Культивирование, титрование и очистка тогавирусов

Курсовая работа

на тему:

"Культивирование, титрование и очистка тогавирусов"

2008

Введение

В семействе Togaviridae выделяют два основных рода -- альфавирусы и флавивирусы), ранее называвшиеся соответственно вирусами групп А и В. Вирусы в пределах каждого из родов имеют антигенное родство, сходные циклы репродукции и морфологические особенности; в то же время вирусы, принадлежащие к разным родам, различаются по антигенным свойствам. К указанным выше вирусам применяют также название «арбовирусы» из-за их способности размножаться как в организме позвоночных, так и в организме членистоногих.

В течение многих лет основным способом выделения диких штаммов арбовирусов было заражение новорожденных мышат, однако в настоящее время с этой целью начинают использовать комаров, их личинки, а также и культуры клеток беспозвоночных. Данные системы особенно важны для выделения некоторых медленно размножающихся арбовирусов, например вируса денге.

Методы, используемые для определения инфекционности, зависят от имеющегося оборудования, конкретного вида вируса и характера данных, которые должны быть получены. Так, например, в некоторых странах заражение новорожденных мышат является более удобным и дешевым способом титрования инфекционности арбовирусов, чем заражение культур клеток комаров, в то время как в других странах ситуация противоположная. Кроме того, в тех случаях, когда нужна максимальная точность, используют линии клеток комаров. С другой стороны, пока не доказано, что все тогавирусы способны размножаться в этих клетках.

Там, где возможно, мы будем описывать несколько методов, их преимущества и недостатки, приводя конкретные примеры. Очищенные вирионы необходимы для различных целей: их используют для изучения состава и строения самих вирионов, 4 также в качестве исходного материала для получения индивидуальных структурных компонентов. В зависимости от задач эксперимента в препарат вируса можно ввести радиоактивную метку, выращивая вирус в присутствии радиоактивных изотопов, например -уридина или -ортофосфата для мечения РНК, -метионина для мечения белков или -глюкозамина или маннозы для мечения гликопротеинов. Если при очистке меченого вируса обычно используют небольшое количество клеточной культуры и соответственно работу ведут с малым объемом жидкости, то при очистке больших количеств немеченого вируса может потребоваться обработка нескольких литров культуральной жидкости; при этом на последних стадиях очистки может быть достигнута исключительно высокая концентрация инфекционного вируса.

Важно отметить, что многие вирусы данного семейства считаются опасными. Поэтому необходимо принимать соответствующие меры к тому, чтобы между экспериментатором и вирусом всегда существовала физическая преграда. В большинстве стран действуют строгие правила, допускающие использование в целях обучения и фундаментальных исследований лишь определенных штаммов. Названия вирусов, их хозяева-беспозвоночные, необходимые меры безопасности, наиболее распространенные лабораторные хозяева и чувствительные клеточные культуры описаны в Каталоге арбовирусов.

1. Культивирование тогавирусов

1.1 Заражение новорожденных мышат

При интрацеребральном заражении новорожденных мышат содержащим тогавирусы материалом во многих случаях удается получить вирус в высоком титре. При заражении многими вирусами мышата погибают в течение 2--8 сут, хотя для некоторых природных изолятов может потребоваться один или два «слепых» пассажа, прежде чем будет достигнут высокий титр. Мозг зараженных мышат в качестве источника вируса следует брать не раньше, чем за несколько часов до их гибели. Обычно в последние сутки жизни у зараженных животных нарушается координация движений, часто наступает паралич задних конечностей, и через несколько часов они погибают. Следует ежедневно наблюдать за инфицированными животными; гибель в течение первых суток после заражения считается неспецифической.

Если в течение б сут. после заражения нет очевидных симптомов заболевания, следует забить половину животных и их мозг ввести новой группе новорожденных мышат. Такую процедуру называют «слепым пассажем». Если после двух слепых пассажей по-прежнему не обнаруживается симптомов заболевания, считают, что исследуемый материал не содержит вируса. Природный материал в отличие от штаммов вируса, адаптированных в лаборатории, может и не давать одинаковой картины заболевания во всей группе зараженных животных. Поэтому целесообразно исследовать отдельно мозг каждого животного, заболевшего через двое суток после заражения или позже.

1.1.1 Подготовка материала для заражения новорожденных мышат

Беременных мышей незадолго до родов отсаживают в отдельные чистые клетки и наблюдают за ними ежедневно. Дату рождения мышат регистрируют и через 2--3 сут? после рождения оставляют не более 10 новорожденных на одну мать. Для снижения риска поедания новорожденных матерями при работе с ними следует пользоваться перчатками. Если имеется несколько пометов одного и того же возраста, их объединяют и распределяют по 8--10 штук на клетку. Как правило, для выделения и наращивания вирусов используют мышат не старше 4 сут, если только по специфическим условиям эксперимента не требуются детеныши большего возраста. Для выделения вируса из образцов сыворотки последнюю вводят в мозг мышат без разведения. Из мозга и других тканей готовят 10%-ную суспензию в растворе, содержащем 25% инактивиро-ванной нагреванием ЭТС. Комаров или их личинок для приготовления суспензии тоже растирают в ступке, затем добавляют 2 мл раствора, содержащего 25% ЭТС. После растирания суспензию разливают по пробиркам, центрифугируют при 1500 g в течение 15 мин и супернатант используют для заражения. Суспензию можно длительно хранить при --70 °С. Если известно, что препараты содержат вирус в высоком титре, готовят серию 10-кратных разведений. Максимальным титром вируса считают то наибольшее разведение, которое еще обеспечивает развитие заболевания у всего помета мышат. Вся работа по заражению животных должна проводиться в полностью изолированных ламинарных боксах, удовлетворяющих правилам техники безопасности, принятым в данной стране.

Необходимо также иметь следующее дополнительное оборудование и материалы: перчатки одноразового пользования, стерильные шприцы одноразового пользования объемом 1 мл, стерильные иглы для инъекций № 26 одноразового пользования, бумажные полотенца, пробковую панель для фиксации мышат, метанол.

1.1.2 Методика заражения

1. Внутри ламинарного бокса на пробковую панель кладут Шпажное полотенце.

2. В шприц набирают используемый для заражения материал.

3. Новорожденного мышонка помещают на бумажное полотенце.

4. Как показано на рис. 1, животное крепко, но осторожно зажимают пальцами и вводят в одно из полушарий мозга 0^01 мл образца. Нельзя вводить иглу в мозг слишком глубоко; ее следует задержать в мозге на две секунды и затем медленно вынуть. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет заражен весь помет. Во время заражения, для того чтобы руки экспериментатора не дрожали, можно опираться ими о переднюю панель ламинарного бокса.

5. При выделении вируса из природного материала следует использовать не менее двух пометов мышат. Титрование вируса начинают с максимального разведения, чтобы для всей работы можно было использовать одни и те же иглу и шприц.

6. Каждый помет мышат возвращают к матери. Клетку нумеруют и ставят обратно на стеллаж.

1.1.3 Методика учета результатов и сбора вируса

1. Животных осматривают ежедневно, предпочтительно рано утром. Их состояние регистрируют следующим образом: П -- павшее животное; С -- имеются симптомы заболевания; Н -- состояние нормальное; О -- животное отсутствует. Павших животных удаляют из клеток с помощью пинцета, используя для каждой клетки отдельный пинцет.

2. В мозге мышат как с выраженными симптомами заболевания, так и у павших, но не более чем за 1--2 ч до момента наблюдения, должно содержаться значительное количество вируса. Мышат, у которых имеются четкие симптомы, умерщвляют в закрытом сосуде парами хлороформа или эфира.

3. На пробковую панель кладут одно поверх другого два бумажных полотенца.

4. Умерщвленного мышонка прикрепляют к пробковой панели, вводя одну иглу в нос и другую в основание хвоста, как показано на рис. 2.

5. Животное протирают достаточным количеством метанола, после чего отделяют скальп, пользуясь стерильными пинцетом и ножницами. Затем, используя другую пару стерильных инструментов, вскрывают череп. Для этого применяют ножницы с одним острым, а другим тупым концом. Острый конец ножниц вводят в череп сзади по центру и делают разрез под сводом черепа в направлении кончика морды. Затем ножницы переворачивают и делают такой же разрез с другой стороны головы. После этого свод черепа можно поднять, обнажив мозг, который легко вынуть концом закрытых ножниц.



6. Мозг немедленно помещают в стеклянный флакон объемом 25 мл, содержащий стеклянные бусы. В один флакон можно поместить мозг от 15 животных.

7. Крышку флакона плотно закручивают и содержимое тщательно перемешивают 30 с, либо энергично встряхивая, либо с помощью миксера.

8. Во флакон добавляют используемый для приготовления суспензии раствор из расчета 1 мл на мозг одного новорожденного мышонка или 1,5 мл на мозг сосунка. Работу проводят в ламинарном боксе, экспериментатор должен пользоваться перчатками.

9. Флакон вновь плотно закрывают и энергично встряхивают, как описано выше, 30 с.

10. Суспензию центрифугируют при 1500 g и 4°С в течение 15 мин.

11. Полупрозрачный супернатант, представляющий собой 20%-ную суспензию вирусного антигена из мозга мышат, отбирают, делят на порции и хранят при --70°С. Работу ведут в ламинарном боксе.

Этот метод можно модифицировать, начиная со стадии 5, если у новорожденных мышат симптомы развились не позже пятого-шестого дня. В этом случае мышат можно непосредственно заморозить при --70°С.

Получив вирусный антиген, необходимо уничтожить путем сжигания все трупы животных, бумажные полотенца, перчатки инструменты одноразового пользования. Остальные инструменты и клетки для животных стерилизуют, а ламинарный бокс тщательно дезинфицируют.

1.2 Выделение и наращивание тогавирусов в культуре клеток

комаров

Показано, что во многих случаях культуры клеток беспозвоночных более чувствительны к альфа- и флавивирусам, чем новорожденные мышата или культуры клеток позвоночных. В особенности это относится к первичному выделению вирусов. Если в лаборатории имеются условия для культуральной работы, клетки беспозвоночных можно легко нарастить и использовать для постоянной работы с тогавирусами. Для некоторых линий клеток комаров характерна высокая чувствительность к переносимым комарами альфа- и флавивирусам, причем многие из этих вирусов способны образовывать бляшки, хотя результаты, по-видимому, до некоторой степени зависят от конкретных условий эксперимента. Если какой-либо конкретный метод не дал хороших результатов, имеет смысл попытаться применить другой. Например, обычно клетки комаров для культивирования и выделения вирусов инкубируют при 27--28°С, но в случае вируса денге лучшие результаты получают при повышении температуры до 32 СС. Имеется ряд стандартных клеточных линий, и если размножение вируса не удается в одной из них, имеет смысл испытать другую. Подробные сведения об используемых средах приведены в приложении.

1.2.1 Культивирование клеток комаров

1. С монослоя клеток сливают среду и добавляют в каждый флакон 5--10 мл свежей среды.

2. Клетки снимают со стекла либо пипетированием, либо с помощью стерильной палочки с резиновым наконечником.

3. Убедившись в том, что получена гомогенная суспензия, с помощью гемоцитометра определяют концентрацию клеток. Для этого подсчитывают клетки в четырех больших угловых квадратах. Число клеток в 1 мл подсчитывают, умножая среднее число клеток в одном большом квадрате на 10. Обычно результаты получаются наиболее точными, если в одном большом квадрате содержится 100--200 клеток. С таким расчетом и следует готовить разведение клеток.

4. После подсчета суспензию разводят культуральной средой до концентрации 2-Ю кл/мл и разливают по стерильным куль-туральным сосудам. Необходимый объем суспензии зависит от типа используемого сосуда; толщина слоя жидкости в сосуде должна составлять 2--4 мм.

5. Клетки инкубируют при 28 °С. Если среда содержит в качестве буфера бикарбонат натрия, культуру инкубируют во влажной камере в атмосфере 5% СОг, причем пробки в культуральных сосудах закрывают неплотно.

6. Плотный монослой клеток формируется обычно в течение 3--6 сут.

1.2.2 Наращивание тогавирусов в культурах клеток комаров

1. С монослоя клеток удаляют культуральную среду и непосредственно на монослой в небольшом объеме наносят вирус. Раствор, содержащий вирус, распределяют по всему монослою и инкубируют клетки 1 ч при комнатной температуре, проверяя каждые 10 мин, покрыт ли монослой жидкостью. Природный материал, обычно хранящийся в растворе с 25% ЭТС и антибиотиками, не разводят перед заражением. Если же используют вирус, уже адаптированный к размножению в культуре клеток или мозге мышей, его разводят соответствующей средой по крайней мере в 100 раз.

2. После адсорбции вируса к клеткам добавляют среду, чтобы получить слой жидкости толщиной 2--4 мм, и инкубируют клетки при 28 °С. Если есть основания предполагать, что вирус лучше размножается при более высокой температуре, часть флаконов с культурой инкубируют в соответствующих условиях.

3. Состояние культур проверяют ежедневно, пользуясь инвертированным микроскопом с небольшим увеличением.

Контрольная незараженая культура должна сохранятъ нормальный вид по крайней мере в течение 14 сут. Многие альфа- и фла-ййвирусы не дают ЦПД при размножении в клетках комаров при 28 °С. В этих случаях вирус необходимо идентифицировать каким-то другим методом, например, с помощью гемагглютинации или по способности вызывать летальное заболевание у новорожденных мышат. Ожидаемый тип ЦПД зависит от вируса и от частоты пассирования клеток. Инфекционный вирус выделяется в культуральную среду. Как правило, альфавирусы обнаруживаются в среде в достаточно высоком титре, начиная со второго дня после заражения клеток. Однако для того, чтобы получить высокий выход флавивирусов, может потребоваться 5 сут или более. При ежедневной смене культуральной среды продукция вируса сохраняется. Это особенно полезно, если для концентрирования и анализа требуется большое количество вируса.

1.2.3 Метод непрямой иммунофлуоресценции как способ

идентификации вируса при отсутствии ЦПД

Данный метод предполагает использование специфической антивирусной сыворотки, антител против нее, конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом, и флуоресцентного микроскопа. Некоторые ФИТЦ-конъюгированные антитела имеются в продаже.

1. Снимают небольшую часть инфицированных клеток с поверхности культурального флакона.

2. Клетки осаждают центрифугированием при 1500 g в течение 10 мин.

3. Клетки ресуспендируют в небольшом объеме PBS.

4. Готовят стекло для микроскопии, вычерчивая на обезжиренном предметном стекле несколько небольших кружков алмазным пером.

5. В каждый кружок на стекле наносят по капле клеточной суспензии.

6. Каплям дают высохнуть при комнатной температуре, оставляя стекло в ламинарном боксе, затем погружают его на 10 мин в охлажденный до 4°С ацетон. Стекло используют непосредственно или хранят при --70°С.

7. На высушенные капли наносят соответствующие разведения антивирусной сыворотки.

8. Стекло помещают на 5 мин в PBS, буферный раствор заменяют свежим и инкубируют стекло дважды.

9. Стекло насухо промокают фильтровальной бумагой и наносят на каждое пятно ФИТЦ-конъюгированные антитела. Стекло инкубируют, промывают и сушат, как описано выше.

10. На стекло наносят забуференный глицерин и накрывают покровным стеклом.

11. Препарат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа, используя источник ультрафиолета и светофильтр, обеспечивающий регистрацию флуоресценции.

12. Зараженные клетки можно узнать по интенсивной флуоресценции, в то время как незараженные выглядят темными или вообще не видны. Специфичность флуоресценции можно проверить, исследуя контрольные незараженные клетки. Если наблюдается неспецифическая флуоресценция всех клеток, антисыворотку разводят до тех пор, пока не удается зарегистрировать специфическую флуоресценцию зараженных клеток.

13. На рис. 6 приведена черно-белая фотография типичного препарата, приготовленного описанным способом.

1.3 Наращивание вирусов в культуре клеток млекопитающих

Имеется несколько линий клеток млекопитающих, чувствительных к тогавирусам. Применение этих линий особенно эффективно после того, как вирусы выделены и их титры повышены путем адаптации в лабораторных условиях. Поскольку методы культивирования указанных выше клеток в основном одни и те же, мы опишем только один. В большинстве случаев Можно использовать любую из широко распространенных линяй клеток. Имеется много сред разного состава; лучше всего использовать ту среду, в которой данная клеточная линия постоянно культивируется поставщиком. Однако следует отметить, что среда Лейбовича-Ы5 имеет определенные преимущества, так как не требует СОг-инкубатора или HEPES-буфера; в присутствии 10% ЭТС эта среда подходит для роста всех перечисленных выше линий клеток. Полезно также заметить, что клетки Vero исключительно стабильны и их можно оставлять на 10--14 сут при 37 °С без пересева.

1.3.1 Пересев клеток млекопитающих

1. С плотного монослоя клеток удаляют культуральную среду. На монослой наносят 5 мл теплой смеси трипсина и версена, быстро ополаскивают клетки и сливают раствор. Эту процедуру повторяют трижды.

2. Культуральный флакон на 1--2 мин помещают в термостат с температурой 37°С, после этого энергично постукивают по стеклу рукой; при этом клетки должны отделиться от субстрата. Как только это произойдет, клетки ресуспендируют в подходящем объеме свежей среды.

3. С помощью гемоцитометра определяют концентрацию клеток и доводят ее культуральной средой до 2-10 кл/мл.

4. Клеточную суспензию разливают по культуральным сосудам таким образом, чтобы толщина слоя жидкости составляла 2--4 мм.

5. Клетки инкубируют при 37 °С, в случае необходимости в СОг-инкубаторе с увлажненной атмосферой.

1.3.2 Наращивание тогавирусов в клетках млекопитающих

На практике в большинстве случаев титр инфекционного вируса, используемого для заражения, известен и составляет около 10 БОЕ/мл или выше. Если отсутствует особая необходимость использовать для заражения очень большое или, наоборот, очень маленькое количество вируса, лучше всего вносить его с таким расчетом, чтобы зараженными оказались 1-- 10% клеток в монослое. Если титр вируса неизвестен, следует сначала взять для заражения 2--3 разные концентрации. Избыток вируса при заражении клеток не приводит к повышению его выхода.

1. Перед заражением клеточного монослоя из культурально-го сосуда удаляют среду.

2. На монослой наносят небольшой объем вируса в соответствующем разведении так, чтобы только покрыть клетки.

3. Клетки инкубируют 1 ч при комнатной температуре, каждые 10 мин проверяя, покрыт ли монослой средой.

4. Если клетки используются для выделения вируса из природных образцов, то после часовой адсорбции вируса к ним сразу же добавляют свежую среду. Если же вирус уже адаптирован к размножению в культуре клеток или мозге новорожденных мышат, то его удаляют, клетки осторожно промывают 10*--20 мл культуральной среды и добавляют такой объем среды, чтобы толщина слоя жидкости в сосуде составляла 2--4 мм.

При появлении признаков ЦПД среду собирают, центрифугируют 15 мин при 1500 g и хранят при --70°С или используют непосредственно для заражения свежей культуры.

Большинство альфавирусов в течение 2 сут дают выраженное ЦПД. При этом сначала клетки вытягиваются и приобретают очень длинные отростки; затем они округляются и отрываются от субстрата. При заражении клеток флавивирусами ЦПД обычно развивается медленнее, начиная с третьего или четвертого дня после заражения. Во многих случаях монослой сохраняет целостность в течение нескольких дней, хотя отдельные клетки округляются и отрываются от субстрата. Если клетки такого монослоя пересеять на свежую среду, они обычно вновь дают монослой и продолжают продуцировать инфекционный вирус. Пока монослой сохраняет свою целостность, ежедневно меняя культуральную среду, можно получить значительное количество вируса.

Альтернативный подход состоит в том, чтобы заражать суспензию клеток, а затем высевать ее в культуральные сосуды для образования монослоя. Этот метод имеет определенные преимущества, например, при исследовании клеток путем иммунофлуоресценции или при необходимости одновременной обработки большого числа образцов.

1. Клетки снимают со стекла смесью трипсина и версена, как описано выше.

2. Готовят суспензию клеток, определяют их концентрацию и доводят ее культуральной средой до 2-Ю кл/мл.

3. К аликвотам клеток добавляют вирус в таком разведении, чтобы заразить 1--10% клеток. Перемешивают содержимое 1 ч при комнатной температуре.

4. Если зараженные клетки используются для иммунофлуоресценции, аликвоты клеточной суспензии разводят до концентрации 2-Ю кл/мл и высевают в чашки Петри с покровными стеклами.

5. Чашки инкубируют при 37°С до тех пор, пока в 30--50% клеток методом иммунофлуоресценции не будет обнаруживаться вирусный антиген.

По этому же принципу можно получить культуру зараженных клеток на покрытых тефлоном пластинах или пластинах Терасаки. Кроме того, таким же способом получают персистентно зараженные клеточные культуры. В этом случае панели «ли стекла с клетками инкубируют 4--6 ч при 37 °С во влажной камере.



1.4 Выращивание вирусов на комарах и их личинках

1.4.1 Интраторакальное заражение комаров

Оборудование, необходимое для заражения комаров, подробно описано в работе Розена и Габлера. Комаров поддают в охлажденный контейнер или пробирку, погруженную ледяную баню. При этом подвижность комаров резко снижается, но они не погибают. Перед заражением следует убедиться в том, что используемый микрошприц заполнен воздухом, иглу необходимо изолировать трехходовым клапаном от капиллярной трубки, содержащей инфекционный материал. Недвижного комара помещают на предметный столик микроскопа и, глядя в микроскоп, вводят иглу в грудь непосредственно под кутикулу. Имеющийся на шприце переключатель ставят в рабочее положение и вводят в грудь комара около 2 мкл содержащего вирус препарата. Инъекцию прекращают, переводя переключатель в открытое положение. Иглу извлекают и комара пересаживают во временный контейнер. Всю операцию нужно проводить максимально быстро, чтобы комар не успел улететь. После окончания заражения комаров помещают обратно в постоянные инкубаторы.

1.4.2 Интрацеребральное заражение личинок комаров

Используют то же оборудование, что и для описанного выше заражения комаров. На предметный столик микроскопа помещают кусок влажной ткани, а на него личинку, которую Осторожно придерживают пинцетом. Иглу вводят на глубину около 0,5 мм в дорзальную часть головной капсулы, позади глаз и между передними экдизиальными линиями. Вводят примерно 0,1--0,2 мкл раствора, после чего удаляют иглу, а зараженную личинку возвращают в инкубатор. С интервалом в сутки из зараженных комаров или личинок готовят отпечатки и исследуют их на присутствие вирусного антигена методом иммунофлуоресценции, как описано ниже.

1.4.3 Обнаружение вирусного антигена методом

иммунофлуоресценции

1. Готовят стекло для микроскопии, вычерчивая на предметном стекле 4 кружка диаметром около 1 см; кружки должны быть расположены на значительном расстоянии друг от друга.

2. Комара помещают в центр кружка и с помощью скальпеля отделяют голову от груди и грудь от брюшка.

3. Грудь отбрасывают, голову оставляют в верхней половине кружка, а брюшко -- в нижней.

4. Эту операцию проводят со всеми исследуемыми комарами.

5. На стекло с 4 комарами помещают другое предметное стекло и с силой сжимают их.

6. Верхнее стекло удаляют, смещая его относительно нижнего примерно на 3 мм и затем поднимая. В результате получают одинаковые отпечатки на обоих стеклах.

2. Титрование тогавирусов

Обычно для титрования тогавирусов используют новорожденных мышат. Однако в некоторых случаях использование клеточых культур явно предпочтительнее.

2.1 Титрование путем интрацеребрального заражения

новорожденных мышат

2.1.1 Титрование вируса

1. Пометы новорожденных мышат рассаживают в пронумерованные клетки вместе с матерями.

2. Для титрования готовят последовательные 10-кратные разведения вируса на соответствующей культуральной среде.

3. В ламинарный бокс помещают пробковую панель для заражения, покрытую бумажными полотенцами одноразового пользования.

4. Первый помет мышат помещают на панель для заражения; работать при этом необходимо в перчатках. Каждое животное интрацеребрально заражают 0,02 мл последнего разведения вируса, используя иглу № 26 и шприц одноразового пользования объемом 1 мл. Зараженных животных немедленно возвращают в клетку. Метод внутримозгового заражения был уже проиллюстрирован и описан выше. Для всех разведений вируса можно использовать одни и те же иглу и шприц, если работу начинать с максимального разведения.

5. Если нужно протитровать несколько вирусов, следует менять перчатки, шприц, иглу и панель для заражения. Прежде чем начинать работу с очередным вирусом, необходимо тщательно дезинфицировать ламинарный бокс.

6. В конце каждого опыта все оборудование уничтожают или стерилизуют.

7. Мышей наблюдают ежедневно и регистрируют число павших. В большинстве случаев титрование можно считать законченным через две недели.

8. Титром считается разведение вируса, вызывающее гибель 50% зараженных мышей, в данном случае его называют 50%-ной конечной точкой, или ЛД50. Пример расчета титра инфекционного вируса по методу приведен в табл. 1. Очевидно, что в этом примере 50%-ная конечная точка лежит между 1-Ю- и 1-Ю".

Таблица 1. Метод расчета титра инфекционного вируса

Точный расчет делается следующим образом:

В данном примере:

66,66--50=16,66, 66,66--14,29 = 52,37, 16,66:52,37=0,32.

2.1.2 Определение титра антивирусных антител в опытах по

защите мышей

С помощью модификации описанного выше метода можно определить способность антисыворотки защищать новорожденных мышат от заражения летальной дозой тогавируса.

1. Из титра, определенного в описанном выше опыте, рассчитывают, какое разведение вируса нужно приготовить, чтобы в 0,02 мл содержалось 100 ЛД50. Например, если титр вируса 5-Ю ЛДйо/мл, потребуется разведение 1: 1000.

2. Готовят нужное разведение на культуральной среде.

3. Готовят последовательные 10-кратные разведения исследуемой антисыворотки.

4. Аликвоты используемого разведения вируса объемом 0,1 мл смешивают с таким же объемом каждого разведения сыворотки.

5. Смеси инкубируют при 37 °С 60 мин. В качестве контроля готовят также смесь вируса с неразведенной преиммунной сывороткой.

6. Смеси вводят интрацеребрально группам новорожденных мышат дозами по 0,2 мл, пользуясь описанным выше методом. Заражение начинают с минимального разведения антител и для введения каждой смеси используют новые шприц и иглу.

7. Каждый день регистрируют число павших животных. Вся контрольная группа должна погибнуть. Титром антител считается их разведение, защищающее 50% животных. Эту 50%-ную протективную дозу можно рассчитать методом, описанным выше для ЛД50.

2.2. Титрование в культуре клеток

Хотя во всех описанных ниже методах в качестве тест-культуры взяты клетки Vero, однако можно использовать с этой целью ВНК-21, LLCMK2, РК15 и другие линии клеток млекопитающих. Первый метод оптимален при исследовании большого числа образцов; его легко адаптировать для работы с микропланшетами для титрования, как описано здесь, или с планшетами или чашками большего размера, например для определения морфологии бляшек. В этом случае для титрования используют карбоксиметилцеллюлозу. Далее описан еще один метод, предполагающий использование агарозы и окрашивание клеток нейтральным красным. Он особенно полезен при работе с вирусными клонами, когда необходимо, чтобы бляшки содержали инфекционный вирус.

2.2.1 Метод бляшек с использованием покрытия из

карбоксиметилцеллюлозы

1. Готовят 8 последовательных 10-кратных разведений вируса на культуральной среде.

2. С помощью пастеровской пипетки одну каплю восьмого разведения вируса помещают на дно лунки в восьмом ряду плоскодонного микропланшета для титрования.

3. Из пипетки удаляют весь оставшийся вирус и описанную процедуру повторяют с седьмым разведением, внося каплю в соответствующую лунку в седьмом ряду.

4. Описанную процедуру повторяют со всеми разведениями вируса.

5. Сразу после заполнения планшета в каждую лунку вносят каплю суспензии клеток Vero.

6. Планшеты инкубируют 3 ч при 37°С. Затем в каждую лунку вносят по две капли культуральной среды, содержащей 1,5% КМЦ.

7. Планшеты инкубируют в герметически закрытом контейнере при 37°С.

8. Большинство альфавирусов формируют бляшки через 2--3 дня, а флавивирусов -- через более длительный срок. Пока вирус не охарактеризован, необходимо ежедневно осматривать планшеты.

9. Исследуют культуры с помощью инвертированного микроскопа. Из лунок, в которых обнаружено ЦПД вируса, удаляют культуральную среду.

10. В каждую лунку добавляют 2--3 капли солевого раствора с формальдегидом, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, удаляют раствор и добавляют раствор красителя нафталинового черного. Планшеты инкубируют 30 мин при комнатной температуре и промывают водой.

11. Рассчитывают титр образцов вируса. Для этого подсчитывают число бляшек, образуемых каждым разведением вируса.

Пример:

Число бляшек--9 Разведение вируса-- ЫО Объем инокулята -- 0,04 мл

Титр вируса = 9-Ы0-1/0,04 БОЕ/мл = 2,25-10 БОЕ/мл

Следует подчеркнуть, что для каждого разведения вируса необходимо ставить по крайней мере три пробы, чтобы избежать влияния небольших экспериментальных ошибок. Однако в целом при сравнении большого числа образцов описанный метод дает обычно удовлетворительные результаты.

2.2.2 Метод бляшек с использованием агарозного покрытия

1. Выращивают плотный монослой клеток в небольших флаконах одноразового пользования площадью 25 см или в чашках Петри.

2. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса на культуральной среде.

3. Удаляют среду и вносят по 0,2 мл вируса, начиная с максимального разведения. При этом необходимо следить, чтобы жидкость полностью покрывала монослой.

4. Флаконы помещают на качалку или в течение нескольких минут покачивают вручную, после этого оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

5. Вирус удаляют из флаконов, лучше всего с помощью пипетки, и добавляют 5 мл агарозного покрытия.

6. Убедившись, что покрытие равномерно распределилось по монослою, флаконы, оставляют на 10 мин при комнатной температуре и далее инкубируют при 37 °С.

7. Разные вирусы формируют бляшки на разных сроках после заражения. Оптимальное время инкубации определяют, ежедневно осматривая флаконы, начиная со второго дня после заражения для альфавирусов и с четвертого дня для флавиви-русов.

8. Когда начинают появляться бляшки, в каждый флакон добавляют по 2 мл агарозного покрытия, содержащего 0,02% нейтрального красного. Флаконы оставляют на 10 мин, чтобы агароза застыла, после этого инкубируют при 37°С в темноте.

9. В течение нескольких часов живые клетки окрашиваются в красный цвет, в то время как бляшки остаются прозрачными. Если необходимо извлечь из бляшек инфекционный вирус, не следует оставлять флаконы на свету дольше чем на несколько секунд.

10. Для стойкого окрашивания после формирования бляшек и внесения нейтрального красного в каждый флакон добавляют 2--4 мл солевого раствора с формальдегидом. После инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин формалин вместе с агарозой удаляют и промывают монослой водой.

11. Титр вируса определяют, как описано выше, подсчитывая число бляшек при соответствующем разведении вируса.

2.2.3 Определение титра нейтрализующих антител по уменьшению

числа бляшек

Каю и в предыдущих случаях, мы описываем методику работы с клетками Vero, однако можно использовать и многие другие линии клеток млекопитающих и комаров. Описанный микрометод титрования позволяет выразить титр антител либо через индекс нейтрализации, либо через конечное активное разведение. Последний способ более точен, но требует больше времени и специального оборудования.

1. Исследуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56 °С для инактивации некоторых компонентов комплемента и неспецифических ингибиторов.

2. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса и сыворотки на культуральной среде. Если предполагается, что титр антител невысок, то вместо 10-кратных используют двукратные разведения сыворотки.

3. Одну каплю максимального разведения вируса помещают в каждую лунку ряда «Н» микропланшета для титрования. Следующее разведение вносят в ряд «G» и т. д. до ряда «А».

4. В каждую лунку рядов 11 и 12 вносят по капле культуральной среды, ряда 10 -- по капле максимального разведения сыворотки, в ряд 9 -- по капле следующего разведения сыворотки и т. д. до ряда 1.

5. Планшеты инкубируют 60 мин при 37 °С и в каждую лунку вносят каплю суспензии клеток Vero.

6. Планшеты инкубируют 3 ч при 37 °С, далее в каждую лунку добавляют по две капли культуральной среды, содержащей 1,5% КМЦ, и инкубируют планшеты при 37 °С в герметически закрытом контейнере или в СОг-инкубаторе, если используется среда, содержащая в качестве буфера бикарбонат.

7. Когда в рядах, не содержащих сыворотки, образуются бляшки, среду удаляют и заменяют солевым раствором, содержащим 10% формальдегида. С этим раствором планшеты инкубируют 10 мин, затем в течение 30 мин окрашивают нафталиновым черным и промывают водой.

Титр нейтрализующих антител может быть рассчитан одним из двух способов. В первом случае определяют разведение сыворотки, которое вызывает снижение числа образующихся бляшек на 50%. Например, если при внесении сыворотки в разведении 1: 1000 число бляшек уменьшается от 20 до 10, титр нейтрализующих антител равен 1000. Чтобы точно определить его значение, можно построить график зависимости числа бляшек от разведения антител.

Во втором случае рассчитывают индекс нейтрализации для данной сыворотки, который представляет собой разницу между титром контрольного вируса и титром вируса при максимальной концентрации антител. Пример: если титр контрольного вируса составляет ЫО БОЕ/мл, а титр вируса при разведении антител 1:20 -- 1 * * 10 БОЕ/мл, то ИНС равен 3.

2.2.4 Тест на повышение инфекционное™ вируса

Данный метод основан на использовании Fc-рецепторов, имеющихся на поверхности выращиваемых в культуре человеческих или мышиных макрофагов. Вирус, не адсорбировавшийся на клеточной поверхности, может проникнуть в цитоплазму в результате образования комплексов с вирус-специфическими антителами. Комплексы антиген антитело связываются с Fc-рецепторами, и в результате этого повышается инфекционность вирусного препарата. Использование этого явления особенно полезно при работе с моноклональными антителами, так как удается идентифицировать антитела, реагирующие с поверхностью вириона. С помощью этого метода можно получить данные трех типов: о повышении инфекцион-ности вируса в присутствии антител, о титре нейтрализующих антител и о стандартной инфекционности вируса. Многие тога-вирусы размножаются в макрофагах мыши, имеющих на поверхности Fc-рецепторы. Эти клетки хорошо прикрепляются к поверхности культуральных сосудов, поэтому с ними можно работать, как с обычными культурами клеток.

1. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса на среде L15.

2. С помощью стерильной пастеровской пипетки в 12 лунок каждого ряда микропланшета для титрования вносят по одной капле каждого разведения вируса, начиная с максимального.

3. В ряды 11 и 12 вносят по одной капле среды L15. Эти ряды не содержат антител и служат контролем.

4. Готовят двукратные последовательные разведения сыворотки на культуральной среде.

5. По одной капле каждого из разведений сыворотки добавляют в 8 лунок, содержащих разведение вируса; в лунки ряда 10, таким образом, попадет по капле максимального разведения сыворотки, в лунки ряда 9 -- по капле предыдущего разведения и т. д.

6. Планшет, закрытый крышкой, инкубируют 30 мин при 30 °С в герметичном контейнере.

7. Тем временем готовят суспензию клеток Р388 D1. Для этого с плотного монослоя клеток сливают среду и снимают клетки со стекла пипетированием или с помощью резиновой палочки.

8. Определяют концентрацию клеток, доводят ее до 1 * * 10 кл/мл и добавляют в каждую лунку по капле клеточной суспензии.

9. Планшеты инкубируют 3 ч при 37 °С в герметичном контейнере, затем в каждую лунку вносят по две капли покрытия, содержащего КМЦ, на основе среды L15. Планшеты инкубируют при 37°С. Для большинства альфавирусов ЦПД проявляется не позднее чем через 3 сут после заражения, а в случае флавивирусов -- через 4--7 сут.

10. Оптимальное время инкубации определяют, ежедневно осматривая клетки. После появления явных признаков цито-патических изменений среду удаляют и добавляют солевой раствор с формальдегидом.

11. Через 10 мин раствор с формальдегидом, заменяют на раствор нафталинового черного и проводят окрашивание в течение 30 мин.

12. Планшеты промывают водой, высушивают и подсчитывают бляшки в каждой лунке. Титр вируса можно рассчитать следующим образом: число бляшек в лункеХфактор разведения X 1/объем инокулята.

Пример:

если в лунке образовалось 15 бляшек при разведении вируса 1-10, а исходный объем вируса, внесенный в лунку, 0,04 мл, то титр вируса составляет 15-1 * 10-1/0,04 = = 3,75-10 БОЕ/мл.

13. Рассчитывают степень увеличения инфекционности вируса, определяя титр в каждом ряду планшета. Максимальный титр сравнивают с контрольным титром. Разница между ними и представляет собой искомую степень.

Пример:

контрольный титр -- 6-10 БОЕ, максимальный титр -- 3,6-10 БОЕ. Следовательно, инфекционность увеличилась в 6 раз.

14. На основе этих же данных можно рассчитать и индекс нейтрализации для используемой антисыворотки. Для этого сравнивают самый низкий титр в присутствии антител с контрольным титром.

Пример:

контрольный титр -- 6-Ю БОЕ, минимальный титр -- 6-10 БОЕ. Следовательно, индекс нейтрализации равен 2,0.

2.3 Титрование методом гемагглютинации

Все тогавирусы агглютинируют эритроциты различного происхождения, хотя конкретные условия проведения гемагглютинации неодинаковы для разных вирусов. Чаще всего используют эритроциты гусей или цыплят, поскольку с ними реакция наиболее чувствительна. Титрование неохарактеризован-ного вируса проводят при нескольких значениях рН. После того как оптимум рН определен, в дальнейшем гемагглютинацию проводят при этом значении.

Как и для остальных вирусов, агглютинирующих эритроциты, в реакции гемагглютинации определяют число физических частиц тогавирусов, а не инфекционный титр вируса. Тем не менее, во многих случаях это хороший способ оценки качества вирусного препарата.

2.3.1 Получение и концентрирование вирусного гемагглютинина из

монослойных культур клеток

В описанном ниже методе для получения гемагглютинина используют монослой клеток Vero. В нашей лаборатории метод дает хорошие результаты в случае альфа- и флавивирусов при использовании среды с очень низким содержанием сыворотки. Однако высокие выходы гемагглютинина могут быть получены и на других линиях клеток млекопитающих и комаров. Ранее использовали антиген из мозга мышат-сосунков, который перед постановкой реакции обрабатывали органическими растворителями. Эти методы очень четко описаны Кларком и, Казалсом и здесь обсуждаться не будут. Гемагглютинин, продуцируемый монослоем зараженных клеток, не требует такой обработки. Многие вирусы дают выход гемагглютинина более 10 000 гемагглютинирующих единиц.

1. С плотного монослоя клеток сливают среду.

2. Наносят на монослой небольшой объем вируса, разведенного с таким расчетом, чтобы множественность инфекции составляла около 0,1 БОЕ на одну клетку. Убедившись, что инокулят полностью покрывает монослой, клетки оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

3. Каждые 10 мин флаконы покачивают, чтобы вирус равномерно распределялся по монослою.

4. Добавляют такой объем культуральной среды, чтобы монослой был покрыт слоем жидкости в 2--3 мм» и инкубируют клетки при 37°С.

5. Большинство альфавирусов дают выраженное ЦПД в течение 2--3 сут. На этой стадии собирают культуральную жидкость.

6. С монослоя, зараженного флавивирусом, при первых признаках ЦПД удаляют среду и заменяют свежей, содержащей 0,5% ЭТС.

7. Каждый день собирают культуральную жидкость и немедленно заменяют ее свежей средой с 0,5% сыворотки.

8. Пробы культуральной жидкости объединяют и центрифугируют 15 мин при 2000 g и 4°С. К осветленному супернатанту добавляют хлористый натрий до концентрации 23,36 г/л и ПЭГ 6000 до концентрации 60 г/л.

9. Суспензию перемешивают до растворения соли и поли-этиленгликоля и оставляют на ночь при 4°С.

10. Осадок вируса собирают центрифугированием при 5000 g в течение 1 ч. Супернатант отбрасывают, а центрифужные пробирки оставляют в перевернутом виде для удаления остатков среды.

11. Осадок растворяют в боратном буферном растворе, используя 1% исходного объема среды. Таким образом достигается 100-кратное концентрирование вируса.

12. Полученный этим методом гемагглютинин можно хранить практически неопределенное время при --70 °С или несколько месяцев при 4°С.

2.3.2 Титрование гемагглютинина

Вместо объемов, указанных ниже, можно использовать и другие, сохраняя при этом соотношения между ними. Более того, суспензию эритроцитов, промытых глюкозо-желатиновым буфером, можно в течение нескольких дней хранить при 4°С. Однако суспензию эритроцитов в растворе с рН 6,0--7,0 необходимо готовить непосредственно перед титрованием.

1. Эритроциты гусей или цыплят промывают DGV, центрифугируя суспензию 5 мин при 1500 g. Промывку повторяют не менее трех раз, причем в последний раз клетки центрифугируют 10 мин. Осадок клеток ресуспендируют в DGV, так чтобы концентрация эритроцитов составила 10%.

2. В каждую лунку микропланшета с коническим дном вносят по 25 мкл BBS, рН 9,1.

3. В первую лунку каждого ряда вносят по 25 мкл исследуемого образца ГА.

4. Пользуясь многоканальной микропипеткой с одноразовыми наконечниками, готовят последовательные двукратные разведения ГА на BBS. Все разведения можно готовить, используя один набор наконечников на планшет.

5. Готовят несколько буферных растворов с разными значениями рН в интервале от 6,0 до 7,0. На каждом растворе готовят 0,5% суспензии эритроцитов.

6. В ряд лунок, содержащих разведения вируса, и в контрольный ряд лунок без вируса немедленно вносят по 25 мкл 0,5%-ной суспензии эритроцитов.

7. Планшеты накрывают крышками и инкубируют 40 мин при 37°С. В лунках, где не произошла гемагглютинация, видны небольшие «бляшки» из клеток и прозрачная надосадочная жидкость; с другой стороны, содержимое лунок, в которых произошла агглютинация, гомогенно, и клеточная «бляшка» в них отсутствует.

Титром ГА считается максимальное разведение, при котором образующаяся «бляшка» еще видна невооруженным глазом. Оптимальным значением рН считается то, при котором ГА имеет самый высокий титр. Типичный результат титрования, проведенного описанным здесь методом, показан на рис. 9.

Некоторые тогавирусы лучше всего агглютинируют эритроциты» при 4°С, а другие -- при 22°С; поэтому в начальных опытах имеет смысл поставить реакцию при обеих температурах.

2.3.3 Титрование гемолизина тогавирусов

Агглютинация эритроцитов часто сопровождается их лизисом. Лизис обусловлен активностью поверхностного гликопро-теина вирусов, отличного от гемагглютинирующего компонента'. Особенно сильно выражен гемолиз, вызываемый альфа-вирусами. Хотя титрование гемолизина в большинстве лабораторий не является стандартным приемом, оно может быть полезным как дополнительный метод анализа гликопроте-инов оболочки вирусов.

1. Проводят титрование ГА, как описано выше, при оптимальном рН.

2. Как только рассчитан титр ГА, эритроциты в планшете ресуспендируют, осторожно постукивая по бортику планшета. Необходимо убедиться в том, что все эритроциты ресуспенди-рованы.

3. Планшеты инкубируют 4--6 ч при 37°С, а затем центрифугируют 1--2 мин при 1000 g. Имея практический опыт, титр ГЛ можно определить уже на этой стадии. Лунки, в которых произошел лизис, окрашены в ярко-красный цвет; «бляшки» в них совсем маленькие или вообще отсутствуют. В лунках, где лизиса клеток не произошло, четко видна клеточная «бляшка», супернатант остается прозрачным.

4. Более точный расчет можно провести, если использовать большие объемы каждого из реагентов и проводить реакцию в стеклянных пробирках Кана. После того как произошел лизис, пробирки центрифугируют, супернатант собирают и спектрофотометрически определяют процент лизиса по поглощению при 410 или 540 нм. Для построения калибровочной кривой готовят серию пробирок, содержащих лизированные в разной степени эритроциты; их получают, обрабатывая суспензию эритроцитов ультразвуком.

2.3.4 Титрование антител в реакциях торможения

гемагглютинации и гемолиза

Сыворотки, используемые в реакциях торможения гемагглютинации и гемолиза, обрабатывают для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации. В присутствии ТГА-антител гемолиз не происходит; следовательно, описанная ниже РТГ может проводиться только с антителами против индивидуальных антигенов, не обладающими ТГА-активностью, или с соответствующими моноклональ-ными антителами.

1. Рассчитывают ГА-титр вируса, как описано выше.

2. В каждую лунку микропланшета с коническим дном вносят по 25 мкл BBS.

3. С помощью многоканальной микропипетки готовят последовательные двукратные разведения обработанной антисыворотки.

4. Рассчитывают, какое разведение вируса соответствует 4 единицам гемагглютинации; например, если ГА-титр равен 1/256, то 4 единицы соответствуют разведению вируса 1/64.

5. Готовят соответствующее разведение вируса на BBS и вносят по 25 мкл в каждую лунку планшета с разведениями сыворотки.

6. Закрытые планшеты инкубируют 1 ч при 37°С.

7. Готовят 0,25%-ную суспензию эритроцитов на буферном растворе с рН, оптимальным для данного вируса.

8. В каждую лунку немедленно вносят по 50 мкл суспензии эритроцитов и инкубируют закрытый планшет 40--60 мин при 37°С. Максимальное разведение сыворотки, которое еще подавляет гемагглютинацию, считают ТГА-титром.

9. В каждый опыт по определению ТГА-титра включают контроль с 4 ГАЕ.

10. Если определяется ТГ-титр, то в контроле результат должен быть негативным, т.е. ТГА-активность должна отсутствовать. Эритроциты ресуспендируют, осторожно постукивая по планшету, инкубируют планшеты 2--4 ч при 37°С, а затем центрифугируют 1--2 мин при 1000 g. Максимальное разведение сыворотки, еще подавляющее гемолиз, считают ТГ-титром.

Как и титрование гемолизина, эту реакцию можно ставить в пробирках, используя большие объемы реагентов. Для некоторых вирусов может возникнуть необходимость увеличения стандартной дозы от 4 ГАЕ до 8 или 16.

3. Очистка тогавирусов

3.1 Культивирование тогавирусов

3.1.1 Системы для культивирования

Оптимальную систему для культивирования следует подбирать специально в каждом случае. В целом лучшей можно считать ту систему, в; которой вирус дает максимальный титр, хотя нужна иметь в виду, что очистка вируса из тканей зараженных животных, например экстрактов мозга, затруднена в связи с большим содержанием в препаратах клеточных компонентов; кроме того, радиоактивное мечение вируса в организме животных, как правило, невозможно. В тех случаях, когда вирус хорошо размножается в культуре ткани, имеет смысл потратить некоторое время, чтобы оптимизировать его выход. Выбор же таких параметров, как чувствительная линия клеток, культуральная среда, множественность инфекции, температура инкубации и время сбора вируса, существенно влияет на выход. При оптимизации условий культивирования важно пользоваться таким методом, который позволяет определить реальное количество вируса в исходном материале для очистки. Использование только непрямых методов, например определения доли зараженных клеток с помощью иммунофлуоресценции, может привести к неправильным выводам.

Количество клеток, используемых для культивирования вируса, определяется, естественно, теми целями, для которых проводится очистка вируса, и выходом вируса в расчете на клетку. Нередко достаточное количество радиоактивно мечен-«ого вируса можно получить на монослойной культуре во флаконе площадью 75 см, однако в целом для проведения экспериментов как в малом, так и в большом масштабе более удобны роллерные культуры. В настоящее время имеются в продаже пластиковые роллерные бутылки одноразового пользования объемом, от 490 до 1750 см; можно использовать и стеклянные бутылки тех же размеров. Площадь ростовой поверхности роллерного флакона можно значительно увеличить с помощью микроносителей, например гранул цитодекса. Кроме того, имея соответствующее оборудование, клетки можно выращивать в виде гомогенной суспензии или в суспензии на микроносителях, что значительно упрощает работу и сокращает расход среды. Полезную информацию об использовании микроносителей для культур клеток можно найти в методической литературе, издаваемой фирмой Pharmacia.

3.1.2 Радиоактивное мечение

1. РНК. Геном тогавирусов можно пометить, выращивая вирус в присутствии -уридина или -ортофосфата. -уридин можно просто добавить в обычную культуральную среду; клетки при этом эффективно поглощают его путем активного транспорта. Как правило, для мечения РНК используют концентрации метки 5--20 мкКи/мл. Меченый уридин вносят одновременно с вирусом и не отмывают вплоть до сбора накопившегося вируса. Чтобы пометить РНК по фосфору, используют два подхода. В первом случае в культуральную среду вносят радиоактивный изотоп в высокой концентрации для обеспечения необходимой удельной радиоактивности, поскольку обычно используемые культуральные среды содержат фосфаты в значительных концентрациях. Во втором случае в не содержащую фосфатов среду вносят радиоактивный изотоп в меньших концентрациях. Преимущество второго подхода состоит в том, что удается работать с меньшим уровнем радиоактивности; юднако в не содержащей фосфатов среде вирус иногда размножается намного хуже, чем в нормальной, и это приводит к недопустимо низкому включению метки. Чтобы определить оптимальный способ введения метки в каждом конкретном случае, могут потребоваться предварительные эксперименты. Не содержащие фосфатов среды имеются в продаже. В этом случае сыворотку необходимо диализовать против не содержащей фосфатов среды и затем стерилизовать фильтрованием.