Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

Половинкина Е.О., Синицына Ю.В.

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И ОСОБЕННОСТИ ВОЗДЕЙСТВИЯ

СЛАБЫХ СТРЕССОРОВ ФИЗИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ НА ПЕРЕКИСНЫЙ ГОМЕОСТАЗ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ННГУ, обучающихся по направлению подготовки «Биология».

Нижний Новгород

2010

УДК 57.053

ББК 28.0

П- Половинкина Е.О., Синицына Ю.В. Окислительный стресс и особенности воздействия слабых стрессоров физической природы на перекисный гомеостаз растительной клетки. Учебно-методическое пособие. - Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2010. - 62 с.

Рецензенты:

В настоящем пособии изложены теоретические основы учения о стрессе, а также стрессовой реакции растений на клеточном уровне. Рассмотрены современные биохимические аспекты перекисного гомеостаза и освещены результаты исследований воздействия слабых стрессоров физической природы - низкоинтенсивной ионизирующей радиации и электромагнитного излучения - на перекисный гомеостаз растительной клетки.

Учебно-методическое пособие предназначено для углубленного изучения отдельных глав биохимии и физиологии растений для студентов, специализирующихся в области биохимии и физиологии. Может быть использована аспирантами, проходящими подготовку по специальностям «Биохимия» и «Физиология растений», а также теми, чья научная деятельность связана с исследованиями в области окислительного стресса.

УДК 57.053

ББК 28.0

©Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 2010

ОГЛАВЛЕНИЕ

Глава 1. Прооксидантно-антиоксидантный гомеостаз клетки как система восприятия внешних воздействий

1.1 Общие положения теории стресса

1.2 Особенности стресса у растений

1.3 Перекисный гомеостаз в свете учения о стрессе

1.4 Активные формы кислорода: образование, химизм, реакционная способность

1.5 Перекисное окисление

1.6 Антиоксидантная система клетки

Глава 2. Особенности восприятия слабых стрессоров физической природы растительной клеткой

2.1 Воздействие низкоинтенсивной ионизирующей радиации: эффекты малых доз

2.2 Воздействие низкоинтенсивного магнитного поля на перекисный гомеостаз клетки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРА

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

Глава 1. Прооксидантно-антиоксидантный гомеостаз клетки как система восприятия внешних воздействий

1.1 Общие положения теории стресса

Слово «стресс» нам хорошо знакомо из бытовых ситуаций - в современной жизни мы его часто испытываем, когда состоялся неприятный разговор с руководителем или во время экзамена, или когда какая-то машина окатила нас из лужи грязной водой, когда проголодались, а в буфете под конец дня ничего вкусного не осталось. Все эти неприятные ситуации повергают нас в определенное эмоциональное состояние, которые мы подсознательно правильно идентифицируем и называем стрессом. Стресс изучается на всех уровнях проявления жизни, начиная с клеточного.

Любой организм, многоклеточный или одноклеточный, являясь частью живой материи, обладает всеми ее свойствами, а значит является открытой системой, то есть обменивается с окружающей средой - веществами, энергией и информацией. Однако, в этих условиях, как целому организму, так и клетке свойственно также и постоянство внутренней среды. Эту способность живого Клод Бернар назвал гомеостазом.

Нам известны основные параметры клеточного гомеостаза, это: ассимиляция питательных веществ: белков, углеводов, жиров, минеральных веществ и воды; диссимиляция тех же веществ, температура цитоплазмы, транспорт продуктов метаболизма, кислотность среды и др. В нормальных условиях окружающей среды, то, что мы называем оптимальными, все эти показатели колеблются в определенных пределах - физиологически нормальных - это норма реакции. Это возможно благодаря системе саморегуляции клетки. Изменения в пределах этой узкой зоны - зоны благополучия, гормезиса, привычны для организма, не вызывают существенных изменений внутренней среды и целиком укладываются в понятие покойной жизнедеятельности. Другими словами условием гомеостаза является гомокинез - подвижное равновесие параметров внутренней среды ритмической природы. Физиологический покой подвижен и динамичен и возможен только когда организм получает из среды все необходимые для жизнедеятельности вещества, энергию и информацию, и когда в этой среде отсутствуют какие-либо факторы, угрожающие покойному существованию, когда в самом организма нет никаких повреждений и нарушений. Но как только клетка сталкивается с экстремальными условиями, выходящими за зону ее толерантности (устойчивости) резервов этих систем саморегуляции становится уже недостаточно для поддержания гомеостаза. Здесь подключаются резервные системы, предназначенные обеспечить выживание клетки в аварийных ситуациях и даже адаптировать (приспособить) клетку к этим новым условиям.

Клетка переходит в новый режим функционирования - напряженная жизнедеятельность - стресс.

Датой рождения учения о стрессе принято считать 1936 год, когда канадский физиолог и фармаколог Ганс Селье опубликовал свои первые работы о неспецифическом общем ответе организма на вредные воздействия - повреждения и интоксикации. Ученый обнаружил, что при действии на организм различных раздражителей наблюдаются не только специфические реакции, но и неспецифические, которые были определены как адаптивные для целостного организма, направленные на сохранение постоянства состава внутренней среды или гомеостаза. Для всех живых организмов способность к приспособлению - одна из важнейших черт жизни. Адаптация всегда является результатом специальной концентрации усилий (stress (англ.) - напряжение, усиление, давление). Любопытно, что сначала сам Ганс Селье исключил их своей рукописи термин стресс и использовал другое определение:

Общий адаптационный синдром (стресс) - это общий неспецифический ответ организма на вредоносные воздействия.

Будучи студентом второго курса, Селье пришел к выводу о существовании синдрома «just being sick» (просто быть больным), то есть разные болезни имеют много общих симптомов. Симптомы эти получили название «триада Селье». Г. Селье показал, что при действии на организм стрессового раздражителя происходит возбуждение нервной системы, железа гипофиз, расположенная на нижней поверхности головного мозга, увеличивает секрецию адренокортикотропного гормона. С кровотоком этот гормон попадает к другой парной железе - надпочечникам, кора которых начинает выделять в кровь в большом количестве гормоны-кортикостероиды, образуя их из собственных липидов. Мозговое вещество надпочечников выделяет адреналин. Эти гормоны стимулируют выработку энергии, которая поможет организму приспособиться к изменившимся условиям среды. Выделение кортикостероидов приводит к торможению воспалительных реакций за счет угнетению иммунной системы, которое выражается в сморщивании вилочковой железы (тимуса) и сопутствующей атрофии лимфатических узлов. Адреналин повышает содержания глюкозы (легкодоступного источника энергии) в крови за счет расщепления запасного углевода печени - гликогена, также усиливает расщепление белков и ускоряет все обменные процессы в тканях организма. Другое последствие повышенного содержания кортикостероидов в крови - образование язвочек пищеварительного тракта (в желудке и кишечнике).

Итак, общая физиологическая реакция организма при стрессе, которую обнаружил Ганс Селье, получила название триады Селье, и включает последовательно сменяющиеся стадии:

1. исчезновение липидов из надпочечников и увеличение коркового слоя;

2. инволюция тимуса, лимфоузлов, жировой ткани;

3. изъязвление ЖКТ.

Развивая свою теорию, Г. Селье обнаружил, что наряду с колебаниями внешней среды, психологические, эмоциональные, психосоциальные факторы также могут вызвать стресс. Таким образом, Селье обобщил концепцию стресса, подразумевая под ним любую угрозу гомеостазу. Сейчас эти два стресса разделены: есть стресс психоэмоциональный, а есть соматический (физиологический или биологический).

Первоначально общий синдром адаптации представлялся реакцией, присущей лишь человеку и высшим животным. Постепенно применение термина «стресс» расширилось и биологи применяют его для характеристики общих реакций на изменения окружающей среды на всех эволюционно-таксономических уровнях. Также в обиход биологов прочно вошло понятие клеточного стресса. Только за период 1991-2000 г.г. в самых разных областях науки от молекулярной биологии до психологии и педагогики опубликовано 69000 работ, в которых ключевым словом является «стресс».

Итак, на стресс на любом уровне характеризуется следующей последовательностью реакций. Начинается стресс стадией тревоги (alarm - реакции), во время которой мобилизуются защитные силы клетки, но резистентность (сопротивляемость) к стрессору падает ниже нормы. Причем, если реакция оказывается слишком сильной, то организм погибает уже на этой стадии. На этапе тревоги стресс запускает адаптивные функции - на физиологическом уровне - прежде всего в мозге, откуда сигнал передается к системам регуляции - к исполнительным органам, а на клеточном уровне - активирует экспрессию стрессовых генов.

В ходе длительного нелетального воздействия наступает фаза адаптации, или резистентности - сопротивляемость организма возрастает, негативные симптомы стадии тревоги угасают, возрастает анаболическая активность - достигается состояние равновесия в присутствии стрессора. Продолжение или прекращение действия слабого стрессора означает выход из состояния стресса. Повторное действие слабых стрессоров ускоряет процесс их преодоления, тренирует защитные механизмы.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Три фазы общего адаптационного синдрома по Г. Селье (1979):

А) стадия тревоги; Б) фаза резистентности; В) фаза истощения

И, наконец, если действие стрессорного агента продолжается и достигнутая адаптация оказывается недостаточной, то происходит истощение живой системы. Симптомы этой фазы похожи на те, что имеют место на стадии тревоги: сопротивляемость падает и организм умирает.

Таким образом, биологический смысл и назначение стресса - повысить общую сопротивляемость, резистентность, неспецифическую устойчивость живой системы по отношению к действующему стимулу и другим стрессовым факторам. В биофизике существует представление о клетке, как биологическом триггере. В.А. Веселовский исследовал стрессовую реакцию растительной клетки и рассматривает стресс, как новое устойчивое состояние, возникающее при запороговой напряженности возмущающего фактора. Переключение клетки в новый режим функционирования - «катастрофа» или перестройка системы происходит при получении сигнала. Предполагается, что сигналом для запуска стресс-реакции может служить некое стереотипное изменение внутренней среды клетки - смещение гомеостаза.

По представлениям Г. Селье, воздействие самых разнообразных стрессоров индуцирует в организме образование (высвобождение) некоего первичного медиатора стресса - того общего звена, с которого начинается стереотипный стресс-ответ живой системы. На клеточном и субклеточном уровне этот первичный медиатор может иметь лишь очень простую природу и возникать с максимальной быстротой.

Стресс-ответ включает более 1400 физиолого-биохимических изменений. Эти изменения активируются в разной степени и в разные периоды стресса, но далеко не все из них можно рассматривать как характерные признаки стресса. Идеальный маркер стресса должен быть:

1. патогенетически связан со стресс-реакцией;

2. не должен часто вызываться нестрессовыми факторами (такими как пол, возраст);

3. иметь длительное время жизни;

4. иметь связь со стрессором (наличие или отсутствие зависимости доза-эффект, корректность связи - появление маркера вслед за стрессором) и т.п.

Одним из наиболее постоянных спутников стресса является окислительный стресс - следствие смещения окислительно-восстановительного равновесия клетки в сторону активации окислительных процессов. Окислительный стресс сопровождает каждое увеличение напряжения в организме.

1.2 Особенности стресса у растений

Изначально стрессовая реакция исследовалась на животных. Однако в настоящее время убедительно показано, что у большинства растений под действием самых различных неблагоприятных факторов, как правило, развивается цепочка сходных неспецифических адаптационных реакций, совокупность которых, с целью подчеркнуть наличие специфических черт, получило название фитостресса.

Факторы, способные вызвать стресс у растений, можно подразделить на три основные группы: физические (недостаточные или избыточные влажность, освещенность, температура, механические воздействия, радиоактивное излучение, аноксия), химические (соли, газы, ксенобиотики, промышленные отходы и биологические (поражения возбудителями болезней или вредителями, отрицательное влияние животных, голодание и др.).

Чаще всего фитостресс проходит через три фазы, однако в современной физиологии растений существует множество терминов для обозначения одних и тех же стадий неспецифического адаптационного синдрома. Процессы, совершающиеся в клетке на стадиях тревоги и адаптации прямо противоположны: на стадии тревоги преобладают реакции распада различных соединений, а на стадии резистентности - процессы синтеза.

При сопоставлении фаз триады у растений и животных наибольшее сомнение возникало в идентичности первой фазы. Судя по доминирующим в ней реакциям, она не могла быть названа фазой тревоги. Начальную стадию называют стадией повреждения (Удовенко, 1977), реакцией защитного торможения метаболизма, первичной стрессовой реакцией, фазой физиологической депрессии (Пахомова, 1995), стадией активного состояния (Гордон, 1992), индуктивной фазой (Пахомова, Чернов, 1996).

Наиболее ранними процессами, происходящими на первой фазе, являются повышение проницаемости мембран и выход из клетки различных веществ, нарушение окислительного фосфорилирования и развитие свободнорадикальных реакций, выход Са2+ в цитоплазму, деполяризация мембран и генерация потенциалов на мембране, снижение интенсивности фотосинтеза, увеличение синтеза стрессовых гормонов этилена и абсцизовой кислоты, снижение содержания ауксинов и гиббереллинов.

Самой уязвимой структурой, в первую очередь повреждаемой при стрессе, являются мембраны. Значение клеточных мембран в развитии стресс-реакции обусловливается тем, что на ней расположено большое количество рецепторов для фитогормонов и элиситоров. В клетке есть несколько систем передачи информации. Общая картина передачи информации от внеклеточного сигнала к эффектору пока до конца не изучена. В основе всех форм внутриклеточной регуляции лежит единый принцип: белковая молекула-рецептор «узнает» специфический для нее фактор, и, взаимодействуя с ним, изменяет свою конфигурация. Существует 3 основных типа рецепторов, интегрированных во внешнюю клеточную мембрану:

1. рецепторы, сопряженные с G-белками;

2. рецепторы, ассоциированные с ферментами;

3. рецепторы-ионные каналы.

Одной из ранних ответных реакций организма на действие стрессовых факторов является изменение состава отдельных классов липидов, текучести мембран. Увеличивается проницаемость мембран в результате изменения молекулярного состава их компонентов. Это приводит к обратимому выходу ионов калия из клетки и входу ионов кальция из клеточной стенки, вакуоли, ЭПР, митохондрий.

Одним из наиболее ранних проявлений стрессовой реакции являются изменения разности электрических потенциалов на плазмалемме, которые включают ряд стадий, соответствующих фазам процесса адаптации по Г.Селье. Первоначальное снижение потенциала действия (ПД) после латентного периода сменяется фазой адаптивной реполяризациии, а при сильном действии фактора наступает глубокая деполяризация. Генерация ПД сопровождается активацией электрогенного Н+-насоса плазматической мембраны, что является первичным неспецифическим процессом, происходящим в клетках при действии самых разнообразных факторов: механической деформации, света, температурного воздействия, химической и электростимуляции, электромагнитных волн.

Несомненную роль в развитии клеточных адаптационных реакций играет Са2+, как вторичный мессенджер. Предполагается участие Са2+ в генерации потенциала действия у растений, что может быть одним из механизмов передачи сигнала о стрессе. При различных неблагоприятных воздействиях в цитоплазме значительно возрастает доля свободного кальция, приводя к деполяризации мембран и активации НАДФН-оксидазы, в результате чего происходит усиление продукции АФК и в дальнейшем увеличение проницаемости мембран, приводящее к массивному выходу электролитов.

Увеличение проницаемости мембран и торможение H+-АТФ-азы ведут к закислению цитоплазмы. Снижение pH цитоплазмы способствует активации гидролаз, большинство который имеет оптимум pH в кислой среде. В результате усиливаются процессы распада полимеров, направленных, в частности, на деполимеризацию макромолекул и, таким образом, на обеспечение необходимого для создавшихся условий пула низкомолекулярных соединений: моносахаридов амидов, аминокислот и полиаминов, карнозина, свободных жирных кислот и окисленных производных ненасыщенных жирных кислот, неорганического фосфата и продуктов деградации адениновых нуклеотидов и других соединений, которые выполняют очень разнообразные функции.

Мономерные соединения могут служить субстратом для синтеза стрессовых белков, фитогормонов и др. Мономеры используются в качестве субстратов дыхания, с чем связывают их энергетическую роль.

Низкомолекулярные углеводы способны связывать свободные радикалы, предотвращая индуцируемые ими окислительные процессы и активно используются в энергетических процессах. Пролин стабилизирует белки, полирибосомы, мембраны, защищает ферменты, регулирует рН цитоплазмы в условиях стресса.

Такие мономеры, как моно- и олигосахариды, аминокислоты, прежде всего пролин, бетаин, связывают воду, что особенно важно для сохранения внутриклеточной воды при повышении проницаемости мембран и облегчении выхода воды из клетки.

Полиамины способны поддерживать нативную структуру нуклеиновых кислот, стабилизировать мембраны и перехватывать радикалы. Академик И.А. Тарчевский (2001) говорит об энергетической, о корректирующей функции продуктов биодеградации, которые способны устранять биополимеры с «неправильной структурой» и участвовать в синтезе наиболее востребованных в условиях стресса биополимеров.

Имеется информация о том, что продукты деградации белков и липидов обладают свойствами активаторов и ингибиторов процессов метаболизма, оказывая влияние на рост и морфогенез растений.

Дыхание вначале активируется, однако следствием усиления катаболических процессов при развитии адаптационного синдрома является разобщение окислительного фосфорилирования с дыханием, что происходит, по-видимому, из-за изменений в митохондриальной мембране или из-за недостаточной обеспеченности компонентами, например, фосфатами, снижается уровень АТФ.

При стрессовом воздействии происходит нарушение и мембран хлоропластов, изменяется фотосинтетическая функция к клетке, что приводит к сдвигу в обмене веществе в целом. Наиболее чувствительными к стрессу оказываются фотохимические процессы, происходящие в тилакоидных мембранах - фотоокисление воды, поглощение световой энергии светособирающими комплексами, электронный транспорт, работа НАДФ-редуктазы. Имеются данные о перераспределении углерода из CO2, усвоенного в процессе фотосинтеза: уменьшается включение метки в высокополимерные соединения (белки, крахмал) и сахарозу и увеличивается включение в аланин, малат, аспартат.

Тормозится синтез белка, изменяется конформация белковых молекул. Происходит дезинтеграция полисом, информационные РНК «дострессовых» белков гидролизируются или взаимодействуют с особыми белками, образуя «стрессовые гранулы» в цитоплазме. Тормозятся процессы транскрипции и репликации. Активируется сборка элементов цитоскелета, что приводит к увеличению вязкости цитоплазмы. Вместе с тем на этом этапе происходят экспрессия репрессированных генов и синтез ряда белков и стабилизация метаболизма при стрессе обеспечивается благодаря индукции синтеза стрессовых белков, снижающих уровень опасных метаболитов. При этом под стресс-белками понимаются не только специализированные пептиды, подобные белкам теплового шока (БТШ), но и другие протеины (например, ферменты антиоксидантной защиты, сдерживающие липопероксидацию в мембранах), синтез которых активируется в экстремальных условиях. Индукция белков стресса достигается в системе за счет отключения транскрипции генов белков нормы. Одновременно, посредством модификации универсального фактора репрессии, формируются механизмы, обеспечивающие автоматическое возвращение системы в режим нормы после прекращения стрессирующего воздействия. Появление стрессовых белков у растений отмечено при различных влияниях в условиях анабиоза, разобщении окислительного фосфорилирования, при осмотическом шоке, действии абсцизовой кислоты, пониженной и повышенной температурах. Во всех этих случаях синтезируются сходные белки, которые условно делят на две группы:

1) белки стресса, синтез которых резко увеличивается в ответ на шоковое воздействие;

2) белки адаптации, кодируемые генами с медленной экспрессией и синтезирующиеся в течение длительного времени. При этом многие белки, вероятно, должны входить в обе группы.

Большинство стрессовых белков, синтезирующихся у эукариот, делят на 2 класса: высокомолекулярные (БТШ 100, 90, 70 и 60) и малые (15-30 кДа), при этом у растений преобладают именно малые БТШ. Все растительные малые БТШ кодируются ядром и локализуются в различных клеточных компартментах.

Одной из функций БТШ является создание гранул теплового шока. Тепловой шок активирует синтез такого важного белка как убиквитин, ковалентно связывающегося с денатурированными белками, которые впоследствии разрушаются специальной АТФ-зависимой протеазой. При гипертермии показано ассоциация мБТШ с мембранами тилакоидов, по-видимому для предотвращения окислительной модификации данных органелл. Распространено мнение, что большинство БТШ, особенно высокомолекулярные, относятся к белкам - шаперонам. Они могут предотвращать ошибки в процессе синтеза белка, осуществлять транспорт белков, образовывать многокомпонентные белковые комплексы, предотвращать нежелательные связи в клетке между макромолекулами.

Таким образом, катаболическая фаза стресса играет важную роль в неспецифическом адаптационном синдроме растений, не только предшествуя адаптации к изменениям условий среды, но и играя в ней активную роль. Накапливающиеся в ходе катаболизма вещества способны оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие. По концепции о защитно-адаптивном снижении функциональной активности клеток на начальном этапе действия стрессора, в процессе эволюции клетки приобрели способность в неблагоприятных условиях переводить свой метаболизм на аварийный режим, при котором происходит сужение метаболической активности для сохранения потенциала клеток для последующей репарации.

Вторая фаза адаптационного синдрома растений - фаза адаптации - характеризуется снижением гидролитических и катаболических процессов, восстановлением физиологических параметров и структур. В этот период может наблюдаться возрастание поглотительной способности клеток и катион-зависимых АТФаз, мембранного потенциала, уровня АТФ и восстановительных эквивалентов, общего и фракционного содержания белка и нуклеиновых кислот, стимуляция образования полисом, увеличение активности сукцинатдегидрогеназы, СОД, этиленобразующего фермента, накопление крахмала, сахарозы, увеличение цианид-резистентного дыхания. Эта фаза в теории фитостресса получила название состояния гетеростаза, энергезированного состояния или суперкомпенсации. Таким образом, в организме растения восстанавливается интенсивность фотосинтеза, дыхания, ростовых процессов, то есть происходит переход на новый режим жизнедеятельности, способствующий формированию приспособительных реакций.

Вопрос о специфичности адаптации растений к разным факторам является дискуссионным. Сторонники одной точки зрения считают, что при неблагоприятных условиях комплекс адаптивных реакций, протекающих в растении, носит универсальный неспецифический характер, и не зависит от природы действующего фактора (Удовиденко, 1977; Батыгин, 1986). Сторонники другой точки зрения утверждают, что устойчивочть растений определяют специфические приспособительные реакции, адекватные природе повреждающего фактора (Генкель, 1978). Большинство исследователей считают, что наряду с неспецифическими изменениями имеют место и специфические особенности адаптации, которые не всегда удается определить на фоне многочисленных неспецифических.

В нашей стране учение о неспецифических ответах клеток на воздействие разнообразных факторов внешней среды было разработано Введенским, Насоновым и Александровым. Учение Введенского о парабиозе фактически служило предпосылкой становления теории неспецифического адаптационного синдрома.

Адаптация к одному из факторов может приводить в некоторых случаях к увеличению устойчивости только к одному фактору, а в других случаях растительный организм становится устойчивым одновременно и к другим факторам среды. Существование такой «перекрестной» устойчивости служит важным аргументом в пользу универсального характера защитных реакций.

По мнению сторонников «специфической» концепции «перекрестная» устойчивость - это проявление устойчивости сопряженной. При этом сопряжение может быть как положительным, так и отрицательным.

Трудно предположить, что клетка обладает специфической устойчивостью к веществу, которого она в природе не встречала. Механизмы реагирования живой системы на внешние воздействия подвергались в процессе эволюции естественному отбору и поэтому биохимическая стратегия адаптации растительной клетки должна быть однотипной и рациональной.

Таким образом, большинство наблюдаемых при стрессе реакций имеют неспецифический характер. Однако в ответ на действие стрессоров возникают и условно специфические реакции, характерные для конкретного стрессового воздействия. Например, увеличение концентраций ионов при засолении, пожелтение листьев (хлороз), при несбалансированном минеральном питании, разрастании корневой шейки при затоплении корней, усиление транспирации при засухи, синтез тех или иных стрессовых белков, например БТШ при перегреве или металлопротеинов и фитохелатинов при действии тяжелых металлов.

В настоящее время существует представление о клетке, как динамической триггерной системе. При определенном пороговом воздействии клетка способна переходить на новый метаболический уровень, в новое дискретное функциональное состояние, которое и предложено называть его состоянием стресса у растительной клетки. Представление, что растительная клетка - биологический триггер, помогает устранить трудности в разграничении специфических и неспецифических ответов клетки. Веселовский с соавт. (1993) говорит о том, что специфическим следует считать любое изменение соотношений характеристик в начале ответа клетки в пределах толерантной зоны. Heспецифической физиологической реакцией является сам акт переключения («катастрофа») в новое устойчивое состояние (стресс) при запороговой напряженности возмущающего фактора, т.е. перестройка системы.

Таким образом, стресс представляет собой стереотипную генетически детерминированную адаптационную реакцию живых систем, имеющую множество взаимосвязанных между собой механизмов реализации.

1.3 Перекисный гомеостаз в свете учения о стрессе

растительный клетка прооксидантный гомеостаз

Предполагается, что сигналом для запуска стресс-реакции может служить некое стереотипное изменение внутренней среды клетки. Таким сигналом вполне может являться смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия (или перекисного гомеостаза) в направлении активации окислительных процессов. Сбалансированность между обеими частями этой системы является необходимым условием для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки.

При чрезмерном накоплении активных форм кислорода (АФК), пероксидов и их вторичных продуктов развивается состояние, получившее название окислительного стресса. В многочисленных работах показано, что активация перекисного окисления биополимеров представляет собой универсальное следствие воздействия на живую систему разнообразных экстремальных агентов, при этом продукты перекисного окисления могут являться как «индикаторами», так и «первичными медиаторами» стресса как особого состояния клетки, которое может привести к увеличению ее резистентности.

Стадии тревоги сопутствует первичная активация прооксидантных процессов, которая быстро меняется реактивной мобилизацией антиоксидантных резервов. Стадии истощения свойственен значительный рост интенсивности перекисного окисления при снижении антиоксидантного потенциала тканей.

При индукции окислительного стресса в ответ на различные факторы окружающей среды можно выделить два основных принципа, в значительной степени отражающих сложность системы регуляции перекисного гомеостаза растений. Во-первых, один фактор может затрагивать несколько различных механизмов, ответственных за сдвиги в прооксидантно-антиоксидантном равновесии. Это наблюдается, например, при инфицировании растений патогенами, когда с одной стороны активируются многочисленные системы, продуцирующие АФК, а также синтезируется салициловая кислота, ингибирующая активность антиоксидантных ферментов. Во-вторых, несколько факторов, различных по природе могут влиять на перекисный гомеостаз растения по одному и тому же механизму, обусловливая значительную степень универсальности регистрируемого ответа на действие стрессора.

1.4 Активные формы кислорода: образование, химизм, реакционная способность

Нашу планету окружает окисленная атмосфера. Кислород, являясь биогеном, входит в состав всех живых организмов на планете. В основном состоянии молекула кислорода имеет два неспаренных электрона, т.е. представляет собой бирадикал и является значительно менее активным окислителем, чем это следует из его термодинамических свойств. Но помимо обычного молекулярного кислорода, находящегося в триплетном состоянии (3О2), существует шесть его активных производных. К ним относятся: атомарный кислород - О, озон - О3, синглетный кислород - 1О2, супероксидный анион радикал - О, гидроксильный радикал - ·ОН и гидропероксидный радикал - НО. Если атомарный кислород и озон не относятся к продуктам жизнедеятельности, то четыре другие активные формы кислорода (АФК) непрерывно образуются в сложной цепи окислительных реакций живого организма.

Термин «активные формы кислорода» (АФК) обозначает совокупность короткоживущих, взаимопревращающихся и относительно реакционно-способных форм кислорода, возникающих в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений.

Продукт одноэлектронного восстановления кислорода называют гидропероксидным радикалом в его протонированной форме и супероксидным анион-радикалом в его ионизированной форме. Супероксид можно получить также одноэлектронным окислением пероксида водорода (Н2О2). Одним из важнейших свойств (в отличие от других кислородных радикалов и синглетного кислорода) является относительно высокое время жизни в водных растворах (порядка нескольких микросекунд), благодаря чему этот радикал способен удаляться на значительные расстояния от мест его образования. При протонировании супероксида возникает гидропероксидный радикал НО, который обладает значительно более сильными окислительными свойствами.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Образование и взаимопревращение активных форм кислорода

Образование супероксидного анион-радикала происходит при работе флавинсодержащих ферментов, таких как ксантиноксидаза, которая катаболизирует пурины до мочевой кислоты (пурины входят в состав, например, ДНК), микросомальных монооксигеназ, которые участвуют в метаболизации ксенобиотиков - чужеродных веществ, при окислении восстановленных форм флавинов и хинонов:

хинон семихинон

Однако наибольшее количество супероксида образуется в результате работы электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) митохондрий и хлоропластов. Остановимся чуть подробнее на хлоропластах.

Супероксид является одним из основных первичных продуктов восстановления кислорода в хлоропластах, где он образуется за счет переноса электронов на молекулярный кислород при работе фотосинтетической электрон-транспортной цепи на низкопотенциальных акцепторах:

в ФС1 - на негемовом железосодержащем белке ферредоксине (Fd), цитохроме b563 и Фд-НАДФ+редуктазе;

в ФС2 - на первичном хинонном акцепторе электронов - феофитине.

Это происходит при псевдоциклическом потоке электронов в ФЭТЦ, когда вместо НАДФ+ акцептором электронов от фотоокисления воды является молекулярный кислород. Кислород при этом либо не выделяется, либо наблюдается его видимое поглощение. Наиболее активен этот процесс в ФС1. Такой перенос электронов на молекулярный кислород (псевдоциклический транспорт электронов) получил название реакции Мелера, в честь немецкого ученого А. Мелера, который открыл его в 1951 г.

Непосредственными переносчиками электронов на кислород в строме хлоропластов являются ферредоксин-зависимые редуктазы (например нитритредуктаза) а также рибулезо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК/О).

В митохондриях супероксид продуцируется на двух участках ЭТЦ: в результате утечки электронов на уровне цитохрома b556 и при участии убихинона.

Генерация кислородных радикалов может с определенной эффективностью протекать и в пероксисомах, что может быть связано с протеканием глиоксилатной реакции фотодыхания, ?-окисления жирных кислот, энзиматическими реакциями флавинооксидаз, с функционированием ксантинооксидазы, NO-синтазы и мембранной НАДФН-оксидазы.

Сходные процессы происходят в микросомах, где содержится цитохром b и цитохром Р450. Сходные процессы образования супероксида проходят и на ядерной мембране.

В клеточной стенке растений также идет генерация кислородных радикалов, которая рассматривается в этом случае с их возможной ролью в иммунных реакциях растений, в образовании фенольных сшивок между полисахаридами стенки при ее удлинении, а также биосинтезе лигнина при свободнорадикальной полимеризации монофенолов.

В результате присоединения второго электрона к супероксидному аниону образуются пероксид водорода, гидроперекисный и перекисный анионы, представляющие собой нерадикальные продукты. Супероксидный радикал малоактивен в водных системах, где он и гидроперекисный радикал претерпевают дисмутацию до пероксида водорода и кислорода.

Пероксид водорода является наиболее стабильным из продуктов восстановления кислорода и не несет электрического заряда, в связи с чем он способен легко проникать через биологические мембраны. Время жизни этой АФК составляет 1 мс, поэтому она способна диффундировать на значительные расстояния от места образования.

Скорость продукции пероксида составляет 100-200 нМ/м2 листовой поверхности в секунду в митохондриях, в 20 раз быстрее в хлоропластах и в 50 раз - в пероксисомах растительной клетки.

Н2О2 является первичным продуктом восстановления кислорода на многих оксидазах. Некоторые ферменты, например ксантиноксидаза, дегидрогеназа оротовой кислоты, альдегидоксидаза, мембраносвязанные НАДФН-оксидазы дают одновременно и супероксид и пероксид в соотношениях, зависящих от pH и концентрации.

В хлоропластах растений большое значение в образовании пероксида водорода имеют процессы фотодыхания при окислении гликолата гликолатоксидазой в пероксисомах, где Н2О2 затем разлагается каталазой. Генерация пероксида водорода может происходить в ФС II хлоропластов при фотоокислении воды. а также на участке феофитин-пластохинон. Кроме того, образование Н2О2 (через супероксид) приписывают терминальной флавиновой редуктазе ФС1.

Основная часть экспериментальных данных касается восстановительной стороны ФС I, где происходит реакция дисмутации супероксида:

Пероксид водорода может образовываться также при взаимодействии супероксида с имеющимися в хлоропластах и митохондриях восстановителями: аскорбатом, ферредоксином и прочими, что может трактоваться как детоксикация супероксида:

Образование пероксида может происходить и в результате гидролиза крахмала, когда накапливаются фосфаты сахаров, при окислении которых продуцируются НАДФН, восстанавливающий ферредоксин-редуктазу, которая, в свою очередь, пополняет запас восстановленного ферредоксина, способного восстанавливать кислород до Н2О2.

В плазмалемме и клеточной стенке Н2О2 образуется при функционировании пероксидаз и связано с защитной функцией клетки.

Пероксид водорода является окислителем умеренной силы, однако при взаимодействии с ионами железа или меди разлагается с образованием крайне реакционно-способного гидроксильного радикала по реакции Фентона:

Этим объясняется токсическое действие пероксида водорода.

Долгое время считалось, что другой важной реакцией образования НО· радикалов может быть реакция Хабера-Вайса:

,

однако в условиях, приближающихся к физиологическим, эта реакция представляет собой сумму реакции Фентона и реакции восстановления ионов Fe3+ супероксидом:



Гидроксильный радикал - крайне нестабильная форма (время жизни 10-9 с). Уникальные свойства этого радикала основаны на высокой электрофильности, выражающейся в сильнейшей окислительной способности.

Генерация НО· возможна и при восстановлении Н2О2 переносчиком ЭТЦ ферредоксином. НО· является также основным продуктом радиолиза воды, и этим объясняется действие радиации в биологических системах.

Свободный гидроксильный радикал может образоваться в реакциях, связанных с окислением сульфита до сульфата, которые осуществляются в хлоропластах:

Известно также активирование кислорода путем передачи ему энергии без передачи электрона, что приводит к образованию синглетного кислорода 1О2. Основная форма молекулы кислорода - триплетная - валентные электроны имеют параллельные спины. При обращении спина молекула переходит в возбужденное синглетное состояние и становится крайне реакционно-способной частицей. Это явление имеет место при контакте молекулы кислорода с возбужденным хлорофиллом в триплетном состоянии.

Электронная конфигурация синглетного кислорода иллюстрирует его нерадикальную природу. Генерация синглетного кислорода очень часто обсуждается в связи с липоскигеназной реакцией окисления липидов, участвующей в сигнальных системах клетки. Образование в хлоропластах синглетного кислорода обусловлено спонтанной дисмутацией супероксида или его взаимодействием с окисленными компонентами ЭТЦ.

Активной формой кислорода является также озон О3, который проникая в клетки взаимодействует с водой с образованием всех остальных АФК.

Итак, термин «активные формы кислорода» (АФК) обозначает совокупность короткоживущих, взаимопревращающихся и относительно реакционно-способных форм кислорода, возникающих в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений. Понятие АФК шире, включает как «свободные радикалы кислорода» (супероксид и гидроксильный радикал), так и молекулярные формы - пероксид водорода Н2О2, синглетный кислород 1О2, озон О3 , а также органические кислородсодержащие радикалы: перекисный радикал RO2, алкоксильный радикал RO.

1.5 Перекисное окисление

В норме концентрации АФК в клетке не высоки: концентрация супкроксида составляет порядка 10-11 М, пероксида водорода - 10-8М, гидроперекисного радикала - меньше 10-11М.

При чрезмерном накоплении АФК возникает состояние, называемое оксидативным или окислительным стрессом. В силу своей высокой активности, АФК способны вызывать повреждение важнейших биополимеров: нуклеиновых кислот, белков, липидов и углеводов. Этот процесс называется перекисным окислением, а совокупность этих реакций - окислительными модификациями молекул.

Ввиду того, что клетка является мембранной структурой наиболее выраженным действием АФК является повреждение именно клеточных мембран за счет перекисного окисления их липидов (ПОЛ).

Наиболее активно свободнорадикальное окисление идет при атаке инициирующим радикалом диаллильного атома углерода, в связи с этим в реакцию наиболее активно вступают полиненасыщенные жирные кислоты липидов мембран. В растениях окислению подвергаются преимущественно линолевая, линоленовая и олеиновая кислоты. Первичными продуктами перекисного окисления липидов являются пентадиенильные радикалы, образующие диеновые конъюгаты и гидроперекиси жирных кислот. Дальнейшее их окисление и распад приводит к образованию широкого спектра конечных продуктов: альдегидных и спиртовых производных с укороченной цепью, в частности 4-гидрокси-2-ноненаль, низкомолекулярные продукты (этан, пентан), малоновый диальдегид, эпоксиды.

Так, окислительный радикал, атакующий липид, отрывает атом водорода от диаллильного углерода. В итоге возникает радикальный центр, делокализованный между углеродными атомами, содержащими двойные связи. Молекулы с двумя конъюгированными двойными связями называются диеновые коньюгаты. После взаимодействия с молекулярным кислородом образуется перекисный радикал RОО•, а затем диеновые конъюгаты, после чего - гидроперекись RООН:

- СН2 - СН = СН - СН2 - СН = СН - СН2 -

фрагмент остатка ненасыщенной жирной кислоты

+Х •v - ХН

-СН2 - СН= СН - *СН - СН = СН - СН2 -

радикальный центр

v+О2

- СН2 - СН - СН = СН - СН = СН - СН2 -

|

ОО•

свободнорадикальный промежуточный продукт

+RН v ?R•

- СН2 - СН - СН = СН - СН = СН - СН2 -

|

ООН

диеновый конъюгат

Диеновые конъюгаты и гидроперекиси можно рассматривать как первичные продукты ПОЛ. В биологических мембранах окислению подвергаются преимущественно полиненасыщенные жирные кислоты, и обнаружение диеновой конъюгации является чувствительным тестом на появление гидроперекисей. Дальнейшее их окисление приводит к образованию широкого спектра конечных продуктов ПОЛ: альдегидных и спиртовых производных с укороченной цепью, в частности 4-гидрокси-2-ноненаль, низкомолекулярные продукты (этан, пентан), эпоксиды и малоновый диальдегид (МДА).

Процессам ПОЛ принадлежит существенная роль в регуляции метаболизма мембранных липидов, изменении физико-химических свойств и проницаемости биологических мембран в физиологических условиях. При усилении окислительных процессов в клетке образуется избыток продуктов перекисного окисления липидов (ППОЛ), что может нарушить целостность и физические свойства мембран.



Рис. 4. Последствия ПОЛ по Ю.В. Владимирову (2002)

Проблема окислительных модификаций особенно актуальна применительно к белковым молекулам. АФК вызывают окисление боковых цепей аминокислотных остатков, формирование белок-белковых сшивок и окисление остова белковой молекулы, приводящее к фрагментации белка. Существует теория, что радикальной атаке подвергаются сначала не липиды, а именно белки плазматической мембраны, что сопровождается ее деполяризацией и лизисом клетки. При действии активных форм кислорода происходит окисление аминокислот, с образованием пероксильных радикалов. Из пероксильных радикалов образуются гидропероксиды и алкоксильные радикалы. Последние обладают высокой реакционной способностью и сами могут индуцировать образование высокореактивных соединений радикальной природы. Гидропероксиды также генерируют новые радикалы, если имеются ионы металлов переменной валентности. Производными перкосидных групп ( - С - О - ОН) являются группы - СОН (о- и м- тирозины), - С(ОН)2, карбонилы и другие соединения. Образуются также димеры (дитирозины), и происходит окислительное гликозилирование белков. АФК-индуцированные окислительные модификации аминокислот приводят к нарушению третичной структуры белков, к их денатурации и агрегации с сопутствующей потерей функциональной активности.

Еще один тип окислительных модификаций макромолекул - окислительные модификации нуклеиновых кислот (особенно важны ОМ ДНК). Формально окислительные модификации ДНК могут быть разделены на три группы: повреждение азотистых оснований, повреждение дезоксирибозы и появление новых ковалентных связей («сшивок»). Наиболее заметное действие оказывает гидроксильный радикал, который модифицирует все 4 основания в молекуле ДНК, образуя множество производных форм. Синглетный кислород избирательно атакует гуанин, супероксидный радикал и пероксид не реагируют с основаниями ДНК вообще.

Под действием АФК нуклеотиды повергаются перекисному окислению. Так, из тимина образуется 5-CH2OOH-урацил. Дальнейшее превращение образовавшихся перекисей приводит к гидропроизводным типа ROH или R(OH)2, главным из которых является 8-гидроксигуанин. Эта окислительная модификация гуанина приводит к нарушению ферментативного процесса метилирования цитозиновых оснований, которые соседствуют с модифицированными гуанозиновыми основаниями. Модификации оснований, вызванные АФК становятся причиной разрывов цепей ДНК и повреждений хромосом. АФК являются мощными мутагенными агентами, ингибиторами синтеза ДНК и деления клеток.

Выход окислительных процессов из-под контроля может быть губителен для клетки, однако в то же время существует представление об АФК, как о нормальных и даже необходимых метаболитах аэробной. В общем случае ПОЛ является универсальным модификатором свойств биологических мембран, важным физиологическим регулятором их структуры и функций, фактором, устанавливающим и поддерживающим стационарное функционирование ферментов, каналообразователей, рецепторов. Развиваются представления о возможности выполнения АФК и продуктами липопероксидации сигнальных функций. В частности пероксид водорода запускает синтез этилена и салициловой кислоты, способен активировать G-белки и факторы транскрипции, а также стимулировать увеличение внутриклеточной концентрации Са2+. Некоторые АФК могут являться вторичными мессенджерами в тарнсдукции гормональных сигналов, в частности ИУК, гибберелловой кислоты и АБК. Известно, что у растений АФК контролируют клеточный цикл, регулируют дифференцировку пластид и аппарата Гольджи. Отмечается важная роль АФК в иммунных реакциях растений при патогенезе, которая заключается в запуске синтеза патоген-зависимых белков.

1.6 Антиоксидантная система клетки

Роль поддержания концентрации АФК на относительно стабильном низком уровне отводится многокомпонентной системе регуляции процессов активации кислорода, без которой функционирование клеток в аэробной среде было бы невозможно. В биологических системах антиоксидантами называются вещества, способные ингибировать процессы свободнорадикального окисления.

Н.Г. Храпова (1982) предложила выделить следующие компоненты антиоксидантной системы:

1. антиоксиданты, ответственные за строго определённую структурную организацию липидов и влияющие на скорость инициирования и продолжения цепи;

2. соединения, регулирующие обмен липидов мембран путём изменения состава НЖК липидов;

3. ферменты:

а) ответственные за образование и гибель свободных радикалов и АФК;

б) участвующие в разложении пероксидов нерадикальным путём;

4. низкомолекулярные регуляторы, влияющие на стадию разветвления и обрыва цепи (взаимодействующие с радикалами либо разрушающие перекисные соединения: аскорбат, глутатион, цистеин, -токоферол, хиноны, холестерин, многоатомные спирты и другие).

Согласно Ю.А. Владимирову (2000) все антиоксиданты можно разделить на 4 класса:

а) антиоксидантные ферменты: супероксиддисмутазы, каталаза, пероксидазы;

б) низкомолекулярные соединения, взаимодействующие с радикалами и образующие малоактивные продукты;

в) комплексоны ионов металлов, тормозящие их окисление и восстановление;

г) гидрофобные соединения, действие которых основано на торможении реакций, непосредственно протекающих в липидном слое мембран - холестерин и токоферол.

По механизму действия антиоксиданты можно разделить на:

1."мусорщиков" (scavenger of free radicals), которые очищают организм от всех свободных радикалов, чаще всего восстанавливая их до стабильных неактивных продуктов;

2."ловушки" (trap of free radicals) - антиоксиданты, которые имеют сродство к какому-то определенному свободнорадикальному продукту (ловушки синглетного кислорода, гидроксил-радикала и т.д.). Ловушки часто используют для уточнения механизма свободнорадикальной реакции.

3. антиоксиданты, обрывающие цепи (chain breaking antioxidants) - вещества, молекулы которых более реакционноспособны, чем их радикалы. Чаще всего это фенолы, которые легко отдают свои электроны, превращая радикал, с которым они прореагировали, в молекулярный продукт, а сами при этом превращаются в слабый феноксил-радикал, который уже не способен участвовать в продолжении цепной реакции.

Низкомолекулярные антиоксиданты имеют наибольшее значение на самых ранних этапах активации повышенного образования АФК и вместе с ферментом супероксиддисмутазой составляют первую линию защиты от АФК. Однако, в дальнейшем их количество быстро истощается и зависит от активности восстанавливающих их ферментов. Эти вещества, отдавая свой атом водорода, превращают свободные радикалы в стабильные молекулы и предупреждают цепное развитие реакций перекисного окисления.

К антиоксидантам относится очень большое число веществ различной химической природы: фенолы и полифенолы, витамины группы Е, С, Р и А, стероидные гормоны (в частности эстроген), а также фосфолипиды и серосодержащие соединения.

Наиболее значительный вклад в антиоксидантную защиту вносят глутатион (ГSH) и аскорбиновая кислота (Аск). Они находятся в водной фазе клетки. Эти вещества перехватывают свободные радикалы, восстанавливают АФК и продукты окисления мембран. Основной антиоксидантный эффект этих соединений реализуется посредством их участия в работе ферментов, субстратами которых они являются.

L-Аскорбиновая кислота (аскорбат, витамин C) - необходимое вещество, которое находится в большом количестве в растительных тканях и играет очень важную роль. Она оказывает существенное влияние на некоторые физиологические процессы растений, включая рост, дифференциацию тканей и органов, метаболизм. Функция аскорбата - восстановление многих свободных радикалов и минимизация разрушения окислительного стресса.

Ее синтез происходит в цитозоле из D-глюкозы в несколько стадий. Сначала происходит окисление 1С атома глюкозы, затем - формирование двойной связи между 2 и 3 атомами С.

Антиоксидантные свойства аскорбата основаны на существовании одноэлектронных циклических переходов между дигидро-, монодегидро- и дегидроаскорбатными формами. Именно поэтому первой мерой для повышения сопротивляемости заболеваниям, которую рекомендуют врачи - прием ударной дозы аскорбиновой кислоты. Но в присутствии ионов металлов переменной валентности аскорбат обладает прооксидантным эффектом.