где ka и kh -- коэффициенты массопереноса соответственно для газовой и жидкой пленок.

Для воздуха и других газовых смесей, содержащих кислород, po₂i и Co₂i определить нельзя; в этих случаях используются коэффициенты переноса Kg для газа и k_L для жидкости:



где р*о₂ -- равновесное парциальное давление, соответствующее Со₂, а с*о₂ -- равновесная концентрация, соответствующая парциальному давлению ро₂- Тогда, согласно закону Генри, получаем

Величины, обратные коэффициентам массопереноса, называются коэффициентами сопротивления транспорту, т. е. l/ka и 1/&L -- соответственно коэффициенты сопротивления в газовой и жидкой пленках, а l/Ка и I/Kl -- соответственно коэффициенты сопротивления для всего объема газа и всего объема-жидкости. Их относительные значения зависят от растворимости газа. При абсорбции очень хорошо растворимого газа, например аммиака в воде, постоянная Генри Hnh₃ очень мала, и последним членом в уравнении, аналогичном (81), можно. пренебречь, так что коэффициент массопереноса для газовой фазы /Cg практически равен коэффициенту для газовой пленки ka; абсорбция лимитируется процессами, происходящими в газовой пленке. При абсорбции (транспорте) кислорода, который растворяется в воде слабо, постоянная Но₂ очень велика, так что в уравнении (82) член 1/Ho₂&g очень мал и им можно пренебречь. Коэффициент массопереноса для жидкой фазы К.ь практически равен коэффициенту массопереноса для жидкой пленки k\.\ абсорбция кислорода лимитируется процессами, протекающими в пленке жидкости. Когда газовая фаза содержит кислород, po₂i = po₂ и k_a -- бесконечно большая величина, так что абсорбция в этом случае также лимитируется процессами в жидкой пленке.

В большинстве аэробных биореакторов кислород поступает в культуральную среду из пузырьков воздуха, диспергированных в ней; в этом случае необходимо оценить скорость массо-передачи кислорода в единице объема, и уравнение принимает следующий вид:

Транспорт кислорода из пузырька в жидкую среду -- это лишь часть общего процесса переноса кислорода к бактериаль ным клеткам. Как было показано для переноса кислорода из; пузырьков в жидкость, транспорту препятствуют разного рода факторы, один из которых является лимитирующим.

Понятие сопротивления переносу можно распространить и на последующие стадии процесса. Кислород, поступив в культуральную среду, должен затем транспортироваться к месту его использования в микроорганизме.

Сопротивление переносу складывается из сопротивления со стороны жидкой фазы (1/&в), которым' для невязких, ньютоновских жидкостей в условиях полной турбулентности можно пренебречь, из сопротивления со стороны жидкой пленки, прилегающей к поверхности бактериальной клетки, хлопьям, осадку или к поверхности мицелия (1/Ј_м) и либо внутриклеточного сопротивления в случае дисперсионных культур, либо межклеточного (включая и внутриклеточное) в случае хлопьев, осадков и мицелия (1/&_с).

Все типы сопротивления переносу кислорода представлены на рис. 10.11.



Рис. 10.11. Различные типы сопротивления транспорту кислорода из пузырька газа к месту его использования микроорганизмом (обобщение модели Уитмена)

18. Массообмен в биологических процессах: теплообмен

К числу наименее разработанных проблем биотехнологии отно сятся разнообразные проблемы осуществления процессов теплопередачи, которые обеспечивают поддержание температуры' аэрируемой культуральной среды на уровне, соответствующем оптимуму анаболической и катаболической активности данных микроорганизмов. Для большинства из них диапазон температур, оптимальных для роста или образования продукта, очень узок, нередко всего несколько градусов. При температурах ниже оптимальной скорость роста любого микроорганизма повышается в ответ на повышение температуры относительно медленно, а при температурах, лишь на несколько градусов превышающих этот оптимум, происходит резкое снижение скорости роста до нуля. Подавляющее большинство микроорганизмов, используемых в биотехнологических процессах, -- мезофилы: температурный оптимум для них лежит между 15 и 40 °С. Температурный оптимум термофильных микроорганизмов значительно превышает 40°С, а у облигатных психрофильных микроорганизмов он лежит ниже 10 °С.

При производстве любого валового микробиологического-продукта аэробным способом охлаждение биореактора представляет собой серьезную технологическую проблему. Если температурный оптимум, при котором достигается максимальный выход продукта и производительность, лежит ниже 40 °С, на охлаждение приходится основная часть производственных расходов. Обычно в практике биотехнологических процессов промышленного масштаба используют в качестве охлаждающей среды воду, а не какой-либо хладагент. При определении размеров охлаждающей поверхности, необходимой для поддержания температуры любого процесса, особое значение имеет максимальная температура охлаждающей воды, а производственные расходы на системы охлаждения определяются средней температурой охлаждающей воды, используемой на разных этапах лроцесса. Следует подчеркнуть, что при очистке валового продукта требуется значительно меньшее охлаждение, чем при ¦осуществлении обычных биологических процессов. Однако некоторые из недавно разработанных физических методов разделения протекают при температурах, близких к обычным, и представляются весьма перспективными в плане использования их в биотехнологии.

Температура охлаждающей воды зависит от многих факторов. К ним относятся происхождение этой воды, климатические условия и различия в местоположении установки, а также тип используемой системы охлаждения: это может быть проточная система или система с рециркуляцией. В будущем для охлаждения, вероятно, все больше будут применяться замкнутые системы (с рециркуляцией), с тем чтобы исключить тепловое и возможное химическое загрязнение окружающей среды в результате сброса воды из проточных систем охлаждения. В условиях умеренного климата и при использовании мезофильных организмов в крупных, интегрированных производствах оптимальная температура процесса будет лишь немного отличаться от температуры охлаждающей воды.

Хотя калориметрические методы измерения количества тепла, выделяющегося при росте и дыхании микроорганизмов, разработаны уже давно, использованию этого процесса посвящено сравнительно немного работ. Измерения количества выделяющегося тепла производили обычно для оценки интенсивности роста микроорганизмов. В аэробных микробиологических процессах количество тепла, выделяющегося в единицу времени, прямо пропорционально скорости потребления кислорода, которая в свою очередь связана с ростом с помощью соответствующего коэффициента выхода. Считается, что это эмпирическое соотношение между скоростью потребления кислорода и .количеством выделяющегося тепла можно применять для оценки последней величины, и прямые ее измерения проводят только в редких случаях. Это соотношение имеет вид

Здесь Q -- количество тепла, выделяющегося при росте аэробных микробов в единицу времени на единицу объема, Ro₂-- скорость потребления кислорода на единицу объема (равная скорости транспорта кислорода), & --константа, равная 124, если Q выражено в

Большинство промышленных биореакторов снабжено охлаждающим кожухом и/или внутренними охлаждающими змеевиками. В последнее время для интенсификации процессов в биореакторах как обычной конструкции, так и новых конфигураций стали использовать наружные охлаждающие контуры. В некоторых реакторах новых конфигураций внутренняя охлаждающая система настолько нарушает основные гидродинамические рабочие характеристики, что исключает такое охлаждение. При увеличении размера реактора создание необходимой внутренней охлаждающей поверхности становится все более трудной задачей. Для геометрически подобных емкостей увеличение объема пропорционально кубу линейных размеров, при этом площадь увеличивается только пропорционально квадрату линейных размеров. Эффективность охлаждения аэробных биореакторов зависит от следующих факторов: 1) переноса тепла от отдельных клеток в культуральную среду; 2) переноса тепла от культуральной среды, содержащей диспергированные пузырьки газа и микроорганизмы, к охлаждающим поверхностям; 3) поступления тепла за счет рассеяния мехаииче--- ской энергии, затрачиваемой на перемешивание среды с целью ее аэрации; 4) охлаждения при испарении, выравнивания температур и работы при расширении, связанной с прохождением воздуха через среду; 5) изменения коэффициента теплопередачи вследствие загрязнения охлаждающих поверхностей накапливающимися на них микроорганизмами. Потенциальную значимость этих факторов необходимо рассматривать отдельно для каждой технологической системы.

19. Масштабирование биотехнологического оборудования. Смысл масштабирования. Принцип размерности

С анализом размерностей и с безразмерными величинами хорошо знакомы лишь немногие микробиологи. Это прежде всего метод, с помощью которого можно получить какую-то информацию о взаимосвязях между переменными; характеризующими определенные физические системы. Ценность такого подхода состоит в том, что его можно применять в тех случаях, когда мы располагаем неполной информацией о системе, и тогда получаемая частичная информация нередко-имеет большую ценность, позволяя уменьшить число экспериментов, необходимых для получения полной информации.

Рассмотрим, например, физическую абсорбцию кислорода в аэрируемом биореакторе. Очевидно, что для полного описания системы с физической точки зрения необходимо вывести сложные гидродинамические уравнения, описывающие перемещение газообразной и жидкой фаз и диффузию в жидкой фазе. Количество поглощенного кислорода будет сложным образом зависеть от скорости поступления газа и от всех других переменных, входящих в уравнения, которые описывают перемещение фаз. Определить точный вид зависимости между скоростью подачи газа и другими переменными практически невозможно; однако анализ размерностей позволяет установить ряд важных - соотношений, которые должны выполняться для любой такой зависимости.

Это связано с тем, что корректные способы измерений удовлетворяют требованию, согласно которому число, равное отношению между результатами измерений двух объектов, не зависит от того, какая единица используется для измерений, а корректные системы уравнений имеют такой вид, который не зависит от системы единиц.

Решение той или иной технологической проблемы обычно начинают с очень приближенного анализа, учитывая как можно меньше деталей. В результате исходные характеристики процессов, протекающих в реакторе, могут быть представлены в виде простого соотношения между двумя или тремя безразмерными величинами и соответствующими эмпирическими константами.

Существует около трехсот безразмерных величин, представляющих интерес с точки зрения технологии, но на самом деле большинство биотехнологов имеют дело только с двумя десятками.

Наиболее широко используемая безразмерная величина -- это число Рейнольдса N_Ke, которое применяется при описании потока жидкости:

где L -- характеристический размер, и -- скорость потока, р -- плотность жидкости, ц -- ее вязкость.

При конструировании биореакторов числа Рейнольдса используются при описании потока жидкости в трубопроводах, движения капель, частиц и пузырьков газа, а также вращающихся мешалок.

Для потока жидкости в трубопроводе



где d -- диаметр трубопровода, и -- скорость потока. Для частиц, пузырьков или капель, погружающихся в жидкости или всплывающих в ней,

где d₃ -- эквивалентный диаметр частиц, пузырька или капли, т. е. диаметр сферы, равной по объему частице, пузырьку или капле, U -- скорость частицы, всплывающей или погружающейся в жидкость, ,р_с -- плотность среды, т]_с -- ее вязкость. Для вращающихся мешалок

где D -- диаметр перемешивающего устройства, N -- скорость вращения.

Перечислим некоторые другие безразмерные величины, обычно используемые химиками-технологами: число Нуссель-та N_Nu, число Прандтля Np_r, число Гразгофа N_Gr, число Фруда N_Fr, число Пекле N_Pe, число Стэнтона N_st, число Шмидта N_Sc, число Шервуда Nsh, число Вебера N_We. Как и число Рейнольд-са, некоторые из этих величин имеют по нескольку определе*-ний, а, например, числа Пекле, Прандтля и Нуссельта записываются в одинаковом виде в случае теплопередачи и переноса массы. Кроме того, одни из этих безразмерных величин, например число Стэнтона, представляют собой комбинации других величин, а некоторые имеют более одного названия.

Любой материальный объект или физическая система характеризуются тремя параметрами: размером, формой и составом. Все эти параметры меняются независимо друг от друга, так что два объекта могут различаться по размеру, но< иметь одинаковую форму и состав или быть одинаковыми: только по форме, но существенно различаться по размерам и составу. Принцип подобия устанавливает взаимосвязь между физическими системами р-азных размеров; на нем основан» увеличение или уменьшение масштабов процессов и оборудования. Согласно этому принципу, пространственная и временная конфигурации системы определяются отношением между соответствующими величинами внутри систем и не зависят от того, в каких единицах эти величины измеряются. Принцип подобия нередко путают с методом анализа размерностей, хотя логически они совершенно различны. Первый из них -- это общий принцип природы, тогда как второй -- всего лишь один из методов его реализации.

20. Технология приготовления питательных сред

Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста испытывают потребность в азоте, фосфоре, макро- и микроэлементах. Все вещества этого рода находятся в питательных средах в виде солей, исключение составляют среды, где азот и фосфор могут усваиваться растущими культурами из органических источников, например автолизатов или гидролизатов микробного или животного происхождения.

Отделения приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий или эмульсий. При этом питательные соли хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси с заданным соотношением компонентов производится в аппарате с мешалкой, куда подаются твердые компоненты в необходимом количестве и далее происходит их растворение. Иногда соединяются и перемешиваются заранее приготовленные растворы. Жидкие и твердые источники углерода обычно вводят в уже готовую питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность которого возрастает при хранении готовой питательной смеси.

При непрерывном культивировании в производстве микробного белка углеводороды и растворы солей вводят в ферментер раздельно по индивидуальным линиям, а смешение и эмульгирование нерастворимых в воде n-алканов происходит уже в самом биореакторе. При культивировании бактерий на метане последний постоянно барботируют в аппарат через специальные устройства.

При периодической ферментации в начале процесса инокулят (засевная доза микроорганизмов) вносится в уже готовую питательную среду, содержащую все компоненты. Поэтому источники углерода вводят непосредственно перед засевом или отдельные компоненты среды вводят по мере потребления их культурой, поддерживая в ферментере некоторую оптимальную их концентрацию, которая на разных этапах ферментации может меняться по определенному закону.

Важнейшим элементом приготовления питательных сред является соблюдение требований асептики. Это либо создание заданного значения рН, обеспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо полная стерилизация всех подаваемых потоков и самого биореактора.

Для стерилизации газовых потоков (в первую очередь воздуха) используют процесс фильтрации через специальные волокнистые фильтры с последовательно расположенными фильтрующими элементами. Фильтрующий материал периодически стерилизуется подачей острого пара в отключенный фильтр через заданные промежутки времени. Жидкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых практический интерес представляют термический, радиационный, фильтрационный и отчасти химический.

Термический - самый распространенный, при температурах порядка 120-150оС.

Радиационный - g-излучение, применяется редко из-за трудностей создания и эксплуатации мощных источников этого излучения.

В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты (вещества с ярко выраженным асептическим действием). Основная проблема в этом случае - необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели микрофлоры до внесения инокулята. Химические антисептики должны быть не только высокоэффективны, но и легко разлагаемы при изменении условий после завершения стерилизации. К числу лучших относится пропиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в молочную кислоту.

Мало распространен и метод фильтрации, что объясняется аппаратными трудностями. Метод основан на способности полупроницаемых мембран с крупными порами пропускать жидкую фазу и концентрировать клетки микроорганизмов. В принципе этот метод является идеальным для стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых средств, поскольку может осуществляться при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Основная трудность - наличие термостойких мембран, способных выдерживать многократную стерилизацию их самих. В настоящее время эта проблема решается путем применения термостойких полимеров в производстве мембран.

В заключение заметим, что ряд субстратов не требует стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием; сюда относят метанол, этанол, концентрированная уксусная кислота и др. В этом случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов питательной среды.

21. Классификация биотехнологических процессов

В настоящее время существуют следующие основные типы биопроцессов:

- производство биомассы (например, белок одноклеточных);

- клеточных компонентов (ферменты, нуклеиновые кислоты и т.д.)

- метаболитов (химические продукты метаболической активности), включая первичные метаболиты, такие как этанол, молочная кислота;

- вторичные метаболиты ;

- односубстратные конверсии (превращение глюкозы во фруктозу);

- многосубстратные конверсии (обработка сточных вод, утилизация лигноцеллюлозных отходов).

Производство биомассы

Человек традиционно получает белки, жиры и углеводы (основные компоненты пищи) из животных и растительных источников. Уже сегодня эти источники не покрывают все увеличивающиеся потребности человечества. Выяснилось, что белки и жиры микроорганизмов с успехом могут заменить белки и жиры традиционного происхождения. Преимущества микроорганизмов как продуцентов белка состоит в высоком содержании белка в биомассе и высокой скорости роста микроорганизмов.

Термин белок одноклеточных (БОК) был предложен в 1966 г. для обозначения биомассы различных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, грибов и водорослей). Кроме высокого содержания белка микробная биомасса содержит также жиры, нуклеиновые кислоты, витамины и минеральные компоненты. Источниками получения пищевого белка могут стать также белковые изоляты из различных видов зеленой биомассы, в т.ч. из табака.

Для получения БОК используют самые разнообразные субстраты, включая парафины нефти, метан, водород, метанол, этанол, уксусную кислоту, углекислый газ, молочную сыворотку, мелассу, крахмал и целлюлозосодержащие отходы промышленности и сельского хозяйства.

Для промышленного использования перспективными являются термофильные (растущие при высоких температурах до 50о С) микроорганизмы. Качество биомассы оценивается по высокому содержанию белка, низкому содержанию нуклеиновых кислот и отсутствию вредных веществ.

Получение спиртов и полиолов

Некоторые дрожжи и бактерии способны продуцировать этанол и бутанол, а также такие полиспирты как глицерин и 2,3-бутандиол. Эти продукты обычно синтезируют из нефти, однако микробное получение этанола и других спиртов вызывает все больший интерес.

В России большая часть этанола получается микробиологическим путем из растительного сырья. Сдвиг в сторону получения микробиологического этанола наблюдается и в др. странах. Найдены бактерии Zymomonas mobilis, которые вдвое эффективнее сбраживают углеводы в этанол, чем дрожжи.

В Бразилии производство топливного спирта вносит наибольший вклад в энергобаланс страны и составляет миллиарды литров.

Ферментация мелассы различными видами Clostridium может быть использована для получения не только этанола, но и ацетальдегида, уксусной кислоты, этилацетата и диэтилового эфира. При изменении условий культивирования, например, в условиях щелочной среды вместо этанола образуется глицерин.

Сырьем могут быть гидролизаты древесины, меласса, крахмал, молочная сыворотка. Отходы производства этанола содержат белки, углеводы, рибофлавин и др. витамины, и могут использоваться как кормовая добавка.

Штаммы-продуценты первичных метаболитов получают путем индуцированного мутагенеза, так как в природе мутации, ведущие к сверхпродукции одного из метаболитов вредны. Нарушения в обмене веществ приводят к снижению конкурентоспособности и жизнеспособности микроорганизмов.

Производство вторичных метаболитов

Из всех продуктов, получаемых с помощью микробных процессов, наибольшее значение имеют вторичные метаболиты. Вторичные метаболиты, называемые также идиолитами,--низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Они производятся ограниченным числом таксономических групп и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной и той же химической группе.

К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины.

Молекулы антибиотиков очень разнообразны по составу и механизму действия на микробную клетку. При этом в связи с возникновением устойчивости патогенных микроорганизмов к старым антибиотикам постоянно существует потребность в новых. В некоторых случаях природные микробные антибиотические продукты химическим или энзиматическим путем могут быть превращены в так называемые полусинтетические антибиотики, обладающие более высокими терапевтическими свойствами.

Микробные биотрансформации

Микроорганизмы способны осуществлять реакции трансформации, в которых те или другие соединения превращаются в новые продукты. Условия протекания этих реакций мягкие, и во многих случаях микробиологические трансформации предпочтительнее химических.

Пример существующих крупномасштабных промышленных биоконверсий - производство уксуса из этанола, глюконовой кислоты из глюкозы.

Широко используется микробная модификация стероидов, которые являются сложными полициклическими липидами. Теперь с использованием биоконверсии получают кортизон, гидрокортизон, преднизолон и целый ряд других стероидов. Применение и совершенствование микробной технологии в сотни раз снижает себестоимость производства стероидов.

Производство ферментов

Получение ферментов с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. Микробные клетки продуцируют более 2 тысяч ферментов, катализирующих биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть выделены и проявляют свою активность независимо от клетки.

В мире производится около 20 ферментов в объеме 65 тыс. тонн (а существует, как предполагают 25000 ферментов). Например, промышленным способом производят такие ферменты как амилаза, глюкоамилаза, протеаза, инвертаза, пектиназа, каталаза, стрептокиназа, целлюлаза и др.

Амилазы и протеазы используют в текстильной, хлебопекарной и кожевенной промышленности. Пектолитические ферменты могут быть использованы для мацерации тканей при переработке растительного сырья, например при получении льноволокна. Щелочные протеазы, особенно иммобилизованные, очень эффективно используются в составе моющих средств. Кроме протеолитических ферментов в состав моющих средств вводят липазу, целлюлазу, оксидазу и амилазу для удаления загрязнений крахмального происхождения. Использование иммобилизованной глюкозоизомеразы для непрерывного получения глюкозы является наиболее крупным процессом такого рода в мире.

Микробные ферменты активно используют в клинической диагностике при определении уровня холестерина в крови и мочевой кислоты. Ферменты предлагают использовать для очистки канализационных и водопроводных труб и т.д. и т.п. Ферменты для медицинских или аналитических целей должны быть высокоочищенными.

Для повышения стабильности выделенных ферментов используют технику иммобилизации, т.е. связывания ферментов на поверхности нерастворимого в воде носителя, например, органических полимеров, стекла, минеральных солей, силикатов и т.п. Иммобилизованные ферменты (ИФ) можно длительное время использовать в биохимических реакторах в условиях непрерывного процесса.

Примеры использования ИФ - изомеризация глюкозы во фруктозу, гидролиз белков, трансформация стероидов, гормонов и т.д. Новая область применения ИФ - создание на их основе бессеребряных фотоматериалов. На основе действия ферментов построены биолюминесцентные и иммуноферментные методы анализа, отличительной чертой которых является высокая чувствительность и абсолютная специфичность.

Аминокислоты, органические кислоты, витамины и другие биопродукты

Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов.

Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза.

За рубежом 60% мощностей по производству аминокислот занимают глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. Глутаминовая кислота производится при участии в качестве продуцента штамма Corynebacterium. С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получаются в промышленном масштабе - итаконовая, молочная, уксусная, лимонная.

Лимонная кислота во всем мире успешно производится с помощью гриба Aspergillus niger. Уксусную кислоту получают путем микробиологической конверсии водорода и углекислого газа бактериями Acetobacterium woodi и Clostridium aceticum.

Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако рибофлавин (В2), витамин В12 и аскорбиновую кислоту получают микробиологическим путем. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes.

Микроорганизмы являются также ценным источником получения никотиновой кислоты (витамин РР).

Микроорганизмы являются источником получения липидов специального назначения с заранее определенными свойствами. Микробные жиры заменяют растительные (а в ряде случаев и превосходят)и могут использоваться в разных отраслях промышленности, с.-х., медицине.

Микроорганизмы являются важным источником получения полимерных материалов на основе полисахаридов. Ценным микробным полисахаридом является декстран, образуемый бактериями рода Leucomonstoс. Декстран служит основой получения медицинских препаратов (кровезаменителей) и препаратов для биохимических исследований - сефадексов и др. молекулярных сит.

Микроорганизмы являются источником получения нуклеозидов и нуклеотидов и их производных, поверхностно-активных веществ и т.д.

22. Процессы стерилизации в биотехнологических производствах

При непрерывной стерилизации нагревание среды до температуры стерилизации, выдерживание при этой температуре и охлаждение происходят в потоке. Прямая подача пара в среду разбавляет ее на 10--20%, это надо учитывать при приготовлении среды. При работе с колонками используют пар давлением 0,5 МПа (5 кгс/см²). Скорость потока среды в колонке зависит от состава и температуры.

В кожух выдерживателя вводят пар давлением 0,25 МПа (2,5 кгс/см²). Длительность выдерживания (5--7 мин) зависит от состава и свойств питательной среды. Температура среды, вытекающей из выдерживателя, 124--130°С.

Для очистки воздуха в микробиологической промышленности обычно используют фильтрацию. Воздух подают обычно под давлением 0,2 МПа (2 кгс/см²). Для сжатия воздуха чаще всего используют турбокомпрессоры или поршневые компрессоры. Перед подачей в компрессор воздух очищается от грубых частиц на масляных фильтрах. Фильтры выполняют функцию холодной стерилизации воздуха, отделяя клетки микроорганизмов. Как общие, так и индивидуальные фильтры заполняют гранулированным зернистым и волокнистым фильтровальным материалом, используя гранулированный уголь (КАД по ТУМХП 3136--52) и стеклянную вату, диаметр которой равен 18 мкм (ГОСТ 5174--49). В последнее время начали использовать специальные бактерицидные волокна. Толщина фильтрующего слоя обычно 0,4--0,75 м. Индивидуальные фильтры часто заполняют стеклянной, хлопчатобумажной ватой или активным углем.

Для стерилизации воздуха в микробиологической промышленности используют стеклянную и простую вату, ткань Петриянова, базальтовое волокно или фильтры из активного угля. Иногда для стерилизации воздуха применяют комбинирование термической обработки, фильтрации и ультрафиолетового облучения. Для очистки воздуха от микрофлоры можно использовать аппараты типа скрубберов, в которых сверху разбрызгивается дезинфицирующее вещество--10%-ная гидроокись натрия или 15--20%-ный раствор серной кислоты.

В этих аппаратах нельзя применять такие дезинфицирующие вещества, которые, попадая с потоком воздуха в ферментатор, помешали бы процессу биосинтеза.

23. Промышленные биотехнологические процессы: получение посевного материала, ферментация. Системы конторя и управления биотехнологическими процессами

Получение посевного материала в цехе чистой культуры. Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции. Аппараты первой стадии часто называют инокулятора ми, аппараты второй стадии -- посевными ферментаторами.

Схема приготовления посевного материала из споровых культур на предприятиях по производству антибиотиков показана на рисунке.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Количество питательной среды в аппарате не должно превышать 60% общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема среды. Такое небольшое количество посевного материала требует длительного периода инокуляции (2--4 сут). Для посевных ферментаторов используют 10--12% инокулята, поэтому продолжительность приготовления посевного материала на этой стадии уменьшается и обычно не превышает 1 сут. Во время приготовления посевного материала надо следить, чтобы в аппаратах был оптимальный режим культивирования. Три раза в сутки отбирают образцы для микробиологического и биохимического анализов. Посевной материал для главной ферментации готовят в количестве 5--20% объема используемой питательной среды.

Схема приготовления посевного материала:

/ -- законсервированный штамм продуцента, 2 -- первое поколение иа косом агаре в пробирке с образованием спор, 3 -- второе поколение на твердой среде в колбах с образованием спор, За и ЗЬ -- первое и второе поколения иа жидкой среде в колбах, 4 -- инокулятор, 5 -- посевной ферментатор, 6 -- ферментатор

Стадия ферментации - центральная среди этапов промышленного производства. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную среду инокулята до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации.

Ферментация проходит в специальных емкостях, называемых ферментерами или биореакторами. Конструкция биореактора приведена на рис. 3. Основными элементами ферментера являются двойные стенки, промежуток между которыми заполняется охлаждающей или нагревающей жидкостью, входные отверстия для газовых и жидких потоков, система контроля за составом питательной среды и условиями внутри реактора.

Поскольку в промышленной биотехнологии выделяют 2 типа процессов - накопление биомассы и накопление ценных веществ, возникающих в ходе роста и последующего развития культуры, то меняется и характер построения производства во времени. Биомасса одноклеточных выращивается непрерывным способом в аппаратах хемостатного типа, а все процессы второй группы осуществляются периодически, когда в одном и том же аппарате в производственном цикле протекают все необходимые фазы развития клеток и биосинтеза. Процессы двух рассматриваемых типов отличаются по требованиям к степени асептики, что связано с их объёмами - белок одноклеточных выпускается миллионами тонн сухого вещества, а выпуск продуктов второго типа составляет, как максимум, тысячи или десятки тысяч тонн. Поэтому в производстве белковых веществ ограничиваются достаточно высокой, но не 100% степенью асептики, обеспечивая последнюю подбором режима культивирования, подходящего для продуцента, но неблагоприятного для возможных примесных штаммов.

Технологическое оформление процессов промышленной биотехнологии в значительной мере определяется отношением микроорганизма-продуцента к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное оборудование и нормы технологического режима подбираются таким образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу) обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и оптимальных для данной культуры в данной фазе роста.

Промышленное использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного исключения кислорода из среды, поэтому процессы этого типа (брожение) технологически проще аэробных. В начальной фазе этих процессов требуется лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.

Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для процессов брожения, так как в этом случае необходимо полностью исключить возможность попадания кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую среду.

Вопросы термостатирования ферментационного процесса (подвода или отвода тепла в ходе ферментации) являются очень острыми в целом ряде производств биотехнологии. В аэробных условиях микробиологический синтез протекает со значительным тепловыделением, что вызывает необходимость отвода тепла из аппаратов большого объема (сотни и тысячи кубометров). Технологические требования к скорости теплоотвода очень жесткие из-за узкого температурного оптимума роста культуры (2-3up>оС). Наиболее приемлимый на практике способ теплоотвода - охлаждение водой через змеевики, рубашки и др. устройства - осложняется небольшой разностью температур между содержимым биореактора (32-34оС для дрожжей Candida) и охлаждающей водой (20оС), температура которой в жаркое время года еще выше. Поэтому в реакторе создается развитая поверхность газообмена, увеличивается скорость движения жидкостей и т.д.

Важно также поддерживать определенный состав питательной среды. В непрерывных процессах биосинтеза задача технолога сводится к поддержанию концентрации всех питательных веществ (и кислорода) и дозированному введению кислоты или щелочи для рН-статирования системы на заданном уровне. Простейшим вариантом управления стадией ферментации в периодическом режиме является изменение концентраций компонентов среды и её рН, а также введение необходимых добавок по заранее разработанной программе, реализуемой технологом в каждом цикле ферментации. Этот способ относительно прост и легко поддается автоматизации.

Во многих случаях необходимо возможно полно исчерпывать компоненты питательной среды, чтобы они не попадали на последующие стадии переработки. Эта необходимость может быть вызвана рядом причин:

- дороговизна или дефицитность субстрата;

- вредное воздействие субстрата на качество готового продукта(например, при производстве дрожжей на парафинах , когда выделение остаточных количеств углеводородов из клеточной массы затруднено, поэтому добавляют дополнительные секции для дозревания или утилизации запасенных в цитоплазме углеводородов);

- затруднения, возникающие на стадии выделения и очистки метаболитов при одновременном присутствии в культуральной жидкости неутилизированных веществ.

24. Выделение и очистка целевого продукта

Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ.

В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы - сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты, представляющие практическую ценность. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод.

Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от природы продуцента. Например, сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность.

Дрожжи же рода Candida, служащие источником кормового белка плохо флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме лишь в принципе отказавшись от выделения его из культуральной жидкости: содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта. Неутилизированные компоненты культуральной жидкости могут отразиться на способности продукта к хранению.

При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осаждается добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно - физическое осаждение.

Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал, внутриклеточные биополимеры возможно и методом фильтрации. Так как фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру.

Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.

Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.

Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы.

К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с последующим резким снижением давления).

Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Культуральную жидкость освобождают от сопутствующих растворимых веществ и фракционируют.

Освобождение от растворимых веществ производят несколькими способами:

1. Осаждение - физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ).

Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает 80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.

Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.

2. Экстракция.

При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной - из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями.

3. Адсорбция - частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент - твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму.

Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.

Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта).

По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул.

Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров.

Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок.

Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора.

При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить.

Электрофорез - метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.

25. Формы биотехнологических препаратов. Контроль качества биопрепаратов

Все товарные формы биопрепаратов с точки зрения технологии их получения можно разделить на три основные группы.

1. Биопрепараты, имеющие в товарном продукте в качестве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы. К этой группе относятся средства защиты растений, бактериальные удобрения, закваски для силосования кормов, биодеграданты, другие активные средства биотрансформации.

2. Биопрепараты, в состав которых входит инактивированная биомасса клеток и продукты ее переработки. Это кормовые дрожжи, грибной мицелий и т.д.

3. Биопрепараты на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов. К ним относятся витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики, биолипиды, полисахариды, продукты комплексной переработки микробных масс и метаболитов.

В зависимости от принятых на предыдущей стадии решения товарные формы представляют собой либо сложную смесь, содержащую некоторое количество основного вещества, либо высокоочищенный препарат, отвечающий ряду специальных требований.

Продукт может выпускаться в жидком (например жидкий концентрат лизина) или сухом виде (белково-витаминный концентрат, энтомопатогенные препараты, кормовой концентрат лизина). Стадия фасовки рассмотренных комплексных препаратов заключается в помещении их в тару (мешки, барабаны и т.п.), размеры и тип которой определяются потребностями заказчика и свойствами продукта (его слеживаемостью, гигроскопичностью, стойкостью к загниванию и т.д.). Другие требования предъявляются к медицинским препаратам и биохимическим реактивам.

Современное развитие биотехнологии способствовало появлению нового поколения высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства. Использование для создания таких препаратов природных штаммов микроорганизмов обеспечивает им высокую экологическую безопасность. Прогресс в производстве и применении биопрепаратов, во многом, связан с разработкой высокотехнологичных, сохраняющих долгое время их исходные свойства препаративных форм. Одним из наиболее удачных решений этой проблемы является производство биопрепаратов в порошкообразном виде, удобном для хранения, транспортировки и применения.

Разработка технологий производства сухих препаративных форм биопрепаратов, способных длительно сохранять жизнеспособность и функциональную активность клеток микроорганизмов различных системных групп является актуальной задачей современной биотехнологии.

Использование биотехнологий за короткое время революционным образом изменило фармацевтическую промышленность. Первый биотехнологический препарат был выведен на рынок свыше 20 лет назад, и сроки действия патентной защиты на многие другие заканчиваются, так что к 2010 г. уже более 20 биотехнологических препаратов с общим объемом продаж около 10 млрд дол. США могут оказаться без патентной защиты в США (Waxman H.A., 2007). Это приводит к появлению на рынке новой ниши, которая может быть использована генерическими компаниями. Исходя из нынешнего объема мирового рынка биологических препаратов в более чем 30 млрд дол., согласно результатам исследования компании «Kalorama» (2005) объем продаж аналогичных биологических препаратов может достигнуть 10 млрд к 2010 г. (www.kaloramainformation.com). Этому, однако, пока препятствуют некоторые сложности с получением разрешения на маркетинг аналогичных биологических препаратов в ЕС и США, где сосредоточены основные потребители этих дорогостоящих лекарственных средств (ЛС).

понятия «биологические препараты», «иммунологические препараты» по терминологии и классификации ВОЗ и ЕС имеют существенные отличия от ЛС (химико-фармацевтических препаратов). Национальное законодательство о порядке регистрации медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) отличается от такового по регистрации химико-фармацевтических препаратов. Такая практика объективно обусловлена необходимостью изучения, проверки, контроля и пострегистрационного мониторинга специфических показателей МИБП (реактогенность, иммуногенность, клинико-эпидемиологическая эффективность, биологическая специфичность, биотехнологическая эффективность, биосовместимость, биоспецифичность, генетическая детерминированность эффективности) и условий их производства (соответствие требованиям надлежащих практик -- производства, дистрибьюции, лабораторного контроля, клинического применения и т.д.) с целью обеспечения задекларированных государством эффективности и безопасности, и находится в полном соответствии с рекомендациями ВОЗ и директивами ЕС.