Вплив активації мітохондріальної пори на діяльність серця

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології імені О.О. Богомольця

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВПЛИВ АКТИВАЦІЇ МІТОХОНДРІАЛЬНОЇ ПОРИ НА ДІЯЛЬНІСТЬ СЕРЦЯ

НАДТОЧІЙ СЕРГІЙ МИКОЛАЙОВИЧ

03.00.02 - біофізика

КИЇВ - 2003

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі фізіології кровообігу

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України доктор медичних наук, професор Сагач Вадим Федорович, завідувач відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Малишева Маргарита Костянтинівна, завідувач відділу нейрохімії Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця; доктор медичних наук Нещерет Олександр Павлович, завідувач лабораторії нейрогуморальної регуляції кровообігу Інституту ендокринології і обміну речовин АМН України

Провідна установа: кафедра біофізики біологічного факультету Національного Університету імені Тараса Шевченка, м. Київ.

Захист відбудеться “____”___________2004 р. о ___годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: м. Київ, 01024, вул. О.О.Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: м. Київ, 01024, вул. О.О.Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “____”__________2003 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна

І. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Результати досліджень в галузі біохімії, біофізики та фізіології, накопичені за останні роки, вказують на визначну роль мітохондрій в розвитку реперфузійних і токсичних пошкоджень серця [Griffiths et al., 1995; Crompton, 1999; Halestrap et al., 2002]. Ключовою ланкою у механізмі розвитку цих порушень на клітинному рівні може виступати активація мітохондріальних пор (МП) [Borutaite et al., 2003], тому молекулярна структура, умови активації і пригнічення зараз інтенсивно вивчаються. Показано, що МП являють собою неселективні канали в мітохондріальній мембрані, які можуть утворюватися в умовах in vitro під дією одного з наступних чинників - збільшення внутрішньоклітінної концентрації Са²⁺, вільних радикалів, неорганічного фосфату, значному зменшенні синтезу АТФ та модифікації білкових структур мітохондрій [Hanter et al., 1976; Lemasters et al., 1998; Kowaltowski et al., 2001]. Активація МП відбувається значно легше, якщо кілька з наведених чинників діють одночасно, як це має місце, наприклад, в умовах аноксії-реоксигенації, ішемії-реперфузії чи дії на клітину токсичних агентів [Kerr et al., 1999; Hausenloy et al., 2003]. Показано, що активація МП супроводжується деполяризацією мембрани мітохондрії, порушенням іонного складу її матриксу, розривом дихального ланцюгу, вільнорадикальним вибухом, а також вивільненням в цитозоль клітини різних речовин - цитохрому С, фактору індукції апоптозу, прокаспаз та інших, роль яких поки що залишається не до кінця вивченою [Huser et al., 1998; Susin et al., 1999; Duchen, 2000]. Існуючі дані про активацію МП отримані на рівні ізольованих мітохондрій або клітин. В той же час дослідження ролі МП на органному і організменому рівнях майже відсутні. Це пов'язане насамперед з тим, що розроблені до теперішнього часу методики реєстрації МП дозволяють оцінювати її активність тільки в умовах in vitro. Можливість дослідження активації МП на рівні ізольованого органу обов'язково має супроводжуватися деструкцією тканини до клітинного і навіть субклітинного рівня. Тому проблема вивчення ролі МП в діяльності серцево-судинної системи, а також розробка адекватних методів одночасної реєстрації прижиттєвої активності МП в умовах функціонування органу або організму є дуже актуальною.

У зв'язку з тим, що саме для кардіоміоцитів характерна велика кількість мітохондрій і відповідно високий рівень енергетичного метаболізму [Inczinger, 1983], міокард можна вважати оптимальним об'єктом для дослідження ролі активації МП у змінах функціональної активності серця, а також можливості корекції цих змін шляхом пригнічення утворення МП.

Мета і завдання роботи. Метою нашого дослідження стало вивчення ролі активації МП в змінах діяльності серця. Відповідно до обраної цілі були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити вплив хімічних активаторів МП - феніларсин оксиду і антиміцину А - на показники скорочувальної активності, коронарного потоку і кисневого обміну ізольованого серця.

2. Дослідити вплив ішемії-реперфузії на функціональну активність ізольованого серця.

Вивчити можливість вивільнення внутрішньоклітинних факторів при активації МП і дослідити їх вплив на міокард та ізольовані судинні препарати.

Вивчити вплив інгібіторів МП на функціональну активність серця в умовах ішемії-реперфузії.

Дослідити вплив активаторів МП на вивільнення фактора (або факторів) мітохондріального походження в кровоток тварин in vivo.

Розробити метод оцінки активності МП в умовах ізольованого серця та експериментів in vivo на основі реєстрації речовин, що вивільнюються у відтікаючий розчин або кров при активації МП.

Об'єкт дослідження: ізольоване серце морських свинок, ізольовані міокардіальні та судинні препарати, сольові розчини та кров інтактних тварин.

Предмет дослідження: параметри кардіодинаміки, скорочувальної активності міокарда та кисневого обміну, тонус коронарних судин, тонічне напруження ізольованих препаратів, оптична щільність поглинання сольових розчинів і сироватки крові.

Методи дослідження:

У роботі були використані наступні методи:

фізіологічні - перфузія ізольованого серця за методом Лангендорфа, визначення показників скорочувальної функції серця, коронарного потоку, кисневого режиму, тонічного напруження ізольованих препаратів міокардіальної трабекули і судинної смужки;

біофізичні - спектрофотометричні дослідження сольових розчинів і сироватки крові.

Наукова новизна одержаних результатів. Активатори МП - ФАО, антиміцин А та ішемія-реперфузія призводили до пригнічення скорочувальної активності ізольованого серця морської свинки, зменьшення коронарного потоку і розвитку арітмій. Ці негативні зміни супроводжувалися збільшенням кисневої вартості роботи серця. Блокатор МП циклоспорин А ефективно попереджував розвиток реперфузійних порушень діяльності серця. Показано, що як блокатор МП можна використовувати водорозчинний вітамін Е - тролокс, який також здійснював корегуючий вплив на розвиток реперфузійних порушень діяльності серця та кисневого обміну міокрада. Результати, отримані при використанні активаторів та інгібіторів МП свідчать про те, що МП грає важливу роль в розвитку пригнічення серця.

Вперше показано, що порушення функції міокарда під час активації МП супроводжувалися вивільненням у відтікаючий від серця розчин стабільного мітохондріального фактора (СМФ), який був зареєстрований спектрофотометрично в ультрафіолетовій ділянці спектру в діапазоні довжин хвиль 230-260 нм з максимумом =240-250 нм. Тісна кореляційна залежність між амплітудою піка оптичної щільності поглинання і зміною фізіологічних показників ізольованого серця під час застосування активаторів та інгібіторів МП вказувала на те, що СМФ може виступати як маркер відкриття МП.

В умовах цілісного організму показано, що активація МП під час ішемії-реперфузії однієї з гілок лівої коронарної артерії супроводжувалася вивільненням в коронарний кровоток СМФ. Також продемонстровано, що при активації МП за допомогою ФАО в басейні стегнової артерії відбувалося вивільнення дослідженого фактору у венозний кровоток. Результати досліджень вказують на можливість використання зареєстрованого СМФ як маркера оксидативних ушкоджень клітин, ініційованих активацією МП, як в умовах ізольованого серця так і в цілісному організмі.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані дані мають як теоретичне, так і практичне значення. Дослідження ролі активації МП в механізмах розвитку депресії міокарда належать до фундаментальних наукових розробок. За умов in vitro і, що особливо важливо, in vivo показано негативний вплив активації МП на скорочувальну активність серця, коронарний потік та кисневий режим серця.

Показано, що відкриття МП призводить до вивільнення стабільного фактору мітохондріального походження, який може виступати маркером пошкодження клітин при активації МП. Практичне значення проведеного дослідження полягає в тому, що запропонована методика реєстрації СМФ за допомогою спектрофотометрії може бути використана для аналізу не тільки сольового розчину, але також сироватки крові, на тій підставі, що величини оптичної щільності поглинання зразків пропорційні кількості СМФ, яка тісно корелює зі ступінню пошкодження органу. Безсумнівна перевага цього методу полягає в тому, що СМФ можна реєструвати безпосередньо в пробах крові, що відкриває широкі перспективи для практичного використання результатів наших досліджень у клінічній практиці.

Велике значення мають результати, які були отримані в експериментах з блокаторами МП, які свідчать, що тролокс, інгібітор окислювального стресу, який ймовірно, може виступати блокатором мітохондріальних пор, попереджає порушення функції серця в умовах ішемії-реперфузії і може бути застосований для корекції реперфузійних пошкоджень. Його перевагою перед іншими відомими блокаторами відкриття мітохондріальних пор, наприклад, циклоспорином А, є відсутність токсичних та інших ефектів, що вказує на можливість його впровадження у клінічну практику.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором самостійно. Розробка методичної концепції роботи, схеми експериментів, аналіз експериментальних даних, написання статей були проведені у співпраці з науковим керівником чл.-кор. НАН України Сагачем В.Ф. Підготовка тварин, катетеризація та обрахунки проведені самостійно. Обговорення отриманих результатів, підготовка публікацій здійснювались у співпраці із співробітниками відділу фізіології ковообігу ст. наук. спів., канд. біол. наук Шиманською Т.В., ст. наук. спів., докт. мед. наук Дмитрієвою А.В.

Апробація результатів дисертації. Основні результати і положення дисертації докладались і обговорювались на Національній конференції ”Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології” (Київ, 2002); Міжнародній конференції ”Astroeco-2002” (Терскол, 2002); XVI з'їзд Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002); Національна конференція “Довкілля і здоров'я” (Тернопіль, 2003); ІІІ Всероссийская конференция с международным участием “Механизмы функционирования висцеральных систем” (Санкт-Петербург, 2003); Сателлитный симпозиум “Пурины и монооксид азота” в рамках Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института физиологии НАН Беларуси (Минск, 2003).

Публікації. Основні матеріали роботи опубліковані в чотирьох журнальних статтях і восьми тезах доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Роботу викладено на 147 сторінках друкованого тексту та проілюстровано 28 рисунками і 13 таблицями. Дисертація складається із вступу, огляду сучасної наукової літератури, опису методів дослідження, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків і списку використаних джерел.

ІІ. МЕТОДИКА

Досліди проведені на 15 наркотизованих собаках і 85 морських свинках з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами.

Досліди проводили на ізольованих серцях морських свинок (m = 350 450 г). Тварин декапітували, проводили торакотомію, швидко відсікали серце. Перфузію ізольованого серця здійснювали ретроградно за методом Лангендорфа модифікованим розчином Кребса-Хензеляйта (ммоль/л: NaCl - 118; KCl - 4,7; MgSO₄ - 1,2; NaHCO₃ - 24; KH₂PO₄ - 1,2; глюкоза - 10; СаCl₂ - 2,5; pH 7,4; t=37⁰C) [Neely et al., 1967; Сагач та інш., 2000]. Притікаючий до серця розчин безперервно аерували сумішшю 95% О₂ і 5% СО₂. Перфузія коронарних судин здійснювалась при постійному тиску, який становив 755 мм рт.ст.

У порожнину лівого шлуночка вставляли латексний балончик, з'єднаний з тензодатчиком. Балончик розтягували під тиском 10 см вд.ст. Тиск у лівому шлуночку (ТЛШ), його першу похідну (dР/dt_max, dР/dt_min), кінцево-діастолічний тиск (КДТ) вимірювали тензодатчиком 746. Зазначені параметри реєстрували на багатоканальному полікардіографі Мінгограф-82 (Елема, Швеція) і одночасно на комп'ютері за допомогою АЦП (DT2801) і програмного забезпечення Global Lab V2.4.

Розраховували: індекс скоротливості Верагута (ІВ) [Veragut et al., 1965] і кількість аритмій впродовж кожних 5 хвилин після початку реперфузії. Для реєстрації коронарного потоку легеневу артерію надсікали, вводили катетер відповідного діаметру і фіксували. Швидкість коронарного потоку (КП) вимірювали за об'ємом відтікаючої від серця рідини за 1 хвилину. Напругу кисню (pO₂) у притікаючому та відтікаючому перфузійному розчині вимірювали за допомогою газоаналізатора BMS 3 Mk-2 (Радіометер, Данія). Розраховували: артеріо-венозну різницю (РО₂), об'єм споживання кисню (Q) за методом Neely [Neely et al., 1968] і кисневу вартість роботи серцевого м'язу [Сагач та інш., 2000].

Активатори МП феніларсин оксид (ФАО) (SIGMA, USA у дозі 10^-5 М для морських свинок і 0,4 мг для собак) та антиміцин А (SIGMA, USA у дозі 10^-5 М) додавали в перфузійний розчин протягом 10-ти хвилин. Ішемію-реперфузію ізольованого серця моделювали шляхом повної зупинки перфузії коронарних судин на 20 хвилин і наступної реперфузії впродовж 40 хвилин.

Діетилмаліат (ДЕМ) (SIGMA, USA у дозі 200*10^-6 М) - скавенжер глутатіону, водорозчинний вітамін Е - тролокс (SIGMA, USA у дозі 5*10^-5 М) та специфічний інгібітор МП - циклоспорин А (SIGMA, USA у дозі10^-6М) додавали до перфузійного розчину протягом 10-ти хвилин, після чого моделювали тотальну ішемію (20 хв). Крім того, тролокс вводили per os (10 мг/кг) за 50 хвилин до виділення серця, далі моделювали ішемію-реперфузію за схемою.

Перфузію другого серця здійснювали за методом Лангендорфа, описаному вище. Після його впрацьовування протягом 20-30 хвилин розчин Кребса-Хензелайта замінювали перфузійним розчином, який відтікав від легеневої артерії під час реперфузії першого працюючого серця за перші 5 хвилин, з 5 по 20-ту хвилину, з 20-ї по 40-у хвилину.

Результати та оригінальні криві реєстрації параметрів кардіодинаміки обробляли за допомогою ORIGIN 6.0 та Global Lab V2.4.

Реєстрація змін тонічної напруги ізольованих суперфузованих препаратів. Експерименти проведені на препаратах трабекули з вушка правого передсердя і кільцевих смужках з сонної артерії морських свинок. Тварин декапітували, серце вилучали з грудної порожнини, з вушка правого передсердя відпрепаровували поодинокі трабекули з однонаправлених м'язевих волокон. Кільцеві смужки з сонної артерії нарізали 1,5-2 мм шириною у відповідності до направлення м'язових волокон. Судинні і міокардіальні препарати переносили у термостатовані, суперфузовані камери і перфузували розчином Кребса-Хензеляйта, повністю ідентичний до того, що використовувався в дослідах на ізольованому серці. Препарати розтягували з силою 6-9 мН і залишали на 15 хв для стабілізації тонічного напруження, після чого попередньо активовані за допомогою електричної стимуляції препарати переводили на розчини, які збирали порційно за перші 5 хвилин реперфузії ізольованого серця, з 5 по 20-ту хвилину, з 20-ї до 40-ї хвилини. Скорочувальну активність препаратів реєстрували синхронно за допомогою механоелектричних перетворювачів EMX 1C в режимі, наближеному до ізометричного.

Дослідження за умов in vivo. Експерименти були проведені на 15 безпорідних собаках з премедікацією кетаміном (5 мг/кг, в/м) під хлоралозо-уретановим наркозом (0,05 та 0,5 г/кг, в/в). Як антикоагулянт використовували гепарин - 500 од./кг.

Під час операційної підготовки відпрепаровували і катетеризували: загальні сонні артерії, праву яремну вену, підключичну артерію, праву стегнову артерію і вену.

Модель ішемії-реперфузії здійснювали шляхом повної зупинки кровотоку однієї з гілок лівої коронарної артерії на 20 хвилин з наступною реперфузією (40 хв). Проби крові відбирали з правого передсердя перед ішемією, на 15-ій хвилині ішемії і на 1-5 хвилинах реперфузії. З метою активації МП використовували ФАО [Korge et al., 2001], який дуже повільно вводили в стегнову артерію в 20 мл фізіологічного розчину, за умов зупинки кровопостачання на 5 хв., з послідуючим відновленням кровотоку. Проби крові відбирали зі стегнової вени до введення препарату, а також безпосередньо після відновлення кровотоку в басейні стегнової артерії.

Методика отримання сироватки крові. Зібрані проби крові центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хвилин. У сироватку додавали трихлороцтову кислоту (ТХО). Для забезпечення повного осадження білків кінцева концентрація ТХО в розчині мала складати 5%. Для дослідження сироватки змішували 1мл рідини з 0,1 мл 50% ТХО. Розчин ретельно перемішували і залишали на 10 хвилин. Наступне центрифугування проводили при 3000 об/хв протягом 15 хвилин. Після цього збирали надосадну рідину і проводили спектрофотометричні вимірювання.

Вимірювання оптичної щільності поглинання розчинів. Оптичну щільність поглинання розчинів вимірювали за допомогою спектрофотометра СФ-46. Для вимірювання використовували кварцеві 10-ти міліметрові кювети. Вибір кювет був обумовлений їх здатністю працювати в області ультрафіолетового спектру. В одну з двох абсолютно однакових кювет заливали контрольний розчин, а в другу досліджувану рідину. В монохроматичний потік світла, який випромінювався з вихідної щілини в кюветний відсік, вводилися контрольний і досліджуваний зразки. Принцип роботи полягав у вимірюванні співвідношення між двома світовими потоками: тим, який пройшов крізь кювету з рідиною, і потоком, який падав на неї. Вимірювання проводили в ультрафіолетовій ділянці спектру при довжинах хвиль від 230 нм до 260 нм. Функціональну залежність оптичної щільності поглинання від довжини хвилі будували за допомогою ORIGIN 6.0.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою t-критерію Ст'юдента і різницевого методу. Вірогідними вважали різницю при Р0,05. Результати представлені як середнє арифметичне стандартна похибка середнього арифметичного.

ІІІ. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

мітохондріальний пора серце ішемія інгібітор

Дослідження впливу активаторів мітохондріальної пори та ішемії-реперфузії на функцію ізольованого серця. В наших експериментах (n=9) перфузія (10-хв) з ФАО ізольованого за Лангендорфом серця викликала двофазну реакцію. Перша фаза, максимум якої зареєстрований вже на третій хвилині перефузії препарату, характеризувалась розвитком позитивної інотропної реакції (таб.1) з позитивним хронотропним ефектом. З п'ятої хвилині від початку перфузії ФАО характер реакції кардинально змінювався. Тиск у лівому шлуночку і параметри скорочувальної активності міокарду (таб.1) поступово падали і на 10-й хвилині перфузії з ФАО ці зміни ставали достовірними.

Таблиця 1. Зміни показників кардіодинаміки при перфузії ізольованого серця морської свинки феніларсин оксидом

Зменшення максимальної швидкості розслаблення лівого шлуночка відбувалося в більшій мірі, майже на 43%, що могло свідчити про початкову фазу незворотних пошкоджень міокарда. На користь такого припущення свідчать значне підвищення КДТ у лівому шлуночку з 4,81,6 мм рт.ст. до 11,24,2 мм рт.ст., Р0,05, а також достовірне зменшення КП на 22%. Пригнічення скоротливої діяльності серця не відновлювалось і після закінчення введення ФАО і переведення перфузії серця на чистий розчин Кребса-Хензелейта.

Ці негативні зміни супроводжувались значним зменшенням споживання кисню з 0,940,13 ммоль*год^-1г^-1 у вихідному стані до 0,470,05 ммоль*год^-1г^-1 на 10-й хвилині відмивання після перфузії з ФАО, Р0,05. Натомість киснева вартість роботи серця зростала майже на 60%, Р0,05. Отримані дані вказують на те, що перфузія ізольованого серця активатором МП ФАО супроводжувалася суттєвими порушеннями коронарного потоку, скорочувальної функції міокарда та його кисневого обміну.

Використаний в цій серії дослідів ФАО не є селективним активатором МП. Тому ми рахували за доцільне дослідити вплив на серце інших активаторів МП, механізм дії яких відрізняється від ФАО. Наступним препаратом став інгібітор переносу електронів з цитохрому С на В антиміцин А, який може виступати активатором МП [Tzung et al., 2001; De Graaf et al., 2002].

Перфузія ізольованого серця розчином з антиміцином А у дозі 10^-5М (n=8) вже на 3-й хвилині спостереження приводила до різкого зменшення тиску у лівому шлуночку, який знижувався з 604,2 мм рт.ст. до 21,64,1 мм рт.ст. (Р0,0001) та скорочувальної активності серця. На 10-й хвилині перфузії швидкість скорочення і розслаблення міокарду складали відповідно 57% і 63% (Р0,05) від вихідного рівня. Одночасно КДТ підвищувався більш ніж у два рази. Як і в разі використання ФАО, перфузія з антиміцином призводила до різкого збільшення діастолічної жорсткості міокарду. Вже на 3-й хвилині перфузії з антиміцином А разом із пригніченням скорочувальної активності міокарду відбувалося вірогідне падіння коронарного потоку, а на 10 хвилині він зменшувався до 9,21,2 мл/хв, в порівняні з 16,81 мл/хв в контролі, Р0,05. Після припинення перфузії ізольованого серця з антиміцином А і переведенням його на контрольний розчин Кребса-Хензелейта пригнічення функціональної активності серця поглиблювалось, що свідчило про незворотній характер ушкоджень міокарда.

Найбільш виразних змін зазнавала під дією антиміцина А киснева вартість роботи серця, яка вірогідно збільшувалась більш, ніж у тричі - з 0,170,022 ммоль г^-1мм рт.ст.*10^-5 у контролі до 0,560,062 ммоль г^-1мм рт.ст.*10^-5 на 10-й хвилині відновлення перфузії розчином Кребса-Хензелейта після закінчення перфузії з антиміцином А..

Таким чином, перфузія ізольованого серця з активаторами МП - ФАО і антиміцином А- призводила до суттєвих і глибоких порушень коронарного потоку, скорочувальної функції міокарда та його кисневого обміну. Ці дані свідчать про можливість участі у розвитку порушень єдиного механізму, яким може виступати активація МП. Відомо, що схожий ефект має місце під час реперфузії серця після його тривалої ішемії, до того ж розвиток більшості реперфузійних пошкоджень пов'язують саме з відкриттям МП і дією тих речовин, які при цьому можуть виходити в цитозоль клітини[Griffiths et al., 1993; Kroemer et al., 1998; Halestrap, 2000]. Виключаючи вплив кардіо-кардіальних, кардіо-васкулярних рефлексів на стан серця, ми вирішили дослідити зміни кардіодинаміки, коронарного потоку і параметрів кисневого обміну, що відбуваються при ішемії-реперфузії, за умов перфузії серця сольовим розчином.

В наших дослідах тотальна ішемія протягом 20 хв та наступна реперфузія серця (n=9) призводили до зменшення тиску у лівому шлуночку (рис.1) і показників скорочувальної активності міокарду.

Відразу після закінчення ішемії, на перших хвилинах реперфузії ізольованого серця спостерігалась велика кількість екстрасистол - 250±57, (P<0,001) за перші 5 хвилин (рис.1). Починаючи з 4-5 хвилини після початку реперфузії ішемізованого серця тиск у лівому шлуночку та швидкість зростання тиску неухильно зменшувались по відношенню до вихідного рівня (Р_лш з 63,51,78 мм рт.ст. до 30,83,57 мм рт.ст. на 40-й хвилині реперфузії, (Р<0,01), величина dP/dt_max знижувалась у 1,5 рази на той же час). Аналогічна динаміка спостерігалась і для dP/dt_min. КДТ на 40-й хвилині збільшувався на 40,4 мм рт.ст. (Р<0,05).

Зареєстроване виразне зменшення тиску (з 63,51,78 мм рт.ст. до 30,83,57 мм рт.ст, Р<0,05) і параметрів скорочувальної активності міокарда (dP/dt_max і dP/dt_min знижувались у 1,5 рази) супроводжувалось зниженням коронарного потоку (з 14,01,32 мл в контролі до 9,5 1,16 мл на 40 хвилині реперфузії, (Р<0,006.)). Наведені результати вказують на те, що ішемія-реперфузія призводила до пригнічення скорочувальної функції міокарда ізольованого серця морської свинки, зменшення коронарного потоку і розвитку аритмій.

На 5-й хв реперфузії споживання кисню серцевим м'язом на 5 хвилині зменшувалося на 19%, а на 40-й хвилині воно складало 838,1% від вихідного рівня. Киснева вартість роботи серця вірогідно підвищувалась, починаючи з 10-ї хвилини реперфузії. На 40-й хв величина цього параметру становила 0,20,01 ммоль*г^-1мм рт.ст.*10^-5 , що на 82% більше, ніж у вихідному стані (0,110,005 ммоль г^-1мм рт.ст.*10^-5 (р<0.002)).

Таким чином, активатори МП - ФАО, антиміцин А та ішемія-реперфузія - призводили до порушення кардіодинаміки та скорочувальної активності міокарда, зменшення коронарного потоку. Це супроводжувалось зниженням споживання кисню та збільшенням кисневої вартості роботи серця.

Постішемічні порушення, які ми спостерігали протягом реперфузії, не були транзиторними, і показники скорочувальної активності серця не відновлювалися. Це свідчило про наявність певного невідомого фактора, який вивільнюється при дії активаторів МП і здатен спричиняти депресію міокарда.

Дослідження феномену вивільнення стабільного фактору при активації мітохондріальної пори. Перфузія другого серця розчином, зібраним за перші 5 хв реперфузії ішемізованого серця, приводила до зменшення тиску у лівому шлуночку - з 53,5±2,9 мм рт.ст. до 45,8±3,9 мм рт.ст. (Р< 0,001) через 5 хв. від початку перфузії - та параметрів скорочувальної активності міокарду. DP/dt_max. знижувалось з 1018±117 до 906 ±101 мм рт.ст./с (Р<0,02), а dP/dt_min. з 708±49 до 615±66 (Р<0,05). Перфузії другого інтактного серця розчинами, зібраними з 5-ї по 20-у і з 20-ї по 40-у хвилину реперфузії ішемізованого серця, також приводили до пригнічення скоротливої активності міокарда, але ступінь негативного впливу була значно меншою, ніж у першому випадку. Можна припустити, що концентрація стабільного депресорного фактору у відтікаючому розчині найбільша в перші хвилини реперфузії і з часом поступово зменшується.

Послідовна перфузія міокардіальної трабекули і артеріальної судинної смужки розчином, який був зібраний за перші 5 хв. репефузії ішемізованого серця, викликала значне падіння тонічного напруження як трабекули, так і судинної смужки на 2,36±0,3 мН і 2,24±0,32 мН, відповідно (рис.2).

Концентрація фактора, який вивільнювався з ішемізованого серця під час реперфузії, була максимальною в перші хвилини і зменшувалася з часом реперфузії. Стабільний фактор, який вивільнювався ішемізованим міокардом, здійснював гуморальний вплив не тільки на коронарну циркуляцію і скорочувальну активність серця, але і тонус периферичних судин. Інгібітор розчинної гуанілатциклази метиленовий синій майже повністю нивелював ефект розслаблення ізольованих препаратів під дією розчину, який збирали від ішемізованого серця під час реперфузії, що може свідчити про те, що в складі фактору є NO-вмісний компонент [Дмитриева и др., 2003].

Аналіз суспензій мітохондрій за допомогою HPLC показав наявність в них S-нітрозо сполук, спектр поглинання яких лежить в ультрафіолетовому діапазоні довжин хвиль з максимумом поглинання при =250 нм [Steffen et al., 2001]. Спектрофотометричне дослідження розчину, зібраному на 1-й хвилині реперфузії ішемізованого серця показало значне підвищення величини оптичної щільності поглинання в діапазоні довжин хвиль 230-260 нм з максимумом поглинання при =240-250 нм, амплітуда якого становила 0,110,014. Вимірювання проб, які були зібрані на 5-й, 20-й і 40-й хвилинах реперфузії, показали поступове зниження амплітуди абсорбції (рис.3).

Зростання оптичної щільності поглинання при =240-250 нм спостерігалося також у розчинах, які були зібрани під час перфузії серця з активаторами МП. В дослідах з ФАО максимальна амплітуда складала 0,030,01, а в експериментах з антиміцином А - 0,120,005. Таким чином ми з'ясували, що при дії індукторів МП на ізольоване серце морської свинки в коронарний потік вивільнюється стабільний фактор, амплітуду якого можна кількісно зареєструвати спектрофотометричним методом (рис.3). Цілком ймовірно, що джерелом вивільнення цієї речовини можуть виступати мітохондрії, а її вихід назовні відбувається під час активації МП.

Щоб повністю довести, що вихід стабільного фактору пов'язаний з активацією МП, треба встановити, чи може безпосередньо пригнічення МП попереджувати вихід фактору.

Вивчення впливу інгібіторів мітохондріальної пори на функціональну активність серця і вивільнення стабільного фактору при ішемії-реперфузії. При попередній перфузії ізольованого серця протягом 10-и хв класичним блокатором МП циклоспорином А перед ішемією параметри скорочувальної активності міокарда і максимальний тиск у лівому шлуночку досить стабільно трималися протягом усього часу реперфузії.

dP/dt_max знижувалась з 1441136 мм рт.ст./с до 116480 ммрт.ст./с, (Р0,05), тобто тільки на 19%. А dP/dt_min - з 103483 мм рт.ст./с до 69956 мм рт.ст./с, (Р0,05)). Коронарний потік зменшувався з 8,90,4 мл/хв до 6,70,7 мл/хв, (Р0,05), на 25%. В експериментах з попереднім введенням циклоспорину А кількість аритмій за перші 5 хвилин реперфузії становила 38±16, тоді як в контрольних умовах ця величина складала 250±57. Відсутність збільшення КДТ під час реперфузії в цій серії дослідів може бути ще одним свідченням на користь кращого функціонального стану серця.

На 40-ій хвилині реперфузії серця киснева вартість роботи зростала з 0,150,012 ммоль г^-1мм рт.ст.*10^-5 перед ішемією до 0,170,009 ммоль г^-1мм рт.ст.*10^-5, (Р0,05), що значно нижче, ніж у контролі.

Таким чином, застосування блокатора утворення МП циклоспорину А може попереджувати порушення функції серця в умовах ішемії-реперфузії і зберігати оптимальний кисневий режим.

При спектрофотометричному дослідженні перфузійного розчину, зібраного на першій хвилині реперфузії серця, премедикованого з циклоспорином А, спостерігалось збільшення амплітуди підвищення оптичної щільності поглинання при =240-250 нм на 0,0270,01, в той час як у серії експериментів без застосування блокатору МП ця величина складала 0,1120,014 (рис.4).

Таким чином, ми показали, що блокада відкриття МП може виступати одним з методів попередження або корекції реперфузійних пошкоджень міокарда [Сагач и др., 2003; Sagach et al., 2003]. Однак використання циклоспорину А для пригнічення МП в умовах цілого організму неприпустиме через його імунодепресантний вплив та низку негативних ефектів цього препарату.

Результати наших досліджень свідчать про те, що 20-ти хвилинна тотальна ішемія серця та наступна його реперфузія на фоні попередньої 10-и хвилинної перфузії з тролоксом призводила до менш виразного падіння ефективності споживання кисню міокардом під час реперфузії, ніж це було в серії експериментів без застосування препарату, а також до вірогідного зменшення кількості аритмій на перших хвилинах реперфузії та менш виразного падіння показників скоротливої функції міокарда при ішемії-реперфузії.

В наступній серії дослідів тролокс давали тваринам per os в дозі 10 мг/кг. Виявилось, що такий спосіб введення препарату є навіть більш ефективним, ніж його перфузія. Максимальний тиск у лівому шлуночку, на 5-й хвилині реперфузії серця знижувався на 21% (з 633,81 мм рт.ст. до 50,5 ± 6,6 мм рт.ст., Р < 0,002) по відношенню до вихідного значення та підтримувався на цьому рівні протягом 40 хвилин спостереження (у контрольних умовах на 40-й хвилині він зменшувався на 51.5%). Показники скорочувальної активності міокарда dР/dt_max і dР/dt_min на 40-й хвилині реперфузії складали відповідно 88% (1482 ± 128 мм рт.ст./с) та 85% (1257 ± 93 мм рт.ст./с) від вихідного рівня, проти 66% и 45% у контрольних умовах (рис.5). Індекс скоротливості Верагута протягом реперфузії вірогідно зростав з 65,6 ±3,4 сек^-1 до 75,6 ±4,0 сек^-1 (Р<0,005), а в контрольній серії експериментів мав тенденцію до зниження. Коронарний потік впродовж реперфузії ішемізованого серця поступово зменшувався, але лише на 30-й хвилині реперфузії ці зміни ставали вірогідними (у контрольній серії дослідів вже на 15-й хвилині було зареєстроване вірогідне падіння КП). На 40-ій хвилині спостереження коронарний потік складав 75% від вихідного рівня (Р<0,03), що значно вище, ніж в контрольній серії дослідів. Кількість екстрасистол за 5 хвилин реперфузії була менша, ніж у контрольних експериментах та складала 40,5±6,3 (Р <0,001). Проте їх було більше, ніж у випадку з попередньою перфузією тролоксу.

На відміну від контрольної серії, в якій вже на 10-й хвилині реперфузії киснева вартість роботи серця збільшувалась на 41% відносно вихідного рівня, при використанні тролоксу per os ефективність споживання кисню на цей час вірогідно не змінювалась відносно вихідних ії значень (рис.6). На 40-й хвилині реперфузії значення цього показника становило 0,160,028 ммоль г^-1мм рт.ст.*10^-5, що лише на 23% більше, ніж вихідна величина (0,130,011 ммоль г^-1мм рт.ст.*10^-5), (Р0,05)) (рис.6).

Таким чином, попереднє введення тролоксу призводило до попередження розвитку постреперфузійних порушень діяльності серця та кисневого обміну [Sagach et al., 2002]. Цей результат ще раз свідчить про те, що більшість реперфузійних пошкоджень можуть бути обумовлені активацією МП.

Застосування тролоксу призводило до зменшення амплітуди піку оптичної щільності поглинання розчину, зібраного на першій хвилині реперфузії ішемізованого серця, до 0,0460,01, тобто на 59% в порівнянні з контрольною реперфузією. Зменшення вивільнення фактора корелювало зі зниженням кількості екстрасистол та ступінню пригнічення функціональної активності серця під час його реперфузії. Аналіз результатів показав, що вірогідне зменшення амплітуди підвищення оптичної щільності поглинання під дією блокаторів МП, супроводжується значно меншим падінням як максимального тиску у лівому шлуночку, так і швидкості змін лівошлуночкового тиску (рис.7).

Коефіцієнт кореляції між амплітудою піка поглинання та величиною тиску у лівому шлуночку на 5-й хвилині реперфузії становив 0,987, а на 40-й хвилині 0,998. Аналогічні дані отримані при аналізі коронарного потоку і кисневої вартості роботи міокарда (рис.7). Для останньої коефіцієнт кореляції складав 0,977 на 5-й хвилині та 0,999 - на 40-й хвилині реперфузії.

Вивільнення стабільного мітохондріального фактору і пригнічення функції серця під дією активаторів МП з одного боку, та зменшення вивільнення стабільного фактора і послаблення реперфузійних порушень під час застосування блокаторів МП з іншого боку дають підстави стверджувати, що стабільний фактор, з великою ступінню ймовірності, вивільнюється у відтікаючий від серця розчин саме при активації МП. Отримані результати свідчать про те, що фактор можна використовувати в якості маркеру відкриття МП в умовах in situ.

Дослідження структури стабільного мітохондріального фактора і його визначення в умовах in vivo. Попередня перфузія (10 хв) скавенджеру глутатіону - діетілмалеату (ДЕМ) перед ішемією ізольованого серця усувало збільшення амплітуди піка оптичної щільності поглинання в розчинах, зібраних під час реперфузії. Це підтверджує наше припущення щодо вмісту нітрозоглутатіону у складі стабільного фактору. Дослідження з використанням дитиотриетолу та метиленового синього, що були проведені на ізольованих препаратах, показали, що депресорний фактор є NO-вмісною структурою.

Здатність фактору виходити з пошкоджених клітин при активації МП та його відносна стабільність в сольовому розчині дають підстави для дослідження можливості його реєстрації в кровотоці тварин і використання його в якості маркеру відкриття МП в умовах in vivo.

Оклюзія однієї з гілок лівої коронарної артерії (20 хв) і наступна реперфузія призводили до змін коронарного кровотоку, скорочувальної активності міокарда співставимих з отриманими в дослідах на ізольованому серці. У пробах крові, зібраних через 1-2 хвилини після відновлення кровотоку в одній з гілок лівої коронарної артерії амплітуда збільшення оптичної щільності поглинання сироватки складала 0,29±0,05, а у пробах, зібраних на 3 хвилині реперфузії міокарда відбувалось подальше зростання оптичної щільності до 0,31±0,06 (рис.8).

Розвиток порушень регіонарного кровообігу, обумовлений введенням ФАО (0,4 мг) в стегнову артерію, супроводжувався появою СМФ в пробах крові, зібраних зі стегнової вени при відновленні кровотока. Амплітуда підвищення оптичної щільності поглинання в даному випадку становила 0,24±0,021 (рис.8). Тобто активація МП в басейні стегнової артерії призводила до порушення регіонарної гемодинаміки і вивільнення СМФ.

Наведені результати свідчать, що вивільнення СМФ відбувається не тільки при активації МП в серці, а й в інших тканинах. Це говорить про універсальність фактору, який можна використовувати як маркер активації МП в різних типах тканин.

IV. Заключення

В публікаціях останнього часу показано, що активація МП виступає ключовою ланкою в розвитку реоксигенаційних, реперфузійних і токсичних пошкоджень міокарда [Crompton, 1999; Halestrap, 2002; Lemasters et al., 2002]. Показано, що відкриття МП супроводжується деполяризацією мітохондріальної мембрани, порушенням синтезу і транспорту АТФ, а також вивільненням із мітохондрії в клітину цілого ряду факторів (цитохрому С, фактору індукції апоптозу, прокаспаз) і експресії апоптотичних білків родини Bcl-2, які через каскад внутрішньоклітинних біохімічних перетворень приймають безпосередню участь у механізмах, що можуть вести до апоптозу або некрозу клітини. На теперішній час досить грунтовно вивчений вплив активації МП лише на клітину, бо усі існуючі методики визначення активації МП пов'язані з деструкцією тканини до рівня клітини і навіть органел [Griffiths et al., 1995; Brookes et al., 2000], що робить неможливою реєстрацію активності МП на органному, а тим більше на організменому рівні.

В нашому дослідженні було проведено вивчення впливу активації МП на діяльність ізольованого за Лангендорфом серця та його кисневі режими.

Показано, що активатори МП ФАО і антиміцин А пригнічували функціональну активність ізольованого серця. Перфузія ізольованого серця цими препаратами викликала розвиток акрітмій. Характер депресії скорочувальної активності міокарду свідчив про значне ураження серця. Зменшення коронарного кровотоку в цих умовах відбувалося внаслідок виразної коронароконстрикції. Ефективність споживання кисню знижувалась під дією активаторів МП в декілька разів. Це могло свідчити про генералізацію окислювальних процесів і розвиток вільно-радикального вибуху внаслідок розриву електронно-транспортного ланцюгу мітохондрій.

Використання хімічних активаторів МП є селективним впливом, однак дещо штучною моделлю для вивчення ролі МП в діяльності серця, тому ми вирішили перевірити наші висновки в експериментах з використанням більш природнього активатора МП - ішемії-реперфузії ізольованого за Лангендорфом серця.

Зміни в діяльності ізольованого серця під час ішемії-реперфузії були аналогічні до тих, що мали місце при застосуванні ФАО і антиміцину А. Характер пригнічення скорочувальної активності міокарду і коронарного кровотоку свідчили про значне ураження серця, яке розвивалося в умовах ішемії-реперфузії. Збільшення кисневої вартості роботи серця відбувалося внаслідок неефективного використання кисню, яке можливо було пов'язане з пошкодженням мітохондрій.

Аналіз отриманих даних показав, що усі три активатори МП призводили, по суті, до схожих негативних змін в діяльності ізольованого серця. Таким чином, пригнічення функціональної активності ізольованого серця може відбуватися внаслідок процесів, які мають місце під час активації МП.

Пригнічення скорочувальної функції не відновлювалось після припинення перфузії ізольованого серця активаторами МП, а також протягом реперфузії, що може свідчити про наявність незворотніх змін, які відбувалися в серці під час активації МП. На основі цих фактів можна припустити, що саме з мітохондрій можуть вивільнюватися потужні речовини, які здатні ініціювати описані пошкодження. В літературі зустрічаються вказівки на те, що під час активації МП в цитозоль клітини виходить величезна кількість активних речовин, як добре відомих, так і тих, роль яких поки що до кінця не вивчена [Patterson et al., 2000; Ravagnan et al., 2002; Von Loo et al., 2002].

Результати наших досліджень показують, що розчин, зібраний за перші 5 хв реперфузії призводив до пригнічення Р_лш і першої похідної лівошлуночкового тиску другого послідовно перфузованого серця, а перфузія ізольованих міокардіального і судинного препаратів тим же розчином призводила до різкого падіння тонічного напруження попередньо активованих міокардіальної трабекули і судинної смужки. Перфузія препаратів розчином, зібраним протягом 5-20 хв і 20-40 хв мала менш виразний ефект. Дослідження довели, що діюча речовина зібраного розчину досить стабільна і здатна зберігати свою кардіодепресорну активність протягом доби. Таким чином, встановлено, що під час реперфузії у сольовий розчин, відтікаючий від ізольованого серця, вивільнюється стабільний фактор. Природа цього кардіодепресорного фактору поступово вивчається [Felix et al., 1997], однак точно можна стверджувати, що вивільнення цієї речовини відбувається при пошкодженні клітин внаслідок активації МП. Подальші дослідження, проведені на ізольованих препаратах, показали, що депресорний фактор, що виходить із ішемізованого серця - може бути NO-вмісною структурою. Перфузія ізольованих препаратів, попередньо оброблених метиленовим синім, розчином, зібраним за 5 хв реперфузії, викликала лише незначне зниження тонічного напруження. Наведені данні свідчили про те, що до складу фактору входить NO-вмісний компонент, а стабільність фактору вказувала наявність нітрозотіольних сполук [Дмитриева и др., 2003].

Аналіз суспензії мітохондрій за допомогою HPLC показав наявність нітрозосполук, які можна реєструвати спектрофотометрично в ультрафіолетовій області спектру [Steffen et al., 2001]. Спектрофотометричний аналіз зібраних елюатів показав, що на першій хвилині реперфузії ішемізованого серця у розчині, відтікаючому від ізольованого серця, спостерігалося виразне збільшення амплітуди оптичної щільності поглинання в діапазоні довжин хвиль 230-260 нм з максимумом при =240-250 нм. Вимірювання розчинів, відібраних протягом наступних 40-хв реперфузії, показало неухільне зменшення амплітуди оптичної щільності, що могло свідчити про зниження концентрації стабільного фактору. Аналогічні результати були отримані при спектрофотометричному аналізі елюатів, зібраних під час впливу ФАО і антиміцину А. Це може вказувати на те, що зареєстрована сполука або сполуки можуть виходити у відтікаючий розчин під час активації МП. Подальші дослідження показали, що мітохондріальний фактор є досить стабільною речовиною.

Спектрофотометричний аналіз розчинів, зібраних під час реперфузії ішемізованого серця в умовах попередньої перфузії блокатором МП - циклоспорином А, показав, що амплітуда піка оптичної щільності поглинання зменшувалась більш, ніж в три рази у порівнянні з контрольними дослідами. Це може свідчити про те, що блокада МП за допомогою циклоспорину А пригнічувала вивільнення стабільного фактору.

Наші результати були підтвержені данними, отриманими в біохімічних дослідженнях у відділі фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця [Сагач та інш., 2003]. В дослідах in vitro на ізольованих мітохондріях із сердець морських свинок і щурів було показано, що ФАО і аноксія/реоксигенація суспензії мітохондрій індукували, а циклоспорин А пригнічував вивільнення досліджуваного стабільного фактору. Отримані результати прямо свідчили про мітохондріальне походження СМФ, а також причетність активації МП до процесу утворення і вивільнення фактору.

Таким чином, в результаті наших досліджень встановлено, що активація МП приводить до пригнічення функції ізольованого серця і цей процес супроводжується вивільненням мітохондріального стабільного фактору. Блокатори активації МП усували появу досліджуваного фактору. Одночасно блокатори активації МП позитивно впливали на зміни фізіологічних показників роботи серця під час його реперфузії.

В проведених дослідженнях показано, що попередня перфузія з циклоспорином А сприяла відновленню функції серця під час реперфузії після ішемії, причому протекторний ефект спостерігався не тільки за параметрами кардіодинаміки і скорочувальної активності серця, а й показниками кисневого обміну. Наші результати узгоджуються з літературними данними [Griffiths et al., 2003].

З іншого боку, потужний антиоксидант водорозчинний вітамін Е - тролокс може також ефективно блокувати МП за іншим механізмом, ніж циклоспорин А [Sagach et al., 2002]. В наших дослідженнях показано, що тролокс ефективно відновлював діяльність ішемізованого ізольованого серця під час його реперфузії. Перфузія серця з цим препаратом призводила до більш ефективного споживання кисню міокардом, ніж це було в контрольній серії експериментів, а також до вірогідного зменшення кількості аритмій на перших хвилинах реперфузії та меншого пригнічення скоротливої функції міокарда під час ішемії-реперфузії. Спектрофотометричні дослідження показали, що тролокс також зменшував амплітуду піку оптичної щільності поглинання розчину, зібраного на першій хвилині реперфузії, майже на 60% в порівнянні з контрольною реперфузією.

Беззаперечною перевагою тролоксу перед циклоспорином А була відсутність негативних побічних ефектів. Механізм, за яким відбувається пригнічення МП при введенні тролокса, може полягати в його антиоксидантних властивостях [Zorov et al., 2000].

Рівень депресії функції серця під час активації МП і можливість відновлення його нормальної діяльності при застосуванні інгібіторів МП корелює з величиною піка поглинання, а значить і з його концентрацією. Це вказує на те, що визначений нами СМФ можна використовувати як кількісний маркер пошкодження клітин під час активації МП в умовах in situ. Запропонований нами метод дозволяє за допомогою досить доступного спектрофотометричного аналізу розчинів характеризувати активність МП одночасно з реєстрацією фізіологічних показників.

Масспектрометричні вимірювання суміші, отриманої після леофілізації рідини, відтікаючої від ішемізованого серця, показали, що в розчині присутній цілий спектр невизначених речовин. “Розмитий” спектр елюатів в ультрафіолеті вказує на те, що зареєстрований спектрофотометрично стабільний фактор - це, можливо, коньюгат кількох речовин. Як показали наші дослідження, попередня перфузія серця з скавенджером глутатіону - діетілмалеатом перед відтворенням ішемії усувала збільшення амплітуди оптичної щільності поглинання в розчинах, зібраних під час реперфузії ішемізованого серця. Розчин, відтікаючий від ішемізованого ізольованого серця під час реперфузії, не спричиняв глибокої дилатації суперфузованих ізольованих міокардіального і судинного препаратів при їх послідовній електричній стимуляції. Наведені дані підтверджують наше припущення щодо присутності нітрозоглутатіону або нітрозосполуки у складі СМФ.

Пригнічення функції серця під час його ішемії/реперфузії в умовах цілісного організму також супроводжувалося вивільненням у кровоток СМФ, що може бути, з одного боку свідченням прямої активації МП, а з другого, своєрідним кількісним маркером пошкодження міокарда.

Активація МП за допомогою ФАО в басейні стегнової артерії призводила до порушення регіонарної гемодинаміки і вивільнення СМФ. В цьому випадку слід підкреслити, що СМФ може бути маркером оксидативного пошкодження неміокардіальних клітин.

Наведені результати свідчать, що вивільнення СМФ відбувається під час тривалої активації МП не тільки в серці, а й в інших тканинах. Це може вказувати на те, що СМФ можна використовувати як маркер вільнорадикального пошкодження клітин різних типів тканин, ініційованого активацією МП.

ВИСНОВКИ

Перфузія ізольованого за Лангендорфом серця з активаторами мітохондріальних пор ФАО і антиміцином А призводила до порушень скорочувальної активності міокарда, зменшення коронарного потоку та підвищення кисневої вартості роботи серця. Ішемія/реперфузія призводила до подібних змін скорочувальної активності міокарда, коронарного потоку та кисневої вартості роботи серця.

Порушення функціональної активності міокарду супроводжувалися вивільненням у відтікаючий від серця розчин стабільного мітохондріального фактору, який зареєстрований спектрофотометрично в ультрафіолетовій ділянці спектру в діапазоні довжин хвиль 230-260 нм з максимумом =240-250 нм.

Інгібітори МП - циклоспорин А і водорозчинний вітамін Е- тролокс - ефективно усували порушення функції ізольованого серця під час реперфузії після ішемії протягом 20-и хв. Це супроводжувалось вірогідним зменшенням амплітуди піка оптичної щільності поглинання у відтікаючому розчині на першій хвилині реперфузії в порівнянні з контрольною серією.

Пригнічення функції серця в умовах реперфузії, яке супроводжувалось вивільненням СМФ, а також корекція реперфузійної депресії міокарда за допомогою інгібіторів мітохондріальної пори і зменшення в цих умовах амплітуди піку оптичної щільності поглинання свідчать, що СМФ вивільнюється у коронарний потік з мітохондрій при активації МП, ступінь пригнічення функціональної активності серця та можливість її попередження корелює з величиною піка оптичної щільності, тобто і з концентрацією СМФ в ньому. Це вказує на те, що СМФ можна використовувати як маркер відкриття МП в умовах ізольованого серця.

В умовах цілісного організму пригнічення функції серця під час ішемії/реперфузії однієї з гілок лівої коронарної артерії супроводжувалося вивільненням СМФ в коронарний кровоток з максимумом на 3 хв. реперфузії. Активація МП за допомогою ФАО в басейні стегнової артерії супроводжувалась вивільненням СМФ у кровоток, що свідчить про активацію МП за умов in vivo і пошкодження м'язових тканин. Отримані дані вказують на можливість його використання як маркера активації МП в цілісному організмі.