92

На правах рукописи

СОРОКИНА Ирина Васильевна

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ

ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПОЛИОРГАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

ТРИТЕРПЕНОИДАМИ КЛАССА ЛУПАНА -

БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТОЙ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫМИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Новосибирск - 2010

Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н.Н.Ворожцова СО РАН и Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск)

Научные консультанты:

доктор биологических наук,

профессор Толстикова Татьяна Генриховна

доктор биологических наук,

профессор Лушникова Елена Леонидовна

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор Ляхович Вячеслав Валентинович

доктор биологических наук, профессор Айдагулова Светлана Владимировна

доктор биологических наук, профессор Плотников Марк Борисович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование схем полихимиотерапии злокачественных опухолей является одной из актуальных проблем практической онкологии. Наряду с разработкой препаратов, обладающих высокой цитостатической активностью, в последнее время также развивается направление, связанное с поиском агентов - модификаторов биологических реакций, повышающих переносимость традиционной противоопухолевой терапии. (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Трещалина Е.М., 2005; Pucheault M., 2008). Основными требованиями к агенту-кандидату являются низкая токсичность, отсутствие стимулирующего влияние на опухоль и ее метастазы, усиление противоопухолевого иммунитета, повышение морфо-функционального статуса здоровых клеток и тканей.

Большинство применяемых в клинической практике препаратов-модификаторов является иммуномодуляторами белковой природы: БСЖ, препараты тимуса (Т-активин, тималин), полипептиды (бестатин, циклоспорин А), цитокины и факторы роста, стимуляторы гемопоэза (колониестимулирующие факторы) и др. Побочными эффектами данных биогенных стимуляторов являются нежелательные иммунологические реакции (выработка нейтрализующих антител, сенсибилизация), а также способность стимулировать в определенных условиях рост первичного узла или метастазов опухоли (Трещалина Е.М., 2005; Корман Д.Б., 2006). Этих недостатков лишены препараты растительного происхождения, обладающие противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами. В лечении злокачественных новообразований показана высокая эффективность экстрактов шлемника байкальского, элеутерококка, подорожника, побегов и листьев облепихи и др. (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000; Амосова Е.Н. и др., 2003). Поскольку растительные соединения обычно обладают комплексной активностью (гепатопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и иммуномодулирующей) и лучше переносятся организмом, то они остаются в фокусе внимания при отборе корректоров химиотерапии.

В настоящее время поиск перспективных растительных корректоров цитостатиков ведется среди соединений различных классов: алкалоидов, сапонинов, флавоноидов, кумаринов, полисахаридов, терпеноидов и др (Жанатаев А.К. и др., 2004; Разина Т.Г. и др., 2006). В этом ряду особое значение имеют пентациклические тритерпеноиды лупанового типа - легкодоступные вторичные растительные метаболиты. В экспериментах in vitro установлено, что бетулин, лупеол, бетулиновая кислота и их производные проявляют противовоспалительную, противоопухолевую, противовирусную, антимикробную активность (Chartulvedula V.P. et al., 2003; Mutai C. et al., 2004; Tolstikova T.G. et al., 2006). В опытах на животных было показано, что эти агенты могут использоваться для профилактики и лечения злокачественных опухолей. Уникальным свойством данных соединений является сочетание цитотоксического действия на опухолевые клетки и низкой токсичности в отношении нетрансформированных клеток (Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004; Chaturvedy P.K. et al., 2008). В настоящее время бетулиновая кислота проходит клинические испытания за рубежом в качестве препарата для профилактики и лечения меланомы и диспластического невуса (Fulda S. et al., 2009). Синтетические трансформации тритерпеноидов лупанового ряда рассматриваются как современный и перспективный подход к получению нового поколения препаратов с противоопухолевыми и химиопревентивными свойствами (Baglin I. et al., 2003, Cichewicz R.H., Kouzi S.A., 2004).

Другой многообещающей лупановой платформой можно считать бетулоновую кислоту (БК), получаемую путем одностадийного окисления бетулина. Несмотря на то, что БК является близким структурным аналогом бетулиновой, ее синтетические превращения и фармакологические свойства, в отличие от последней, до сих пор широко не изучены. По имеющимся данным, полученным на культурах опухолевых клеток человека (миеломы, лимфомы, карциномы молочной железы и яичника и др.), цитотоксическая активность БК в 2 - 19 раз выше, чем у бетулиновой (Ле Банг Шон и др., 2004; Шинтяпина Ф.Б. и др., 2008).

Результаты исследований, проведенных за последние 10 лет, выявили молекулярные мишени тритерпеноидных соединений в клетке, что позволило обосновать политаргетный механизм их действия. Показано, что взаимодействуя с белком KEAP1, тритерпеноиды активируют гены сигнального пути Nrf2, кодирующие семейство цитопротекторных белков, включая ферменты синтеза глутатиона, хинонредуктазу, каталазу, супероксиддисмутазу, гемоксигеназу, тиоредоксин, а также подавляют индукцию ЦОГ2 и NO-синтазы (Liby K.T. et al., 2007; Chaturvedy P.K. et al., 2008). Противовоспалительная активность агентов также связана с ингибированием белков сигнального пути NFкB, регулирующего процессы воспаления, апоптоза и дифференцировки (Shishodia S. et al., 2006; Fulda S. et al., 2009). Противоопухолевое действие тритерпеноидов может реализовываться через индукцию ими внутреннего митохондриального пути апоптоза, не зависящего от внешнего, связанного с экспрессией р53 и CD95/FasL, что характерно для большинства противоопухолевых препаратов (Zarec J. et al., 2003; Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004). Последнее обстоятельство повышает интерес к тритерпеноидам, как агентам, способным преодолевать лекарственную устойчивость к традиционной химиотерапии. В доказательство этой способности в экспериментах на культурах опухолевых клеток был установлен синергический эффект бетулиновой кислоты с различными химиопрепаратами (доксорубицином, этопозидом, цисплатином, таксолом, актиномицином D), направленный на повышение апоптоза и подавление клоногенного окружения клеток опухоли (Fulda S. et al., 2005). Бетулиновая кислота также усиливает цитотоксический эффект винкристина на клетки меланомы (Sawada N. et al., 2005), повышает апоптотическую активность индуктора внешнего пути апоптоза TRAIL (Fulda S. et al., 2004).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что лупановые соединения могут потенциально являться эффективными средствами дополнительной противоопухолевой терапии. Однако до настоящего времени интересы исследователей фокусировались в основном на изучении противоопухолевой активности тритерпеноидов, в то время как их свойства как модификаторов биологических эффектов цитостатической химиотерапии оставались за рамками внимания. В частности, практически не исследовано протекторное действие лупанов в тканях животных на фоне цитотоксических полиорганных эффектов традиционных противоопухолевых препаратов. Отчасти это связано с тем, что основные результаты были получены в экспериментах на культурах клеток, в то время как системных исследований in vivo не проводилось.

Таким образом, актуальность изучения лупановых тритерпеноидов в качестве потенциальных модификаторов цитостатической химиотерапии не вызывает сомнений. Решение данной проблемы связано, прежде всего, с исследованием не изученных ранее клеточных механизмов протекторного действия тритерпеноидов в условиях полиорганных цитотоксических эффектов как индивидуальных противоопухолевых препаратов, так и комбинированных схем полихимиотерапии.

Цель исследования - выявить среди тритерпеноидов ряда лупана соединения с комплексной протекторной и противоопухолевой активностью и изучить клеточные механизмы коррекции цитотоксических повреждений разных тканей при комбинированном и изолированном введении противоопухолевых препаратов, исследовать влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатический полихимиотерапии.

Задачи исследования:

1. Провести широкий скрининг фармакологических свойств соединений ряда лупана и выявить среди них агенты с гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Изучить противоопухолевую активность и антиметастатический эффект лупановых тритерпеноидов.

2. Изучить особенности морфологических изменений печени и миокарда при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином).

3. Изучить особенности внутриклеточной реорганизации гепатоцитов и кардиомиоцитов при изолированном применении бетулоновой кислоты и ее производных и при их сочетаниях с цитостатиками (циклофосфамидом и доксорубицином) с оценкой цитопротекторных и цитотоксических свойств исследуемых агентов.

4. Изучить особенности коррекции бетулоновой кислотой и ее производными токсических эффектов полихимиотерапии СНОР у интактных животных

5. Изучить характер влияния отобранных соединений на морфологию и лейкоцитарный профиль периферической крови, клеточный состав костного мозга, уровень перекисного окисления липидов в условиях полихимиотерапии СНОР у животных с перевиваемыми опухолями.

6. Установить характер морфологических изменений печени и почек в условиях комбинированного воздействия цитостатической полихимиотерапии СНОР и лупановых тритерпеноидов.

7. Оценить влияние различных лупановых тритерпеноидов на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии СНОР у мышей с перевиваемыми опухолями - карциномой легких Льюис и злокачественной лимфомой RLS, резистентной к циклофосфамиду.

Научная новизна. Впервые в результате комплексного морфологического исследования изучен характер модифицирующего влияния бетулоновой кислоты и ее производных на действие цитостатических препаратов в различных тканях интактных животных и у животных с перевиваемыми опухолями. Впервые установлены in vivo фармакологические свойства широкого спектра лупановых соединений. Выделены наиболее эффективные тритерпеноидные агенты для включения их в схемы противоопухолевой терапии.

Впервые установлены особенности ремоделирования печени, сердца и почек, отражающие коррекцию тритерпеноидами повреждений, вызванных противоопухолевыми препаратами. Показано, что применение тритерпеноидов после моделирования противоопухолевой химиотерапии способствует снижению выраженности дистрофических и некробиотических изменений паренхиматозных клеток без значимого влияния на цитостатические свойства противоопухолевых препаратов.

Впервые выявлены особенности ультраструктурной перестройки основных внутриклеточных компартментов гепатоцитов и кардиомиоцитов под действием цитостатиков и тритерпеноидов. Показано, что бетулоновая кислота и ее в-аланиламид при изолированном введении интактным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты, эндотелиоциты). Впервые исследованы общецитологические особенности цитопротекторных и цитотоксических эффектов бетулоновой кислоты и ее в-аланиламида, представлены их ультраструктурные эквиваленты.

Впервые показано, что бетулоновая кислота и ее в-аланиламид, вводимые на фоне цитостатиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени и миокарда, потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции - в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. Установлено, что оба тритерпеноида не ингибируют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.

Получены доказательства иммуномодулирующей и противовоспалительной активности аланиламидов бетулоновой кислоты, лежащей в основе их системных эффектов и клеточных механизмов коррекции цитотоксического воздействия. Впервые проведено комплексное исследование протекторных свойств широкого ряда новых соединений лупанового типа, позволившее выявить перспективные агенты с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.

Теоретическая и практическая значимость. Впервые получены фундаментальные знания о фармакологической активности нового класса корректоров токсических эффектов цитостатической химиотерапии. Получены новые знания о характере тканевой и внутриклеточной реорганизации печени, почек, сердца и тимуса в условиях комбинированного и изолированного действия цитостатических противоопухолевых препаратов и тритерпеноидов лупанового типа.

Показана высокая перспективность бетулоновой кислоты как новой тритерпеноидной платформы для получения агентов с широким спектром фармакологической активности. На основании результатов исследования 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота рекомендована для доклинических испытаний в качестве препарата-модификатора цитостатической полихимиотерапии. Результаты исследования и методические подходы, разработанные в диссертации, могут быть использованы при подготовке материалов доклинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Тритерпеноиды лупанового ряда - новый класс модификаторов биологических реакций, оказывающих антиоксидантное, противовоспалительное и цитопротекторное действие при токсическом и лекарственном поражении. Аланиламидные производные бетулоновой кислоты в условиях цитостатической гемодепрессии модулируют содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови.

2. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее в-аланиламида как при изолированном, так и комбинированным с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов.

3. К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. При комбинированном применении с цитостатиками бетулоновая кислота и ее производные способствуют более быстрому восстановлению ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов, уменьшают степень выраженности дистрофических изменений эпителиоцитов почечных канальцев.

4. Введение БК и ее производных мышам-опухоленосителям понижает интенсивность перекисного окисления липидов и повышает противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии СНОР. В то же время бетулоновая кислота и ее в-аланиламид уменьшают выраженность дистрофических и некробиотических изменений гепатоцитов, обусловленных неопластическим процессом и полихимиотерапией.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), XII Международной конференции «Медицина XXI века» (Словакия, Низкие Татры, 2004), Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2004), Научно-практической конференции с международным. участием «Медицина и образование в XXI веке» (Новосибирск, 2004), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально значимых заболеваниях» (Новосибирск, 2004), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), Научной конференции «Перспективы развития биотехнологии в России» (Пущино, 2005), III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), III International Сonference «Basic science for Medicine» (Novosibirsk, 2007), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), II Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Казахстан, Алматы, 2007), EHRLICH II, 2^nd World Conference on Magic Bullets (Nurnberg, Germany, 2008), 2^nd Annual Russian-Korean Conference «Current issue of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010), ученом совете в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 64 работы, из них 21 - в рецензируемых журналах по списку ВАК, получено 6 патентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 232 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав с результатами собственных исследований, обсуждения, выводов; иллюстрирована 33 таблицами, 56 микрофотографиями. Список использованной литературы включает 348 работ отечественных и иностранных авторов.

Материал и методы ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследуемыми соединениями были 44 впервые синтезированных тритерпеноидов ряда лупана, в том числе 4 производных бетулина, 2 - лупеола и 38 - бетулоновой кислоты (БК). Соединения были получены из нескольких научно-исследовательских институтов Сибирского и Уральского отделений РАН. Все агенты вводили животным в виде взвеси в воде с Твином-80, готовившейся непосредственно перед экспериментом.

Эксперименты проводили на беспородных мышах (1844 особей) и крысах линии Вистар обоего пола (360 особей), а также мышах-самцах СВА/Lac (300 особей) и самках C57BL/6 (460 особей) (табл. 1), полученных из лаборатории разведения лабораторных животных Института цитологии и генетики СО РАН.

Во время опытов животных содержали в условиях естественного освещения, они получали гранулированный корм ПК120-1 (Лабораторснаб, Москва) и воду ad libitum. Все манипуляции выполняли в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под легким эфирным наркозом.

Экспериментальные модели и скрининг гепатопротекторных, антиоксидантных, противовоспалительных и противоопухолевых свойств. При скрининге синтезированных соединений использовали модели и схемы введения, рекомендованные для проведения доклинических исследований (Руководство …, 2005).

Модель CCl₄-индуцированного поражения печени. Беспородным мышам однократно вводили в желудок 25% раствор CCl₄ в подсолнечном масле. Испытуемые соединения вводили однократно внутрижелудочно в виде водно-твиновой взвеси в дозах 20, 50, или 100 мг/кг за 1 ч до токсического воздействия. В качестве референсного соединения использовали известный антиоксидант дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] (99% чистоты), который вводили в желудок в эффективной дозе 100 мг/кг. Контрольные животные получали водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. Гепатопротекторные свойства оценивали через сутки по снижению в сыворотке крови активности трансаминаз (АЛТ и АСТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) с использованием стандартных наборов реактивов («Biocon», «Olvex Diagnosticum»). Антиоксидантный эффект определяли у этих же животных по уменьшению в крови концентрации ТБК-активных соединений (ТБКАС), согласно общепринятой методике (Камышников В.С., 2000).

Модели индуцированного воспаления. Воспалительный отек вызывали у мышей введением в апоневроз задней лапы водного раствора флогогена (1,5% каррагенина или 0,1% гистамина) в объеме 0,05 мл. Тестируемые соединения вводили внутрижелудочно в виде водно-твиновой взвеси за 1 ч до введения флогогена. Референсными препаратами были субстанции индометацина («Fluka») и ибупрофена («ICN Farmaceutical») в дозах 20 мг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентное количество воды с твином. Через 5 ч после введения флогогена животных умерщвляли путем кранио-цервикальной дислокации и определяли массу обеих задних лап ниже голеностопного сустава с отеком и без него. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению индекса отека у животных опытных групп по сравнению с контролем. Индексы воспаления рассчитывали как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой, выраженной в процентах.

Модель экспериментальной полихимиотерапии. Применяли классическую схему СНОР, адаптированную для лабораторных животных (Каледин В.И. и др., 2000; Мишенина С.В. и др., 2002). Однократно парентерально вводили комплекс цитостатических препаратов в дозах, составляющих 1/5 от ЛД50 соответственно для мышей и крыс: циклофосфан («Биохимик», Саранск) - 50 и 21 мг/кг; доксорубицин - («ЛЭНС-Фарм», Москва) - 4,0 и 2,1 мг/кг; винкристин («Гидеон Рихтер», Венгрия) - 0,1 и 0,04 мг/кг; преднизолон («Гидеон Рихтер», Венгрия) - 5,0 и 2,1 мг/кг. Контрольным животным вводили эквивалентное количество физиологического раствора.

Методы перевивки и характеристика опухолевых штаммов. Для перевивки использовали штаммы опухолей с разной степенью злокачественности и чувствительности к циклофосфану. Весь перевивочный материал был получен из банка опухолей лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН. Использовали следующие штаммы опухолей:

- карциному легких Льюис (LLC), возникающую спонтанно у мышей линии С57Bl/6, растущую в виде солидного узла и метастазирующую гематогенно в легкие практически в 100% случаев (Козлов А.М., Софьина З.П., 1978). Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1 - 6х10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- лимфому LS - первично индуцированную у мышей СВА/Lac нитрозометилмочевиной, растущую в виде солидного узла, склонную к спонтанной регрессии (Каледин И.И., 2002). Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1х10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- лимфому RLS - субштамм лимфомы LS, возникший у мышей СВА/Lac в результате многочисленных пассажей на фоне введения повышающихся доз циклофосфана. Характеризуется агрессивным течением и устойчивостью к циклофосфану, спонтанной регрессии не подвергается, метастазирует гематогенно в печень и почки. Перевивали внутримышечно в бедро задней лапы по 1х10⁵ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора;

- асцитную опухоль Эрлиха перевивали беспородным мышам внутрибрюшинно по 0,2 мл асцита в разведении 1:10.

Лупановые тритерпеноиды вводили на разных стадиях развития опухоли: на фоне сформированного первичного узла или через 48 ч после перевивки. В первом случае применяли режимы однократного введения (внутрижелудочно - 500 мг/кг, внутрибрюшинно - 250 мг/кг) либо курсового (ежедневно по 50 мг/кг течение 8 дней). Во втором случае использовали курсовой режим введения и референсный препарат циклофосфан в дозах 100 и 40 мг/кг внутрибрюшинно. Критерием противоопухолевого эффекта было уменьшение объемов опухоли по отношению к контролю, которые измеряли в период от начала ее визуализации до наступления массовой гибели животных в группе.

Исследование особенностей и механизмов политаргетного действия тритерпеноидов в условиях изолированного и комбинированного введения противоопухолевых препаратов интактным животным. Эксперименты проводили в трех независимых сериях. Цитотоксическое воздействие моделировали: 1) однократным парентеральным введением интактным крысам комбинации циклофосфана (ЦФ), доксорубицина (ДОК), винкристина и преднизолона по схеме СНОР; 2) однократным внутрибрюшинным введением ЦФ в дозе 125 мг/кг; 3) однократным внутрибрюшинным введением ДОК в дозе 7 мг/кг. Дозы препаратов в двух последних сериях выбирали с учетом оптимальной выраженности основного побочного действия для каждого цитостатика (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2000).

Тритерпеноидные соединения вводили внутрь через сутки после цитотоксического воздействия в дозе 50 мг/кг в течение 13 дней. Состояние животных исследовали по следующим показателям: динамике массы тела, картине периферической крови, лейкоцитарной формуле, биохимическому профилю крови, клеточному составу костного мозга, массе основных паренхиматозных органов. В каждой серии экспериментов с помощью светооптических методов проводили морфологическое исследование органов-мишеней, преимущественно поражаемых цитостатиками: для СНОР - печени, почек, тимуса; для ЦФ - печени, сердца; для ДОК - сердца, печени. Обследование животных проводили дважды: в период максимальной выраженности токсического эффекта цитостатиков (4 - 5-й дни после введения) и после окончания введения тритерпеноидов (14 - 15-й дни).

Оценка действия тритерпеноидов и их влияния на противоопухолевую и антиметастатическую эффективность цитостатической полихимиотерапии животных с перевиваемымыми опухолями. Полихимиотерапию СНОР проводили у мышей с перевиваемыми опухолями LLC и RLS соответственно на 10-й и 5-й дни после перевивки. Изучаемые соединения вводили через сутки после цитостатиков внутрижелудочно в курсовом режиме в дозе 50 мг/кг течение 8 дней. Референсной группе мышей проводили только полихимиотерпию. Контролем была группа животных с опухолью, которые получали внутрь водно-твиновую взвесь. В период введения агентов оценивали их влияние на рост опухоли путем измерения объема опухолевых узлов штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Противоопухолевый эффект определяли по величине индекса торможения роста опухоли (ТРО), который рассчитывали как отношение разности средних объемов опухолей в контрольной и опытной группах к ее среднему объему в контроле.

По окончании введения соединений у животных исследовали периферическую кровь с использованием проточного гемоанализатора («Медоник Оден», Швеция). В мазках крови, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали лейкоцитарную формулу. В сыворотке крови определяли активности трансаминаз (АЛТ, АСТ) и вторичные продукты окисления (ТБАС). Для цитологического исследования брали костный мозг, для морфологического анализа и определения степени метастатического поражения брали образцы легких, печени и почек.

Методы морфологического исследования. Для светооптического исследования органы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, а затем подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе Микром («Zeiss», Германия). Для заливки в блоки использовали гистопласт. Срезы толщиной 4 - 5 мкм готовили на ротационном микротоме той же фирмы. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по методу PAS - гематоксилин - оранжевый G. Препараты исследовали в световых микроскопах Axioscop 2 plus и «Leica DM 4000B» (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровых фотокамер «Leica DFC 320» (Германия) и обрабатывали с помощью компьютерных программ «Leica QWin V3» и AxioVision.

Для электронно-микроскопического исследования брали образцы миокарда и печени размерами не более 1 мм³, которые первоначально фиксировали в 4% растворе параформальдегида, постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. После обезвоживания в серии спиртов возрастающей концентрации образцы печени заливались в смесь эпона и аралдита. Полутонкие (1 мкм) и ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором азура II. Полутонкие срезы использовали для морфологического описания, морфометрического и стереологического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Исследование проводили в электронном микроскопе JEM-1400 (фирмы «Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой камеры Veleta и программного обеспечения iTEM (фирма «Olympus», Япония, Германия).

Тканевый стереологический анализ проводили с помощью сетки из 289 точек (Автандилов Г.Г., 1990). В печени подсчитывали объемную плотность (Vv) зон с дистрофическими и некротическими изменениями гепатоцитов, объемную плотность синусоидов и клеток с двумя ядрами. В почках определяли объемную плотность нефроцитов с дистрофическими и некротическими поражениями, объемную плотность интерстициальной ткани и просветов канальцев.

Объемную плотность каждого структурного компонента в тканях определяли по формуле: Vv = X/n, где X - количество точек, приходящееся на каждый структурный компонент, n - общее количество подсчитанных точек. Изменение объемной плотности в опытных группах выражали в процентах относительно контроля.

Оценка клеточного состава костного мозга. Приготовление мазка костного мозга для подсчета миелограмм проводили согласно рекомендациям (Гольдберг Е.Д. и др., 1992) с некоторыми модификациями. Костномозговой канал левой бедренной кости вскрывали со стороны эпифиза и 0,05 мл плазмы крови крыс осторожно ресуспендировали непосредственно в канале, переносили на обезжиренное стекло и делали мазок шлифованным стеклом. Окраску препаратов производили по Папенгейму (Наджимитдинов С.Т., 1969), подсчитывали в каждом случае 500 миелокариоцитов.

Подсчет метастатических поражений проводили путем морфометрического анализа срезов обеих долей легких у мышей с перевиваемой LLC, печени и почек у животных с RLS.

Объемную плотность (Vv, %) метастазов подсчитывали по методу Г.Г.Автандилова (1990) с использованием окулярной сетки из 289 точек с помощью программы «Видео-Тест».

Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ).

Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ):

(Ак х Вк ) - (А х В) х 100%,

(А_к х В_к )

где

А_к - частота метастазирования в контрольной группе,

А - частота метастазирования в опытной группе,

В_к - плотность метастазов у животных контрольной группы,

В - плотность метастазов у животных опытной группы.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «STATISTIKA 6,0».

При оценке значимости различий применяли критерий Стьюдента, различия считались достоверными при р?0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Скрининг гепатопротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой активности

На модели CCl4-индуцированного поражения печени и индуцированного воспалительного отека лапы протестированы 44 тритерпеновых соединений лупанового типа, в том числе 4 производных бетулина, 2 - лупеола и 38 - бетулоновой кислоты (БК).

Среди них выявлены агенты со значимыми гепатопротекторным, антиоксидантным и противовоспалительным свойствами.

В ряду производных, синтезированных из БК, установлено, что наиболее высоким антицитолитическим эффектом, не уступающим дигидрокверцетину,

Обладают ее производные с аминокислотными фрагментами в положении С28 (в-алаБК, Of-19, Ме-в-алаБК, Ме-Ь-алаБК) (табл. 2).

Достоверный эффект продемонстрировали также секо-производные (Of-30, Of-31) и бетулоны с метиловым (Ме-БК), диоксииминовым (Of-15), оксимным (Of-2), нитроксильным (А75), фурфурилиденовым (Of-8) и анилиновым (ВГ153, ВГ157, ВГ132,) заместителями (см. табл. 2). Среди этих соединений выделяются агенты, обладающие дополнительно антихолестазными свойствами: Ме-в-алаБК, Of-8, Of-15, ВГ153, ВГ157, ВГ182 и Of-31.

В ряду производных БК выявлены соединения с большей, чем у референсного соединения, антиоксидантной активностью, в том числе сама БК, ее оксимы (Of-18, Of-2), триазолы (ВГ263, ВГ264, ВГ216, ВГ211), производные анилина (ВГ156, ВГ182), аланиламиды (Ь-алаБК, Ме-Ь-алаБК) (табл. 2). У некоторых агентов (Ме-в-алаБК, Of-15, ВГ157, Of-19) антиоксидантные свойства проявились лишь на уровне тенденции.

В результате скрининга производных БК на 2 моделях воспаления выявлены соединения с высокой противовоспалительной активностью (табл. 3). Эта группа агентов представлена в основном аланиламидными и анилиновыми производными БК и соединениями с метильным, децилуреидным и метилпиперазиновым заместителями в тритерпеноидной структуре. Аланиламиды БК проявляли статистически достоверный эффект в диапазоне доз 50 - 100 мг/кг, при этом их активность имела доза-зависимый характер. При введении в дозе 100 мг/кг их активность убывала в ряду в-алаБК>Ме-в-алаБК>Ь-алаБК>Ме-Ь-алаБК. Метиловый эфир БК был более активным, чем сама кислота. Аналогичная зависимость активности от структуры для производных с анилиновым фрагментом, вводимых в дозе 20 мг/кг, имела вид: ВГ174>ВГ182>ВГ112>ВГ157. В целом лупановые тритерпеноиды уступали по выраженности противовоспалительного действия индометацину, однако три производных в аналогичных условиях проявили активность, не уступающую референсному препарату: ВГ174, ВГ182 и Ме-БК.

Скрининг противоопухолевых свойств тритерпеноидов лупанового ряда проводили выборочно для соединений разных структурных типов с использованием нескольких видов перевиваемых опухолей при разных режимах и способах введения. В табл. 4 приведены максимальные значения индекса торможения роста первичного узла опухоли.

Сравнение эффективности однократного и курсового режимов введения аланинамидных производных выявило преимущество курсового введения, которое в большинстве случаев позволяло снизить дозу без существенного ослабления эффекта. Не установлено повышения активности агентов при внутрибрюшинном способе введения по сравнению с внутрижелудочным, что, по-видимому, объясняется низкой растворимостью исследуемых соединений в водных и липидных средах.

Оценивая выраженность противоопухолевого эффекта лупановых агентов, вводившихся через 2 сут после перевивки опухоли и на фоне сформировавшегося узла, можно сделать вывод об их относительно невысокой противоопухолевой активности, которая не превышала 50% по критерию ТРО и существенно уступала эффекту ЦФ. Вместе с тем, необходимо отметить, что изучаемые соединения не оказывали стимулирующего действия на рост трансплантатов. Наиболее значимую противоопухолевую активность демонстрировали БК и ее аланиламидные производные, 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-15), 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-41), 3в,28-ди-О-никотинат бетулина (of-3), нитроксил БК (А75), N-[3-оксо-лупано-28-ил]-4-метилпиперазин и N-[3-оксо-лупано-28-ил]-4-этилпиперазин (М-Ме и М-Et).

На основании результатов скрининга тритерпеноидов ряда лупана для дальнейшего исследования в качестве потенциальных корректоров цитостатиков были выбраны следующие соединения: БК, ее метиловый эфир (МеБК), 2-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота (б-алаБК), ее метиловый эфир (Ме-б-алаБК), 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оиламино]-пропионовая кислота (в-алаБК), ее метиловый эфир (Ме-в-алаБК), 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-41), 3-оксо-28-(N-метилпиперазин)-карбонил-луп-20(29)-ен (of-15) и 3в,28-ди-О-никотинат бетулина (of-3).

Морфологический анализ и клеточные механизмы политаргетных эффектов тритерпеноидов в условиях изолированного и комбинированного введения c противоопухолевыми препаратами

Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее в-аланиламидом цитотоксических эффектов циклофосфана у интактных животных. Ведущим осложнением при лечении ЦФ является угнетение иммунной системы и кроветворения. Введение экспериментальным животным этого алкилирующего препарата в токсических и субтоксических дозах вызывает глубокие и стойкие нарушения практически во всех ростках гемопоэза (Гольдберг Е.Д. и др., 2000). Для клинической картины ЦФ также характерно поражение печени, вызванное токсическими продуктами его метаболизма. Клинически данный тип поражения печени характеризуется ее увеличением, болезненностью и асцитом, развитием вено-окклюзионного синдрома и симптомами острого гепатита (Никитин И.Г. и Сторжаков Г.И., 2002). Образующийся при метаболизме ЦФ акролеин вызывает поражение почек и тяжелый геморрагический цистит. ЦФ также обладает кардиотоксическими свойствами (Лушникова Е.Л. и др., 2009).

В данной работе для оценки общей картины полиорганных повреждений, вызванных ЦФ, и их коррекции бетулоновой кислотой и ее в-аланиламидом, использовали интегральный показатель - коэффициенты массы внутренних органов. Анализ полученных данных выявил достоверный ингибирующий эффект ЦФ на лимфоидные органы - тимус и селезенку (табл. 5). В группе с изолированным введением цитостатика относительная масса тимуса на 4-й день опыта снизилась в 5 раз, а селезенки - в 2 раза относительно контроля.

К 14-му дню в этой же группе мышей масса тимуса отставала в 1,4 раза, а масса селезенки превысила в 2,5 раза соответствующие показатели контрольной группы.

Под действием ЦФ происходило достоверное повышение массы экскреторных органов, обусловленное их кровенаполнением вследствие нарушения гемодинамики. Масса почек на 4-й день увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контролем и оставалась повышенной до конца эксперимента, в конце опыта значимо повысились коэффициенты масс печени и легких.

Введение в-алаБК на фоне ЦФ полностью купировало его депрессивный эффект на тимус и селезенку, а также нормализовало массу экскреторных органов. Введение БК в тех же условиях не купировало негативный эффект цитостатика на оба лимфоидных органа в течение всего наблюдаемого периода и не оказало регулирующего влияния на массу выделительных органов. В режиме изолированного введения в-аланиламид не оказывал влияния на массу лимфоидных органов, в то время как БК, подобно ЦФ, вызвала такое же продолжительное угнетение тимуса и временное угнетение селезенки.

По данным литературы, однократное введение ЦФ в максимально переносимой дозе приводит к длительно сохраняющейся (до 6 мес) дезорганизации клеточного состава тимуса и нарушению функционального состояния клеток иммунной системы (Гольдберг Е.Д. и др., 2000; Захаров А.А., 2008). Известно, что снижение численности Thy1,2+ в костном мозге приводит к подавлению образования селезеночных колоний. Показано, что тимоциты необходимы для миграции КОЕ-С из костного мозга в селезенку, а также для активации колониеобразования в селезенке (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, 2008). Поэтому отмеченное нами снижение массы селезенки на 4-й день эксперимента в группах с изолированным введением ЦФ и его совместным введением с БК можно объяснить как значительным угнетением гемопоэза в костном мозге, так и выраженным угнетением тимуса в этот период.

В ряде работ показано, что восстановление массы селезенки сопровождается увеличением ее клеточности, связанной с активной миграцией костномозговых стволовых и некоммитированных кроветворных клеток в селезенку, что совпадает по времени с активным восстановлением гемопоэза в костном мозге. Восстановление массы селезенки происходит в большей степени за счет ее заселения клетками миелоидного ряда, тогда как численность лимфоцитарной колонии увеличивается позже [Barcew K., 2008, Sпefc L., 2003]. Эти данные объясняют развитие спленомегалии в группах с изолированным введением ЦФ и с его сочетанным введением с БК к 14-му дню опыта и косвенно указывают на восстановление кроветворной функции костного мозга и селезенки.

Отмеченные выше изменения в состоянии органов кроветворения нашли отражение в картине периферической крови крыс (табл. 6). Под влиянием ЦФ в первые четыре дня у животных развилась тяжелая лейкопения (снижение лейкоцитов в 13 раз), которая к 14-му дню сменилась лейкоцитозом (увеличение лейкоцитов в 3,6 раза). В этих условиях БК и в-алаБК оказали модулирующий эффект, снижая выраженность как лейкопении (в 1,4 раза), так впоследствии и лейкоцитоза (в 1,3 - 1,7 раза относительно циклофосфана). При изолированном введении оба тритерпеноидных агента не вызвали статистически значимых изменений в содержание лейкоцитов периферической крови.