Регуляция стресс-устойчивости фотосинтетического аппарата индукторами различной природы

39

На правах рукописи

КРЕСЛАВСКИЙ ВЛАДИМИР ДАНИЛОВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ СТРЕСС-УСТОЙЧИВОСТИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ИНДУКТОРАМИ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Москва - 2010

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На всем протяжении процесса вегетации растения подвержены негативному воздействию стрессовых факторов различной природы, что приводит к снижению продуктивности за счет ингибирования роста и фотосинтеза. Изучение путей повышения устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды относится к числу приоритетных направлений современной физиологии растений. Оно связано с именами ряда известных ученых, в частности, В.Я. Александрова, А.Ф. Титова, Вл.В. Кузнецова, J.A. Berry, О. Bjцrkman, N. Murata.

Фотосинтетический аппарат (ФА) растений - одна из наиболее чувствительных к абиотическому стрессу клеточных систем. Хотя физиологические, биофизические и биохимические аспекты фотосинтеза и функционирования фотосистем подробно изучены благодаря исследованиям известных Российских и зарубежных ученых: А.А. Красновского, В.А. Шувалова, А.Б. Рубина, Н.В. Карапетяна, В.В. Климова, Ю.С. Карпилова, Дж. Барбера, Говинджи и др., - закономерности формирования устойчивости ФА к неблагоприятным внешним факторам и механизм действия физиолого-биохимических защитных реакций исследованы недостаточно. Между тем, понимание основных закономерностей формирования стресс-устойчивости ФА позволяет выявить наиболее эффективные пути повышения устойчивости растений к стрессовым факторам, и, следовательно, снизить их негативное действие на продукционный процесс.

Одним из ключевых путей повышения стресс-устойчивости ФА является, по-нашему мнению, использование индукторов защитных систем растений, то есть факторов, активизирующих естественные стресс-защитные механизмы растений (Шакирова, 2001).

Индуктором может быть слабый предшествующий стресс, который индуцирует устойчивость к стрессу другого типа (кросс-адаптация). Слабый стресс может быть вызван неблагоприятными факторами внешней среды, в частности, повышенной температурой, различными факторами химической природы, такими как некоторые ретарданты, например, холинхлорид (ХХ) (Sheng et al., 2006) и фитогормоны (Шакирова, 2001; Титов и др., 2006), а также физической природы, например, узкополосным красным светом (Будаговский, 2008). ФА часто играет ключевую роль в устойчивости растений к неблагоприятным внешним факторам, однако механизм повышения устойчивости ФА индукторами защитных систем растений во многом остается невыясненным. Имеются только единичные работы по сравнительному исследованию влияния индукторов различной природы на стресс-устойчивость ФА и целого растения (Dat et al., 1998). Можно предположить, что одним из наиболее общих механизмов действия таких индукторов является кратковременное накопление активных форм кислорода (АФК), играющих регуляторно-сигнальную роль, а также, в ряде случаев, - абсцизовой кислоты (АБК) и активной формы фитохрома (Фх). Такого рода исследования могли бы быть полезны для целенаправленного отбора эффективных индукторов, повышающих стресс-устойчивость растений.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование регуляции стресс-устойчивости фотосинтетического аппарата высших растений с помощью индукторов защитных систем растений.

На основе литературных данных (Lingakumar, Kulandaivelu, 1993; Gilley, Fletcher, 1997) мы предположили, что эффективными индукторами защитных систем являются ретарданты хлорхолинхлорид (ХХХ) и ХХ, а также красный свет (КС) в спектральной области 620-660 нм. Представляло интерес сравнить действие этих разных по природе факторов между собой и с традиционным фактором, который увеличивает стресс-устойчивость растений - закаливающей температурой. Были изучены условия, при которых данные факторы индуцируют повышенную (пониженную) стресс-устойчивость ФА и некоторые пути ее регуляции.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние индукторов защитных систем растений (хлорхолинхлорид, холинхлорид, а также КС и закаливающие повышенные температуры) на устойчивость ФА к высоким температурам, УФ-облучению и свету высокой интенсивности.

2. Исследовать роль антиоксидантной и фитогормональной систем в повышении стресс-устойчивости ФА при действии индукторов защитных систем растений.

3. Изучить роль Н₂О₂ в первичных ответных реакциях ФА на действие индукторов защитных систем.

4. Исследовать роль фитохромной системы в повышении стресс-устойчивости ФА растений к УФ-радиации.

5. Изучить влияние кратковременной тепловой предобработки растений пшеницы на устойчивость ФА к повторному тепловому стрессу и свету высокой интенсивности, а также на скорость пост-стрессового восстановления фотосинтетической активности.

Научная новизна. Проведенные исследования позволили выявить ряд общих и специфических закономерностей по регуляции устойчивости ФА к стрессам абиотической природы при действии различных доз разных по природе индукторов защитных систем растений.

1. Впервые обнаружено защитное действие индукторов защитных систем растений: КС низкой интенсивности и ретардантов ХХХ и ХХ на ФА высших растений при действии УФ-радиации и повышенной температуры.

2. Установлено участие активной формы фитохрома в формировании УФ-защитных систем ФА при предоблучении растений КС. Обнаружена связь между защитным действием КС против УФ-радиации и КС-индуцированным повышением пероксидазной активности, а также увеличением содержания каротиноидов и флавоноидов.

3. Впервые установлено, что повышение пула Н₂О₂ в листьях растений, обработанных ретардантными дозами ХХХ, а также облученных КС с _м=660 нм предшествует увеличению стресс-устойчивости ФА, что предполагает участие АФК в повышении устойчивости.

4. Впервые выявлена связь между кратковременной генерацией Н₂О₂ при тепловом закаливании, повышением уровня антиоксидантной активности и скоростей темнового дыхания в листьях, а также циклического фотофосфорилирования в изолированных хлоропластах с одной стороны и повышением стресс-устойчивости ФА в закаленных растениях с другой стороны.

5. Установлено, что разные по природе индукторы защитных систем: КС низкой интенсивности, ретарданты ХХХ и ХХ, а также закаливающие повышенные температуры, - участвуют в формировании повышенной стресс-устойчивости ФА аналогичным образом - через транзитное повышение пула Н₂О₂, которое наблюдается при достаточно высоких дозах индуктора и предшествует повышению активности антиоксидантных ферментов и увеличению содержания низкомолекулярных антиоксидантов.

Научно-практическая значимость. Проведенные исследования позволяют понять основные закономерности формирования повышенной стресс-устойчивости ФА под действием различных индукторов защитных систем химической и физической природы: ретарданты ХХХ и ХХ, закаливающие температуры и красный свет низкой интенсивности. Предложена концепция - повышение стресс-устойчивости ФА при действии этих индукторов происходит путем увеличения активности антиоксидантных ферментов и уровня низкомолекулярных антиоксидантов, вероятно, за счет транзитного повышения пулов сигнальных интермедиатов, участвующих в формировании устойчивости: АФК, ионов Са²⁺ и АБК.

Результаты наших исследований были использованы для создания новых типов светопреобразующих пленок на основе наноразмерных фотолюминофоров (Воробьев и др., 2008). Было изучено влияние дополнительного КС, получаемого от свето-трансформирующих пленок (Полисветан, РэдЛайт) с разными типами фотолюминофоров, на основе неорганических комплексов редкоземельных элементов, и светодиодов на фотосинтез и рост растений (Кособрюхов и др., 2000; Мартиросян и др., 2008). Использование таких пленок и светодиодов приводит к снижению фотоингибирования при высокой интенсивности света и к увеличению содержания в листьях каротиноидов. Наши концепции о трансдукции светового и теплового сигналов в растительной клетке и механизмах стресс-устойчивости ФА представлены в обзорах (Биологические мембраны 2006, 2007; Photosynthesis Research 2008; Photochemistry Photobiology (C) 2009) и могут быть использованы при чтении базового курса и спецкурсов по физиологии растений в вузах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хлорхолинхлорид и холинхлорид повышают устойчивость ФА к УФ-радиации и высоким температурам. Защитное действие хлорхолинхлорида связано с увеличением активности антиоксидантных ферментов и содержания низкомолекулярных антиоксидантов в листьях и хлоропластах. Увеличение пула Н₂О₂ в листьях растений, обработанных хлорхолинхлоридом, предшествует росту тепловой устойчивости ФА, что предполагает участие АФК в формировании повышенной устойчивости ФА к высоким температурам.

2. Предоблучение растений КС низкой интенсивности повышает устойчивость их ФА к УФ-радиации. Защитное действие КС связано с повышением пероксидазной активности и увеличением содержания УФ-поглощающих соединений в листьях растений. Ключевыми сигнальными интермедиатами в трансдукции сигнала КС являются активная форма фитохрома, а при относительно высоких дозах красного света (0.3-2 Дж см^-2) - также АФК.

3. Кратковременное тепловое закаливание растений повышает устойчивость ФА к вторичному тепловому стрессу и к свету высокой интенсивности. Закаливание приводит к кратковременному увеличению содержания АФК, с последующим повышением активности антиоксидантных ферментов и скорости темнового дыхания в листьях, а также скорости циклического фотофосфорилирования, что обуславливает повышение стресс-устойчивости ФА.

4. Одним из ключевых путей повышения стресс-устойчивости ФА является увеличение уровня антиоксидантной активности и содержания низкомолекулярных антиоксидантов, регулируемых пулом АФК и других сигнальных интермедиатов, образующихся при обработке растений индукторами защитных систем.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на Всесоюз. конф. «Преобразование энергии в фотосинтетических системах и их моделях» (Пущино, 1989); межд. конф. «Фотосинтез и фотобиология» (Пущино, 1991); III и V межд. конф. «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1995, 1999); X конгр. федерации Европейских обществ физиологов растений (Florence, 1996); XIII межд. конгр. по фотобиологии (San-Francisco, USA, 2000); XIII Western Photosynthesis Conf. (Asilomar, California, USA, 2004); межд. конф. «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of the Photosystems» (Пущино, 2006), II межд. симп. «Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture» (Киев, Украина, 2007); VI съезде общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007); межд. конф. РГАУ-МСХА (Москва, 2009); межд. симп. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования (Москва, Пущино, 2003-2009), конф. и съездах фотобиологов России (1996-2008).

Личный вклад соискателя. Диссертация выполнена самостоятельно. Основные теоретические концепции предложены соискателем. В обсуждении данных участвовали: Климов В.В., Ерохин Ю.Е., Аллахвердиев С.И., Ладыгин В.Г., Музафаров Е.Н., Христин М.С. (ИФПБ РАН, Пущино), Кузнецов Е.Д. (ИОФАН, Москва), Бухов Н.Г. (ИФР, Москва), Murata N. (Национальный институт общей биологии, Япония), Carpentier R. (Квебекский университет, Канада) и др. Автор выражает им всем глубокую благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 75 научных работ, из них 22 статьи в отечественных научных журналах, рекомендованных в списке ВАК, и 11 в ведущих международных журналах, а также монография (Музафаров и др., 1995), получено авторское свидетельство на изобретение.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, 4 экспериментальных глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 470 источников, в том числе 322 на английском языке. Работа изложена на 330 страницах, включает 78 рисунков и 15 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из 5 разделов. В первом разделе дано развернутое определение стресса, окислительного стресса, индукторов стресс-защитных механизмов. Во втором разделе рассмотрены мишени окислительного стресса, образование и роль АФК при действии окислительного стресса на ФА, проанализированы основные защитные механизмы против развития окислительного стресса, роль света, энергетического обеспечения и баланса про/антиоксидантов в стресс-защитных механизмах. С одной стороны АФК обладают повреждающим действием, с другой стороны, АФК, участвуют в передаче стрессового сигнала, запуская адаптивные механизмы клетки (Барабой, 1991; Demmig-Adams, Adams, 2002), в частности, на уровне ФА (El-Shintinawy et al., 2004). Другими общими вторичными мессенджерами в цепи трансдукции стрессового сигнала могут быть Са²⁺ и АБК (Larkindale, Knight, 2002; Титов и др., 2006; Колупаев, Карпец, 2009).

Рассмотрено стресс-защитное действие ряда регуляторов роста, в том числе холинсодержащих соединений (ХСС), ретардантов ХХ и ХХХ. Изменение гормонально-ингибиторного статуса и уровня антиоксидантной активности в листьях растений являются одним из путей регуляции стресс-устойчивости ФА при действии этих соединений.

39

В третьем разделе рассмотрены механизмы действия УФ-облучения на ФА растений и защитное действие оранжево-красного света в области 600-730 нм при УФ-облучении, роль активной формы фитохрома (Фх_ДК) в механизме защитного действия света. В четвертом разделе проанализировано влияние кратковременной тепловой предобработки растений на теплоустойчивость и устойчивость ФА к свету высокой интенсивности. В пятом разделе дан анализ особенностей фотоингибирования в цианобактериях, роль каталазы-пероксидазы в защитном действии против фотоингибирования и NaCl-индуцированного фотоингибирования.

Высказана гипотеза о том, что при действии индукторов различной природы на ФА растений общим звеном формирования повышенной стресс-устойчивости ФА является транзитное повышение содержания АФК, цитозольного Са²⁺ и АБК в листьях и хлоропластах, вследствие чего возрастает активность антиоксидантных ферментов и содержание низкомолекулярных защитных соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В материалах и методах описаны объекты, схемы экспериментов и измерительные методики. В экспериментах использованы листья высших растений (пшеница, фасоль, шпинат и салат), зеленые микроводоросли и цианобактерии. Для оценки стресс-устойчивости использованы несколько стресс-индуцирующих факторов: 1) ? кратковременное (обычно 20 мин) воздействие высокой температуры; 2) ? свет высокой интенсивности прогрев, NaCl; 3) ? УФ-облучение.

Действие стресс-факторов и индукторов устойчивости на растения было изучено по следующим схемам:

1. Высшие растения: кратковременный прогрев; кратковременный прогрев свет различной интенсивности; свет высокой интенсивности; обработка растений холинсодержащими соединениями или низкоинтенсивным светом в видимой области УФ или кратковременный тепловой стресс; УФКС. Стрессовые факторы: прогрев при 39-44^оС (20 мин); УФ-А (365 нм, 20 Вт м^-2, 0.5-1 ч); УФ-В (300 нм, 0.45-5 Вт м^-2); УФ-С (254 нм, 6 Вт м^-2); белый свет (100-400 Вт м^-2).

2. Цианобактерии: свет высокой интенсивности (100-600 Вт м^-2) солевой стресс (0.5 М NaCl).

Влияние ХХ и ХХХ изучали на проростках фасоли и пшеницы. В экспериментах на фасоли ХХ и ХХХ (0.002-0.6%) вводили с питательным раствором или проводили обработку листьев раствором этих ретардантов (0.01-5%). В опытах на пшенице использовали семена, замоченные в растворах ретардантов. УФ-защитное действие предоблучения разных длин волн изучали на 8-10-дн. проростках салата и на полностью развитых листьях шпината. Использовали КС с _м=625, 660 и 690 нм, а также дальний красный свет (ДКС) с _м=730 нм и свет с _м=570, 470 и 400 нм, который получали с помощью светодиодов, либо от ламп накаливания, используя интерференционные светофильтры. Продолжительность облучения от 5 мин до 4 ч при интенсивности света 1-10 Вт м^-2. Использовали как относительно высокие дозы КС (0.3-2 Дж см^-2), облучая отделенные листья, так и низкие дозы КС (0.05 Дж см^-2), облучая сами растения.

Для оценки состояния ФА в стрессовых и нормальных физиологических условиях использовали методы переменной и замедленной флуоресценции (ЗФл) хлорофилла (Хл) а, а также измеряли скорость газообмена СО₂ (Biel et al., 2009). Активность ФС2 оценивали по отношению F_v/F_m, где F_v - фотоиндуцированное изменение флуоресценции Хл а, а F_m - максимальная интенсивность флуоресценции. Кроме того, определяли отношение (I_m-D)/D, где I_m- максимальная амплитуда быстрой или медленной компоненты ЗФл Хл а, а D - минимальная амплитуда ЗФл. Содержание фотосинтетических (Хл а и в, каротиноиды) и УФ-поглощающих (преимущественно флавоноиды; Mirecki, Teramura, 1984) пигментов определяли, используя спектрофотометрический метод. Антиоксидантную активность оценивали по изменению активности супероксиддисмутазы (СОД), пероксидазы, аскорбатпероксидазы (АсП), глутатионредуктазы (ГР), каталазы (Балахнина и др., 2005), а также по содержанию каротиноидов и УФ-поглощающих пигментов. Уровень окислительного стресса оценивали по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), а также по образованию Н₂О₂ с помощью метода биолюминесценции. Выделение этилена изучали в экспериментах с хлореллой Chlorella pyrenoidosa Pringh 82T. Содержание свободных фитогормонов цитокининов, гиббереллинов и АБК определяли с помощью иммуноферментного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ХХХ и ХХ повышают устойчивость ФА к УФ-радиации и тепловому стрессу

ХХХ является ретардантом, который используется в растениеводстве. Вместе со своим аналогом ХХ он защищает растения от негативного действия абиотических стрессов (Grossmann, 1992; Пруссакова и др., 1993; Fletcher et al., 2000; Sheng et al., 2006; Zhao et al., 2007). Однако, мало известно о том, как предобработка этими соединениями влияет на стресс-устойчивость ФА.

Влияние ХХ и ХХХ на рост, активность ФА и содержание пигментов на уровне клетки (микроводоросли) и целого растения. Механизмы развития стресс-устойчивости и адаптации фотосинтезирующих организмов во многом определяются влиянием регуляторов роста на ФА, состав фотосинтетических пигментов, гормонально-ингибиторный баланс и, в конечном итоге, на рост этих организмов. Нами было изучено влияние ХХ на рост, активность ФА и пигментный состав клеток Chlamydomonas reinhardtii в 5 и 10-дн. культурах. При [ХХ]>1 мМ обнаружено уменьшение фотосинтетического выделения О₂, активности ФС2, содержания хлорофилла и скорости деления клеток, что, вероятно, связано с деструкцией мембран хлоропластов, индуцированной присутствием ХХ (рис. 1). Отсюда был сделан вывод, что ретардантное действие ХХ на клетки Chlamydomonas сопровождается развитием в них слабого окислительного стресса.

В высших растениях обработка ХХХ и ХХ также вызывала развитие слабого окислительного стресса и ретардантные эффекты. В результате обработки наблюдалось заметное уменьшение высоты растений фасоли, а также площади и сырого веса листьев, тогда как сухой вес листьев возрастал (табл. 1). При низкой концентрации ХХХ (0.08 мМ) ретардантные эффекты практически не наблюдали.

Обработка растений фасоли и пшеницы ХХХ и ХХ приводила к увеличению содержания в листьях фотосинтетических и УФ-поглощающих пигментов (табл. 1 и 2). По-видимому, рост этих показателей является следствием усиленного синтеза хлорофилла (Sankhla et al., 1985; Kobzar et al., 1999) и более высокой плотности хлоропластов на единицу площади листа (Khalil, 1995).

Ретардантное действие ХХХ также обнаружено при листовой обработке растений фасоли (0.1-1% ХХХ) и обработки семян пшеницы (0.5-1% ХХХ).

Было исследовано влияние предобработки растений ХХХ и ХХ на устойчивость ФА настоящих листьев растений фасоли к УФ-В-облучению и кратковременному нагреванию (Kreslavski et al., 2001), а также на устойчивость к УФ-С препаратов тилакоидных мембран (ПТМ), выделенных из листьев предобработанных растений (рис. 2). После тепловой обработки растений (43^оС, 6 мин) активность ФС2 падала, затем постепенно восстанавливалась в течение 2-3 суток. В то же время в ХХХ-обработанных растениях, как первичная теплоустойчивость, так и скорость восстановления активности ФС2 были выше. Аналогичные данные о защитном действии ХХ на ФА растений огурца, подвергнутых действию низких температур, были получены в работе (Sheng et al., 2006). УФ-облучение листьев фасоли также приводило к снижению активности ФС2, которое заметно усиливалось в процессе выдерживания отделенных листьев в темноте, тогда как в предобработанных ХХХ растениях снижение активности ФС2 было значительно меньше (рис. 2).

Таблица 1. Влияние обработки ХХ и ХХХ, а также УФ-В (УФ) на содержание Хл (a+b), каротиноидов (Кар), пигментов, поглощающих УФ (ППУ), площадь (Пл.) и относительное содержание сухого вещества настоящих листьев (СВЛ) 11-дн. растений фасоли. ХХХ или ХХ в конечных концентрациях 1.6 мМ и 19 мМ, соответственно, вносили с питательным раствором. Отделенные листья подвергали УФ-облучению, затем определяли СВЛ и площадь листьев, а через 48 ч выдерживания в темноте анализировали на содержание пигментов (SE; n=3). ЕОП - единицы оптич. плотн. при _м=327 нм (Kreslavski et al., 2001).

*- незначительная разница между контролем и опытом (p>0.05).

Таблица 2. Влияние обработки ХХХ (0.75%) на содержание хлорофилла, каротиноидов и ППУ (преимущественно флавоноиды) в листьях 10-дн. растений пшеницы. Разница между опытом и контролем во всех вариантах достоверна (p<0.05) (Креславский и др., 2010б).

Мы предположили, что одной из ключевых причин защитного действия ХХ и ХХХ является стабилизация тилакоидных мембран и сохранение их целостности в условиях окислительного стресса. Действительно, устойчивость ПТМ, выделенных из листьев обработанных ХХ растений фасоли, к облучению УФ-С была выше устойчивости ПТМ из контрольных растений (рис. 2).

Относительная максимальная амплитуда медленной компоненты ЗФл также падала после термообработки, а на свету вновь восстанавливалась, причем у ХХХ-обработанных растений фасоли восстановление шло быстрее, чем у необработанных (рис. 3). ЗФл связана с обратной рекомбинацией зарядов в ФС2, а ее медленная компонента в основном отражает изменения рН на тилакоидных мембранах (Bigler, Schreiber, 1990). Таким образом, обработка растений ХСС приводит к меньшему снижению и более быстрому восстановлению фотохимической активности ФС2, как ее квантовой эффективности, так и свето-индуцированной величины рН.

Аналогичные результаты были получены при изучении влияния замачивания семян пшеницы в 0.5-1% ХХХ или 5% ХХ на первичную теплоустойчивость ФС2 и на скорость пост-стрессового свето-индуцированного восстановления активности фотосинтеза в первых листьях пшеницы (Креславский и др., 2010б). В обработанных таким образом проростках пшеницы наблюдали повышение первичной теплоустойчивости препаратов мембран тилакоидов, выделенных из листьев обработанных растений (табл. 3). Снижение активности ЭТЦ было значительно ниже в препаратах из растений, обработанных ХХХ.

В литературе (Bode, Wild, 1984) высказано предположение о том, что в листьях растений пшеницы, обработанных ХХХ, развивается окислительный стресс, подобный стрессу при засухе. Эта идея нашла подтверждение в опытах с нативными листьями фасоли, обработанными ХХХ. Согласно нашим данным при концентрации ХХХ, вызывающей заметный ретардантный эффект (0.75%), наблюдали снижение активности ФС2, увеличение темнового дыхания и содержания Н₂О₂ (рис. 4). При этом теплоустойчивость ФА листьев через 1.5-4 суток была заметно повышена, а транзитное повышение уровня Н₂О₂, предшествовало снижению активности ФС 2 и увеличению теплоустойчивости ФА.

Действие ХХХ и ХХ на активность антиоксидантных ферментов и уровень низкомолекулярных антиоксидантов. Известно, что развитие умеренного окислительного стресса в растениях обычно сопровождается повышением активности ключевых антиоксидантных ферментов (Mittler, 2002). Действительно, активности

СОД, АсП и ГР, определенные в листьях, СОД и пероксидазы - в препаратах тилакоидных мембран, были выше в предобработанных ХХ или ХХХ растениях, по сравнению с контрольными (табл. 4 и 5). Более того, повышенная активность ферментов сохранялась и после развития окислительного стресса, вызванного УФ-радиацией (Kreslavski et al., 2001).

На основе полученных данных можно заключить, что антиоксидантная активность в хлоропластах из листьев обработанных растений выше, чем в контрольных. Это происходит за счет повышенной активности пероксидаз, СОД и других антиоксидантных ферментов, а также вследствие увеличения содержания каротиноидов и УФ-поглощающих пигментов, которые с одной стороны играют роль внутреннего фильтра при УФ-облучении, с другой стороны являются антиоксидантами (Cuttriss, Pogson, 2004). Защитное действие этих пигментов и повышение уровня антиоксидантной активности объясняют также повышенную стресс-устойчивость ФС2 в препаратах тилакоидных мембран, выделенных из листьев растений, обработанных ХСС по сравнению с необработанными.

Повышенная активность антиоксидантных ферментов в ХСС-обработанных растениях может проявляться в быстром и более существенном усилении антиоксидантной активности в ответ на действие стрессора. В этой связи было изучено влияние ХХХ и тепловой предобработки на активность ферментов гваякол-зависимой (ГЗ) пероксидазы и АсП, определенных в первых листьях растений пшеницы после теплового стресса при 40^оС (рис. 5).

Таблица 3. Влияние обработки растений ХХХ (0.75%) на теплоустойчивость препаратов тилакоидных мембран, выделенных из листьев 11-дн. растений пшеницы. Активность ЭТЦ определяли путем восстановления дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ). Устойчивость оценивали как отношение активностей после прогрева при 40^оС в течение 5 мин и до прогрева (%) (n=3) (Креславский и др., 2010б).

Таблица 4. Влияние обработки ХХХ (1.6 мМ) и УФ-В на активность антиоксидантных ферментов, а также на содержание абсцизовой кислоты, гиббереллинов (ГК₁-подобных веществ) и цитокининов (З+ЗР), (пмоль/г сырого веса) в листьях 11-дн. растений фасоли. Активности ферментов даны на 1 г белка. Условия выращивания и обработки как в табл. 1 (n=2)

* ? незначительная разница между контролем и вариантами ХХХ и УФ-В (p>0.05).

Таблица 5. Влияние обработки ХХ (0.6%) на активность СОД и пероксидазы в препаратах тилакоидных мембран, выделенных из листьев 11-дн. растений фасоли. Активность рассчитывали на 1 г белка. Условия выращивания и обработки, как в табл. 1.

В результате нагревания обнаружен более быстрый рост активности АсП и ГЗ пероксидазы в листьях ХХХ-предобработанных, а также закаленных тепловой предобработкой растений по сравнению с контрольными, необработанными растениями. В обработанных вариантах впоследствии наблюдалось и более быстрое снижение активности ферментов, что свидетельствует о большей эффективности антиоксидантной системы в листьях обработанных растений, что в значительной степени определяет повышенную теплоустойчивость ФА (рис. 2, 3 и 5).

Известно, что в ряде случаев увеличение уровня цитокининов (Чернядьев, 1997, 2005) и АБК (Liu, Huang, 2002; Таланова, 2009) дает вклад в увеличение стресс-устойчивости растений, в частности засухоустойчивости и термоустойчивости. Было изучено влияние ХХХ на содержание АБК, цитокининов и гиббереллинов в настоящих листьях фасоли, облученных УФ-В (табл. 4). Содержание АБК и цитокининов в листьях проростков, обработанных ХХХ, было выше, а уровень гиббереллинов ниже, чем в необработанных, эта тенденция сохранялась и во время УФ-облучения. При низкой концентрации ХХХ (0.08 мМ) увеличение содержания АБК и повышение устойчивости к УФ-В не наблюдали (рис. 2). Повышенное содержание АБК и цитокининов в листьях обработанных растений может отчасти объяснять повышенную устойчивость ФС2 этих растений к УФ-облучению и высокой температуре.

Предполагается, что накопление АБК является одним из триггерных механизмов формирования повышенной стресс-устойчивости растений, в частности теплоустойчивости (Титов и др., 2006), хотя конкретные механизмы функционирования АБК пока неясны (Larkindale, Huang, 2004). Возможно, что повышение содержания АБК приводит к индукции образования АФК (Hung et al., 2005; Hu et al., 2006) и специфических для АБК стрессовых белков (Шакирова. 2001).

Снижение фотосинтетической активности и повышение антиоксидантной активности в препаратах тилакоидных мембран - все это признаки окислительного стресса, развивающегося в хлоропластах. Эксперименты с обработкой листьев ХХХ (0.1-1%) и прямое определение уровня Н₂О₂ в листьях (рис. 4) показали, что повышению стресс-устойчивости ФА, которое наблюдали через 1.5-4 суток после предобработки, предшествует усиленное образование Н₂О₂ (burst) и рост темнового дыхания. По-видимому, предобработка ХХХ или ХХ приводит к генерации АФК, которые активируют антиоксидантную систему, что приводит клетку в состояние с повышенной стресс-устойчивостью ФА. Мы предлагаем следующую возможную схему повышения стресс-устойчивости ФА при действии ХСС на растения: ХХХ (ХХ) АБК/Н₂О₂ (окислительный стресс) сигнальные белки повышенный синтез белков и низкомолекулярных соединений, участвующих в стресс-защитных реакциях повышение стресс-устойчивости ФА (Kreslavski et al., 2001; Креславский и др., 2007а; Sheng et al., 2006; Креславский и др., 2010б).

Повышенная устойчивость ФА растений, обработанных ХХХ или ХХ, к нагреванию и УФ-облучению может объясняться увеличением активности антиоксидантных ферментов, а также пула низкомолекулярных антиоксидантов (Kreslavski et al., 2001; Sheng et al., 2006), которое, по нашим данным, инициируется образованием Н₂О₂ и/или, возможно, АБК. Накопление осмотически активных веществ, к которым относятся продукты разложения ХХХ и ХХ - бетаин и пролин (Sheng et al., 2006), также может вносить вклад в повышение стресс-устойчивости ФА.

2. Предоблучение красным светом повышает устойчивость ФА к УФ-радиации

Известно, что УФ излучение повреждает различные молекулы мишени и системы ФА, особенно ФС2, прежде всего такие компоненты как Q_A, Q_B, PQ и белок D1 (Kolli et al., 1998; Babu et al., 1999). С другой стороны, УФ-радиация активирует различные защитные системы ФА, усиливает синтез фотозащитных соединений, поглощающих УФ. При этом возрастает активность и/или синтез антиоксидантных ферментов, и происходит накопление низкомолекулярных антиоксидантов (Strid et al., 1994; Hдder et al., 2003; Соловченко, Мерзляк, 2008). Важную роль в фотозащите ФА от УФ-радиации и/или в процессах фотореактивации может играть видимый свет низкой интенсивности, в частности, в синей (Han et al., 2001; Hдder et al., 2003) и красной области спектра (Joshi et al., 1991; Biswal et al., 2003), которые могут действовать через фоторецепторы синего света - (криптохромы и фототропины) и красного света - фитохромы. Предполагается, что КС индуцирует переход фитохрома в физиологически активную форму (Фх_ДК), которая поддерживает структуру и активность хлоропластов во время старения листьев, а также предохраняет Хл от деградации (Joshi et al., 1991; Lingakumar, Kulandaivelu, 1993; Biswal et al., 2003). Вместе с тем имеется мало данных и теоретических разработок о том, как формируются механизмы защитного действия КС против УФ-индуцированного ингибирования фотосинтеза, какие фоторецепторы и сигнальные интермедиаты, а также стресс-защитные системы ФА, такие как антиоксидантная, участвуют в процессе формирования и регуляции защитных механизмов.

Одним из важнейших фоторецепторов КС является фитохром, который является, прежде всего, датчиком качества света (Smith, 1986). Роль этого фоторецептора больше всего исследована в «классических» фитохром-контролируемых реакциях. В этом случае при последовательном облучении КС с _мax=660 нм (5-10 мин), затем ДКС с _max=730 нм (5-10 мин), регуляторные эффекты КС снимаются (Kendrick, Kronenberg, 1994).

Предоблучение КС защищает фотосинтетические пигменты от УФ-индуцированной деградации. Известно, что в листьях растений, помещенных в темноту, может наблюдаться старение (Biswal, Biswal, 1984; Biswal et al., 2003), которое проявляется в постепенной потере Хл и белков. Как УФ-В, так и УФ-А могут ускорять, а КС и/или синий свет замедлять старение листьев (Biswal et al., 2003). Однако, механизм действия КС во многом не ясен.

Роль Фх и возможных интермедиатов защитного действия КС была изучена на двух основных объектах -? отделенных настоящих и нативных семядольных листьях, которые часто используются для исследования старения. При длительном выдерживании растений салата в темноте (>2 сут.) наблюдали старение листьев, которое проявлялось в постепенной деградации Хл (а+в) и каротиноидов. Облучение растений УФ приводило к более быстрой деградации пигментов в темноте, особенно у растений, выращенных на слабом свету (табл. 6). При предоблучении проростков КС (_м=660 нм, 8 мин) наблюдали частичное снижение скорости деградации пигментов, которую вызывало УФ-облучение (рис. 6), тогда как сам по себе КС (без УФ) оказывал незначительное влияние. Последующее облучение листьев ДКС (_м=730 нм) полностью снимало защитное действие КС (табл. 6), что свидетельствует об участии Фх в качестве фоторецептора. Вес семядольных листьев снижался после УФ-А-облучения, но потери веса были ниже при предоблучении КС (КСУФ), что указывает на интегральное развитие окислительного стресса в листьях, облученных УФ, и меньший уровень стресса в листьях, предоблученных КС. На другом объекте исследований - отделенных листьях шпината, при более длительном КС-облучении (2 ч) обнаружены аналогичные закономерности: предоблучение листьев КС уменьшало потери Хл и каротиноидов.

Считается, что важную роль в процессе деградации Хл в листьях играют протеолитические ферменты (Pjon et al., 1992), а образование некоторых АФК, по-видимому, индуцирует их синтез. Следовательно, УФ-облучение, индуцирующее образование АФК, может приводить к усилению деградации фотосинтетических пигментов. Обнаруженное нами повышение антиоксидантной активности в листьях растений, предоблученных КС, наоборот, вероятно, обеспечивает защиту Хл от деградации (Креславский и др., 2009).

Пигменты, поглощающие УФ. В зависимости от световых условий выращивания и дозы УФ-облучение приводило как к увеличению, так и уменьшению содержания пигментов, поглощающих УФ (ППУ) в листьях салата и шпината. Эти пигменты являются преимущественно флавоноидами (Mirecki, Teramura, 1984). Предобработка КС приводила к возрастанию уровня ППУ (табл. 6), вероятно, вследствие КС-индуцированного их синтеза. Вывод согласуется с ростом пула ППУ в листьях, облученных одним только КС, которое проявляется после некоторой лаг-фазы.

Таблица 6. Действие предоблучения КС и ДКС, а также УФ-А на содержание (на 1 г сырого веса) фотосинтетических пигментов и пигментов, поглощающих УФ (ППУ), а также сырой вес пары семядольных листьев 10-дн. растений салата, выращенных при разной интенсивности света. Все параметры определяли после облучения растений и выдерживания их в темноте (Т) в течение 2 или 26 ч. [Хл (а+в)] составляла в контроле для № 2, № 3, № 4 - 0.4, 0.5 и 0.7 мг г^-1, соответственно. ППУ определяли в единицах оптической плотности. Время УФ экспозиции - 50 и 100 мин

*- недостоверная разница между опытом и контролем (p>0.05). Во всех вариантах нет разницы между контролем и (КСУФ).

Фотосинтетическая активность. В наших (Кобзарь и др., 1997,1999; Kobzar et al., 1998; Креславский и др., 2004а, 2009) и других работах (Lingakumar, Kulandaivelu, 1993; Bossalandro et al., 2001; Biswal et al., 2003; Константинова и др., 2004) показано, что КС низкой интенсивности модифицирует действие УФ-радиации на рост, фотосинтез и накопление хлорофилла. Однако неясно, как развивается защитное действие КС, какие сигнальные интермедиаты участвуют в формировании повышенной устойчивости ФА к УФ-радиации. Для решения этой задачи были проведены эксперименты по исследованию действия УФ-радиации на фотосинтетическую активность и развитие окислительного стресса в листьях салата и в отделенных листьях шпината, фасоли и рябины, а также по изучению защитного действия предоблучения КС. В результате облучения листьев УФ-А/В и последующего их выдерживания в темноте наблюдали ингибирование активности ФС2 (рис. 7, 8) и усиление перекисного окисления липидов (см. диссертацию). Наиболее существенно снижалась после УФ-облучения относительная амплитуда быстрой (100 мс) компоненты ЗФл (рис. 7), которая отражает активность электронного транспорта на акцепторной стороне ФС2 (Lambrev, Golstev, 1999).

Защитное действие КС проявлялось через 1-2 ч и выражалось в меньшем снижении этой компоненты ЗФл в УФ-облученных листьях.

Обнаружено два типа защитного действия КС при действии УФ-радиации: один тип реакций (Креславский и др., 2001, 2004а) наблюдали при относительно длительном (>1 ч) облучении и умеренных дозах КС (0.3-2 Дж см^-2) (рис. 7, 8). Предоблучение листьев КС (КСУФ) частично снимало ингибирующее действие УФ, а последующее облучение ДКС, в свою очередь, снимало эффект КС.

Само облучение КС вызывало снижение быстрой (рис. 7, 8) и медленной компоненты ЗФл. Эти изменения наблюдали не менее, чем через 1 ч после облучения листьев КС вследствие, как мы предполагаем, транзитного повышения пула Н₂О₂ в КС-облученных листьях с максимумом через 0.5 ч (рис. 9).

Другой тип защитных реакций изучен на нативных семядольных листьях салата при кратковременном облучении (5-10 мин) и низкой дозе (0.05 Дж см^-2) КС (рис. 10).

В экспериментах было обнаружено УФ-индуцированное снижение скорости (Р_n) и эффективности (F_m-F_s)/F_s, где F_s - стационарный уровень флуоресценции, фотосинтеза и защитное действие КС. Полная обратимость эффекта КС при последующем облучении ДКС и низкая интенсивность КС (1-2 Вт м^-2) свидетельствуют о проявлении классической КС/ДКС обратимой низкоэнергетической реакции, свойственной обычно фотостабильному ФхВ (Креславский, Аллахвердиев, 2006).

Защитное действие КС, оцененное по изменению быстрой компоненты ЗФл в листьях шпината при относительно высоких дозах (0.3-3 Дж см^-2), не наблюдалось в присутствии ингибитора белкового синтеза линкомицина (0.4 мМ) (см. диссертацию). Отсюда следует, что синтез de novo белков играет определенную роль в защитном действии предоблучения.

Предоблучение при тех же дозах другими длинами волн (_м=540 и 570, 690, и 730 нм) не приводило к заметному проявлению защитного эффекта при действии УФ-А-радиации. Это согласуется с участием в защитном действии предоблучения активной формы фитохрома, предположительно, ФхВ.

Было также изучено УФ-защитное действие КС при одновременном облучении листьев КС и УФ-радиацией. И в этом случае КС частично снимал индуцированное УФ ингибирование активности ФС2, что предполагает комплексное влияние КС в защите ФА. Защитное действие КС было наиболее выражено после достаточно длительной темновой экспозиции растений до облучений, что, вероятно, связано с уменьшением % Фх_ДК в этих условиях.

Роль фитогормонов в защитном действии КС. На основании полученных данных по световой регуляции роста хлореллы и выделения этилена в клеточной суспензии было высказано предположение, что Фх-подобный фоторецептор регулирует рост хлореллы и образование этилена (Креславский и др., 1988, 1989; Kreslavski et al., 1997). При этом наблюдали увеличение уровня этилена при действии КС (10-30 мин) и снятие этого эффекта последующим облучением ДКС (рис. 11), что свойственно низкоэнергетическим процессам, контролируемым ФхВ. На основании литературных (Mшller et al., 2002) и наших данных по регуляции выделения этилена экзогенными фитогормонами (Креславский и др., 1988) высказано предположение, что как Фх_ДК, так и эндогенные цитокинины играют роль интермедиатов, через которые реализуется влияние КС и ДКС на выделение этилена. Это также согласуется с обнаруженной корреляцией между относительным уровнем Фх_ДК и содержанием цитокининов, образующихся в листьях пшеницы в процессе их зеленения (Креславский и др., 2004б; Kreslavski et al., 2005). Вероятно, одним из путей влияния на клетку КС (при исходно низком пуле Фх_ДК) является повышение пула Фх_ДК, что приводит к изменению гормонального баланса.

Роль соотношения про-/антиоксидантов в защитном действии КС. Изменение про-/антиоксидантного равновесия является одним из неспецифических признаков стрессовой реакции (Веселова и др., 1993), в частности при УФ-облучении (Frohnmeyer, Staiger, 2003). Помимо этого, в настоящее время высказывается предположение о том, что это соотношение является также инструментом, с помощью которого клетка может регулировать многие процессы роста и адаптации (Dat et al., 2000; Pastori, Foyer, 2002), а также реагировать на действие некоторых экзогенных фитогормонов (Dat et al.,1998; Pei et al., 2000). Мы попытались связать обнаруженные защитные эффекты КС с индукцией синтеза антиоксидантных ферментов, которые часто служат важным звеном в нейтрализации окислительного стресса в растениях (Allen, 1995).

Одним из ключевых антиоксидантных ферментов при УФ-индуцированном окислительном стрессе является пероксидаза (Rao et al., 1996), которая обладает широкой субстратной специфичностью и способна катализировать реакции окисления различных органических соединений. Активность пероксидазы также может регулироваться фитохромной системой (Sharma et al., 1976) и УФ. Эти результаты подтверждаются нашими данными по исследованию влияния предоблучения УФ-А и КС на пероксидазную активность в листьях шпината, которая повышалась практически сразу после УФ-облучения (рис. 12). Кроме того, мы наблюдали синергизм в действии КС и УФ, а также частичную обратимость эффекта КС последующим облучением ДКС, что предполагает участие Фх_ДК в стимулирующем действии КС на пероксидазную активность. Аналогичные закономерности были обнаружены при исследовании пероксидазной активности в препаратах тилакоидных мембран, выделенных из облученных УФ-А, а также из КС- предоблученных листьев салата.

Участие Фх_ДК в индукции пероксидазной активности также согласуется с нашими данными, полученными на этиолированных 7-8-дн. проростках пшеницы. После их предоблучения КС с _мax=660 нм (7.5 мин) вслед за лаг-фазой наблюдалось быстрое увеличение пероксидазной активности в листьях, которое было частично обратимо ДКС (Любимов, Креславский, 2008).

Таким образом, нами установлено, что индукция стресс-устойчивости ФА к повреждающему действию УФ связана с активацией Фх в результате предоблучения растений КС с _м=625 и 660 нм, а также с усилением активности антиоксидантной системы, включающей как антиоксидантные ферменты, так и низкомолекулярные антиоксиданты. К последним также относятся УФ-поглощающие фотозащитные пигменты (флавоноиды) и каротиноиды (Takeuchi, 1996).

Мы предполагаем, что активация пероксидазы и других антиоксидантных ферментов с помощью КС может происходить путем, описанным для трансдукции фитохромного сигнала через активацию факторов транскрипции типа PIF3, обеспечивающих прямую фоторегуляцию экспрессии защитных генов (Креславский и др., 1993; Креславский, Аллахвердиев, 2006) и через транзитное повышение уровня свободного Ca²⁺ в цитозоле. Как при УФ, так и КС облучении активность пероксидазы, может быть повышена за счет усиленного синтеза субстратов пероксидазы, например, фенольных соединений, в частности флавоноидов. Считается, что повышение уровня флавоноидов происходит через свето-индуцированную активацию ФАЛ и халкон-синтазы (Gaspar et al., 1982; Wade et al., 2001). При относительно высоких дозах КС при облучении в темноте могут наблюдаться повышение уровня АФК, и активация защитных клеточных систем (Lubart et al., 1997; Саляев и др., 2003). Эти данные согласуются с наблюдаемым нами транзитным, с максимумом образования через 0.5 ч, повышением пула Н₂О₂, которое предшествовало повышению пероксидазной активности и снижению активности ФС2 при длительном предоблучении листьев КС (рис. 9). При высоких дозах КС (>5 Дж см^-2) наблюдали более значительное снижение активности ФС2 и понижение устойчивости ФС2 к УФ-А-радиации.

Установлено, что образование Фх_ДК сопровождается увеличением уровня стрессового гормона этилена (Kreslavski et al., 1997), а также активности пероксидазы и пула каротиноидов и пигментов, поглощающих УФ (преимущественно флавоноиды), которые защищают ФА от АФК и продуктов ПОЛ (Креславский и др., 2009). По нашим данным повышенная антиоксидантная активность индуцируется вследствие транзитного увеличения пула Н₂О₂.

На основе полученных данных можно предположить, что в естественных условиях защитное действие видимого света от УФ-излучения, ингибирующего рост и фотосинтез растений, проявляется в значительной степени благодаря поглощению света в области 620-670 нм (КС), которая стимулирует образование активной формы фитохрома. В полуденное время и в солнечный день, когда велика доля УФ-радиации, а отношение КС/ДКС высокое (Музафаров и др., 1995), пул Фх_ДК в листьях высокий, и наблюдается заметная компенсация ингибирующего эффекта УФ-радиации за счет активации Фх. В потоке солнечного света, попадающего в листовую тень, а также в условиях облачности отношение КС к ДКС падает с 1.1 до 0.2-0.7 (Weinig et al., 2004) компенсация ингибирующего эффекта не нужна, так как доля УФ мала.

Предоблучение растений КС может приводить к активации антиоксидантных ферментов, но механизм во многом неясен (Sharma et al., 1976; Qi et al., 2000, 2002). В настоящее время все большее признание находит идея свободно-радикальной регуляции синтеза белков (Артюхов и др., 2005). Развивая эту идею, мы предположили, что реализуется следующая схема повышения стресс-устойчивости ФА к УФ-облучению: КС (_м=660 нм) Фх Фх_ДК (транзитное повышение содержания Са²⁺, АФК и некоторых фитогормонов) повышение активности антиоксидантных ферментов и пула низкомолекулярных антиоксидантов повышенная стресс-устойчивость ФА (рис. 13). По этой схеме, АФК, транзитно образующиеся при действии КС, играют роль сигнальных интермедиатов в формировании повышенной стресс-устойчивости ФА.

Установлено, что повышение пула Н₂О₂ происходит даже при облучении листьев умеренными дозами КС и инициирует повышение пероксидазной активности, а также синтез низкомолекулярных антиоксидантов, в частности флавоноидов и каротиноидов (Креславский и др., 2009). При высоких дозах КС, следовательно, высоких уровнях АФК, устойчивость ФА к УФ-А-радиации снижена. Внутриклеточное транзитное возрастание АФК, даже в небольших количествах, может вызвать переход многих факторов транскрипции в активное состояние. Они связываются с соответствующим промоторным участком гена и индуцируют экспрессию генов, кодирующих различные защитные белки.

Повышение стресс-устойчивости ФА при облучении низкими дозами КС необязательно связано с усиленным транзитным образованием АФК. В недавних работах было показано, что после активации кратковременным КС, Фх_ДК переходит из цитозоля в ядро, где с помощью факторов транскрипции прямо взаимодействует со светоактивируемыми генами, вызывая их экспрессию (Quail, 2002, 2006, 2007).