Вивчення функціональної активності гена інсуліну людини в складі аденоасоційованого вірусу як вектора для генної терапії інсулінозалежного цукрового діабету

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія наук України

Інститут молекулярної біології та генетики

УДК 577.21:616.379-008.64

03.00.26 - Молекулярна генетика

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата

біологічних наук

Вивчення функціональної активності гена

інсуліну людини в складі аденоасоційованого вірусу як вектора для генної терапії інсулінозалежного цукрового діабету

Аджаміян Фарзам

Київ-2000

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України та АМН України Віталій Арнольдович Кордюм, завідувач відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Олександр Петрович Соломко, завідувач відділу біохімічної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Наталя Сергіївна Дяченко, завідувач відділу молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Провідна установа - Інститут експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України.

Захист дисертації відбудеться "22" лютого 2000 р. о 10⁰⁰ год. на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д.26.237.01 в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: Київ, 03143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано "12" січня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук Л.Л. Лукаш

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми.

Генна терапія за неповні 20 років свого існування пройшла напрочуд яскравий і часом драматичний шлях. Однак тепер, коли вона вже вийшла на рівень практичної реалізації, її революціонізуюче значення для медицини стало очевидним.

Приблизно половина відомих спадкових захворювань людини викликана пошкодженням одного гена, тобто є моногенною. Ця обставина дозволяє сподіватися, що в майбутньому дослідники зможуть спробувати лікувати моногенні спадкові хвороби шляхом заміни пошкоджених генів нормальними. В разі моногенних захворювань існує конкретний дефект у конкретному гені. І все завдання (яким би складним технічно воно не було) зводиться до усунення цього дефекту (або шляхом виправлення, або комплементацією за рахунок введення повноцінного гена під тією ж регуляцією ззовні). Але тут просте введення гена нічого не дасть. Еффект може бути досягнутий лише при створенні такої молекулярної конструкції, при використанні якої введений ген буде функціонувати, незважаючи на змінену регуляцію в організмі, яка примушує неповноцінно функціонувати такий же існуючий у клітинах свій власний повноцінний ген.

Сучасний рівень розвитку технології рекомбінантних ДНК дозволяє здійснити клонування практично будь-якого гена. При цьому з'являється можливість не лише зв'язати конкретний ген з проявом визначеної фенотипової ознаки, але й обійти труднощі, пов'язані з отриманням генетичного матеріалу в кількостях, необхідних досліднику, розробляти зручні моделі різних біохімічних процесів. Це відкриває перспективи для подальшого розвитку генної терапії спадкових захворювань.

Однією з найскладніших проблем, що виникають при спробах практичного використання клонованих генів, є регуляція їхньої експресії, оскільки умови функціонування генів у природному нуклеотидному оточенні часто відрізняються від тих, які можливо змоделювати в експерименті. Тому пошук і застосування нових гетерологічних регуляторних послідовностей ДНК при конструюванні еукаріотичних векторів експресії видається актуальним.

Мета і завдання дослідження. Метою представленої роботи було клонування гена інсуліну людини в оточенні різних генетичних елементів і вивчення його функціональної активності в складі різноманітних рекомбінантних плазмід як на культурі клітин ссавців, так і на рівні інтактних тварин як підхід до використання генної терапії інсулінзалежного цукрового діабету. Для цього було потрібно:

1. Переклонувати ген препроінсуліну людини та створити молекулярні конструкції з різними системами регуляції його експресії, що включало наступні завдання:

а) перевірку як на культурі клітин, так і на модельних тваринах рекомбінантної молекули pTR-UF з фрагментами аденоасоційованого вірусу (AAV) і цитомегаловірусу (CMV), а також маркерним та репортерним генами для підтвердження можливості подальшого її використання як базового вектора;

б) видалення одного з трьох BamHI сайтів у ДНК вірусу гепатиту В і субклонування його у векторну плазміду pTR-UF для одержання рекомбінантних молекул, які містять ген препроінсуліну людини.

2. Тестувати на культурі клітин біологічну активність продукту гена препроінсуліну людини за ступенем його здатності знижувати рівень глюкози в середовищі після трансфекції його в складі рекомбінантних плазмід.

3. Відпрацювати схему отримання стрептозотоцинових діабетичних мишей.

4. Вивчити фізіологічну активність гена препроінсуліну людини, введеного в складі різних рекомбінантних плазмід у печінку діабетичних експериментальних тварин.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. У послідовності клонованої ДНК вірусу гепатиту В ділянку, що кодує поверхневий антиген (HВsAg), замінено повнорозмірним структурним геном препроінсуліну людини. Таким чином, отримано молекулярну конструкцію, яка містить всі регуляторні області вірусу гепатиту В, що забезпечують максимальний рівень експресії з промотору HВsAg, під контролем якого знаходиться ген препроінсуліну. В той же час видалення частини геному вірусу, яке призводить до інактивації вірусної полімерази і капсидного білка, виключало можливість інфекційного процесу.

2. У касеті AAV під промотор CMV клоновано структурний ген препроінсуліну людини і з його 3'-кінця - енхансер І вірусу гепатиту В. Таким чином, отримано конструкцію лише з одним посилювачем експресії з вірусу гепатиту В.

3. З використанням двох вищезгаданих конструкцій, а також описаної в літературі векторної системи, у якій структурна частина гена препроінсуліну людини була поставлена під промотор HВsAg, але поза вірусом, здійснено порівняння фенотипового ефекту в культурі клітин і на рівні організму у діабетичних мишей.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані рекомбінантні молекули з різними регуляторними елементами можуть бути використані для вивчення експресії різних генів у клітинах як у культурі, так і в інтактних тваринах. Проведена оцінка внеску різних регуляторних елементів у рівень фенотипового ефекту введеного у клітини гена інсуліну людини може бути використана для конструювання рекомбінантних молекул, що містять інші цільові гени.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора полягає в безпосередній участі у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, обробці літературних даних, аналізі та інтерпретації отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації відбулася на ІІ Міжнародній конференції "Біоресурси та віруси" (Київ, 7-10 вересня 1998 р.), на VІІІ Конференції "Нові напрямки біотехнології" (Москва, 27-29 квітня 1998 р.), на Silver Jubilee FEBS Meeting (July 5-10 1998, Copenhagen, Denmark) та на спільному науковому семінарі відділу регуляторних механізмів клітини і відділу біохімічної генетики ІМБіГ НАН України 22 липня 1999 р.

За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, основної частини (огляд літератури, матеріали та методи дослідження, результати і обговорення), закінчення та висновків. Роботу викладено на 142 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 40 рисунками і 4 таблицями. Перелік цитованої літератури охоплює 648 найменувань.

Основний зміст

Матеріали і методи

Штами, середовища. Штами Escherichia coli (XL, DH5б, JM 109), використані в роботі, отримані з колекції культур Інституту молекулярної біології та генетики НАН України; штам E. coli Sure 2 - з фірми "Stratagene" (США, cat # 200152-1999). У роботі використано стандартні методи вирощування мікроорганізмів і культивування соматичних клітин на відповідних середовищах _{(Миллер Дж., 1976)}.

Плазміди. У роботі використано три вихідні плазміди, на основі яких отримано решту рекомбінантних ДНК. Це плазміда pTR-UF, люб'язно надана нам С. Золотухіним _{(Zolotukhin S. et al., 1996)}, як вектор та раніше отримані у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України рекомбінантні плазміди pBR322ins _{(Незнанов Н.С. и др., 1987)} і pGins _{(Lukash L. et al., 1994)} як джерела отримання гена препроінсуліну людини для його подальшого субклонування. В експериментах з вивчення експресії гена gfp (green-fluorescent protein) також використовували рекомбінантну ДНК плазміди pEGFP-C1 фірми "Clontech" (США) Крім того, у роботі використано плазміду pHB320, отриману від д-ра Е. Грена (Інститут органічного синтезу АН Латвії). Вона являє собою pBR322, в BamHI сайт якої вбудовано повну копію ДНК вірусу гепатиту В.

Генноінженерні маніпуляції. Генноінженерні маніпуляції з плазмідними ДНК та отриманими рекомбінантними молекулами здійснювали за загальноприйнятими методиками, описаними Маніатісом _{(МаниатисТ. и др., 1984; Sambrook J. et al., 1989)}. Плазмідну ДНК виділяли за методом лужного лізису Kriey P. and Melton D. _{(Promega Biotech Catalogue 1985/1986)}. Трансформацію рекомбінантної ДНК, одержання компетентних бактеріальних клітин і відбір клонів після трансформації здійснювали методом Nishimura A. et al. _{(Nishimura et al., 1990)}. Лігування вектора з фрагментами чужорідних ДНК проводили Т 4-ДНК-лігазою стандартним методом _{(Sambrook J. et al., 1989, 5.6)}. Фрагменти ДНК елюювали з 0,6 і 0,7 %-го гелю агарози методом заморожування з фенолом _{(Hojman F., 1990)}.

Ліпосоми. Як переносник плазмідних ДНК в експериментах використовували негативно заряджені моноламелярні ліпосоми розміром від 10 до 100 нм такого складу (%): лецитин - 70; холестерин - 20; децитилфосфат - 9; фосфатидилетаноламін - 1. Концентрація ліпідів складала 20 мг/мл. Плазмідну ДНК вміщували в них, як описано в роботах _{(Костецкий И. и др., 1989; Билич К. и др., 1990)} методом кальцієвої плавки (Ca-fusion). Розміри, ламелярність і термин збереження ліпосом контролювали за допомогою мікроскопії з використанням методу негативного контрастування зрізів _{(Билич К. и др., 1990)}.

Трансформація. У роботі використано лінію клітин Нер-2 (культура клітин з карциноми гортані), отриману з Асоціації клітинних культур Сант-Петербурга (Росія). Трансформацію клітин плазмідами з геном інсуліну здійснювали методом кальцій-фосфатного преципітату _{(Graham F., van der Eb A., 1973)}. Зміни концентрації глюкози під дією гена інсуліну реєстрували в пробах культурального середовища стандартним глюкозооксидантним методом ("Діаглюк-2"). ген інсулін плазміда рекомбінантний

Виготовлення препаратів гепатоцитів. Ембріональні гемопоетичні клітини і гепатоцити ізолювали з абортусів 5-9-го тижнів вагітності. В експериментах з вивчення експресії гена gfp дослідження здійснювали на двомісячних гібридних мишах F1 (gBALB x C₅₇BL). Плазміди pEGEP-C1 і pTR-UF у складі ліпосом вводили безпосередньо у велику нижню частин печінки. Для виготовлення цитологічних препаратів використовували частину печінки, в яку було введено матеріал. Наявність введеного у печінку екзогенного матеріалу і проникнення його в гепатоцити тестували за допомогою люмінісцентного мікроскопа МЛ-2. Продукт експресії гена gfp, який світиться зеленим кольором при опроміненні УФ у діапазоні 340-400 нм _{(Stearns T., 1995)}, тестували в цитоплазмі гепатоцитів з використанням збуджуючого фильтра ФС 1-2, відтінюючих фільтрів ЖС 18 і ЖС 19, а також об'єктива Х 40. Мікрофотографії препаратів зроблено на МФН-10.

Отримання стрептозотоцинового діабету в експериментальних тваринах. ІЗЦД у мишей одержували загальноприйнятим методом з використанням СТЦ. Препарат вводили інтраперитонеально щодня протягом 5 днів з розрахунку 40 мг на 1 кг живої ваги, розчинений ex tempore в цитратному буфері з рН 4,8-5,0. Використовували самців лінії C₅₇Bl/6J у віці 1,5-4 місяці, яких утримували на звичайному раціоні. Ця модель найбільше відповідає ІЗЦД у молодих людей і має імунну основу. Концентрацію глюкози в крові визначали за допомогою індикаторних смуг "Гемоглан" на відображальному фотометрі "Глюкофот" виробництва фірми ПВП "Норма". Нерозведену кров отримували з ретроорбітального венозного сплетення за допомогою скляних капілярів. Аналізи здійснювали натщесерце.

Статистична обробка результатів. Статистичну обробку результатів здійснювали, як описано _{(Плохинский, 1980)} з достовірністю прогнозу 95 %.

Результати і обговорення

Розробка технології генної терапії інсулінозалежного цукрового діабету

Конструювання рекомбінантних молекул ДНК. Для переклонування гена препроінсуліну людини у векторну молекулу ДНК, яку буде введено у клітини людини і яка повинна виробляти інсулін, було сконструйовано низку проміжних рекомбінантних ДНК pTR-UF^neo-, pSK91, pSK91e, pSK91_(ad), pHB320^BamHI-, pTR-HBV і серію рекомбінантних векторних ДНК, таких як pTR^neo-ins (pTR-ins), pTR-UF^neo-insе, pTRHBV-ins_(ad) та ін. Векторною основою цих плазмідних ДНК є плазміда pTR-UF, яка містить касету, створену на основі AAV. Рестриктне картування показало, що в касеті позначені сайти рестрикції дійсно існують. Наступним етапом перевірки було визначення білка, якому притаманна здатність до люмінесценції, що підтвердило б адекватність існуючих у касеті регуляторних послідовностей таким, які функціонують у клітинах людини.

Проміжна плазміда pSK91 є плазміда pBlueScript SK⁺ (фірми "Stratagene"), яка містить ген препроінсуліну з мінімальним розміром 3'- і 5'-фланкуючих послідовностей геному людини довжиною 1620 п. н. На основі цієї конструкції отримано проміжну рекомбінантну ДНК плазміди pSK91e, яка, крім послідовності гена препроінсуліну, містить фрагмент ДНК вірусу гепатиту В (підтип ayw), визначений як енхансер І, тобто послідовність, що активує промоторну область генів еукаріотів та посилює експресію цих генів. Фрагмент enh I (? 600 п. н.) був видалений з плазміди pHB320 _{(Пумпен П. и др., 1982)} і вбудований у плазміду pSK91 після гена інсуліну.

Плазміда pSK91_(ad) отримана при включенні праймера фагу М 13 у полілінкер плазміди pSK91 у кінці клонованого гена препроінсуліну. Знайдено послідовність всередині гена препроінсуліну (на початку гена) для парного праймера, що дозволяє використовувати цю пару праймерів для виявлення введеного гена в подальших експериментах за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Рекомбінантний вектор pTR^neo-ins (pTR-ins) отримано на основі проміжної векторної плазміди pTR-UF^neo-. Одержано транскрипційну касету для гена препроінсуліну, яка містить промотор цитомегаловірусу (P_cmv) та має сигнал поліаденілювання рА 2. Карту-схему плазміди pTR^neo-ins (pTR-ins) наведено на рис. 1.

Рекомбінантний вектор pTR-UF^neo-inse одержаний на основі проміжної векторної плазміди pTR-UF^neo-, у яку за сайту XbaI було вбудовано фрагмент XbaI-XhoІ плазміди pSK91e з послідовністю гена препроінсуліну і енхансера І (enh I) (рис. 2).

Рис. 1. Карта-схема плазміди pTRneo-ins (pTR-ins): TR - кінцевий повтор AAV; Pcmv - промоторна область цитомегаловірусу; SD/SA - донор/акцептор сплайсингу вірусу SV40; pA1, pA2 - сигнал поліаденілювання; ins - ген препроінсуліну людини

Рис. 2. Схема одержання плазміди pTR-UFneo-inse

Плазміду pTRHBV-ins_(ad) отримано таким чином: 1) було видалено саме внутрішній з трьох BamHI cайтів з ДНК вірусу гепатиту В. Отриману плазміду названо pHB320^BamHI-; 2) BamHI фрагмент плазміди pHB320^BamHI- лігували з BamHI фрагментом вектора pTR-UF. Отриману рекомбінантну плазміду, перевірену на правильність орієнтації, названо pTRHBV; 3) ген поверхневого антигена вірусу гепатиту В вилучено з плазміди pTRHBV. Фрагмент геномного ДНК-інсуліну з адаптором було вирізано з полілінкера плазміди pSK91_(ad). Після лігування вищеописаного вектора з цим фрагментом геномного гена інсуліну отримали рекомбінантну плазміду pTRHBV-ins_(ad), яка містить геном вірусу гепатиту В з заміною послідовності гена поверхневого антигена на ДНК гена препроінсуліну з адаптором фагу М 13 (М 13-20 праймер). Було перевірено правильність орієнтації плазміди. На рис. 3 наведено карту-схему плазміди pTRHBV-ins_(ad).

Таким чином, отримано рекомбінантні векторні плазміди, що містять ген препроінсуліну людини в оточенні різних генетичних елементів, які повинні забезпечувати ефективну регуляцію експресії цільового гена.

Перевірка функціональної активності цільових генів у складі сконструйованих плазмідних ДНК

Відпрацювання техніки трансфекції клітин людини. Було використано оптимальні умови для трансфекції клітин ембріональної печінки людини за допомогою кальцій-фосфатного методу. В наших дослідах число життєздатних клітин після трансфекції складало 70-95 % від загального числа клітин. Ефективність трансфекції ембріональних гемопоетичних клітин сягала 1-6 % у залежності від умов експерименту (табл. 1).

Таблиця 1 Кількість флюоресціюючих клітин у популяції ембріональних гемопоетичних клітин після трансфекції їхньої рекомбінантної ДНК, сконструйованої на основі плазміди pTR-UF

Тестування концентрації глюкози в пробах культурального середовища після обробки клітин різними препаратами інсуліну і рекомбінантними плазмідами. Оскільки ми оцінювали функціональну активність рекомбінантних ДНК, сконструйованих для потреб генної терапії ІЗЦД, за здатністю знижувати концентрацію глюкози, точність тестування концентрації глюкози мала принципове значення. Концентрацію глюкози в пробах культурального середовища тестували за допомогою стандартного глюкозооксидантного методу. Для здійснення серії експериментів використовували набори "Діаглюк", які застосовують звичайно при ферментативному визначенні глюкози в нерозведеній крові та інших біологічних рідинах.

Для перевірки точності методу і виявлення можливих артефактів провели спеціальні експерименти. По-перше, порівняли стандартні та експериментально визначені значення концентрації глюкози у фосфатному буферному розчині, який є в наборі для тестування. По-друге, тестування глюкози здійснювали з додаванням медичного препарату інсуліну та з проведенням специфічної реакції. Було знайдено, які присутність інсуліну у високій концентрації, а, можливо, й інших білків впливає на показник оптичної густини, даючи артефакти. Так, плазміди, що індукують значну продукцію інсуліноподібних білків, можуть бути неправильно оцінені внаслідок отримання завищених значень концентрації глюкози. Таким чином, інсулін потрібно застосовувати в досить вузькому діапазоні доз для одержання адекватних результатів в умовах іn vitro. Показано, що в дозі 0,025 од/мл інсулін спричинює зниження концентрації глюкози. Доза 0,01 од/мл виявилaся неефективною. Дози 0,05 од/мл і вище можуть давати артефакти.

Вивчення експресії білка-продукту та визначення функціональної активності гена препроінсуліну в складі рекомбінантних конструкцій. Продукцію досліджуваного білка вивчали за умов підвищеного (500 мг%) порівняно з нормою (100 мг%) рівня глюкози, що, як малося на увазі, повинно посилювати транскрипційну і трансляційну регуляцію гена інсуліну. Ключовим моментом регуляції генів інсулінової родини є швидкість транскрипції _{(Walker M. et al., 1983; Niven M. and Hitman G., 1986)}. Як відомо з огляду літератури, біосинтез інсуліну в в-клітинах підшлункової залози стимулюється глюкозою _{(Itoh N. and Okamoto H., 1980)}. У неактивованих глюкозою клітинах значна частина відповідної мРНК знаходиться поза полісомами і є менш ефективною як матриця для синтезу білка _{(Cordell B. et al., 1982)}. При високому вмісті глюкози продукція інсуліну в клітинах ссавців збільшується в 10 разів _{(Kakita K. et al., 1982)}.

У табл. 2 наведено дані щодо порівняння функціональної активності гена препроінсуліну, введеного в субстратзалежні клітини у складі різних молекулярних конструкцій. Показано, що pGins _{(Lukash L. et al., 1994)} та інсулін (позитивний контроль) спричинюють приблизно однакове зниження рівня глюкози при контролі Са-фосфатним методом. Вихідна плазміда, яку використано для конструювання, також трохи знижувала рівень глюкози (факт, що потребує спеціального дослідження). З цього випливає, що вірогідними можна вважати лише порівняльні дані між дією контрольної та досліджуваних плазмід. З чотирьох рекомбінантних плазмід на основі pTR-UF дві (pTR-UF^neo-inse i pTR^neo-ins (pTR-ins)) спричиняли зниження концентрації глюкози до 70 і 75 % від рівня контролю Са-фосфатним методом або до 80 і 87 % від рівня плазмідного контролю.

Таблиця 2 Визначення функціональної активності гена препроінсуліну в складі ДНК плазмід pTR-UF^neo-gins, pTR-^neo-gins, pTR-UF^neo-inse, pTR-^neo-ins (pTR-ins) i pGins

Примітка. Інсулін додавали до середовища в концентрації 0,25 од/мл. В експерименті № 1 використовували нормальні фібробласти, в № 2 - пухлинні клітини людини лінії Нер-2.

Таким чином, незважаючи на незначне обмеження глюкозооксидантного методу тестування глюкози, було виявлено, що раніше отримана рекомбінантна плазміда pGins _{(Lukash L. et al., 1994)}, а також дві нові рекомбінантні плазміди, сконструйовані нами (pTR-UF^neo-inse i pTR^neo-ins (pTR-ins)), містять активний ген препроінсуліну людини і можуть бути використані в подальших дослідженнях.

Як відомо, самі клітини Нер-2 не здатні утилізувати глюкозу. Для цього, як і всім клітинам людини, необхідний інсулін. Тому поглинання глюкози культурою відповідає кількості інсуліну, що продукується клітинами за рахунок включення в них плазмід з геном інсуліну людини. 20 %-е зниження концентрації глюкози Стосовно плазмідного контролю в середовищі з доданою глюкозою (500 мг%) або в середовищі з ендогенною глокозою (451, 485 мг%) з урахуванням незначної біомаси клітин видається досить вагомим. Але, як випливає з даних табл. 1, кількість клітин, які містять плазміду, не перевищує 10 %, і лише вони здатні продукувати інсулін, забезпечуючи ним як себе, так і інші клітини. Тому реальна активність отриманих рекомбінантних молекул за здатністю продукувати інсулін у 10 разів вища, ніж така, що визначається на рівні загальної популяції клітин.

Вивчення функціональної активності гена препроінсуліну людини в складі конструкції pTR-UF^neo-inse, введеної в клітини методом трансфекції. У двох експериментах вивчали зміну рівня глюкози після трансфекції клітин Нер-2 рекомбінантною плазмідою pTR-UF^neo-inse, яка містила ген препроінсуліну людини. Транскрипцію цієї плазміди з цитомегаловірусного промотору посилює послідовність енхансера І вірусу гепатиту В.

Як позитивний контроль використовували очищений інсулін людини в концентраціях 0,005; 0,01 і 0,02 од/мл. При концентрації інсуліну 0,005 од/мл спостерігали поступове зниження рівня глюкози з максимумом через 6 год після трансфекції клітин (на 100 мг% відносно контролю). Картина динаміки зміни рівня глюкози під дією рекомбінантної плазміди відповідала такій під впливом інсуліну в концентрації 0,005 од/мл (рис. 4). Експресію за допомогою моноклональних антитіл гена препроінсуліну людини, використаного нами для створення вищезгаданих молекулярних конструкцій, також було вивчено в попередніх роботах, де застосовували плазміди pGins i pBR322ins. На рис. 5 наведено дані з визначення кількості білка-продукту, який секретується ембріональними гепатоцитами людини після трансфекції рекомбінантної ДНК pGins і pBR322ins (pBR322ins - негативний контроль) _{(Lukash L. et al., 1994; Kordyum V. et al., 1993)}.

Розробка системи введення тваринам рекомбінантних молекул

Використання гена gfp як маркера експресії. Зелений флюоресціюючий білок GFP як репортерний ген має низку переваг порівняно з іншими відомими маркерними білками. Були здійснені дослідження можливості тестування білка GFP - продукту експресії генетичної конструкції, яка містить ген gfp. Для цього були вирішені такі питання: підібрано зручний для роботи тваринний об'єкт, обрано орган, який більше за все підходить для введення матеріалу та його тестування. Визначено склад і обсяг ін'єкцій, підібрано умови приготування цитологічних препаратів для тестування білка GFP. В результаті досліджень, здійснених на модельному об'єкті - лабораторних мишах, показано ефективну експресію плазмід pEGFP-C1 i pTR-UF, введених у складі ліпосом безпосередньо в печінку тварин. Продукт експресії плазмід (GFP) накопичувався в достатній кількості для візуального цитологічного спостереження в цитоплазмі гепатоцитів та вирізнявся характерним зеленим кольором при опроміненні ультрафіолетовими променями. Спостереження проводили на живих гепатоцитах, що дозволило отримати реальну картину розміщення білка в об'ємі окремої клітини і чітко встановити його практично рівномірний розподіл у цитоплазмі та повну відсутність світіння в ядрах і ядерцях. Результат даного експерименту, відпрацьований на модельному гені, був використаний надалі в дослідах з геном проінсуліну людини для виконання досліджень на діабетичних мишах.

Рис. 3. Карта-схема плазміди pTRHBV-ins(ad)

Рис. 4. Зміна рівня глюкози в пробах культурального середовища (клітини Нер-2); 0 год - додавання глюкози в середовище через 4 год після трансфекції; 1. Інтактний контроль 2. PTR-UF 3. pTR-UFneo-inse 4. 0.005 ед/мл інсулину 5. 0.01 ед/мл інсулину 6. 0.02 ед/мл інсулину

Отримання діабетичних мишей Значення тієї чи іншої моделі експериментального діабету потрібно розглядати не з позиції простоти отримання, зручності та інших технічних деталей, а наскільки цей тип експериментального діабету відповідає формі протікання діабету і його патогенезу у людей. Для досліджень генної терапії ІЗЦД нами було обрано СТЦ-модель діабету, яка сповна підходить для цих цілей не лише через порівняно швидке отримання її у мишей, але й тому, що вона є найадекватнішою за механізмом патогенезу ІЗЦД людини.

При отриманні модельного СТЦ-діабету нами було виявлено деякі особливості. Аналіз динаміки розвитку глікемії показав, що рівень її у використаної лінії мишей залежить від віку тварин. У дорослих самців спостерігали помірну глікемію, в той же час у самців віком не більше 2,5 місяця розвивалася гіперглікемія. В наших експериментах було спостережено, що на додаткове введення препарату в значно меньшій загальній дозі тварини відреагували розвитком більш інтенсивної глікемії, ніж при першому п'ятикратному введенні.

Вплив рекомбінантних молекул ДНК, які містять ген препроінсуліну людини, на концентрацію глюкози в крові діабетичних мишей. Для експерименту брали мишей на 14-18-й день після останнього введення СТЦ, коли концентрація цукру в крові сягала високих значень. Суміш навантажених плазмідними ДНК ліпосом вводили безпосередньо в печінку під візуальним контролем. У перших двох дослідах було сформовано чотири групи тварин, рівнозначних за показниками рівня глюкози в крові. Плазмідним контролем була прототипна рекомбінантна плазміда pTR-UF, яка не містить гена інсуліну. Ефективність рекомбінантних плазмід оцінювали за біологічною активністю продукту експресії введеного гена препроінсуліну людини, тобто за рівнем глюкози в нерозведеній крові через 6 год і 1, 5, 6, 7, 8, 13 днів після ін'єкції.

Результати показали, що через 6 год спостерігається зниження концентрації глюкози нижче початкового рівня в усіх групах, у тому числі і в інтактному контролі. У миші, якій було введено ген інсуліну під регуляцією енхансера І вірусу гепатиту В (плазміда pTR-UF^neo-inse), спостерігали зниження рівня концентрації глюкози з 11-13 мМ до гіпоглікемії (2,9-3,0 мМ) та норми (4,2-5,3 мМ). В усіх інших групах спостерігали зниження, яке не досягало верхньої межі норми (рис. 6).

Потрібно звернути увагу на те, що в цьому часовому інтервалі функціонування введених рекомбінантних плазмід деякою мірі ускладнюється і дією стресових факторів в організмі, наприклад, голодуванням і/або дією фактора інтерлейкіна-1, який активується у відповідь на введення чужорідного матеріалу в печінку і якому притаманні протидіабетичні властивості _{(Del Rey A. and Besedovsky H., 1989)}. Ефект дії рекомбінантних молекул продовжувався і надалі (до 13-ї доби), але у миші з плазмідою pTR-UF^neo-inse рівень глюкози в крові був нижчим, ніж в інших групах.

Рис. 5. Вміст інсуліноподібних білків у культуральному середовищі після трансфекції ембріональних гепатоцитів рекомбінантними плазмідами pGins i pBR322ins

Рис. 6. Динаміка рівня глюкози (ммоль/л) у крові діабетичних мишей; 1. Інтактний контроль 2. Плазмідний контроль, pTR-UF 3. pGins 4. pTR-UFneo-inse. (n=10)

Отримані результати можуть свідчити про те, що ген препроінсуліну людини, введений діабетичним мишам у складі плазміди pTR-UF^neo-inse, є активним і, можливо, відбувається секреція продукту в кров.

В іншій серії експериментів використовували плазміду pTR-^neo-ins (pTR-ins), де ген інсуліну знаходиться під контролем цитомегаловірусного промотору без регуляторних послідовностей вірусу гепатиту В. Результат даного експерименту представлений на рис. 7. Максимальний ефект спостерігався через 24-36 год після ін'єкції. Через 48 год концентрація глюкози зростає, але не досягає вихідного рівня (рис. 7).

Подібний експеримент було здійснено з рекомбінантною плазмідою pTRHBVins_(ad), у якій ген інсуліну був у складі геному вірусу гепатиту В (ген інсуліну замінено геном поверхневого антигена (HBsAg) HBV і плазмідою pTR-UF^neo-inse як позитивний контроль). Результат досліду наведено на рис. 8. Як видно з даних цього рисунку, плазміда pTRHBVins_(ad) спричиняла зниження рівня глюкози в крові діабетичних мишей у період з 1-ї по 5-ту добу після її введення в печінку експериментальних тварин, у той час як при використанні плазміди pTR-UF^neo-inse, для якої в попередніх дослідах спостерігалося суттєве падіння рівня глюкози, не виявлено значного зниження рівня концентрації глюкози. В конструкції pTRHBVins_(ad) ген інсуліну знаходився під контролем двох промоторів (пре-S1 i пре-S2) вірусу гепатиту В і в оточенні різних регуляторних елементів цього вірусу, в тому числі енхансера ІІ. Значний позитивний вплив енхансера ІІ на транскрипційну активність вищезгаданих промоторів у клітинах печінки _{(Yuh C. and Ting L., 1990)}, висока печінкоспецифічність енхансера ІІ та наявність короткого сегмента ДНК (з -27 до +30 нуклеотидів) в S-промоторі HBV, який має енхансероподібну активність (De-Мedina T. et al., 1988), можуть бути причинами зазначеної дії плазміди pTRHBVins_(ad) порівняно з pTR-UF^neo-inse, яка містить лише послідовність енхансера І вірусу гепатиту В.

Рис. 7. Динаміка розвитку глікемії у діабетичних СТЦ мишей лінії С 57Bl/6J після введення плазмід: 1 - контроль 1, після введення фізіологічного розчину; 2 - контроль 2, після введення pTR-UF; 3 - після введення pTR-ins. (n=12)

Рис. 8. Динаміка розвитку глікемії у діабетичних СТЦ мишей лінії С 57Bl/6J після введення плазмід: а - після введення pTR-UFneo-inse (позитивний контроль); б - після введення pTRHBVins (ad). (n=12)

Таким чином, отримані нами експериментальні дані свідчать про те, що введення лабораторним тваринам клонованого в складі еукаріотичних векторів експресії гена препроінсуліну людини призводить до змін деяких фізіологічних параметрів, які статистично вірогідно можна віднести за рахунок експресії гена.

Результати in vitro i in vivo наших досліджень по переклонуванню гена інсуліну людини в оточенні різних регуляторних елементів у складі генетичних конструкцій і вивчення їхньої функціональної (біологічної і фізіологічної) активності, особливо їхнього впливу на концентрацію глюкози як у культурі клітин, так і на рівні експериментальних тварин, відповідають результатам авторів, які вивчали дію екзогенного гена інсуліну на зміну рівня глюкози in vitro (Hayashi M. et al., 1997; Koloddka T. et al., 1995; Valera A. et al., 1994; Stewart C. et al., 1993; Kawakami Y. et al., 1992; Selden R. et al., 1987 та ін.) i in vivo (Mitanchez D. et al., 1997; Valera A. et al., 1994; Frank B. and Chance R. et al., 1985; Nicolau C. et al., 1983; Frank B. et al., 1981 та ін.). Згідно як з нашими, так і з результатами інших авторів проінсулін може бути ефективним еквівалентом інсуліну, але з меншим ступенем активності порівняно з інсуліном (Galloway J. et al., 1992; Spradlin C. et al., 1990; Glauber H. et al., 1986; Revers R. et al., 1984; Stoll R. et al., 1971 та ін.). Використаний нами підхід до генної терапії ІЗЦД - введення ззовні молекулярно

Размещено на Allbest.ru