Свободные радикалы в биологических системах

Размещено на http://www.allbest.ru/

Свободные радикалы. Определение, номенклатура, классификация

свободный радикал хемилюминесценция парамагнитный

Хорошо известно, что в органических молекулах (включая те, из которых состоит наш организм) электроны на внешней электронной оболочке располагаются парами: одна пара на каждой орбитали (рис. 1)

Свободные радикалы отличаются от обычных молекул тем, что у них на внешней электронной оболочке имеется неспаренный (одиночный) электрон (рис. 2 и 3).

Неспаренный электрон в радикалах принято обозначать точкой. Например, радикал гидроксила обозначают как HO·, радикал перекиси водорода как HOO·, радикал супероксида как ·OO- или O2·-. Ниже даны формулы трех радикалов этилового спирта: CH3CH2O·; CH3·CHOH; CH3CH2O·

Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо избавиться от "лишнего" электрона, отдавая его другим молекулам.

В особом положении оказалась молекула кислорода (диоксигена), которая содержит на внешней оболочке целых два неспаренных электрона. Таким образом, диоксиген - это бирадикал и, подобно другим радикалам, обладает высокой реакционной способностью.

Рис.

Важно подчеркнуть, что неспаренные электроны должны находиться на внешней оболочке атома или молекулы. В понятие свободного радикала не включаются ионы металлов переменной валентности, неспаренные электроны в которых находятся на внутренних оболочках. Поскольку и радикалы и ионы таких металлов как железо, медь или марганец (так же как комплексы этих металлов) дают сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), эти частицы в совокаупности часто называют парамагнитными центрами.

Образование радикалов из устойчивых молекул обусловлено, таким образом, появлением на свободной, валентной орбитали нового электрона или наоборот - удалением одного электрона из электронной пары. Эти процессы обычно происходят в результате реакций одноэлектронного окисления или восстановления. В таких реакциях обычно участвует, наряду с молекулой, из которой радиукал образуется, ион металла переменной валентности, который раз и служит донором или акцептором одного электрона (а не двух сразу, как это бывает в реакиях между двумя органическими молекулами или между органической молекулой и кислородом). Типичный пример реакции, в которой образуется радикал - это реакция Фентон: взаимодействие пероксида водорода с ионом двухвалентного железа:

Fe2+ + H2O2 => Fe3+ + OH- + ·OH (радикал гидроксила)

При высоких температурах или под действием ультрафиолетового излучения радикалы могут образовываться также в результате разрыва химической связи (гомолитическое расщепление). В обычных условиях такие реакции в нормальных живых клетках практически не имеют места.

Остановимся на некоторых из этих рекомендаций. Прежде всего нет необходимости писать "свободный" перед словом радикал [533]. О радикальной природе рассматриваемой частицы говорит окончание "ил". Так радикалы RO· и НО· имеют наименование, соответственно "алкоксил" и "гидроксил".

Существенно новым можно считать рекомендацию не злоупотреблять производными от "пероксид" и "гидропероксид". Группа из двух связанных между собой атомов кислорода называется "диоксид". В соответствии с этим радикал ROO· рекомендуется называть "алкилдиоксилом" {Koppenol, 1990 #7}. Допускается сохранение и альтернативного названия "алкилпероксил", но это хуже {Koppenol, 1990 #7}. Молекулярный кислород называется "диоксигеном", а озон - "триоксигеном".

Наименование с окончанием "ил" весьма удобно, но ничего не горит о том, каков заряд частицы. Поэтому в необходимых случаях рекомендуется использовать систематическое название радикала, где после названия группы дается в скобках заряд. Например радикал O₂^·- имеет наименование "диоксид (1-)". В этой работе мы будем использовать более краткое название "диоксид".При написании формул радикалов в суперскрипте сначала ставится точка, указывающая на наличие неспаренного электрона у данного атома, а затем знак заряда иона. Например "O₂^·-". В структурных формулах точка должна стоять именно у того атома, где локализован неспаренный электрон. Например, чтобы подчеркнуть, что диоксиген имеет два неспаренных электрона, можно написать его формулу таким образом "О₂". В таблице 1 приведен список рекомендуемых названий радикалов; в квадратных скобках даны названия, которые будут преимущественно использованы в данной книге.

Радикалы, встречающиеся в нашем организме

Первичные радикалы и реактивные молекулы

Все радикалы, образующиеся в нашем организме, можно разделить на природные и чужеродные. В свою очередь природные радикалы можно разделить на первичные, вторичные и третичные {Владимиров, 1998 #8}. (См. схему на рис. 4).

Рис.

Первичными можно назвать радикалы, образование которых осуществляется при участии определенных ферментных систем. Прежде всего к ним относятся радикалы (семихиноны), образующиеся в реакциях таких переносчиков электронов, как коэнзим Q (обозначим радикал как Q·) и флавопротеины. Два других радикала - супероксид (·OO^-) и монооксид азота (·NO) также выполняют полезные для организма функции, которые будут подробнее рассмотрены в соответствующих разделах.

Из первичного радикала - супероксида, а также в результате других реакций, в организме образуются весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов (см. рис. 5). Такие молекулы, наряду с радикалами, получили в англоязычной литературе название "reactive species", что в русской литературе чаще всего переводится как "активные формы". Чтобы провести водораздел между радикалами и молекулярными продуктами, мы предлагаем называть последние "реактивными молекулами". Таким образом, предлагается такая терминология:

Активные формы - свободные радикалы + реактивные молекулы

Halliwell предлагает термины активные формы кислорода, азота и хлора {Halliwell, 1998 #9}. Как видно из схемы на рис. 5, к активным формам кислорода относятся супероксид, радикал гидроксила, перекись водорода и синглетный кислород. Окись азота и результат ее взаимодействия с супероксидом - пероксинитрит предлагается называть активными формами азота. Активной формой хлора можно назвать гипохлорит, образуемый в реакции перекиси водорода с ионом хлорида, которую катализирует фермент миелопероксидаза.

Рис.

В складывающейся в настоящее время терминологии нужно найти место радикалам и гидроперекисям полиненасыщенных жирных кислот, которые образуются в очень важной реакции цепного окисления липидов. С химической точки зрения - это неоднородная группа. При отрыве атома водорода от молекулы полиненасыщенной жирной кислоты образуется алкисльный радикал, в котором неспаренный электрон локализован у углеродного атома. Это как бы "активная форма углерода". Но при дальнейшем взаимодействии алкильного радикала с диоксигеном (молекулярным кислородом) образуется диоксид-радикал с локализацией неспаренного электрона на атоме кислорода. По структуре, и отчасти по свойствам, такой радикал напоминает супероксид, и его можно отнести к активным формам кислорода, что и делают некоторые авторы. Образующиеся при перекисном окислении липидов гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот также можно отнести к этой категории активных форм, по аналогии с пероксидом водорода. В эту же категорию попадают тогда и алкоксильные радикалы липидов, образующиеся при одноэлектронном восстановлении гидроперекисей, например, ионами Fe²⁺; по сути, это гомологи гидроксильного радикала.

Несмотря на все сказанное, мы предлагаем объединить все перечисленные продукты (и реагенты) цепного окисления липидов одним термином: активные формы липидов. Для биолога и врача все же важнее, не у какого именно атома локализован непарный электрон, а какая молекула при этом становится химически агрессивной, т. е. приобретает черты свободного радикала или его реактивного предшественника. Итак, к активным формам липидов мы отнесем алкильные, алкоксильные и диоксид-радикалы. а также гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот и соответствующих цепей фосфолипидов, триглицеридов или холестерина (см.рис. 5).

Вторичные и третичные радикалы

Реактивные молекулы: перекись водорода, гидроперекиси липидов, пероксинитрит, - образуются в реакциях, одним из участников которых в большинстве случаев является радикал, а иногда - диоксиген, который, впрочем, тоже имеет неспаренные электроны на внешней электронной оболочке. В свою очередь, эти молекулы, а наряду с ними - гипохлорит, охотно образуют радикалы в присутствии ионов металлов переменной валентности, в первую очередь - ионов двухвалентного железа. Такие радикалы мы будем называть вторичными; сюда относятся радикал гидроксила и радикалы липидов. Вторичные радикалы, в отличие от первичных, образуются в неферментативных реакциях и, насколько известно в настоящее время, не выполняют физиологически-полезных функций. Напротив, они обладают разрушительным действием на клеточные структуры и с полным основанием могут быть названы вредными радикалами. Именно образование вторичных радикалов (а не радикалов вообще) приводит к развитию патологических состояний и лежит в основе канцерогенеза, атеросклероза, хронических воспалений и нервных дегенеративных болезней (см. обзоры {Cross, 1987 #4}{Cross, 1994 #5}{Darley-Usmar, 1995 #10}{Darley-Usmar, 1996 #11}). Впрочем, реактивные молекулы также обладают цитотоксическим действием, причем не только благодаря образованию из них свободных радикалов, но и непосредственно, как это доказано для пероксинитрита и гипохлорита, а в некоторых ситуациях - и для перекиси водорода.

Для защиты от повреждающего действия вторичных радикалов в организме используется большая группа веществ, называемых антиоксидантами, к числу которых принадлежат ловушки, или перехватчики свободных радикалов. Примером последних служат альфа-токоферол, тироксин, восстановленный убихинон (QH₂) и женские стероидные гормоны. Реагируя с липидными радикалами, эти вещества сами превращаются в радикалы антиоксидантов, которые можно рассматривать как третичные радикалы (см. рис. 3).

Наряду с этими радикалами, постоянно образующимися в том или ином количестве в клетках и тканях нашего организма, разрушительное действие могут оказывать радикалы, появляющиеся при таких воздействиях, как ионизирующее излучение, ультрафиолетовое облучение или даже освещение интенсивным видимым светом, например, светом лазера. Такие радикалы можно назвать чужеродными. К ним принадлежат также радикалы, образующиеся из попавших в организм посторонних соединений, ксенобиотиков, многие из которых оказывают токсическое действие именно благодаря свободным радикалам, образующимся при метаболизме этих соединений (рис. 3).

Основные методы изучения реакций с участием радикалов

Об участии свободных радикалов в том или ином процессе, будь то химическая реакция в пробирке или развитие патологического состояния в организме, можно судить, используя прямые и непрямые методы ([1], стр. 19-32). "Самый прямой" метод изучения свободных радикалов - метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить о существовании непарных электронов в образце, определять их концентрацию, а иногда и выяснить, какова химическая структура радикалов, которые эти непарные электроны содержат. К прямым методам изучения радикалов можно отнести также метод хемилюминесценции (ХЛ). При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая в некоторых случаях испускается в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы и, следовательно - их концентрации.

Главными непрямыми методами изучения реакций, в которых участвуют радикалы, служат определение концентрации конечных продуктов реакции, а также применение ингибиторов. Остановимся подробнее на этих методах.

Ингибиторный анализ

Радикалы обладают высокой реакционной способностью и изучать их обычными химическими методами невозможно: стандартные процедуры вроде хроматографии или центрифугирования совершенно бесполезны. Биохимические анализы позволяют, правда, определять конечные продукты реакций, в которых предполагается участие радикалов, но всегда остается вопрос, а действительно ли радикалы участвовали в процессе и какие именно. Важную роль при решении таких вопросов играет так называемый ингибиторный анализ.

Классическим примером может служить применение фермента супероксиддисмутазы (СОД). Этот фермент катализирует реакцию взаимодействия (дисмутации) двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Если добавление СОД тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал и остается выяснить, в какой именно реакции этот радикал участвует. Можно сказать без приувеличения, что современные успехи в изучении роли свободных радикалов в жизни и смерти наших клеток, органов и тканей во многом обязаны именно открытию фермента супероксиддисмутазы (СОД), которое сделали И. Фридович и Мак-Корд около четверти века тому назад. Этот фермент, как уже говорилось, катализирует реакцию:^.OО^- + ^.ОО^- + 2Н⁺ => O₂ + H₂O

В присутствии другого фермента, каталазы, перекись водорода разлагается с образованием кислорода и воды:

H₂O₂ => O₂ + H₂O

Открытие СОД совершило переворот в умах биохимиков: раз есть фермент, удаляющий свободные радикалы, специально вырабатываемый живыми клетками (и, как выяснилось, чрезвычайно широко распространенный в живой природе), то ясно, что и сами радикалы существуют в природе и почему-то их надо обязательно удалять. До этого мало кто из биохимиков осознавал, что в метаболизме живых организмов участвуют не только "настоящие" молекулы, но и свободные радикалы. Затем СОД и каталаза стали широко использоваться во всех исследованиях, где изучают роль супероксида и перекиси водорода в том или ином процессе, будь то индивидуальная биохимическая реакция или развитие болезни у лабораторных животных или человека. Если, например, добавление СОД резко тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал и теперь предстоит лишь выяснить, в какой именно химической реакции этот радикал участвует. Если же процесс тормозится каталазой, значит, в нем участвует перекись водорода, разлагаемая этим ферментом.

Таков же принцип применения других ингибиторов. Так для выяснения роли липидных радикалов используют жирорастворимые "ловушки" радикалов, к числу которых относятся каротиноиды и токоферолы (витамин Е). Эти вещества, реагируя с радикалами L· или LOO·, обрывают цепи окисления и ингибируют пероксидацию липидов. Таким же свойством обладают стероидные гормоны и тироксин. Антиоксидантное действие этих веществ проявляется и в их влиянии на кинетику хемилюминесценции (см. например, рис. 3, Б). Широко применяется также синтетическая "ловушка" радикалов, ди-трет-бутилгидрокситолуол (ионол).

Другие ловушки радикалов не так специфичны, но тоже иногда используются. Так, водорастворимые радикалы эффективно "перехватываются" аскорбиновой или мочевой кислотой. Для "улавливания" гидроксил-радикалов (HO·) используют маннитол или бензойную кислоту, а иногда - этанол. Для выяснения участия в каком-нибудь процессе реакций цепного окисления липидов (см. ниже) используют жирорастворимые "ловушки" липидных радикалов, которые ведут цепи окисления. К числу таких ловушек относятся токоферол (витамин Е) и некоторые синтетические соединения, например трет-бутилгидрокситолуол (ионол). Водо-растворимые радикалы эффективно "перехватываются" аскорбиновой или мочевой кислотой. Для "улавливания" радикалов гидроксила (HO·) используют маннитол или бензойную кислоту, а иногда - этанол. Надо однако сказать, что далеко не всегда ловушки специфичны: многие из них реагируют не только с радикалами, но и с достаточно активными молекулами.

Метод электронного парамагнитного резонанса

Хотя польза исследований, основанных на изучении молекулярных продуктов свободнорадикальных реакций и ингибиторного анализа, сомнений не вызывает, не следует пренебрегать возможностью прямого обнаружения свободнорадикальных реакций и непосредственного изучения изменения их концентрации в ходе исследуемого процесса.На сегодняшний день существует два прямых метода обнаружения радикалов: электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и хемилюминесценция (ХЛ).

Рис.

Методом ЭПР удается довольно уверенно изучать радикалы семихинонов, в частности, радикалы убихинола и токоферола (см. спектры на рис. 6). Радикалы активных форм кислорода и липидов непосредственно наблюдать обычно не удается. Лишь используя метод быстрого смешивания двух растворов при их непрерывном протоке (см. рис. 7), удалось наблюдать сигналы ЭПР липидных радикалов, образующихся при разложении гидроперекисей линолевой кислоты ионами Ce⁴⁺ и Fe²⁺, правда, довольно слабые, несмотря на огромные расходы реактивов {Осипов, 1980 #594}. Попытки непосредственно обнаружить методом ЭПР радикалы кислорода или липидов в биологических системах оказались неудачными, поскольку стационарные концентрации большинства радикалов, таких как радикалы кислорода или липидов, в биологических системах слишком малы. Успех пришел, однако, после разработки метода спиновых ловушек.

Спиновые ловушки

При всех достоинствах метода ЭПР, его чувствительности оказывается зачастую недостаточной для обнаружения свободных радикалов, которые между тем не только образуются в исследуемом образце, но и участвуют в важных процессах, в нем протекающих. Вся беда в высокой химической активности радикалов. В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих радикалов; поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени (так называемая стационарная концентрация) зачастую так мала, что их невозможно обнаружить методом ЭПР.

Чем активнее радикал, тем ниже его стационарная концентрация и тем меньше шансов "увидеть" его методом ЭПР. Выход из положения заключается в том, что активные радикалы переводятся в неактивные, стабильные, которые регистрируются с помощью ЭПР. С этой целью к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками (хотя "ловят" они, конечно не спины, а радикалы). Например, для "улавливания" гидроксил-радикалов HO^. используют фенилбутилнитрон (ФБН).

При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название "спинового аддукта" (от английского слова add - добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе.

На рисунке 8, слева, приведен сигнал ЭПР спинового аддукта ФБН с ОН-радикалом, образовавшемся при разложении ионами двухвалентного железа перекиси водорода, а справа - сигнал ЭПР того же аддукта, образующегося в присутствии ФБН при взаимодействии гипохлорита с ионами двухвалентного железа.

Рис.

Для улавливания других радикалов (скажем, супероксида) используют другие ловушки. Поскольку спиновая ловушка "перехватывает" свободные радикалы, она тормозит (ингибирует) тот процесс, который этими радикалами вызывается, например, уменьшает повреждение живых клеток радикалами. ОН. Таким образом, спиновые ловушки используются в двух целях: чтобы выяснить, какие радикалы образуются и какие процессы в клетке они вызывают.

Метод хемилюминесценции

К эффективным методам изучения реакций, идущих с участием радикалов, можно отнести метод хемилюминесценции (ХЛ). В основе его лежит то обстоятельство, что при взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая может испускаться в виде фотонов (квантов света). Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы и, следовательно, показывает изменение их концентрации в ходе изучаемого процесса. Подробнее об этом будет сказано в лекции "Собственная хемилюминесценция ("сверхслабые свечения") в биологических системах".

Изучение кинетики реакций

Реакции с участием свободных радикалов, в особенности реакции цепного окисления, отличаются большой сложностью и протекают через ряд последовательных стадий. В изучении механизма цепных реакций основную роль сыграло исследование кинетики процессов; при этом измерение кинетики хемилюминесценции позволяет непосредственно видеть изменение во времени концентрации радикалов, например радикалов липидов. Параллельное измерение хемилюминесценции, окисления ионов двухвалентного железа и накопления продуктов реакции в суспензиях митохондрий и фосфолипидных везикул (липосом) позволило экспериментально определить константы скоростей основных реакций свободнорадикального цепного окисления липидов, как это будет рассмотрено несколько позже более подробно.

Свободные радикалы в биологических системах

Известно, что в органических молекулах (включая те, из которых состоит организм человека) электроны на внешней электронной оболочке располагаются пара ми -- одна пара на каждой орбитали. Свободные ради калы отличаются от обычных молекул тем, что у них на внешней электронной оболочке имеется неспаренный (одиночный) электрон. Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо отдать лишний электрон. В обоих случаях молекула-мишень модифицируется.

Неспаренный электрон в радикалах принято обозначать точкой. Например, радикал гидроксила обозначают HO*, радикал перекиси водорода HOO*, ради кал супероксида *OO или O2~. Как пример приведены формулы трех радикалов этилового спирта: CH₃CH₂O*; CHjC'HOH; 'CH₂CH₂OH.

Радикалы обладают высокой реакционной способностью, и изучать их обычны ми химическими методами невозможно: стандартные процедуры вроде хроматографии или центрифугирования бесполезны. Биохимические анализы позволяют, правда, определять конечные продукты реакций, в которых предполагается участие радикалов, но всегда остается вопрос, а действительно ли радикалы участвовали в процессе и какие именно. Важную роль при решении таких вопросов играет так называемый ингибиторный анализ. Классическим примером может служить применение фермента супероксиддисмутазы (СОД). Этот фермент, открытый Дж. Мак-Кордом и И. Фридовичем около тридцати лет назад, катализирует реакцию взаимодействия (дисмутации) двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Открытие СОД совершило революцию в умах биохимиков: раз есть фермент, удаляющий кислородные радикалы и специально вырабатываемый живыми клетками (и, как выяснилось, чрезвычайно широко распространенный в живой природе), то ясно, что и сами радикалы существуют в природе и почему-то их надо обязательно удалять. Постепенно СОД стали широко использовать во всех исследованиях, где изучают роль супероксида в том или ином процессе, будь то индивидуальная биохимическая реакция или развитие болезни у лабораторных животных или человека. Если добавление СОД тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал. Остается выяснить, в какой именно реакции этот радикал участвует. Ингибиторный анализ исполь зуют и для изучения реакций с участием других радикалов. Так, для выяснения участия в каком-нибудь процессе реакций цепного окисления липидов используют жирорастворимые ловушки липидных радикалов, которые "ведут" цепи окисления. К числу таких ловушек относятся токоферол (витамин Е) и некоторые синтетические соединения, например трет-бутилгидроксито-луол (ионол). Водорастворимые радикалы эффективно перехватываются аскорбиновой или мочевой кислотой. Для улавливания радикалов гидроксила (HO*)используют маннитол или бензойную кислоту, а иногда этанол. Надо, однако, сказать, что далеко не всегда ловушки специфичны: многие из них реагируют не только с радикалами, но и с достаточно активными молекулами.

Методы биофизики. Прямой метод изучения свобод ных радикалов -- это метод электронного парамагнитно го резонанса (ЭПР) [1]. По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить о существовании непарных электронов в образце, определять их концентрацию, а иногда и выяснить, какова химическая структура радикалов, которые эти непарные электроны содержат. Эффективным методом изучения реакций с участием радикалов оказался метод хемилюминесцен-ции (ХЛ) [2--4]. При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая может излучаться в виде квантов света. Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы, и, следовательно, показывает изменение их концентрации по ходу реакции.

Надо отметить, что чувствительности этих методов часто бывает недостаточно. В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих радикалов, поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени обычно мала. Выход из положения заключается в использовании так называемых спиновых ловушек в методе ЭПР и активаторов свечения в методе хемилюминесценции. В первом случае к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками. Например, для за хвата радикалов гидроксила HO* используют фенилбу-тилнитрон (ФБН При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название спинового аддукта (от англ. add -- добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов используют другие ловушки.

Согласно предложенной нами классификации, большинство радикалов, образующихся в организме чело века, можно разделить на природные и чужеродные (рис. 1). Природные радикалы можно, в свою очередь, разделить на первичные (природные, табл. 1), вторичные (повреждающие, табл. 2) и третичные (радикалы антиоксидантов). Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем. Эти радикалы выполняют полезные для организма функции. Из первичного радикала -- супероксида, а также в результате других реакций в организме могут образоваться весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, с первую очередь ионов Fe²+, из этих веществ образуются вторичные свободные радикалы, такие, как радикал гидроксила и радикалы липидов, которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры (см. табл. 2).

Перечисленные в табл. 1 и 2 радикалы можно считать природными, поскольку они в определенном количестве всегда образуются в наших клетках. При действии ионизирующей и ультрафиолетовой радиации, а также при превращениях некоторых неприродных соединений, попавших в организм человека, в клетках и тканях также могут появляться радикалы.

Радикалы кислорода. Человеку, как и всякому многоклеточному организму, приходится бороться с микробами, случайно попавшими внутрь его тела в кровь. Эту борьбу ведут специализированные клетки -- фагоциты, к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые клетки -- макрофаги. Все эти клетки, соприкасаясь с поверхностью клеток бактерий, начинают энергично выделять свободные радикалы в результате переноса электрона от НАДФН-оксидазного ферментного комплекса, встроенного в мембраны фагоцита, на растворенный молекулярный кислород

НАДФН + 2O=O --> НАД+ + 2COO") (супероксид анион-радикал).

При этом каждая молекула НАДФН, окисляясь, отдает один за другим два электрона двум молекулам кислорода, в результате чего образуется два анион-радикала супероксида.

Супероксид-радикалы могут нанести вред как самим фагоцитам, так и другим клеткам крови и, разумеется, микробам, вызвавшим активацию макрофага. Естественно, что все эти клетки стараются избавиться от супероксид-радикалов, для чего они вырабатывают ферменты, называемые супероксиддисмутазами (СОД). Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала:

При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода. Судьба последней может быть разной.

В норме фагоциты используют перекись водорода для синтеза гипохлорита, выделяя специальный фермент -- миелопероксидазу (МП). Миелопероксидаза катализирует реакцию:

Гипохлорит разрушает стенку бактериальной клетки и тем самым убивает бактерии. Перекись водорода диффундирует в клетки, но там разрушается в результате

Окись азота. Второй свободный радикал, синтезируемый живыми клетками, -- это моноксид азота *NO, часто называемый просто окисью азота. Структурную формулу окиси азота можно записать так: *N=O. NO образуется клетками стенок кровеносных сосудов (эндотелия), фагоцитами, нервными и многими другими клетками. Эта реакция катализируется гемсодержащими ферментами NO-синтазами. В присутствии соединений, содержащих S^^^rai, из NO образуется выделяемый эндотелием "фактор расслабления". Он играет ключевую роль в регуляции тонуса сосудов и кровяного давления: его недостаток приводит к гипертонии, избыток -- к гипотонии. Именно нарушением метаболизма фактора расслабления объясняют гипертонию и другие болезни, связанные с нарушением нормального кровяного давления. NO выделяется также клетками-фагоцитами и вместе с супероксидными радикалами используется для борьбы с микробами (преимущест венно грибковой природы). Полагают, что цитотокси-ческое действие NO обусловлено его реакцией с супероксидом:

O=N--O--OH (пероксинитрит).

Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием ЧШ:

O=N--O--OH --> O=N--O^ + ^OH (радикал гидроксила).

Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к повреждению клеток. Хорошо, если повреждающее действие системы (NO + супероксид) направлено на болезнетворные микроорганизмы. Плохо, если оно направлено на свои собственные клетки и ткани. Поэтому в тех участках кровяного русла, где выделяется NO^ (как необходимый регулятор кровяного давления), не должно быть супероксидных радикалов. Для этого, в частности, в этих местах синтезируется фермент СОД, который удаляет супероксид.

Радикал коэнзима Q. На конечном этапе окисления субстратов в клетках электроны переносятся от НАДН и либо при одноэлектронном восстановлении убихино на (Q на рис. 2):

процесса переноса электронов, но при нарушении работы дыхательной цепи он может стать источником других, менее безобидных радикалов, а именно радикалов кислорода.

Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии, и следует остановиться на ее механизме [3]. Реакция протекает в несколько стадий, которые получили название "инициирование", "продолжение", "разветвление" и "обрыв" цепи (рис. 3).

Рассмотрим эти стадии подробнее. Инициирование цепной реакции начинается с того, что в липидный слой мембран или липопротеинов внедряется свободный радикал. Чаще всего это радикал гидроксила. Будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, он способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом образуются липидные радикалы:

HO^ + LH --> H₂O +

Чередование двух последних реакций и представляет собой цепную реакцию пероксидации (перекисного окисления) липидов (см. рис. 3, вверху). Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в при сутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом Образующиеся радикалы LO^ инициируют новые цепи окисления липидов (см. рис. 3, внизу):

LO^ + LH --> LOH + L^; + O₂ --> LOO^ и т.д.

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов перемен ной валентности (например, теми же Fe²+) или друг с другом:

LOO^ + Fe²+ + H+ --> LOOH,

LOO^ + InH --> br\

LOO^ + LOO^ --> молекулярные продукты.

Последняя реакция особенно интересна, поскольку она сопровождается свечением (хемилюминесценци-ей). Интенсивность сверхслабого свечения однозначно отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале, и измерение хемилю-минесценции довольно часто используется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах [2--4].

Биологические последствия пероксидации липидов

Увеличенное образование свободных радикалов в организме (которое иногда называют оксидативным стрессом) и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов сопровождаются нарушениями в свойствах биологических мембран и функционировании клеток. Наиболее изучены три прямых следствия перекисного окисления липидов. Первое следствие -- перекисное окисление липидов сопровождается окислением тиоловых (сульфгидрильных) групп мембранных белков (Pr). Это может приводить в результате к неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов. При этом образуются сульфгидрильные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов либо окисляются кислородом с образованием производных сульфоновой кислоты:

Pr--SH + --> LH + Pr--S^,

Prj--S^ + Pr₂--S^ --> Prj--SS--Pr₂,

Pr--S^ + O₂ --> Pr--SO2 --> --- молекулярные производные.

Связанное с перекисным окислением липидов окисление белков и образование белковых агрегатов в хруста лике глаза заканчиваются его помутнением. Этот процесс играет важную роль в развитии старческой и других видов катаракты у человека. Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Ca²+-АТФазы [6]. Инактивация этого фермента приводит к замедлению откачивания ионов кальция из клетки и, наоборот, к входу кальция в клетку, увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки. На конец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий -- ионы калия. В результате происходят увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембран.

Второй результат перекисного окисления липидов связан с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Так, показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция. Это приводит к потере митохондриями способности осуществлять синтез АТФ, и клетка оказывается в условиях энергетического голода. Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры.

Третий (и, быть может, самый важный) результат пероксидации -- это уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому про бою мембраны собственным мембранным потенциалом, то есть под действием разности электрических потенциалов, существующей на мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций [7].

В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под строгим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, отчего скорость его невелика. Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, на прооксиданты (усиливают процессы перекисного окисления) и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов), ионы двухвалентного железа.

Хотя сам процесс перекисного окисления развивается в виде цепных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, начальные (а возможно, и промежуточные) стадии этой сложной системы реакций протекают в водной фазе. Часть защитных систем клетки так же локализуется в водной (рис. 4), а часть -- в липидной фазе (рис. 5). В зависимости от этого можно говорить о водорастворимых и гидрофобных антиоксидантах. Бо лее подробное рассмотрение этого вопроса выходит за рамки данной статьи (см. [8]).

Литература

1.Блюменфельд Л.А., Тихонов А.Н. Электронный парамагнитный резонанс // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 9. С. 91--99.

2.Владимиров Ю.А., Литвин Ф.Ф. Исследование сверхслабых свечений в биологических системах // Биофизика. 1959. Т. 4, № 5. С. 601--605.

3.Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление ли пидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.

4.Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. № 6. С. 25--32.

5.Осипов А.Н., Якутова Э.Ш., Владимиров Ю.А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа // Биофизика. 1993. Т. 38, № 3. С. 390--396.

6.Владимиров Ю.А. Кальциевые насосы живой клетки // Со росовский Образовательный Журнал. 1998. № 3. С. 20--27.

7.Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. 1987. Т. 32, № 5. С. 830--844.

Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика. 1992. Т. 29. С. 3--250.

Размещено на Allbest.ru