Отримання трансгенних рослин тютюну та картоплi з коренеспецифiчною та бульбоспецифiчною експресiєю химерних генiв

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ

IНСТИТУТ КЛIТИННОЇ БIОЛОГIЇ I ГЕНЕТИЧНОЇ IНЖЕНЕРIЇ

МЕДВЕДЄВА Тамара Василiвна

УДК 577.21+582.951.4

ОТРИМАННЯ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН ТЮТЮНУ ТА КАРТОПЛI З КОРЕНЕСПЕЦИФIЧНОЮ ТА БУЛЬБОСПЕЦИФIЧНОЮ ЕКСПРЕСIЄЮ ХИМЕРНИХ ГЕНIВ

03.00.15 -- генетика

Автореферат

дисертацiї на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

Київ -- 1998р.

Дисертацiєю є рукопис

Робота виконана у вiддiлi бiоiнженерiї Iнституту бiоорганiчної хiмiї та нафтохiмiї НАН України та у вiддiлi молекулярної бiологiї Iнституту iм.Пастера, Тегеран, Iран.

Науковий керiвник: доктор бiологiчних наук Галкiн Анатолiй Павлович, Iнститут бiоорганiчної хiмiї та нафтохiмiї НАН України, завiдувач вiддiлом.

Офiцiйнi опоненти: доктор бiологiчних наук Левенко Борис Олексiйович, Iнститут фiзiологiї рослин і генетики НАН України, завiдувач вiддiлом;

кандидат бiологiчних наук Кучук Микола Вiкторович, Iнститут клiтинної бiологiї і генетичної iнженерiї НАН України, старший науковий спiвробiтник.

Провiдна органiзацiя: Київський унiверситет iмені Тараса Шевченка

Захист дисертацiї вiдбудеться 21 січня 1999 року о 14.00 на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д.26.202.01 по захисту дисертацiй на здобуття наукового ступеня кандидата наук при Iнститутi клiтинної бiологiї i генетичної iнженерiї НАН України за адресою: 252143, Київ-143, вул. акад.Заболотного, 148.

З дисертацiєю можна ознайомитись у бiблiотецi Iнституту клiтинної бiологiї i генетичної iнженерiї НАН України.

Автореферат розiсланий 9 грудня 1998 р.

Вчений секретар спецiалiзованої ради Тарасенко Л.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальнiсть теми.

Бурхливий розвиток генетичної та клiтинної iнженерiї рослин привiв до значних успiхiв в розумiннi процесiв, що вiдбуваються в рослиннiй клiтинi, у вивченнi експресiї рослинних генiв, i, як наслiдок, до великого прогресу в генетичному конструюваннi рослин з заданими властивостями (Кучук,1997, Левенко,1998).

Розробка ефективних методiв трансформацiї сiльськогосподарських видiв рослин становить великий iнтерес для бiотехнологiї, агрохiмiї, фармацевтичної та насiннєвої iндустрiї. Цi методи дають можливiсть полiпшення сiльськогосподарських рослин, надаючи їм такi цiннi якостi, як стiйкiсть до гербiцидiв, комах-шкiдникiв, вiрусних захворювань, несприятливих факторiв навколишнього середовища (Tacke et al.,1996, Sano et al.,1997). Трансгеннi рослини -- приваблива i ефективна в цiновому вiдношеннi альтернатива мiкробiологiчним системам для продукцiї бiомолекул. Успiхи в бiотехнологiї дають можливiсть використовувати рослини як природнi бiореактори для продукцiї i надпродукцiї рослинних метаболiтiв, гетерологiчних протеїнiв з промисловою та фармацевтичною цiннiстю (Goddijn et al.,1995, Mason et al.,1995).

Для подальшого розвитку як фундаментальних, так i прикладних робiт по бiотехнологiї важливою умовою є наявнiсть необхiдного набору регуляторних областей генiв, отриманих з рослин, i перш за все областей генiв, що забезпечують органоспецифiчну експресiю внесених генiв. Для цього необхiднi промотори, сумiснi з внутрiклiтинними факторами регуляцiї, так як експресiя внесених генiв пiд контролем неспецифiчних конститутивних промоторiв може призводити до порушення метаболiзму i зниження життєздатностi трансгенних рослин (Matzke et al.,1986). Це продиктовано необхiднiстю отримання трансгенних рослин, в яких набутi в процесi трансформацiї новi ознаки проявлялись би лише в певних органах.

Отриманi трансгеннi рослини являють собою також модельнi системи для вивчення органоспецифiчної i регульованої зовнiшнiми факторами експресiї генiв вищих рослин.

Виходячи з вищесказаного, стає зрозумiлою необхiднiсть робiт по клонуванню генiв, що кодують новi цiннi властивостi, регуляторних областей, якi б забезпечували органоспецифiчну експресiю внесених генiв та розробку ефективних методик для трансформацiї i регенерацiї трансгенних рослин.

Зв'зок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконувалась згiдно науково-тематичного плану 2.1.10.12- "Одержання трансгенних рослин з сiльськогосподарськими корисними ознаками та вивчення молекулярних механiзмiв експресiї генiв, якi обумовлюють цi ознаки" вiддiлу бiоiнженерiї Iнституту бiоорганiчної хiмiї та нафтохiмiї НАН України.

Мета i задачi дослiдження.

Метою даної роботи було отримання трансгенних рослин картоплi та тютюну з експресiєю селективних генiв i генiв, що кодують бiологiчно активнi пептиди. Виходячи з цiєї мети, основними задачами роботи було:

1. Отримати трансгеннi рослини тютюну та картоплi з експресiєю клонованих химерних генiв .

2. Дослiдити експресiю химерного гену npt-II пiд контролем клонованого промотору rpS 12 в рiзних органах рослин-регенерантiв тютюну.

3. Провести порiвняльне дослiдження ефективностi промотора pat 122 та конститутивного 35S промотора ВМКК в рiзних органах трансгенних рослин.

4. Дослiдити характер та рiвень експресiї в рослинах картоплi синтетичного гену епiдермального фактору росту людини та гену поверхневого антигену вiрусу гепатиту Б (hEGF та HBsAg).

Наукова новизна отриманих результатiв.

На тест-системах тютюну та картоплi вперше вдалось показати, що вiдiбранi послiдовностi геномних ДНК цих рослин -- rpS 12 та pat 122 -- мають властивостi рослинних промоторiв, якi забезпечують коренеспецифiчну експресiю гену npt-II та бульбоспецифiчну експресiю генiв cat та hEGF в трансгенних рослинах тютюну та картоплi, вiдповiдно. Одними з перших в свiтi показана можливiсть експресiї в рослинах картоплi гену поверхневого антигену вiрусу гепатиту Б, який специфiчно зв'язується з моноклональними антитiлами проти HBsAg сироватки людини. Одержанi результати можуть слугувати моделлю для створення вакцинної продукцiї в їстiвних культурах. Отримано трансгеннi рослини картоплi з експресiєю синтетичного гену епiдермального фактору росту людини з метою використання цих рослин в лiкувальних цiлях.

Практичне значення одержаних результатiв.

Удосконалено методичнi пiдходи генетичної трансформацiї рослин рекомбiнантними молекулами ДНК та одержано трансгеннi рослини тютюну та картоплi з органоспецифiчною експресiєю клонованих генiв. Цi генно-iнженернi розробки можуть бути використанi для вивчення молекулярних механiзмiв органо-специфiчної експресiї чужерiдних генiв в клiтинах рослин та в подальших роботах, що пов'язанi з одержанням трансгенних рослин з вибiрковою експресiєю в тканинах чужерiдних генiв для потреб бiотехнологiї, сiльського господарства та медицини.

Особистий внесок дисертанта.

Всi основнi результати по вiдпрацюванню технiки трансформацiї протопластiв тютюну та мiкробульбочкових дискiв картоплi, отриманню трансгенних рослин та проведенню аналiзу експресiї внесених в них химерних генiв отриманi автором.

Апробацiя результатiв дисертацiї.

Результати дисертацiйної роботи доповiдались на ХVII Мiжнародному генетичному конгресi (Бiрмiнгем, Англiя, 1993); II-му (1993) та III-му (1995) Симпозiумах "Новi методи бiотехнологiї рослин" (Пущино, Росiя); на Мiжнародному симпозiумi "Бiотехнологiя та генетична iнженерiя рослин" (Київ, 1994); на II з'їздi медичних генетикiв України (Львiв, 1995) та на конференцiях i семiнарах Iнституту бiоорганiчної хiмiї та нафтохiмiї НАН України.

Публiкацiї.

Результати дисертацiї опублiкованi в 8-и статтях наукових журналiв та тезах 8-и конференцiй.

Структура та об'єм роботи. Дисертацiя викладена на 122 сторiнках машинописного тексту i складається iз вступу, огляду лiтератури, опису матерiалiв i методiв дослiдження, результатiв дослiдження та їх обговорення, закiнчення, висновкiв та списку цитованої лiтератури, який мiстить 162 джерела. Робота проiлюстрована 2 таблицями та 16 рисунками.

МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ

Мезофiльнi протопласти тютюну iзолювали за стандартною методикою (Power and Chapman,1985) з рослин, що пiдтримувались в культурi in vitro. Культура стерильних пагонiв картоплi була iнiцiйована з поверхнево стерилiзованих "вiчок" безвiрусних бульб, наданих Волинським науково-дослiдним об'єднанням "Елiта". Мiкробульби iндукували in vitro на модифiкованому живильному середовищi MS (Murashige and Skoog,1962).

Для прямої трансформацiї протопластiв тютюну використовували плазмiди pDNt 23t та pUC 23t (Доманський i iн.,1986). Для трансформацiї мiкробульбочкових дискiв картоплi використовували слiдуючi вектори:

A.tumefaciens 3850(pBin19:: pat122-cat) (Єфiменко i iн.,1995);

A.tumefaciens 3850(pBin19::CaMV35S-HBsAg) (Доманський i iн.,1995);

A.tumefaciens 3850(pBin19::CaMV35S-hEGF) та

A.tumefaciens 3850(pBin19:: pat122-hEGF) (Salmanian et al.,1996).

Трансформацiю протопластiв проводили за модифiкованою нами методикою Шилiто (Shillito et al.,1983). Трансгеннi рослини тютюну регенерували i пiдтримували в культурi за методом Потрiкуса (Potrykus and Shillito,1985). Мiкробульбочковi диски картоплi трансформували спiвкультивуванням з агробактерiальними векторами. На всiх етапах трансформацiї та регенерацiї використовували живильне середовище MLS (Медведєва i iн.,1997). Селекцiю трансформантiв у всiх випадках проводили на середовищах з 100 мг/л сульфату канамiцину.

Аналiз експресiї химерного гену npt-II проводили за методом Рейса (Reiss et al.,1984), гену cat -- за методом Гормана (Gorman et al.,1985). Експресiю химерних генiв hEGF та HBsAg виявляли методом iмуно-сорбентного аналiзу (ELISA) з використанням комерцiйних наборiв моноклональних антитiл -- QuantikineTM Human EGF Immunoassay kit та Micro Elisa System Hepanostica HBsAg згiдно з протоколами фiрм-виробникiв.

Наявнiсть транскриптiв hEGF в екстрактах трансгенних рослин картоплi пiдтверджена дот-блот гiбридизацiєю сумарної РНК.

Очищенi за допомогою iмуно-афiнної хроматографiї пептиди HBsAg аналiзували електрофорезом у полiакриламiдному гелi, використавши маркери молекулярної ваги.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Дослiдження характеру експресiї клонованого фрагменту геномної ДНК тютюну в трансформованих тканинах тютюну.

Як джерела промоторних послiдовностей звичайно використовують клонованi гени, що функцiонують в рослинах. Вiдомо, що деякi з функцiонуючих в рослинах промоторiв здатнi iнiцiювати транскрипцiю в клiтинах E.coli (Herrera-Estrella et al.,1983) i, отже , їх можна вiдбирати по проявленню функцiї в бактерiальних клiтинах. Цей пiдхiд був використаний для клонування послiдовностей ядерної ДНК тютюну, якi функцiонували як промотори в клiтинах E.coli. Припустили, що деякi з таких послiдовностей могли б функцiонувати як промотори i в клiтинах рослин (Доманський i iн.,1986). Для перевiрки цього припущення випадковi фрагменти геномної ДНК тютюну вбудовували перед кодуючою послiдовнiстю гену npt-II без промотора i потенцiйнi промотори виявляли по активностi NPT-II в бактерiальних клiтинах. Одна з отриманих конструкцiй в плазмiдi pDNt 23t, що мiстила вставку довжиною 500 п.н. перед структурною частиною гену npt-II, була особливо ефективна в E.coli, тому її використали для трансформацiї протопластiв тютюну.

Протопласти тютюну є iдеальною i добре вивченою реципiєнтною системою для чужерiдної ДНК, часто в формi плазмiд, забезпечуючи її iнкорпорацiю i експресiю. Трансформацiя рослинних протопластiв рекомбiнантними молекулами ДНК має ту перевагу, що регуляцiя i функцiя чужерiдних генiв може бути вивчена в їх природньому клiтинному оточеннi, а тотiпотентнiсть рослинної клiтини дозволяє регенерувати цiлу рослину, забезпечуючи таким чином генетичний i молекулярний аналiз потомства. В результатi трансформацiї та регенерацiї були отриманi сiм стiйких до канамiцину рослин, в яких експресiю гену npt-II визначали за методом Рейса (Reiss et al.,1984). Результати представленi на Рис.1, з якого видно, що активнiсть NPT-II максимальна в коренях, дещо слабша в стеблах i практично не виявлена в листях, що свiдчить про коренеспецифiчний характер експресiї гену npt-II. Крiм того, рiвень експресiї пiд контролем промоторної послiдовностi тютюну помiтно нижчий, нiж у випадку позитивного контролю. Розмiри бiлкових продуктiв химерних генiв npt-II як в дослiдi, так i в контролi приблизно однаковi, хоча в дослiдi молекулярна маса бiлку дещо вища, а розподiлення його в гелi бiльш дифузне. Це може бути зв'язано з вiдсутнiстю в плазмiдi pDNt 23t еукарiотичного 3'-регуляторного елементу, що може бути причиною молекулярної негомогенностi мРНК i бiлкового продукту, а також, що бiльш вiрогiдно, його стабiльностi i ферментативної активностi.

Гiбридизацiя мiченої плазмiди pDNt 23t з геномною ДНК тютюну i хлоропластною ДНК показали, що ДНК-вставка плазмiди pDNt 23t гiбридизувалась i з ядерною, i з хлоропластною ДНК. Також було виявлено, що вставка в 470 пар основ плазмiди pDNt 23t мала 100% гомологiю з фрагментом хлоропластної ДНК тютюну, який кодує частину гену рибосомного бiлку S 12 (Grzhelyak et al., 1996).

Дослiдження транзиєнтної експресiї гену cat в протопластах тютюну.

Оскiльки in vivo клонований фрагмент ДНК хлоропластного геному не має властивостей органо-специфiчного промотору, можна припустити, що експресiя з цього промотору, яку ми спостерiгали в трансгенних рослинах тютюну, зумовлена позицiйним ефектом. Для перевiрки цього припущення ген cat пiд контролем послiдовностi rpS12 був введений в протопласти тютюну в складi плазмiди pUC23 cat, i через 48 годин культивування в цих протопластах визначали часову експресiю гену cat за методом Гормана (Gorman et al., 1985). На радiоавтографi хроматограми (Рис.2) видно, що в дослiдi реакцiя пройшла до кiнця i утворились всi три форми ацетильованого хлорамфенiколу, тобто, дослiджуваний екстракт має CAT-активнiсть. З цього витiкає, що фрагмент ядерної ДНК тютюну плазмiди pDNt 23t, має властивостi промотору i може iнiцiювати транскрипцiю. Той факт, що клонований фрагмент ядерної ДНК тютюну гiбридизується з фрагментом хлоропластної ДНК тютюну вказує, що послiдовностi хлоропластної ДНК можуть бути i в ядернiй ДНК. Це узгоджується i з широко сприйнятою ендосимбiотичною теорiєю (Weeden et al., 1981). Багато генiв, первiсно кодованих в хлоропластному геномi, були, очевидно, перенесенi протягом еволюцiї в ядра. Про таку мiжклiтинну "мiграцiю" генiв з хлоропластiв в ядра повiдомляють ряд авторiв (Oliver et al., 1990; Baldauf et al., 1990). Оскiльки перемiщення генiв перiодично зустрiчалось в еволюцiї рослин, здається, що бiльшiсть iз пластидних генiв мають "двiйникiв" в ядрах, де вони були виявленi як короткi (1.0 Kb) чи довгi (кiлька Kb) послiдовностi (Du Jardin et al.,1990).

Отримання трансгенних рослин картоплi з експресiєю химерного гену cat пiд контролем промотору гену пататину класу I.

Однiєю iз складових успiху генетичної трансформацiї є правильний вибiр експлантiв, якi повиннi бути чутливими до iнфiкування агробактерiєю i мати високий регенерацiйний потенцiал. Ми тестували експланти листка, стебла та мiкробульб картоплi чотирьох сортiв. Виявилось, що найбiльш високий регенерацiйний потенцiал мають мiкробульби сортiв Невський та Луговський. Нами також були пiдiбранi умови для швидкого отримання мiкробульб in vitro. Оскiльки картопля сорту Невський мала найкращу здатнiсть до утворення мiкробульб, її використовували для трансформацiї.

Мiкробульбочки вiком до 6 мiсяцiв, нарiзали дисками товщиною 1-2 мм i спiвкультивували з A.tumefaciens з бiнарним вектором pBin19, що несе ген cat пiд контролем промотора гену пататину pat122. Рослини картоплi, що регенерували на мiкробульбочкових дисках, трансформованих A.tumefaciens 3850 (pBin19:: pat122-cat), аналiзували на наявнiсть експресiї маркерного гену cat. Оскiльки ген cat вiдсутнiй в тканинах нормальних рослин, то наявнiсть ферментативної активностi CAT в рослинах-регенерантах може слугувати доказом їх трансгенної природи. CAT-активнiсть бiлкових екстрактiв була визначена за методом Гормана (Gorman et al., 1985). Концентрацiї сумарного бiлку для кожної точки були однаковi в усiх випадках. Щоб визначити характер експресiї внесеного гену, активнiсть його продукту визначали в стеблах, коренях i мiкробульбах рослин -- регенерантiв. Як позитивний контроль використовували клiтинний екстракт штаму E.coli, що мiстить плазмiду pBR 325 з геном cat , а в якостi негативного контролю на дорiжку наносили алiквоту реакцiйної сумiшi з екстрактом мiкробульб нетрансформованих рослин. Всi реакцiї проводили в однакових умовах. З хроматограми видно (Рис.3), що максимальна активнiсть CAT спостерiгається в мiкробульбах трансформованих рослин i практично вiдсутня в листях, стеблах i коренях. Цей факт вказує на бульбоспецифiчний характер експресiї химерного гену, який направляється клонованим промотором. Оскiльки експресiя гену cat, що направляється промотором pat122 , практично вiдсутня в коренях, можна вiднести його до класу I, так як вiдомо, що гени пататину класу I здатнi направляти високi рiвнi експресiї виключно в бульбах (Jefferson et al., 1990).

Для порiвняння ефективностi експресiї гену cat пiд контролем промотору pat122 паралельно була проведена трансформацiя з використанням 35S промотору ВМКК (плазмiда pCaMV35S::cat), який забезпечує високi рiвнi експресiї в усiх тканинах трансформованих рослин. Данi, представленi на Рис.4, показують, що сила пататинового промотору дещо бiльша, нiж 35S промотору. Проте, рiвень активностi, що спостерiгався в бульбах з пататиновим промотором B33 (Paiva et al., 1983) знаходився в тих же рамках, що були показанi для такого сильного промотору, як 35S промотор ВМКК та фотосинтетичного ST-LS1 гену (Liu et al.,1990).

Особливiсть експресiї генiв пататину класу I полягає в тому, що вона може регулюватись вмiстом цукрози в живильному середовищi. Вплив цукрози на експресiю химерного гену pat122-cat -- екстракти з листя трансгенних рослин, регенерованих на середовищi з 8% цукрозою, мають CAT-активнiсть, хоча й дещо нижчу в порiвняннi з мiкробульбами (дорiжки 4 i 5).

Експресiя гену епiдермального фактору росту людини в рослинах картоплi пiд контролем промотору гену пататину pat122.

Химерний ген hEGF був хiмiчно синтезований i злитий з промотором pat122 i, для порiвняння, з промотором 35S ВМКК (Salmanian et al., 1996). Позитивнi трансформанти регенерували на середовищi з канамiцином пiсля спiвкультивування мiкробульбочкових дискiв картоплi з агробактерiєю. Наявнiсть транскриптiв hEGF в екстрактах трансгенних рослин пiдтверджена дот-блот гiбридизацiєю сумарної РНК. Кiлькiсний вмiст пептиду hEGF в рослинних екстрактах для двох конструкцiй визначали методом ELISA.

Виявлено також значний вмiст невiдомого матерiалу, що реагував зi специфiчними анти-hEGF антитiлами, представленими в комерцiйному наборi. Особливо велика кiлькiсть його виявилась в коренях. Подiбну картину спостерiгав Хiго в листках тютюну (Higo et al.,1993). Цей факт ще не має задовiльного пояснення, але недавня iдентифiкацiя трансмембранного рецептору PRO 25, що мiстить кiлька EGF-подiбних амiно-кислотних повторiв, можливо могла б допомогти пояснити цей феномен (Kohorn et al., 1992).

картопля тютюн ген клонований

Рис.1. ELISA для hEGF в розчинних фракцiях екстрактiв рiзних тканин рослини: a -- коренi, b -- листя, c -- мiкробульби; 1 -- нетрансформованi рослини, 2 -- 35SCaMV промотор; 3 -- промотор гену пататину

Як видно з того ж Рис.6, рiвень експресiї hEGF пiд контролем промотору pat122 майже вдвiчi вищий в порiвняннi з 35S промотором ВМКК, що свiдчить про можливiсть його подальшого пiдвищення.

Корене-специфiчна експресiя гену поверхневого антигену вiрусу гепатиту Б в рослинах картоплi. П'ять стiйких до канамiцину пагонiв, що регенерували пiсля трансформацiї мiкробульбочкових дискiв химерним геном 35S CaMV::HBsAg, використали для аналiзу експресiї цього гену, яку визначали методом iмуно-сорбентного аналiзу з використанням моноклональних антитiл проти HBsAg сироватки людини. Данi пiдтверджують, що HBsAg, який експресується в рослинах картоплi, специфiчно зв'язується з моноклональними антитiлами.

Концентрацiя HBsAg в бiлкових екстрактах рослинних тканин варiювала вiд 3-11 нг/мг в листках до 76-83 нг/мг розчинних бiлкiв в коренях. Приблизно такий же рiвень експресiї HBsAg в листях тютюну виявили дослiдження Мейсона (Mason et al.,1992). В коренях рiвень експресiї HBsAg в 5-10 разiв вищий, нiж в листях трансгенних рослин картоплi, що, можливо, зв'язано з активуванням промотору 35SCaMV cis-дiючим елементом as-I, що зв'язується з ядерним бiлком ASF-I, концентрацiя якого в коренях в 5-10 разiв бiльша, нiж в листках (Neuhaus et al.,1994).

Електрофорезом в полiакриламiдному гелi з набором маркерних бiлкiв показано, що в трансгенних рослинах картоплi синтезуються саме HBsAg пептиди, якi виявленi в формi мультимерiв. Цi результати узгоджуються з ранiше опублiкованими спостереженнями, згiдно з якими в багатьох випадках антитiла зустрiчаються скорiше в мультимернiй формi, нг/мг розчинних бiлкiв нiж в мономернiй (Murray et al.,1988) i що протягом афiнної очистки HBsAg мiг бути перетворений в дисульфiдно-зв'язанi димери (Thanh et al.,1991) чи мультимери (Wampler et al.,1985).

Рис.2. ELISA для HBsAg в розчинних фракцiях екстрактiв трансгенних рослин: 1 -- коренi; 2 -- листя; 3 -- мiкробульби

Експресiя гену HBsAg в рослинних тканинах представляє особливий iнтерес як приваблива можливiсть використання трансгенних рослин в якостi "їстiвних" вакцин.

ВИСНОВКИ

1. Методом прямого введення генiв отримано трансгеннi рослини тютюну з коренеспецифiчною експресiєю химерного гену npt-II.

2. Показано, що клонований фрагмент ядерної ДНК тютюну, який вiдповiдає 3'- частинi хлоропластного гену rpS12, має властивостi рослинного промотора.

3. Вставка rpS12 фрагменту ядерної ДНК тютюну перед безпромоторним геном npt-II забезпечує коренеспецифiчну експресiю цього гену.

4. За допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформацiї отримано трансгеннi рослини картоплi з експресiєю химерних генiв cat, hEGF та HBsAg.

5. Показано, що клонований промотор гену пататину pat 122 направляє чiтко виражену бульбоспецифiчну експресiю генiв cat та hEGF.

6. Промотор гену пататину забезпечує майже вдвiчi вищий рiвень експресiї химерного гену hEGF в мiкробульбах трансгенних рослин картоплi, нiж 35S промотор ВМКК.

7. В коренях трансгенних рослин картоплi, що мiстять ген HBsAg пiд контролем конститутивного 35S промотора ВМКК, рiвень експресiї в 5 -- 10 разiв вищий, нiж в листовiй тканинi.

Список робiт, опублiкованих по темi дисертацiї

1. Доманский Н.Н., Генинг Л.В., Коваленко П.Г., Медведева Т.В., Галкин А.П., Газарян К.Г. Клонирование фрагмента ДНК табака, обладающего свойствами промотора в трансгенном растении //Молекулярная биология.-1989.-Т.23.- с.1391-1399.

2. Yefimenko I.M., Medvedeva T.V.,Kovalenko P.G., Gazaryan K.G., Galkin A.P. Organ-specific gene expression in transgenic potato: the cloning a new promoter of a class I patatin gene. // Биополимеры и клетка.- 1995.-Т.11.-N.6.-с.96-103.

3. Domansky N., Ehsani P.,Salmanian A.-H., Medvedeva T.V. Organ -- specific expression of hepatitis B surface antigen in potato. // Biotechnology Let.- 1995.-17.-p.863-866.

4. Ehsani P., Medvedeva T., Domansky N. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic potato plants // Iranian J. of Medical Sci.-1995.-V.20.-N.1-2.-pp.42-47.

5. Kovalenko P.G., Yefimenko I.M., Schuman N.V., Medvedeva T.V., Gazaryan K.G., Galkin A.P. Genetic transformation of potato (Solanum tuberosum L.) using a binary Agrobacterium tumefaciens vector with patatin promoter class I // Биополимеры и клетка. -- 1996. --Т.12. --N.2. -- с.42-46.

Grzhelyak N.V., Galkin A.P., Gening L.V., Medvedeva T.V., Lioshina L.G., Bulko O.V., Gazaryan K.G. Chloroplast "cryptic" promoter can be activated upon their transfer to plant nuclear genome // Биополимеры и клетка.-1996.-Т.12.-N.6.-с.87-93.

7. Salmanian A.-H., Gushchin A., Medvedeva T., Noori-Daloii M.R., Domansky N. Synthesis and expression of the gene for human epidermal growth factor in transgenic potato plants // Biotechnology Let.-1996.-v.18.-N.9. --pp.1095-1098.

8. Медведева Т.В., Ефименко И.М., Гржеляк Н.В., Газарян К.Г., Галкин А.П.

АНОТАЦІЇ

Медведєва Т.В. Отримання трансгенних рослин тютюну та картоплi з коренеспецифiчною та бульбоспецифiчною експресiєю химерних генiв.- Рукопис.

Дисертацiя на здобуття вченого ступеня кандидата бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.15-генетика, Iнститут клiтинної бiологiї i генетичної iнженерiї НАН України, Київ, 1998.

Дисертацiя присвячена отриманню трансгенних рослин тютюну та картоплi з експресiєю химерних генiв, що направляється клонованими органоспецифiчними промоторами. Злиттям мезофiльних протопластiв з плазмiдною ДНК отриманi трансгеннi рослини тютюну з коренеспецифiчною експресiєю гену npt-II, що направляється клонованим промотором rpS12. В трансгенних рослинах картоплi, регенерованих з мiкробульбочкових дискiв пiсля спiвкультивування з Agrobacterium, продемонстрована бульбоспецифiчна експресiя генiв cat та hEGF, що направляється промотором гену пататину pat 122 та коренеспецифiчна експресiя гену HBsAg пiд контролем 35S промотору ВМКК.

Ключовi слова: трансгеннi рослини; корене-та бульбоспецифiчна експресiя; промотор гену пататину; ген епiдермального фактору росту людини; ген поверхневого антигену вiрусу гепатиту Б.

Медведева Т.В. Получение трансгенных растений табака и картофеля с корнеспецифической и клубнеспецифической экспрессией химерных генов.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 -- генетика, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1998. Диссертация посвящена получению трансгенных растений табака и картофеля с экспрессией химерных генов, которая направляется клонированными органоспецифическими промоторами. Слиянием мезофильных протопластов с плазмидной ДНК получены трансгенные растения табака с корнеспецифической экспрессией гена npt-II, направляемой клонированным промотором rpS12. В трансгенных растениях картофеля, регенерировавших с микроклубеньковых дисков после сокультивирования с Agrobacterium, продемонстрирована клубнеспецифическая экспрессия генов cat и hEGF, направляемая промотором гена пататина pat122 и корнеспецифическая экспрессия гена HBsAg под контролем 35S промотора ВМЦК.

Ключевые слова: трансгенные растения; корне-и клубнеспецифическая экспрессия; промотор гена пататина; ген эпидермального фактора роста человека; ген поверхностного антигена вируса гепатита Б.

Medvedeva T.V. The obtaining of transgenic tobacco and potato plants with root-specific and tuber-specific expression of chimeric genes . -- The manuscript.

Thesis for gaining a scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.15-Genetics, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv,1998. The dissertation is devoted to obtaining of transgenic tobacco and potato plants with expression of chimeric genes that is driven by cloned organ-specific promoters. By fusion of mesophyl protoplasts with plasmid DNA were obtained the transgenic tobacco plants with root specific expression of chimeric npt-II gene driven by cloned promoter rpS12. In transgenic potato plants that regenerated from microtuber discs after cocultivation with Agrobacterium were shown tuber specific expression of cat and hEGF genes driven by pat122 promoter and root-specific HBsAg gene expression driven by 35SCaMV promoter. Key words: transgenic plants; root and tuber specific expression; patatin gene promoter; the human epidermal growth factor gene; the gene of hepatitis B surface antigen.

Размещено на Allbest.ur