

Размещено на Allbest.ru