Микробы и их особенности

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Классификация микробов по способам питания и источникам

энергии. Приведите примеры микробов. Практическое использование

этих физиологических проявлений. Сущность хемосинтеза

Микрооганизмами принято называть мельчайшие живые существа, размеры которых меньше или немногим превышают разрешающую способность человеческого глаза (0,2 мм). Число известных микроорганизмов составляет много тысяч, причем открываются все новые виды. Большинство микроорганизмов в отличие от макроорганизмов одноклеточные, а имеющиеся многоклеточные формы сравнительно мало дифференцированы. Но в систематическом отношении микроорганизмы не представляют собой единой группы. На основании особенностей организации клеток, прежде всего генетического аппарата, они подразделяются на эукариот и прокариот.

К эукариотным микроорганизмам относятся многие водоросли, грибы и простейшие. Для всех эукариот характерно наличие в клетках ядра, окруженного мембраной и содержащего набор хромосом, в которых находится ДНК, несущая основную генетическую информацию. Кроме того, клетки эукариот имеют развитый эндоплазматический ретикулум, митохондрии (синтезирующие формы и хлоропласты ), а также другие органеллы общего характера.Участие эукариотных микроорганизмов наряду с вегетативным и бесполым размножением установлена способность к половому процессу. Прокариоты, или бактерии, объединяют только микроформы. Организация их клеток более простая, чем у эукариот. Ядро прокариот, называемое нуклеоидом, не окружено мембраной и представлено одной кольцевой молекулой ДНК.

Эндоплазматический ретикулум, митохондрии и другие обособленные органеллы, свойственные эукариотам, у прокариот отсутствуют, а их функции выполняет клеточная мембрана. Большинство бактерий, также как водоросли и грибы, имеют жесткую клеточную стенку, но состав ее иной, чем у эукариот. Типичным компонентом клеточной стенки большинства прокариот, относящихся к эубактериям, является пептидогликан муреин, состоящий из N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты. Ни у одного из эукариот такой полимер не обнаружен. Имеются также и другие различия. Микроорганизмам принадлежит важная роль в природных процессах, а также в практической деятельности человека.

Благодаря небольшим размерам микроорганизмы легко перемещаются с токами воздуха, по воде и другими способами, поэтому они быстро распространяются и встречаются в самых разных местах, включая и те, где другие формы жизни иногда отсутствуют. Характеризуют микроорганизмы способность к быстрому размножению и разнообразие физиологических и биохимических свойств. В результате некоторые из них могут расти в так называемых экстремальных условиях, которые для большинства других микроорганизмов неблагоприятные или вообще не поддерживают рост. Наряду с мезофилами, оптимальная температура для роста которых составляет 25-30 С, среди микроорганизмов есть так называемые психрофилы, некоторые из которых могут развиваться при температуре, близкой к нулю.

Такие микроорганизмы распространены в морях и океанах, в пещерах, но обнаруживаются и в других местах, в том числе в холодильных установках. Известны также термофильные микроорганизмы, рост которых наблюдается при 60-80 С и даже выше (90-110). Такие экстремальные термофилы обнаружены, например, среди бактерий, встречающихся в геотермальных источниках. В зависимости от отношения микроорганизмов к молекулярному кислороду их принято делить на облигатные аэробы, факультативные анаэробы, аэротолерантные анаэробы и облигатные анаэробы.

Большинство микроорганизмов, как и макроорганизмы, являются облигатными аэробами (для роста им необходим молекулярный кислород). Наряду с этим есть микроорганизмы, которые хотя и нуждаются в наличии О2, но могут расти или лучше растут при низком его содержании (2-10%). Такие микроорганизмы называют микроаэрофилами, а условия в которых они растут, микроаэробными.

Факультативные анаэробы растут как в присутствии, так и в отсутствии О2. Но в зависимости от условий роста происходят изменения в их метаболизме, прежде всего в энергетических процессах. Как правило, при наличии молекулярного кислорода такие микроорганизмы переключаются на окисление субстрата с участием О2, т.е. на аэробное дыхание, поскольку оно более выгодно, чем получение энергии в результате анаэробных процессов. Наглядным примером могут служить некоторые дрожжи, способные осуществлять в анаэробных условиях спиртовое брожение, а в аэробных полностью окисляющие в процессе дыхания сахара с образованием углекислоты и воды. Довольно много факультативных анаэробов и среди бактерий. Это Esсheriсhia, некоторые представители рода Baсillus, Рaraсоссus deiсans и ряд других.

К аэротолерантным анаэробам принадлежат многие молочнокислые бактерии, способные расти в присутствии молекулярного кислорода, но при этом их метаболизм остается таким же, как и в анаэробных условиях. И в том и в другом случае они осуществляют брожение. Облигатные анаэробы не только не нуждаются для роста в наличии молекулярного кислорода, но и для многих видов он токсичен даже в ничтожно малой концентрации. К числу строгих анаэробов относятся метанобразующие, сульфатредуцирующие бактерии и ряд других прокариот. Среди эукариот облигатными анаэробами являются некоторые простейшие, в частности отдельные представители трихомонад. Разнообразны возможные типы питания микроорганизмов. Часть из них, называемые фототрофами, как и зеленые растения, способны использовать для роста энергию света (пурпурные и зеленые бактерии, цианобактерии, прохлорофиты, некоторые галобактерии и водоросли).

Остальные микроорганизмы, носящие название хемиотрофов, так же как животные и человек, получают энергию в результате окисления различных химических веществ. Среди фото- и хемотрофов известны виды, способные все соединения клеток синтезировать их углекислоты. Их называют автотрофами. Особенно много автотрофов среди организмов, использующих в качестве источника энергии свет (возможность фотосинтеза). Многим микроорганизмам, как и животным, необходимы для роста органические соединения, которые используются ими в биосинтетических целях. Они носят название гетеротрофов. В случае хемотрофов окисляемый субстрат, иначе называемый донором электронов, обеспечивает получение организмом энергии и биосинтетические реакции восстановительного характера. У фототрофов донор электронов выполняет обычно только вторую функцию, поскольку источником энергии служит свет. Таким образом, с учетом источника энергии, донора электронов и характера веществ, используемых в биосинтетических процессах, возможных типов питания восемь; каждый из них реализуется большим или меньшим числом микроорганизмов, относящихся к прокариотам. В отличие от этого эукариотные микроорганизмы, как и макроорганизмы, проявляют способность либо к фотолитоавтотрофии, либо к хемоорганогетеротрофии. Первый тип питания присущ водорослям и высшим растениям, второй - грибам, животным, включая простейшие, и человеку.

Другие типы питания, очевидно,оказались менее удачными и не явились основой для двух основных направлений эволюции, приведших к возникновению высокоорганизованных форм эукариот. В то же время сохранение у бактерий разных типов питания, видимо, меет существенное значение для их выживания при наличии более совершенных форм и позволяет нередко расти в весьма специфических условиях. Кроме того, микроорганизмы в целом характеризуются способностью спользовать гораздо больше химических веществ, чем микроорганизмы. Это касается прежде всего соединений углерода. Hекоторые микроорганизмы растут на очень сложных органических средах, содержащих те или иные факторы роста, т.е. вещества, которые необходимы им в готовом виде, поскольку синтезировать их они сами не могут. Чаще всего факторами роста являются витамины, но могут быть аминокислоты, пурины, пиримидины и другие органические соединения. Даже отдельные виды и штаммы микроорганизмов, которых относят к автотрофам, обнаруживают такую потребность. Организмы, нуждающиеся в факторах роста, называют ауксотрофами с указанием на то, в каком или в каких конкретно готовых соединениях они нуждаются.

Соответственно виды и штаммы, не обнаруживающие эту потребность носят название прототрофов. К числу микроорганизмов, проявляющих высокую требовательность к составу среды и нуждающихся в ряде факторов роста, относятся многие молочнокислые бактерии, а также представители простейших. Ауксотрофные штаммы микроорганизмов легко образуются в результате мутаций. Известны также микроорганизмы (называемые паратрофами),которые являются облигатными внутриклеточными паразитами.

К числу таковых относятся риккетсии. Из-за высокой требовательности в отношении питания подбор сред для выращивания некоторых микроорганизмов является сложной проблемой, а часть видов на искусственных средах культивировать вообще не удается. На многие микроорганизмы, даже из числа гетеротрофов, хорошо растут на синтетических средах, содержащих всего одно органическое соединение углерода, которое используется как источник энергии в биосинтетических целях. Значительное число микроорганизмов способно использовать белки, нуклеиновые кислоты, парафины, разные углеводы, включая целлюлозу и другие высокомолекулярные вещества. С другой стороны, есть микроорганизмы, рост которых обеспечивают такие простые органические вещества, как этанол, ацетат, гликолат и многие другие.

Широко распространены так называемые метилотрофы, использующие в качестве источника энергии и углерода метан, метанол, метилированные амины и монооксид углерода, которые рост микроорганизмов не поддерживают, а многие даже токсичны. Наряду с использованием различных природных соединений углерода некоторые микроорганизмы могут воздействовать и на синтетические вещества, включая пластмассы и пестициды. Характерная особенность ряда бактерий - способность расти, получая энергию в результате окисления молекулярного водорода, аммония, нитритов, солей двухвалентного железа и некоторых других неорганических соединений. При этом многие из них растут в автотрофных условиях.

Соответственно окисляемым субстратам выделяют такие группы хемолитоавтотрофов, как водородные, нитрифицирующие, серные бактерии, железобактерии. К числу хемолитоавтотрофных микроорганизмов, окисляющих Н2, относятся также многие метанобразующие бактерии, отдельные представители ацетатобразующих, сульфат- и серувосстанавливающих бактерий. Различные возможности проявляют некоторые микроорганизмы в отношении источников азота. Некоторые виды хорошо растут на средах с пептоном и другими органическими азотсодержащими соединениями, в том числе мочевиной. Значительное число микроорганизмов могут ассимилировать нитраты и еще больше аммоний.

Интересной и важной особенностью ряда прокариотных микроорганизмов является их особенность фиксировать молекулярный азот. Долгое время считалось, что это свойство проявляется лишь у немногих видов, как-то у азотобактеров, отдельных представителей клостридий и фототрофных бактерий, а также у клубеньковых бактерий. Однако в последние годы показано, что способность к ассимиляции молекулярного азота распространена более широко. Многие микроорганизмы, как и растения могут использовать для синтеза серусодержащих соединений клеток сульфаты. Но некоторые виды способностью к ассимиляционной сульфатредукции не обладают и поэтому нуждаются для роста в наличии восстановленных соединений серы. Помимо потребности в так называемых макроэлементах, или в основных биоэлементах, к которым относят углерод, азот, кислород, водород, фосфор, серу, магний, железо, калий и кальций, микроорганизмы нуждаются для роста в ряде других элементов, но обычно в гораздо меньшем количестве.

Поэтому их называют микроэлементами или минорными биоэлементами. В основном это различные металлы (цинк, медь, кобальт, никель, молибден, медь и ряд других), входящие в состав отдельных ферментов. Однако следует отметить, что потребность отдельных микроорганизмов в некоторых элементах может существенно различаться и зависит иногда от условий их роста. Например, потребность бактерий в молибдене существенно возрастает при использовании ими в качестве источника азота нитратов или молекулярного азота, поскольку этот элемент входит в состав нитратредуктазы и нитрогеназы, т.е. ферментов, участвующих в ассимиляции клетками соответственно NО3- и N2. Для роста бактерий, получающих энергию в результате окисления Fe2+ до Fe3+, железо необходимо в значительно большем количестве, чем требуется другим организмам. Для многих известных микроорганизмов характерен лабильный метаболизм. Такая способность выражается не только в их способности использовать большое число разных соединений углерода, азота и других элементов, но нередко проявляется в переключении с одного типа питания на другой. Например, значительное число фототрофных микроорганизмов могут расти в темноте в гетеротрофных, а некоторые и в автотрофных условиях. Ряд бактерий проявляет способность и к хемолитоавтотрофии, и к хемоорганонегетеротрофии.

Такие организмы принято называть факультативными автотрофами. Некоторые микроорганизмы обнаруживают способность к так называемой миксотрофии, или смешанному типу питания. Например, одновременное использование в процессах биосинтеза органических и ассимиляции углекислоты по тому же типу, как в автотрофных условиях. Известны также случаи, когда микроорганизмы одновременно окисляют и органические и неорганические субстраты. Особенно четко способность к миксотрофии проявляется при их культивировании в проточных условиях с лимитированием по разным субстратам. Однако ряд микроорганизмов характеризуется постоянством своих потребностей в питании и, соответственно, процессах метаболизма. Среди них есть облигатные фототрофы и облигатные хемотрофы. Известны облигатные автотрофы, которые используют органические вещества в очень ограниченной степени, и во всех условиях основным источником углерода для них служит углекислота.

Примером могут служить многие цианобактерии и нитрифицирующие бактерии. Напротив, некоторым гетеротрофам всегда необходимы определенные органические соединения. Часть из них, как уже отмечалось, удается культивировать только на сложных средах, содержащих ряд факторов роста. К числу таковых относится, например, ряд молочнокислых бактерий. Но есть микроорганизмы рост которых возможен на средах, содержащих очень простые органические вещества, например, метан или метанол.

Однако другие соединения углерода их заменить не могут. Изучение различных микроорганизмов значительно расширило представление о том, в каких условиях возможно существование жизни. В результате проведенных исследований установлен также ряд важнейших биохимических закономерностей. Оказалось, что многие реакции, которые имеют место у микроорганизмов, аналогично таковым у растений и животных. Это подтверждает биохимическое единство всех организмов, обитающих на Земле. Вместе с тем установлено, что некоторые микроорганизмы имеют особенности не только в составе своих клеток, но и в тех процессах, которые могут осуществлять. Выше уже отмечалось, что только некоторые бактерии способны ассимилировать молекулярный азот с образованием из него аммиака, который используется для синтеза аминокислот и других азотсодержащих веществ клеток.

Лишь некоторые микроорганизмы могут расти, используя углеводороды, лигнин и ряд других соединений углерода, а также получая энергию в результате окисления ряда неорганических веществ. Это определяется наличием у них особых ферментов, катализирующих реакции, к которым другие виды не способны. Только среди микроорганизмов есть виды, способные расти в отсутствие молекулярного кислорода. В результате таких энергетических процессов, как различные брожения и анаэробное дыхание. До недавнего времени считали, что фотосинтез облигатно связан с наличием у организмов, которые его осуществляют того или иного хлорофилла, представляющего собой магнийсодержащие тетрапиррольные пигменты.

Однако недавно установлено, что у галобактерий, способных к фотосинтезу данный процесс происходит при участии пигментбелкового комплекса бактериородопсина, в который входит С20 - каротиноид ретиналь. Этот комплекс очень похож на ретиналь, являющийся зрительным пигментом животных. Большинство автотрофов, включая растения и микроорганизмы, ассимилируют углекислоту в результате действия рибулозобифосфатного цикла, называемого также циклом Кальвина. Однако у фототрофных зеленых и серобактерий, а также у некоторых хемотрофных бактерий (Hydrоgenоbaсter и Sulfоlоbus), как недавно установлено функционирует совершенно иная система автотрофной ассимиляции углекислоты, получившая название восстановительного цикла трикарбоновых кислот.

Похожим путем ассимилируют углекислоту метанобразующие бактерии, но процесс не имеет циклического характера. Аналогичным образом, видимо, происходит усвоение углекислоты анаэробными бактериями, образующими ацетат, а также некоторыми другими анаэробами из числа прокариот. Важным результатом изучения метаболизма микроорганизмов, способных расти за счет использования метана, метанола и других С1 - соединений более восстановленных, чем СО2 является открытие у них трех принципиально различных путей ассимиляции формальдегида: серинового, риболозомонофосфатного и ксилулозофосфатного циклов. Таких примеров, свидетельствующих о разнообразии путей ассимиляции и диссимиляции микроорганизмами различных соединений, можно привести очень много.

Трудно переоценить значение микроорганизмов в круговороте веществ, который осуществляется в природе. В результате способности воздействовать на разнообразные субстраты, нередко накапливая при этом в среде те или иные продукты метаболизма, и быстро расти в разных условиях микроорганизмы вызывают существенные изменения в окружающей среде. Они играют важнейшую роль в превращении многих веществ в почве и водоемах, участвуют в формировании и разрушении месторождений ряда полезных ископаемых, а также других природных процессах. Без многих процессов, которые осуществляют микроорганизмы в природе, жизнь на Земле давно бы прекратилась или приняла другие формы. Наглядным примером значения микроорганизмов в природе является их активное участие в разложении азотсодержащих органических веществ в почве, ведущем к образованию аммония и нитратов, а также фиксация молекулярного азота, отчего зависит рост растений. Не меньшее значение имеет разложение микроорганизмами и безазотистых полимерных соединений, прежде всего целлюлоза, которая в огромных количествах образуется ежегодно растениями. В результате деятельности микроорганизмов происходит также освобождение окружающей среды от ряда загрязняющих и ядовитых веществ, в частности пестицидов.

Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены - это восемь химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 10-4 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций. Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.

Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ. В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на:

аутотрофы (используют неорганические вещества - СО2);

гетеротрофы;

метатрофы (используют органические вещества неживой природы);

паратрофы (используют органические вещества живой природы).

Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки.

По источникам энергии микроорганизмы делят на:

фототрофы (способны использовать солнечную энергию);

хемотрофы (получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций);

хемолитотрофы (используют неорганические соединения);

хемоорганотрофы (используют органические )

Это явление наблюдается, например, при ступенчатом разложении растительных и животных остатков в почве. Симбиоз характеризуется взаимовыгодным влиянием микроорганизмов друг на друга в единой ассоциации (совокупности). Так, классическим примером симбиоза между водорослями и грибами являются лишайники. Тесный симбиоз между этими двумя группами микроорганизмов зашел так далеко, что в процессе эволюции данная микробная ассоциация выделилась в особый морфо-физиологический класс, отличный как от грибов, так и от водорослей. При этом гриб, составляющий основу лишайника, расщепляет питательный субстрат и поставляет необходимые для усвоения вещества водорослям, а водоросли снабжают гриб продуктами фотосинтеза. Конкуренция наблюдается тогда, когда совместно развивающиеся организмы нуждаются в одних и тех же питательных веществах и условиях развития. Хищничество заключается в поглощении клеток одних микроорганизмов другими для использования их в качестве питания. Паразитизм характеризуется тем, что один вид микроорганизма (паразит) поселяется в клетке другого (хозяина) и питается за счет хозяина. Абсолютные (облигатные) паразиты не могут развиваться в отсутствие хозяина. Известны паразитические формы бактерий и плесневых грибов, развивающиеся в клетках или в гифах хозяев. Примером паразитизма В известной мере может также служить явление бактерио- и актинофагии. Антагонизм -- подавление развития одних форм микробов другими с помощью вырабатываемых ими антимикробных веществ. Этими веществами могут быть: химические соединения неспецифического действия (кислоты, спирты, перекиси и др.), которые подавляют рост микробов при высоких концентрациях; антибиотики, обладающие специфичностью действия и проявляющие антимикробные свойства при низких концентрациях. микроб хемосинтез клетка раствор вирусология

Хемосинтез (от хемо... и синтез), правильнее -- хемолитоавтотрофия, тип питания, свойственный некоторым бактериям, способным усваивать CO2 как единственный источник углерода за счёт энергии окисления неорганических соединений. Открытие Х. в 1887 (Виноградский С. Н.) существенно изменило представления об основных типах обмена веществ у живых организмов. В отличие от фотосинтеза, при Х. используется не энергия света, а энергия, получаемая при окислительно-восстановительных реакциях, которая должна быть достаточна для синтеза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и превышать 10 ккал/моль.

Бактерии, способные к Х., не являются единой в таксономическом отношении группой, а систематизируются в зависимости от окисляемого неорганического субстрата. Среди них встречаются микроорганизмы, окисляющие водород, окись углерода, восстановленные соединения серы, железо, аммиак, нитриты, сурьму. Водородные бактерии -- наиболее многочисленная и разнообразная группа хемосинтезирующих организмов; осуществляют реакцию

6H2 + 2O2 + CO2 = (CH2O) + 5H2O, где (CH2O)

-- условное обозначение образующихся органических веществ. По сравнению с др. автотрофными микроорганизмами характеризуются высокой скоростью роста и могут давать большую биомассу. Эти бактерии способны также расти на средах, содержащих органические вещества, т. е. являются миксотрофными, или факультативно хемоавтотрофными бактериями. Близки к водородным бактериям карбоксидобактерии, окисляющие CO по реакции

25CO + 12O2 + H2O + 24CO2 + (CH2O).

Тионовые бактерии окисляют сероводород, тиосульфат, молекулярную серу до серной кислоты. Некоторые из них (Thiobacillus ferrooxidans) окисляют сульфидные минералы, а также закисное железо. Способность к Х. у разнообразных водных серобактерий остаётся недоказанной. Нитрифицирующие бактерии окисляют аммиак до нитрита (1-я стадия нитрификации) и нитрит в нитрат (2-я стадия). В анаэробных условиях Х. наблюдается у некоторых денитрифицирующих бактерий, окисляющих водород или серу, но часто они нуждаются в органическом веществе для биосинтеза (литогетеротрофия). Описан Х. у некоторых строго анаэробных метанообразующих бактерий по реакции

4H2 + CO2 = CH4 + 2H2O.

2. Фиксация молекулярного азота микроорганизмами. Возбудители, их

характеристика. Использование азотфиксаторов в земледелии

Азот является абсолютно необходимым элементом для всех живых организмов. Основным резервуаром азота служит земная атмосфера. Эукариотические организмы не способны усваивать азот непосредственно из атмосферы. Такой способностью обладает ограниченное количество видов прокариот, которых называют азотфиксаторами, а процесс связывания азота атмосферы (восстановление до ) этими организмами - биологической азотфиксацией. Многие растения, животные и грибы способны вступать в симбиоз с азотфиксирующими прокариотами. Наиболее интенсивно азотфиксация протекает при образовании эндосимбиозов, когда микроорганизм проникает внутрь тканей или даже в клетки хозяина. При этом микросимбионт обеспечивается питательными веществами и энергией, необходимой для разрыва тройной связи N2, а хозяин получает легко усваиваемый. Биологическая азотфиксация представляет собой глобальный процесс, обеспечивающий существование жизни на Земле. Общая мировая биологическая фиксация азота составляет 17,2· т/год, что в четыре раза превышает связывание N2 в форме NH3 на предприятиях химической промышленности. При этом продуктивность симбиотической азотфиксации составляет 100-400 кг N/га.

Впервые прямые доказательства наличия азотфиксирующих микроорганизмов, живущих в симбиозе с бобовыми растениями, были получены благодаря работам немецкого исследователя Германа Гельригеля. Сравнивая источники азота для злаков и бобовых (1886 год), он показал, что если злаки черпают азот из минеральных веществ почвы, то бобовые, кроме того, обладают способностью фиксировать азот воздуха. Такую способность бобовых Гельригель объяснял наличием на корневой системе клубеньков, развитие которых вызывают микроорганизмы. После работ Гельригеля стало ясно, что фиксация растениями азота связана с микроорганизмами, инфицирующими корневую систему растения. Потребовалось около десятка лет для подтверждения выводов Гельригеля о значимости симбиотических микроорганизмов рода Rhizobium для бобовых растений как азотфиксаторов. Голландский бактериолог М. Бейеринк (M. Beijerinck) выделил в 1888 году клетки Rhizobium в чистой культуре. В дальнейшем была показана их способность инфицировать корневую систему бобовых с определенной степенью избирательности по отношению к конкретным видам растений и вызывать образование на корнях клубеньков - специализированных образований, в которых протекает азотфиксация.

Сейчас известно около 13 тыс. видов бобовых, многие из которых обладают способностью к симбиотической фиксации азота. Для каждого вида бобовых растений имеются свои разновидности (штаммы) Rhizobium, которые и получили свои названия от названий хозяина (Rhizobium trifolii - клубеньковые бактерии клевера, Rhizobium lupini - клубеньковые бактерии люпина и т.д.).

Выяснено также, что водный папоротник Azolla находится в симбиотических отношениях с азотфиксирующими цианобактериями. Некоторые деревья и кустарники (например, ольха, облепиха, восковик) имеют в качестве симбионтов актиномицеты. Поиск новых азотфиксирующих пар растение - микроорганизм далеко не закончен.

В 70-80-х годах нашего столетия в лаборатории доктора Джоан Доберейнер (J. Dobereiner) в Бразилии активизировались поиски азотфиксирующих микроорганизмов, обитающих на поверхности корневой системы диких и культурных злаков. Такие микроорганизмы, живущие в ассоциации с растением, называются ассоциативными азотфиксаторами. Число их видов велико, но благодаря работам доктора Дж. Доберейнер и ее последователей в центре событий оказались микроорганизмы рода Azospirillum. Азоспириллы легко инфицируют корневую систему злаков и других растений. Подобно Rhizobium, они делятся на виды, колонизирующие преимущественно те или иные сорта злаков, фиксируют азот воздуха, могут продуцировать гормоны роста растений и обладают еще другими свойствами, положительно влияющими на рост и развитие растений.

Кроме того, известны азотфиксирующие микроорганизмы, свободноживущие в почве, на растениях, в воде. Впервые выделить культуру свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов удалось в 1893 году С.Н. Виноградскому. Он выделил почвенный спороносный анаэробный микроорганизм, относящийся к роду Clostridium , названный автором в честь выдающегося французского микробиолога Л. Пастера Clostridium pasteurianum. В 1901 году М. Бейеринк выделил аэробно живущий почвенный микроорганизм Azotobacter, способный к азотфиксации, неприхотливый при выращивании. Этот микроорганизм интенсивно исследуют не только как удобную модельную культуру, но и применяют в технологии обогащения сельскохозяйственных посевов биологическим азотом. С тех пор коллекции свободноживущих азотфиксаторов постоянно увеличиваются, особенно с 1949 года, когда в арсенал методов регистрации фиксации азота вошли метод изотопных индикаторов и реакция восстановления ацетилена в этилен, катализируемая основным ферментом системы азотфиксации - нитрогеназой. Тогда выяснилось, что способностью к фиксации азота обладают большинство аноксигенных фототрофных бактерий, многие цианобактерии, некоторые бациллы, клебсиеллы и др.

Фиксация азота клубеньковыми бактериями.

Наибольший вклад в биологическую азотфиксацию вносят клубеньковыми бактериями (ризобии). Ризобии представляют собой грамотрицательные бактерии, образующие клубеньки с растениями семейства бобовых. Клубеньковые бактерии теперь делят на пять родов: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium (быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие).

В основе способности инфицировать корневую систему хозяина лежит сложнейший и не вполне ясный молекулярный механизм, имеющий решающее значение в симбиотической фиксации азота. На первом этапе происходит приближение микробной клетки к растению за счет ее способности передвигаться в ответ на узнавание химических продуктов, выделяемых из корней растения (хемотаксис). Происходит контактное взаимодействие микроорганизма с растением. В этом процессе важное место отводится так называемому лектин-углеводному узнаванию растения микроорганизмом. Лектин корневых волосков растений (углеводузнающий белок) узнает углевод поверхности бактерий и прочно связывается с ним. Происходит взаимное узнавание партнеров и подготовка к формированию симбиотической системы. Растение в нано- или пикомолярных концентрациях начинает продуцировать специфичные флавиноиды, которые активируют гены вирулентности (Nod-гены) ризобий. Nod-гены кодируют синтез Nod-факторов (липоолигосахаридов), вызывающих у растения-хозяина скручивание корневых волосков и образование клубеньковой меристемы. В месте резкого сгиба волоска пектолитические ферменты растения разрушают клеточную стенку, через которую бактерии и проникают внутрь. Вокруг этих бактерий образуется полость - инфекционная нить, стенки ее образованы растительными клетками, а внутреннее пространство заполнено полисахаридами растения и микросимбионта.

Далее происходит эндоцитоз ризобий из инфекционной нити внутрь клеток растения-хозяина. В цитоплазме растительной клетки бактерии окружаются специальными перибактероидными мембранами (ПБМ), синтезируемыми в основном растительной клеткой и частично ризобиями. Количество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растений и обычно составляет от 1 до 10 клеток. Бактериальные клетки, окруженные общей ПБМ, называются симбиосомой и являются основной структурно-функциональной единицей симбиоза.

Вскоре ризобии в ПБМ преобразуются в особые симбиотические формы - бактероиды, имеющие в три-пять раз большие размеры, чем свободноживущие бактерии. Все это способствует формированию на поверхности корней клубеньков. Азотфиксирующий клубенек состоит из следующих частей: а) инфицированная бактериями ткань, б) проводящая ткань, поставляющая углеводы и выносящая продукты азотфиксации, в) меристема, за счет которой идет рост клубенька. Морфология и число клубенька строго определяется растением-хозяином, что возможно связано с большой энергоемкостью их образования.

Клубеньковые бактерии более экономно используют энергию, необходимую для фиксации азота, затрагивая 3-4 г углеводов на 1 г азота, в то время как свободноживущие азотфиксирующие бактерии затрачивают 50 - 100 и более граммов на фиксацию 1 г азота. Это связано с тем, что у свободноживущих азотфиксаторов фиксация азота происходит в процессе их роста, и потому большое количество энергии потребляется на этот рост. Кроме того, в целях создания благоприятных условий для активности нитрогеназы - фермента, участвующего в фиксации азота, для снижения парциального давления кислорода усиливается дыхание, что связано с затратой энергии. Эти расходы энергии отсутствуют у клубеньковых бактерий, поскольку фиксация азота происходит в бактероидах, клетках, прекративших рост, а внутри клубеньков создаются благоприятные условия для активности нитрогеназы, в том числе сниженное содержание кислорода. Очень существенно то, что фиксируемый клубеньковыми бактериями азот на 90 - 95% передается бобовым растениям. Бобовые, получая связанный азот от клубеньковых бактерий, не зависят или мало зависят от обеспечения минеральным азотом почвы и потому могут успешно произрастать совместно с другими растениями на почвах, бедных доступными формами азота.Количество азота, фиксируемого клубеньковыми бактериями бобовых, сильно варьирует от фитоценоза к фитоценозу, а в пределах конкретных фитоценозов может изменяться от года к году. Оно определяется участием бобовых в фитоценозах, условиями среды и эффективностью соответствующих рас бактерий. Для некоторых лугов в Новой Зеландии с травостоями, где преобладает клевер, отмечена фиксация азотом до 450 - 550 кг/га.

Общий уровень азотфиксирующей активности свободно живущих организмов невысок. В зависимости от вида и условий существования они накапливают в год от 10 до 30 - 40 кг связанного азота на гектар.

Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами. Основным элементом симбиоза является нитрогеназа - многомерный фермент, состоящий из комплекса двух белков: MoFe-белка и Fe-белка. Нитрогеназы из разных азотфиксаторов несколько различаются своими молекулярными массами и содержанием металлов. Каждый из белков, в свою очередь, состоит из нескольких субъединиц. Молекулярная масса MoFe-белка различных нитрогеназ находится в пределах 200-250 кДа. Фермент содержит по два атома молибдена, 28-34 атома железа и 18-24 атома серы на одну молекулу. Молекулярная масса Fe-белка колеблется от 50 до 70 кДа и также содержит атомы железа и серы. Нитрогеназа синтезируется в бактероидах и является катализатором фиксации азота.

Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью, т.е. обладает способностью восстанавливать широкий спектр соединений, например, превращать ацетилен в этилен. Данная реакция применяется для определения нитрогеназной активности ацетиленовым методом. Ацетилен восстанавливается только до этилена, который легко поддаётся количественному определению с помощью газовой хроматографии.

Для активной работы нитрогеназы необходимы микроаэрофильные условия. Молекулярный кислород оказывает повреждающее действие на оба белка нитрогеназы, но более чувствителен к O2 Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к O2 определяется прежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как в связывании субстрата, так и в переносе электронов. Поскольку при этом может происходить и ступенчатое восстановление O2 по одноэлектронному механизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидные ионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительное повреждение нитрогеназы. Нитрогеназные белки являются не единственным компонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O2. Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокисляться и подвергаться необратимым окислительным повреждениям.

Микроаэрофильные условия в клубеньке обеспечиваются диффузным барьером (слой плотно прилегающих друг к другу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобный белок, синтезируемый растительными клетками). Леггемоглобин связывает O2, транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыхательную активность клубеньков. Он составляет 30 % белка в клубеньках и придает им ярко-розовый цвет. Нитрогеназный комплекс, образующий аммиак из воздуха, действует по очень экономно. Если в среде обитания достаточно ионов аммония или нитратов, он прекращает работу.

Применение азотфиксаторов на практике.

Открытие азотфиксаторов привело к созданию так называемых микробных удобрений. Уже в 1895 году Наббе и Хилтнером запатентован препарат микробной культуры Nitragin. Он выпускался в 17 вариантах для различных растений. Препарат представлял собой культуры азотфиксирующих микроорганизмов, смешанных с почвой, торфом, песком, навозом и другими субстратами. Внесение нитрагина в почву или обработка семян назывались инокуляцией и позволяли фермеру повысить качество и количество продукции. В первой половине XX века наблюдался неуклонный рост научно-исследовательских работ по созданию перспективных микробных препаратов для бобовых и небобовых культур.

После второй мировой войны начался период химизации сельскохозяйственного производства и работы по исследованию микробиологических препаратов стали свертываться. Возможности большой химии, дешевизна азотных удобрений, простота их использования как бы отодвигали на второй план микробные препараты. Однако выяснилось, что интенсивное использование синтетических азотных удобрений кроме положительного эффекта (роста урожайности) несут в себе большую опасность. Происходит загрязнение азотсодержащими веществами почвы, подпочвенных вод, рек и озер. Минеральные удобрения вымываются из почвы, выщелачиваются и становятся вредными для человека соединениями - нитритами, нитрозаминами и т.д. поэтому в последнее время отдаётся предпочтение микробным препаратам.

Сейчас спектр применяемых микропрепаратов под бобовые, злаковые и другие культуры довольно широк. Штаммы ризобий, используемые для инокуляции сельскохозяйственных бобовых культур, обычно выделяются из клубеньков этих же видов, однако в качестве источника таких штаммов могут быть использованы и некоторые дикорастущие виды бобовых.

В конце XX века во многих странах нитрагенизации подвергается 70-80 % бобовых культур. В районах традиционного возделывания бобовых культур прибавка урожая от применения нитрагина оставляет 2-4 ц/га зерна сои, 1-2 ц/га зерна гороха и люпина, 80-100 ц/га зеленой массы бобовых культур, 6-12 ц/га сена клевера и люцерны. На почвах, где бобовые культуры ранее не возделывались и в которых нет специфичных для них клубеньковых бактерий, дополнительный сбор сельскохозяйственной продукции за счет применения препаратов клубеньковых бактерий достигает 50-100 % и более.

Только прокариоты способны использовать запасы азота, содержащие ся в атмосфере,-фиксировать молекулярный азот. Частью самостоя тельно, а частью в симбиозе с высшими растениями они переводят инертный N2 в органические соединения и включают его (непосред ственно или через растения) в белок, который в конечном счете попа дает в почву. В результате связывания N2 клубеньковыми бактериями в симбиозе с растениями семейства бобовых почва ежегодно обога щается азотом в количестве 100-300 кг на 1 га. Свободноживущие азот-фиксирующие микроорганизмы вносят в почву 1-3 кг азота на 1 га в год. Кроме того, значительные количества связанного азота могут по падать в почву из атмосферы с осадками. Это дает (в зависимости от загрязненности воздуха) от 3 до 30 кг азота на 1 га в год (см. разд. 1.3). По приблизительной оценке, в 1974 г. на всем земном шаре было связано 175106т азота, из них 90106т на сельскохозяйственных угодьях и 40-10бт -в промышленности по методу Габера и Боша. Большую часть азота связывают бактерии рода Rhizobium в корневых клубеньках.

В связи с заметным обогащением почвы связанным азотом его симбио-тическая фиксация давно обратила на себя внимание при разных агро технических приемах (пар, севооборот), и ее стали сознательно использовать в сельском хозяйстве.

На то, что клевер и другие бобовые растения обогащают почву азотом, впервые указал Буссенго. Установление связи между фиксацией азота и корневыми клубеньками бобовых явилось заслугой Хелльригеля и Вильфарта (1886-1888). Бобовые могут расти в отстутствие связанного азота лишь в том случае, если их корни усеяны клубеньками, которые образуются

Многие микроорганизмы используют в промышленном и сельскохозяйственном производстве. Почвенные микробы способны повышать плодородие почвы, ее структуру, накапливать полезные для растений вещества, увеличивать коэффициент использования удобрений. Благодаря высокой скорости метаболических процессов в микробной клетке, с помощью микробов получают различные вещества, имеющие народнохозяйственное значение. Микроорганизмы как источники белка, по сравнению с самыми высокопродуктивными животными и растениями имеют исключительно высокую интенсивность биосинтеза. Вырабатываемый в настоящее время кормовой белок в виде сухих гидролизных дрожжей и белково-витаминного концентрата (БВК) по составу аминокислот, содержанию витаминов и микроэлементов превосходит растительные корма. Путем применения бактериальных удобрений возможно искусственное обогащение почвы некоторыми видами полезных микробов, благодаря чему интенсифицируются процессы биологической азотфиксации и повышается содержание азота в почве. Одним из направлений микробиологии является разработка методов применения микробов и микробных препаратов для борьбы с болезнями и вредителями сельскохозяйственных растений. Эти методы более экологичны и поэтому предпочтительны, по сравнению с химическими способами защиты. Микробиология играет огромную роль в изучении общебиологичесих проблем. Микроорганизмы служат удобной моделью для исследования явлений наследственности и изменчивости, так как обладают высокой скоростью размножения и доступностью культивирования. Открытие новых методов получения наследственно измененных форм полезных микробов открыло новые возможности применения микроорганизмов в сельскохозяйственном и промышленном производстве. Особенно перспективно развитие генной инженерии. Ее достижения обеспечили развитие биотехнологии получения белков, ферментов, витаминов, антибиотиков, ростовых веществ.

3. Значение культур клеток в развитии вирусологии. Питательные

среды и растворы, применяемые в вирусологии. Цель их

использования

ВИДЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК.

Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочисленных структурных элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под контроля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особенностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.

Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целые комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo.

В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования различают несколько видов переживающих и растущих культур тканей и клеток. Наибольшее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологической практики.

Различают два основных вида однослойных клеточных культур: первичные и перевиваемые.

Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро- гуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.

Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином -- полуперевиваемые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и других клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения внеорганизма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.

Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах.

Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур -- трансформированными.

Усовершенствование техники культивирования клеток значительно расширило возможности получения перевиваемых клеточных линий из самых разнообразных тканей животных и человека. При этом не был обнаружен возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации к неограниченному росту in vitro, т.е. к трансформации.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo в результате развития патологического процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной.

Не все злокачественные новообразования способны давать начало перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С трудом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскоклеточного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравнительно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачественных опухолей нервной системы.

Особую категорию клеточных культур составляют полуперевиваемые штаммы, имеющие диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных и перевиваемых клеток.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

В любой клеточной культуре различают клеточную и жидкую фазы. Жидкая фаза обеспечивает жизнедеятельность клеток культуры и представляет собой питательные среды различного состава и свойств.

Все среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя на поверхности стекла или достаточно высокую концентрацию клеточных элементов в суспензии (при получении суспензионных культур). Поддерживающие среды фактически должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вирусных агентов.

Ростовые и поддерживающие среды многокомпонентны. В их состав могут входить как естественные продукты (амниотические жидкости, сыворотки животных), так и субстраты, полученные в результате частичной обработки естественных продуктов (эмбриональные экстракты, гидролизат лактальбумина, гемогидролизат, аминопептид и т. д.), а также синтетические химически чистые вещества (аминокислоты, витамины, соли).

В качестве примера питательной среды, полностью состоящей из естественных компонентов, можно назвать среду Бакли, предложенную для выращивания клеточных культур из почечного эпителия обезьян. В эту среду входит коровья амниотиче-ская жидкость (85%), лошадиная сыворотка (10%) и коровий эмбриональный экстракт (5%).

Все естественные продукты малостандартны, их использование связано с большой опасностью микробной и вирусной контаминации клеточных культур. В связи с этим и происходит постепенное вытеснение их синтетическими стандартными смесями. Наибольшее применение находят синтетическая среда 199 и среда Игла. Широко используются среды, содержащие строго определенные количества солей, аминокислот и витаминов.

Независимо от назначения все питательные среды для тканевых культур конструируются на основе какого-либо сбалансированного солевого раствора с достаточной буферной емкостью. Чаще всего ими являются растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы -- обязательный компонент любой питательной среды.

Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5--10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит.

Включение сыворотки в то же время препятствует созданию ростовых сред точного химического состава, весьма важных для развития фундаментальных исследований по клеточной физиологии, так как вместе с сывороткой (или ее дериватами) вводится целый комплекс неконтролируемых факторов, варьирующих в зависимости от серии сыворотки.

В 50-е годы Ewans и Waymouth были предложены бессывороточные среды точного химического состава. Однако эти среды не обеспечивали тех показателей пролиферативной активности клеток, которые обусловливают среды с добавлением сывороток. В связи с этим представляет интерес работа Birch и Pirt, показавших, что для обеспечения интенсивного роста клеток в бессывороточных средах определяющим является включение сернокислых солей Fe, Zn, Cu, а также МnС12.

В ростовые питательные среды, а так же в буферный раствор для промывания тканей добавляют антибиотики. Их вводят в среду непосредственно перед употреблением из расчета 1 мл основного раствора антибиотиков на 500 мл среды.

Ниже приведен состав и метод приготовления одной из распространенных питательных сред. Среда Игла