9. Перенос генетической информации и биосинтез белка в клетках

Трансформация (transformation) - Перенос генетической информации в бактериальные клетки при помощи изолированной ДНК с участием или без плазмид, но всегда без участия вирусов (см. Трансдукция). Способность клетки к восприятию экзогенной ДНК в процессе трансформации - компетентность (например, в колонии бактерий таких клеток не более нескольких процентов, однако число компетентных клеток может быть увеличено с помощью специальной обработки). Трансформация обнаружена у большинства прокариот, а в последние годы - и у эукариот, включая высшие растения и млекопитающих. Также трансформация - процесс превращения нормальных клеток животных в опухолевые как спонтанно, так и под действием онкогенных вирусов или др. канцерогенных воздействий.

Трансдукция (transduction) - Передача (перенос) генетической информации от одной бактериальной клетки (донора) к другой (реципиенту) с помощью бактериофага. Различают неспецифическую, ограниченную и абортивную трансдукцию, а также котрансдукцию. Трансдукция была открыта Дж.Ледербергом и Н.Циндером в 1952 у Salmonella typhimurium и фага Р22.

В выяснение молекулярных механизмов синтеза белка определенный вклад внесли российские биохимики. Так, в лаборатории А.Е. Браунштейна было впервые указано на участие АТФ в синтезе квазипептидных связей (на примерах гиппуровой кислоты, глутамина, глутатиона и ацетанилида). В.Н. Орехович еще в 50-е годы установил, что перенос аминоацильных или пептидильных группировок на NH2-группу аминокислот может осуществляться не только с амидной или пептидной, но и со сложноэфирной связи. Как будет показано далее, именно этот механизм лежит в основе реакции транспептидирования в 50S рибосоме в стадии элонгации синтеза белка.

Рис. 14.1. Принципиальная схема биосинтеза белка (по А.С. Спирину).

Красные кружочки - свободные аминокислоты и их остатки в составе полипептидной цепи.

Значительно позже были получены доказательства, что в синтезе белка, протекающем в основном в цитоплазме, решающую роль играют нуклеиновые кислоты, в частности ДНК. После того как было установлено, что ДНК является носителем и хранителем наследственной информации, был поставлен вопрос о том, каким образом эта генетическая информация, записанная (зашифрованная) в химической структуре ДНК, трансформируется в фенотипические признаки и функциональные свойства живых организмов, передающиеся по наследству. В настоящее время можно дать однозначный ответ на этот вопрос: генетическая информация программирует синтез специфических белков, определяющих в свою очередь специфичность структуры и функции клеток, органов и целостного организма (рис. 14.1). В природе, как известно, существует два типа биополимерных макромолекул: так называемые неинформативные биополимеры (они представлены повторяющимися мономерными единицами и/или разветвленными структурами, например полисахариды, поли-АДФ-рибоза, пеп-тидогликаны, гликопротеины) и информативные биополимеры, несущие первичную генетическую информацию (нуклеиновые кислоты) и вторичную генетическую, точнее фенотипическую, информацию (белки). Эти общие представления могут быть выражены следующей последовательностью событий (поток информации):

ДНК -> РНК -> Белок -> Клетка -> Организм

Значительный вклад в современные представления о месте, факторах и механизме синтеза белка внесли исследования Т. Касперсона, М. Хоглан-да, П. Берга, П. Замечника, С. Очоа, М. Ниренберга, Н. Горовица, Ф. Гауровица, С. Вейсса и российских биохимиков А.А. Баева, А.Н. Белозерского, А.С. Спирина и др.

Не останавливаясь на всех исторических аспектах развития этой важнейшей проблемы, следует напомнить, что еще в 40-х годах было установлено, что ДНК локализована в ядре клетки, в то время как синтез белка протекает главным образом в микросомах цитоплазмы. Первые экспериментальные доказательства необходимости нуклеиновых кислот для синтеза белка были получены в лаборатории Т. Касперсона. Было показано также, что присутствующие в цитоплазме рибонуклеиновые кислоты контролируют синтез цитоплазматических белков. Таким образом, уже тогда вырисовывалась картина тесной связи между ДНК, локализованной в ядре , и синтезом белка, протекающим в цитоплазме и регулирующимся рибонуклеиновыми кислотами, которые были открыты как в цитоплазме, так и в ядре. На основании этих чисто морфологических данных было сделано заключение, полностью подтвержденное в настоящее время, что биосинтез белка, хотя непосредственно и регулируется рибонуклеиновыми кислотами, опосредованно связан с контролирующим влиянием ДНК ядра и что РНК сначала синтезируется в ядре, затем поступает в цитоплазму, где выполняет роль матрицы в синтезе белка. Полученные значительно позже экспериментальные данные подтвердили гипотезу о том, что основными функциями нуклеиновых кислот являются хранение генетической информации и реализация этой информации путем программированного синтеза специфических белков.

В последовательности ДНК --> РНК --> Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтез специфических белков, определяющих широкое разнообразие признаков живых существ. В настоящее время выяснены основные процессы, посредством которых осуществляется передача наследственной информации: репликация, т.е. синтез ДНК на матрице ДНК; транскрипция, т.е. синтез РНК на матрице ДНК или перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК (см. ранее), и трансляция - процесс, в котором генетическая информация, содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответствующей аминокислотной последовательности в белке. Напомним, однако, что многие тонкие механизмы транскрипции и трансляции окончательно еще неясны.

10. Регуляция биосинтеза белка

Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано, служит матрицей для биосинтеза белка. Регуляция синтеза белка путем индукции представлена на рис. 14.12.

Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода, т.е. формирование мРНК, начинается с промотора - участка ДНК, расположенного рядом с геном-оператором и являющегося точкой инициации для синтеза мРНК, и распространяется последовательно вдоль оператора и структурных генов. Синтезированную молекулу мРНК, кодирующую синтез нескольких разных белков, принято называть полигенным (полицистронным) транскриптом. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон.

В свою очередь деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Структурные гены и ген-регулятор расположены в разных участках цепи ДНК, поэтому связь между ними, как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе (рис. 14.13). Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит в том, чтобы через белок-репрессор прекращать (запрещать) деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связываться с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. Если такой индуктор соединяется с репрессором, то последний теряет способность связываться с геном-оператором, который, таким образом, выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Процесс этот аналогичен взаимоотношениям аллостерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность связываться со своим субстратом.

Рис. 14.12. Регуляция синтеза белка путем индукции (схема). ГР - ген-регулятор; П - промотор; ГО - ген-оператор.

Механизм описанной регуляции синтеза белка и взаимоотношения репрессора со структурными генами были доказаны в опытах с Е. coli на примере синтеза в-галактозидазы (лактазы) - фермента, расщепляющего молочный сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм Е. coli обычно растет на глюкозе. Если вместо глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник энергии и углерода), то штамм не будет расти, пока не будут синтезированы соответствующие ферменты (адаптивный синтез). При поступлении в клетку лактозы (индуктор) молекулы ее связываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геном-оператором. Ген-оператор и структурные гены при этом начинают снова функционировать и синтезировать необходимую мРНК, которая «дает команду» рибосомам синтезировать в-галактозидазу. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но последний блокируется новыми молекулами лактозы, поэтому синтез фермента продолжается. Как только молекулы лактозы будут полностью расщеплены, репрессор освобождается и, поступив в ДНК, связывает ген-оператор и блокирует синтез мРНК, а следовательно, синтез в-галактозидазы в рибосомах.



Рис. 14.13. Регуляция синтеза белка путем репрессии (схема). Обозначения те же, что на рис. 14.12.

Таким образом, биосинтез мРНК, контролирующий синтез белка в рибосомах, зависит от функционального состояния репрессора. Этот реп-рессор представляет собой тетрамерный белок с общей мол. массой около 150000. Если он находится в активном состоянии, т.е. не связан с индуктором, то блокирует ген-оператор и синтеза мРНК не происходит. При поступлении метаболита - индуктора - в клетку его молекулы связывают репрессор, превращая его в неактивную форму (или, возможно, снижают его сродство к гену-оператору). Структурные гены выходят из-под запрещающего контроля и начинают синтезировать нужную мРНК.

Как было указано, концентрация ряда ферментов в клетках резко снижается при повышении содержания отдаленных конечных продуктов, образующихся в цепи последовательных ферментативных реакций. Такой эффект, получивший название репрессии ферментов, часто наблюдается при реакциях биосинтеза. В этих случаях молекулы репрессора, также образующиеся в рибосомах ядра по «команде» гена-регулятора, являются неактивными и сами по себе не обладают способностью подавлять деятельность гена-оператора и, следовательно, всего оперона, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или одним из конечных продуктов биосинтетического процесса (см. рис. 14.13).

Конечный продукт выступает, таким образом, в качестве корепрессора. Имеются данные, что в качестве корепрессоров в синтезе ферментов обмена аминокислот, по-видимому, выступает не только свободная аминокислота как конечный продукт биосинтетической реакции, но и комплекс ее с тРНК - аминоацил-тРНК.

В регуляции экспрессии структурных генов специфическое участие принимает особый белок - катаболитный генактивирующий белок (от англ. catabolite gene activation protein, сокращенно CAP). Этот белок, взаимодействующий с цАМФ, образует комплекс, способствующий прикреплению РНК-полимеразы к промоторному участку генома. В присутствии комплекса САР-цАМФ фермент может начать транскрипцию оперона, включая структурные гены, т.е. в клетках имеется еще один, дополнительный САР-цАМФ-регулятор, действующий, скорее всего, в качестве положительного регулятора, поскольку его присутствие необходимо для начала экспрессии гена.

Таким образом, концепция Ф. Жакоба и Ж. Моно о механизме проявления (экспрессии) активности генов признана одним из блестящих достижений молекулярной биологии. Она явилась логическим развитием многочисленных исследований, проведенных генетиками и биохимиками в предшествующие десятилетия.

11. Генетическая инженерия

Генетическая инженерия - это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала. Основа прикладной генетической инженерии - теория гена. Созданный генетический материал способен размножаться в клетке-хозяине и синтезировать конечные продукты обмена.

Генетическая инженерия возникла в 1972 году, в Станфордском университете, в США. Тогда лаборатория П. Берга получила первую рекомбинатную (гибридную) ДНК или (рекДНК). Она соединяла в себе фрагменты ДНК фага лямбда, кишечной палочки и обезьяньего вируса SV40.

Строение рекомбинантной ДНК. Гибридная ДНК имеет вид кольца. Она содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Большая часть векторов получена на основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40, полиомы, дрожжей и др. бактерий. Синтез белков происходит клетке-хозяине. Наиболее часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и др. бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки. Система вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину. Выбор вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое значение в конструировании гибридной ДНК несут два фермента. Первый - рестриктаза - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И второй - ДНК-лигазы - сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после выделения таких ферментов создание искусственных генетических структур стало технически выполнимой задачей.

Этапы генного синтеза. Гены, подлежащие клонированию, могут быть получены в составе фрагментов путем механического или рестриктазного дробления тотальной ДНК. Но структурные гены, как правило, приходится либо синтезировать химико-биологическим путем, либо получать в виде ДНК-копии информационных РНК, соответствующих избранному гену. Структурные гены содержат только кодированную запись конечного продукта (белка, РНК), и полностью лишены регуляторных участков. И поэтому не способны функционировать в клетке-хозяине.

При получении рекДНК образуется чаще всего несколько структур, из которых только одна является нужной. Поэтому обязательный этап составляет селекция и молекулярное клонирование рекДНК, введенной путем трансформации в клетку-хозяина. Существует 3 пути селекции рекДНК: генетический, иммунохимический и гибризационный с мечеными ДНК и РНК.

Практические результаты генной инженерии. В результате интенсивного развития методов генетической инженерии получены клоны множества генов рибосомальной, транспортной и 5S РНК , гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсулина человека и др. пептидных гормонов, интерферона человека и прочее. Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.

На основе генетической инженерии возникла отрасль фармацевтической промышленности, названная «индустрией ДНК». Это одна из современных ветвей биотехнологии.

Для лечебного применения допущен инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекДНК. Кроме того, на основе многочисленных мутантов по отдельным генам, получаемых при их изучении, созданы высокоэффективные тест-системы для выявления генетической активности факторов среды, в том числе для выявления канцерогенных соединений.

Теоретическое значение генетической инженерии. За короткий срок генная инженерия оказала огромное влияние на развитие молекулярно-генетических методов и позволила существенно продвинуться по пути познания строения и функционирования генетического аппарата.

12. Получение эукариотических белков методами генной инженерии

Для получения гетерологичных рекомбинантных белков с клонированной эукариотической комплементарной ДНК (кДНК) обычно используются прокариотические системы экспрессии. Однако в некоторых случаях эукариотические белки, синтезированные в бактериях, оказываются нестабильными или биологически неактивными.

Чтобы решить эти проблемы, для получения рекомбинантных белков, предназначенных для использования в медицине, были разработаны эукариотические системы экспрессии. Такие белки должны быть идентичны природным по своим биохимическим, физическим и функциональным свойствам. Неспособность прокариот синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансляционных модификаций.

Белки в клетках эукариот претерпевают следующие посттрансляционные изменения.

* Образование дисульфидных связей. Эту реакцию катализирует фермент дисульфидизо-мераза. Неправильно уложенный белок оказывается нестабильным и неактивным.

* Протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционально активного белка.

* Гликозилирование: основная модификация, благодаря которой белки приобретают ста бильность, а в некоторых случаях -- особые свойства. Наиболее распространенная реакция гликолизирования -- это присоединение специфического сахарного остатка либо к серину или треонину (О-гликозилирова-ние), либо к аспарагину (N-гликолизирова-ние).

* Модификации аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование, ацили-рование, гамма-карбоксилирование, сульфа-тирование, миристилирование и пальмитои-лирование.

для получения белка с полным набором специфических модификаций необходимо провести тестирование различных эукариотических систем экспрессии и найти такую, которая воспроизводила бы биологически аутентичный продукт.

Эукариотические экспрессирующие векторы имеют такую же структуру, что и их прокариотические аналоги (рис. 7.1), и должны содержать:

* эукариотический селективный маркер

* эукариотический промотор

* соответствующие эукариотические сайты терминации транскрипции и трансляции

* сигнал полиаденилирования мРНК.

7.1. Обобщенная структура эукариотического экспрессирующего вектора.

Его основные элементы: эукариотический транскриптон с промотором (/?), сайтом клонирования (СК) и сигналами терминации и полиаденилирования (t); эукариотический селективный маркер (СМ); сайт инициации репликации, функционирующий в клетках эукариот (оп⁶¹*); сайт инициации репликации, функционирующий в Е. coli (ол'^Е); селективный маркер Е. coli (Amp^r).

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с реком-бинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Escherichia coli, а другие -- в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих.

Введение ДНК в бактериальные и дрожжевые клетки называется трансформацией. В микробиологии этот термин используется для описания наследственных изменений в результате внедрения (приобретения) экзогенной (чужеродной) ДНК. А применительно к животным клеткам трансформация обозначает изменение характера их роста в культуре, обусловленное превращением нормальных клеток в раковые. Чтобы избежать путаницы в терминологии, для обозначения наследственных изменений в животных клетках после введения в них экзогенной ДНК был выбран термин трансфекция.

Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты) (1). В других случаях клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергают электропорации (3). Трансфекцию культур животных клеток осуществляют инкубацией клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (1), либо элект-ропорацией в присутствии очищенной трансфи-цирующей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. 4, электропорация заключается в воздействии на клетки коротких мощных импульсов электрического тока, вследствие чего в наружной мембране или клеточной стенке образуются временные поры, через которые в клетку может проникнуть ДНК. В некоторых эукариотических системах для доставки ДНК в реципиент-ные клетки используют вирусы.

Системы экспрессии Saccharomyces cerevisiae

Для экспрессии клонированных эукариотических генов интенсивно используют обычные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Тому есть несколько причин. Во-первых, это одноклеточный организм, генетика и физиология которого детально изучены и который можно выращивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промышленных биореакторах. Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные, так называемые 2 мкм-плазмиды. В-третьих, в клетках

5. cerevisiae осуществляется большое число посттрансляционных модификаций. В-четвертых, лишь очень немногие из собственных дрожжевых белков секретируются в среду; таким образом, если гетерологичный белок секретируется клеткой, то его очистка не составит большого труда. В-пятых, поскольку дрожжи уже многие годы используют в хлебопечении и пивоварении, Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) включил S. cerevisiae в список «организмов, признаных безопасными» (GRAS, generally recognized as safe). Таким образом, использование этих организмов для получения белков, применяемых в медицине, не требует дополнительных экспериментов, необходимых при работе с неразрешенными к применению микроорганизмами. Некоторые белки, синтезированные в S. cerevisiae, уже применяются в качестве вакцин и фармацевтических препаратов, а также для диагностики (рис. 7.2).

Рис. 7.2. Рекомбинантные белки, синтезируемые в системах экспрессии S. cerevisiae. H

13. Клеточная инженерия

Основой клеточной инженерии является гибридизация соматических клеток -- слияние неполовых клеток с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным или же клетка-реципиент может приобрести отдельные части клетки-донора: цитоплазму, митохондрии, хлоропласты, ядерный геном или его крупные блоки. Введение небольших блоков генетической информации обычно осуществляется средствами генетической инженерии. Соматическая гибридизация имеет более широкие возможности для скрещивания филогенетически отдаленных организмов, чем половое скрещивание, при котором Природа допускает лишь строго определенные сочетания родительских форм.

Этапы получения гибридных клеток. Слиянию клеток предшествует установление тесного контакта между плазматическими мембранами. Этому препятствует наличие поверхностного заряда на природных мембранах, обусловленного отрицательно заряженными группами белков и липидов. Деполяризация мембран переменным электрическим или магнитным полем, нейтрализация отрицательного заряда мембран с помощью катионоц способствует слиянию клеток. На практике широко используются ионами Са²⁺, хлорпромазинон. Эффективным «сливающим» (фузогенным) агентом служит полиэтиленгликоль.

По отношению к животным клеткам применяют также вирус Сендай, действие которого как сливающего агента, по-видимому, связано с частичным гидролизом белков цитоплазматической мембраны. Участок субъединицы Fi вируса обладает протеолитической активностью (С. Nicolau et al., 1984). Растительные, грибные и бактериальные клетки перед слиянием освобождают от клеточной стенки, при этом получаются протопласты. Клеточную стенку подвергают ферментативному гидролизу, применяя лизоцим (для бактериальных клеток), зимолиазу улитки (для клеток грибов), комплекс циллюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ, продуцируемый грибами (для клеток растений). Набухание и последующее разрушение протопластов предотвращается созданием повышенной осмолярности среды. Подбор гидролитических ферментов и концентрации солей в среде с целью обеспечения максимального выхода протопластов представляет собой сложную задачу, решаемую в каждом случае отдельно.

Для скрининга полученных гибридных клеток используют различные подходы: 1) учет фенотииических признаков; 2) создание селективных условий, в которых выживают лишь гибриды, объединившие геномы родительских клеток.

14. Получение моноклональных антител

Моноклональные антитела -- антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки и полисахариды), которое антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции(обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на -mab (от английского «monoclonal antibody»).

Предпосылками для возникновения метода получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, были разработки двух методологических подходов:

получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне организма;

метод соматической гибридизации клеток.

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы:

иммунизация животных;

подготовка клеток к слиянию;

слияние;

отбор индуцирующих специфические антитела клонов;

клонирование и реклонирование;

массовая наработка гибридомных клеток;

получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;

выделение антител.

Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3-4 месяца.

Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Основными средами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Выбор экспериментального животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере на последних этапах иммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной техники и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и употребив впоследствии эти антитела для очистки антигена.

Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков - слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого, используют введение антигена, преципитированного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация может иметь обратный эффект - отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации.

При применении в качестве иммуногена различных клеток (опухолевые клетки, чужеродные клетки крови, бактерии, паразиты и т.д.) делают несколько инъекций без адъюванта внутрибрюшинно с интервалом в 2-3 недели по (1-5)*10⁷ клеток. Последнюю инъекцию делают внутривенно и через 3 дня выделяют клетки селезенки для гибридизации.

В последнее время активно развиваются методы полной иммунизации вне организма с целью получения гибридомы. Иммунизация in vitro имеет ряд существенных преимуществ:

укорачивается период иммунизации до 4-5 суток;

требуется существенно меньшее количество антигена;

ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии);

повышается процент отвечающих клеток;

легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.

Современные методы иммунизации in vitro основаны на двух системах культивирования лимфоцитов, разработанных в конце 1960-х годов. Метод суспензионного культивирования был первым методом, в котором иммунизация полностью проходила вне организма. Критическими факторами в данном методе были низкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), высокая плотность клеток, легкое покачивание культуры, ежедневное добавление свежей среды и выбор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана).

Другой основной системой иммунизации in vitro является метод Д. Марбрука. Клетки культивируют в маленькой камере на диализной мембране, через которую идет обмен средой из большого резервуара.

Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является доля IgM-образующих клонов. Это связано с тем, что при иммунизации in vivo клетки берут во время вторичного иммунного ответа, при котором образуются в основном антитела IgG класса, тогда как in vitro реакция идет по первичному типу, для которого характерна продукция IgM антител. Эта проблема может быть преодолена после отработки способов получения вторичного иммунного ответа in vitro.

Слияние

Существуют два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее время. Первый метода заключается в следующем. В течение 1 мин добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ при 37⁰ С с постоянным перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде культивирования.

Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре еще на 5-7 мин. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой, обмывают и культивируют.

Клонирование гибридомных клеток

Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела и они могут перерастать антителообразующие гибридные клетки.

К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора - проточного цитофлуориметра.

Клонирование методом лимитирующих разведений. Если клетки посеяны в 96-луночные планшеты очень редко, то доля лунок, в которой наблюдается рост клеток, подчиняется распределению Пуассона:

где f (0) - фракция лунок, в которых отсутствует рост; - среднее число клеток на лунку.

При = 1 f (0) = 0,37. Для того, чтобы получить разумную вероятность только одного клона в лунке, в более 37% лунок не должно наблюдаться роста клеток. Поскольку эффективность клонирования редко бывает равной 100%, клетки необходимо засевать при плотности 10, 3 и 0,5 клеток на лунку. В тех планшетах, на которых наблюдается рост в половине лунок, содержатся изолированные клоны.

При первом клонировании активной может оказаться только небольшая часть клонов. Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором доля положительных клонов будет возрастать.

Для клонирования надо применять клетки питающего слоя. Используются те же виды клеток, что и для начального роста гибридом.

Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно применять полужидкий агар. Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Нижний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему дают затвердеть. Затем добавляют второй слой - мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, в который включаются клонируемые клетки. При использовании клеток питающего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара.

Колонии становятся видимыми через 7-14 суток, их переносят на жидкую культуру.

Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра. Приготавливают флуоресцентные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках, что позволяет выделять их на этом приборе.

После выделения тем или иным способом положительных клонов, клетки этих клонов размножают в достаточном количестве и образцы их замораживаются.

Массовая наработка моноклональных антител

После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя антитела, можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения больших количеств моноклональных антител. В начале культивирования гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность посева. В связи с этим при пересеве клеток их надо разводить не более чем в 3-5 раз. Ускорению роста клеток может способствовать добавление клеток питающего слоя. Гибридомные клетки необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста и избегать повышения концентрации клеток выше 0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах).

Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, то есть не пытаются культивировать дальше оставшиеся живые клетки.

Для получения больших количеств антител вводят гибридомные живые клетки в организм животных и получают от них асцитную жидкость. Предварительно животным вводят агенты, повышающие способность гибридом расти в брюшной полости. В качестве такого агента чаще всего выступает пристан - 0,5 мл за 10-14 суток до введения клеток.

Очистка антител

Для многих целей не требуется очистка антител, и они используются в виде культуральных жидкостей или асцитных жидкостей. Грубую иммуноглобулиновую фракцию можно получить высаливанием белков сульфатом аммония с последующим диализом. Если антитела необходимо выделить в чистом виде, то предварительно определяют их класс и подкласс, так как способы очистки различаются для антител разных классов. Это можно сделать с помощью метода иммунодиффузии по Ухтерлони.

Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах. При этом методе, однако, есть опасность, что при фиксации изменяется антигенная структура клеточной поверхности.

Если не удается выделить антитела прямым способом, то получают иммуноглобулиновую фракцию с помощью различных методов аффинной и ионообменной хроматографии на сефарозес пришитым ковалентно белком А.

15. Кинетические особенности роста микробных культур

В развитии микроорганизмов наблюдается несколько фаз (рис. 1). Посевной материал, попав в свежую полноценную среду, сразу не начинает размножения. Этот период называют лаг-фазой I. Только после определенного времени, иногда через несколько часов, клетки приспосабливаются к среде и окружающим условиям. В этот период активируются ферменты, а также, если это необходимо, синтезируются новые ферментные системы. В период лаг-фазы стремительно возрастает количество нуклеиновых кислот, особенно РНК, что необходимо для биосинтеза белков.

Рис. 1. Фазы роста культуры микроорганизмов: I -- лаг-фаза, II -- логарифмическая фаза, III -- фаза замедленного роста, IV -- стационарная фаза, V --фаза отмирания, N -- число клеток (млн/мл)

После лаг-фазы следует логарифмическая, или экспоненциальная, фаза II, в которой клетки размножаются с максимальной для данной культуры скоростью. Вследствие этого запас необходимых питательных веществ в среде уменьшается, кроме того, происходит накопление различных продуктов обмена веществ, которые в определенной концентрации могут мешать нормальному протеканию биохимических процессов обмена веществ. Иногда в питательной среде накапливается так много клеток, что не хватает пространства, а конкретнее, поверхности для новых поколений клеток. Именно через поверхность происходят процессы обмена -- попадание питательных веществ в клетку и выведение метаболитов. Если клетка находится в тесном окружении других клеток, то площадь поверхности уменьшается и вместе с тем снижается интенсивность процессов обмена. Скорость роста культуры также уменьшается, если сокращается поверхность клеток на единицу объема. Это происходит при увеличении размеров клеток и, таким образом, особенно для клеток сферической формы, значительно ухудшаются условия питания.

Как известно, поверхность сферических тел изменяется пропорционально квадрату их радиуса, а объем -- пропорционально кубу радиуса. Лимитирующие поверхности находятся, очевидно, и внутри клеток. В молекулярной биологии накапливается все больше фактов, которые указывают на то, что функционирование жизненных процессов необходимо связывать с биополимерами, мембранными структурами и их поверхностью.

В ходе интенсивного роста и размножения внутри закрытой системы негативное влияние лимитирующих факторов увеличивается и в результате скорость роста уменьшается, наступает фаза замедленного роста III. Через определенное время в стационарной фазе IV масса клеток в питательной среде достигает максимального уровня. Затем наступает период, когда число отмерших и автолизированных клеток превышает прирост. В результате количество биомассы уменьшается -- наступает фаза отмирания V.

Следовательно, наиболее интенсивно рост и размножение происходят в логарифмической фазе, где еще не действуют лимитирующие факторы. Для характеристики развития культуры микроорганизмов используют скорость роста культуры *-- изменение количества биомассы в единицу времени. Максимальная скорость роста в логарифмической фазе различна для каждой культуры и относится к наиболее важной характеристике ее физиологических свойств. Абсолютный прирост биомассы в единицу времени, обычно за 1 ч, характеризует общая скорость v роста. Если прирост биомассы за бесконечно малый промежуток времени dt обозначить через dm, то:



Чтобы определить, с какой скоростью идет прирост биомассы от исходного количества та до mi за время t_t--to, используют среднюю скорость роста , которую определяют по формуле

Если прирост биомассы в единицу времени отнести к одной единице активной биомассы, тогда скорость размножения, обозначаемую м (или С), можно вычислить по формуле

Среднюю удельную скорость роста за период t\--t₀ при увеличении биомассы на т_{--т₀ определяют по формуле

Если биомасса культуры микроорганизмов увеличивается с постоянной удельной скоростью роста, как это имеет место в логарифмической фазе развития, тогда количество полученной биомассы за период t_t--t₀ можно определить по формуле

где е -- основание натурального логарифма,

В солодовой среде (сусло) дрожжи имеют ц, = 0,194-0,4, а кормовые дрожжи, выращиваемые на гидролизатах и отходах промышленности -- . При выращивании дрожжей в питательной среде за 1 ч на каждый 1 м³ среды можно получить 1-- 3 кг сухой биомассы. Зная удельную скорость роста м, можно вычислить продолжительность генерации g, т. е. период удвоения количества биомассы. Эта величина обратно пропорциональная удельной скорости роста:

Скорость прироста биомассы чаще всего интересует физиологов и технологов. Иногда важнее выяснить не закономерности прироста биомассы, а прирост числа клеток. В этом случае необходимо определить скорость их размножения. Если вначале число клеток равно Л^о и после определенного времени -- длительности генерации -- оно удваивается, тогда через п генераций число клеток Ni равно

Число генераций п, скорость размножения v и длительность генерации g можно определить по уравнениям:

Увеличение биомассы микроорганизмов важно и при получении биомассы, как таковой, и при накоплении в культуральной жидкости какого-либо вещества. В первом случае процесс прекращают, когда достигнуто максимальное количество биомассы, когда максимально использован углерод и азот среды. Если источник углерода для образования биомассы и какого-либо продукта общий, например спиртовое брожение на сахарозе или мальтозе, тогда на определенном этапе увеличение биомассы ограничивают (при спиртовом брожении -- путем образования факультативно анаэробных условий).

16. Кинетические закономерности культивирования микроорганизмов в биореакторах

В основе количественного описания процессов культивирования микроорганизмов (мко) лежат исследования по кинетике накопления биомассы или продуктов метаболизма. Зависимость концентрации биомассы от времени культивирования описывается сложной S-образной кривой.

Количественное описание всей кривой роста на практике не применяется. Наибольший практический интерес представляет выявление зависимости концентрации биомассы от продолжительности культивирования на 2-4 фазах (кинетика роста) и фазе отмирания (кинетика гибели). Наиболее простой способ описания кинетики роста основан на получении аналитических зависимостей, отражающих внешний вид кривой роста на 2-4 участках. Такими зависимостями являются экспоненциальные функции различной степени сложности:

[X]_?

1 + e^{K1+K2ф+К3фІ…}

Однако, данный принцип описания кинетики накопления биомассы не отражает закономерностей роста и развития популяций, является, по сути дела, статистическим.

Этот недостаток устранен при разработке так называемой экспоненциальной модели, основанной на следующих принципах:

1. Увеличение численности популяции мко происходит в результате удвоения каждой особи, происходящего через определенные интервалы времени g (время генерации, время удвоения биомассы);

2. Рост, развитие и деление клеток происходит независимо от присутствия других мко;

3. В некоторых пределах изменение концентрации компонентов питательной среды не влияет на время удвоения клеток g.

Математическое выражение экспоненциальной модели:

[X] = [X]₀ * 2^ф/g;

ln[X] = ln[X₀]*ф/g;

g = ln2/м; ln[X]/[X₀] = мф

Первый принцип соответствует в первую очередь процессу размножения бактерий. Однако если концентрация биомассы выражена через количество АСБ в единице объема, предложенная модель описывает увеличение биомассы при способах размножения, отличных от деления клеток.

Второй принцип справедлив для большинства промышленных процессов культивирования, реализуемых в условиях асептики. Однако в ряде случаев интерес представляет вопрос о взаимодействии клеток в процессе роста. В частности, еще в 19 веке Фюрхельстом была предложена модель, учитывающая наличие внутривидовой борьбы, приводящей к гибели части клеток. Скорость роста популяции в данном случае описывается уравнением:

d[X]/dф = K_p[X] - K_г[X]².

Большой практический интерес представляет вопрос о росте смешанных культур. Однако, существующие модели роста учитывают лишь случаи антагонистического взаимодействия по типу «хищник-жертва». Согласно модели Вольтерра, гибель «жертв» Х₁ происходит при непосредственном взаимодействии с растущим «хищником» Х₂, поэтому скорость гибели пропорциональная произведению концентраций двух мко:

d[X₁]/dф = K_p[X₁] - K_Б[X₁].[X₂]

d[X₂]/dф = K_Б[X₁][X₂] - K_г[X₂].

Константы К_р, К_Б и К_г характеризуют рост «жертв», межвидовую борьбу и гибель «хищников».

Третий принцип является наименее обоснованным, поскольку именно в экспоненциальной фазе происходит наиболее интенсивное усвоение субстрата культурой. В связи с этим, ряд работ по кинетике роста был направлен на дополнение экспоненциальной модели роста зависимостями, позволяющими выразить зависимость скорости роста от концентрации питательных веществ.

17. Массообмен в биологических процессах: перенос кислорода

Одна из основных задач, которые приходится решать химикам-технологам при конструировании биореакторов, -- это обеспечение эффективного переноса кислорода в промышленных биореакторах, где осуществляются аэробные микробиологические процессы. Независимо от того, в каком режиме осуществляется аэробный микробиологический процесс -- периодическом, полунепрерывном или непрерывном, -- в установку должен непрерывно подаваться кислород для достижения достаточно высокой производительности. Потребность аэробной культуры в кислороде зависит от концентрации микроорганизмов в реакторе, скорости их роста и соответствующего коэффициента выхода. В некоторых случаях могут играть роль и другие факторы, например необходимость удаления из культуры двуокиси углерода, особенно для процессов, в которых в качестве источника кислорода используется воздух, который как раз и служит источником кислорода в подавляющем большинстве аэробных микробиологических процессов. При тех температурах, при которых обычно протекают микробиологические процессы (10-- 40°С), и при атмосферном давлении равновесная концентрация растворенного кислорода крайне мала по сравнению с концентрациями в растворе почти всех основных питательных веществ. или субстратов, хотя именно концентрация последних лимитирует рост микроорганизмов в непрерывном проточном хемоста-те. Такой недостаток кислорода приводит к снижению производительности, к ухудшению качества продукта или к образованию побочных продуктов. При реализации большинства аэробных микробиологических процессов расходы на снабжение-кислородом составляют значительную часть общей стоимости, производства.

Для описания переноса (абсорбции) газов в жидкостях: обычно используются три гидродинамические модели: 1) модель двух пленок Льюиса -- Уитмена; 2) модель проницаемости с систематически обновляемой поверхностью (модель Хиг-би); 3) модель проницаемости со случайно возобновляемой поверхностью (модель Данквертса).

Рис. 10.10. Модель двух (ламинарных) пленок, предложенная Уитменом для процесса физической абсорбции (транспорта) кислорода из воздуха в водную среду (обозначения см. в тексте).

Согласно модели Льюиса -- Уитмена, на поверхности раздела фаз газ -- жидкость образуются две тонкие пленки, тесно прилегающие к этой поверхности. Пленки являются в основном неподвижными, а в толще газовой и жидкой фаз происходит турбулентное движение. Абсорбция газа осуществляется в ходе стационарных процессов молекулярной диффузии в этих двух неподвижных пленках. Считается, что на поверхности раздела фаз газ -- жидкость мгновенно устанавливается равновесие, а скорость абсорбции определяется относительными скоростями диффузии в пленках. Предположим, что абсорбция осуществляется из пузырьков воздуха, диспергированных в жидкости; радиус кривизны пузырьков на несколько порядков превышает толщину гипотетической пленки, и транспорт кислорода из пузырьков воздуха в жидкость можно представить так, как это сделано на рис. 10.10. В газовой пленке парциальное давление кислорода меняется от ро₂ -- парциального давления во всем объеме газовой фазы до ро₂ i -- парциального давления в газовой пленке непосредственно у границы раздела фаз; соответственно в жидкой пленке концентрация растворенного кислорода меняется от Co₂i -- равновесной концентрации при насыщении,, соответствующей ро₂ ь до Со₂ -- концентрации во всем объеме жидкости.

Поскольку кислород на поверхности раздела не накапливается, скорость переноса кислорода на единицу площади в газовой и жидкой пленках будет одинакова и равна