Влияние обработки регуляторами роста на устойчивость растений кукурузы к гипо- и гипертермии

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность темы. В настоящее время растения подвергаются нарастающему воздействию абиотических и антропогенных неблагоприятных факторов среды [Лукаткин, 2005; Кошкин, 2010]. Неблагоприятные температуры являются одним из наиболее распространенных абиотических стрессоров, определяющим географическое распространение растений и их продуктивность. На 40% территорий умеренного климата Земли растения испытывают влияние повышенных или пониженных стрессовых температур [Усманов и др., 2001].

Гипотермия является ведущим стрессовым фактором при возделывании теплолюбивых растений [Генкель, Кушниренко, 1966; Wang, 1982; Лукаткин, 2002; Кошкин, 2010]. Действие пониженных температур в умеренном климате приводит к снижению или полной потере урожая, вследствие прямого повреждения либо замедленного созревания; даже небольшие понижения температуры, не вызывающие видимых повреждений теплолюбивых растений, приводят к снижению продуктивности до 50% [Коровин, 1984; Лукаткин, 2002].

Высокотемпературный стресс - один из наиболее значимых абиотических факторов, определяющих урожайность сельскохозяйственных культур. Гипертермия (превышение температуры воздуха 40єС) наблюдается на более чем 23% территории [Кошкин, 2010], и сельскохозяйственные культуры по устойчивости к высоким температурам относятся к группе нежаростойких.

Для успешного выращивания растений в неблагоприятных условиях необходимо знание физиологических механизмов повреждения и адаптации растений и их клеток. Поскольку неблагоприятные абиотические факторы вызывают сверхпродукцию активированных форм кислорода (АФК) и возникновение окислительного стресса [Лукаткин, 2002], то активность антиоксидантной системы является одним из основных механизмов защиты растений [Деви, Прасад, 2003; Sytar et al., 2013].

Реализация максимальной продуктивности культурных растений при попадании в условия абиотического стресса может быть осуществлена пос-редством использования биологически активных веществ (БАВ), в т.ч. регуляторов роста (РР) [Гамбург и др., 1979; Genisel et al., 2013; Kanwar et al., 2013]. В настоящее время созданы новые БАВ и синтетические РР, которые можно использовать для повышения устойчивости растений к стрессорным факторам. Особенностью действия новых РР является то, что они интенсифицируют физиолого-биохимические процессы в растениях и одновременно повышают устойчивость к стрессам и болезням [Прусакова и др., 2005]. Показана возможность антиоксидантного действия некоторых синтетических регуляторов роста, особенно при стрессорных воздействиях [Лукаткин, 1999; Al-Hakimi, 2007; Ramakrishna, Rao, 2013]. Однако плохо выяснены закономерности направленного повышения резистентности растений к различным стрессорам синтетическими и природными РР, а также механизмы их действия, особенно в плане воздействия на про/антиоксидантную активность растительных клеток.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение эффективности и механизмов повышения резистентности растений кукурузы к неблагоприятным температурам посредством обработки семян экзогенными регуляторами роста. Для решения цели поставлены следующие задачи:

- изучить физиологические и биохимические процессы, лежащие в основе повреждения растений кукурузы стрессирующими факторами (гипо- и гипертермией) и направленного повышения резистентности растений экзогенными регуляторами роста различной природы;

- проанализировать влияние предпосевной обработки семян кукурузы регуляторами роста различной природы на прорастание семян, рост и проницаемость мембран растений при действии неблагоприятных температур;

- исследовать влияние обработки семян регуляторами роста на прооксидантную активность в растениях кукурузы;

- изучить влияние экзогенных регуляторов роста на антиоксидантную способность растений (общую и ферментативную);

- провести отбор концентраций регуляторов роста, индуцирующих повышенную термоустойчивость растений.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование физиологических и биохимических процессов в растениях кукурузы при действии гипо- и гипертермии. Показано возникновение окислительного стресса при действии неблагоприятных температур на растения, характеризующееся усилением генерации потенциально опасных АФК и снижением антиоксидантной активности.

Доказано, что синтетические регуляторы роста цитокининовой природы (цитодеф, тидиазурон, 6-бензиламинопурин), а также эпибрассинолид и природные регуляторы - Рибав-Экстра и иммуноцитофит - способствовали улучшению физиологических и биохимических характеристик культурных растений как в оптимальных условиях, так и при действии стрессоров - неблагоприятных (пониженной и повышенной) температур. Впервые показано повышение антиоксидантной активности вследствие обработки регуляторами роста. Выявлено, что эффективность РР, как в нормальных, так и в стрессовых условиях, зависит от особенностей растений, условий их выращивания, а также от стрессора и его дозы (интенсивности и длительности).

Научно-практическая значимость работы. Разработаны методологические подходы к оценке действия стрессорных температур на растения по изменениям физиологических и биохимических параметров, а также способов повышения стрессоустойчивости растительных объектов. Степень повреждения растений, определяемая величиной коэффициента повреждаемости (по выходу электролитов из высечек листьев), может быть использована как критерий сравнительной стрессоустойчивости сортов и гибридов кукурузы.

Выявлены оптимальные концентрации синтетических и природных регуляторов роста, максимально снижающие стрессовые ответы растительных клеток. Использование РР в целях повышения стрессоустойчивости растительных организмов может быть перспективным на территориях с высокой вероятностью возникновения температурных стрессов.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологий повышения стрессоустойчивости и продуктивности культурных растений, в адаптивных системах растениеводства; в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по курсам «Физиология растений», «Растение и стресс», «Экологическая физиология растений», «Регуляция роста и развития растений» и др.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Неблагоприятные воздействия как гипотермии, так и гипертермии вызывают в клетках растений кукурузы сходные ответные реакции, характеризующиеся торможением роста, нарушением физиологических процессов, возникновением окислительного стресса.

2. Синтетические и природные РР могут ослаблять тяжесть стрессорных воздействий, главным образом через изменение про/антиоксидантного состояния клетки.

3. Концентрационные эффекты регуляторов роста сильно зависят от физиологических (сортовых и возрастных) особенностей и условий выращивания растений, и варьируют на фоне различных доз стрессора.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях: VІІ Международной конференции молодых ученых «Біологія: від молекули до біосфери» (Харков, 2012); ХII международной конференции «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов» (Киев, 2012); международной научной конференции «Регионы в условиях неустойчивого развития» (Кострома-Шарья, 2012); X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем» (Киров, 2012); научной конференции XLI Огаревские чтения (Саранск, 2012); международной научно-практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений» (Минск, 2013); Всероссийской научно-практической конференции - выставки экологических проектов с международным участием «Бизнес. Наука. Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2013); Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Саранск, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновацинные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); I международном симпозиуме «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в числе которых 5 статей в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ.

1. Объекты и методы исследования

предпосевной гипотермия регулятор кукуруза

В качестве объектов исследования были использованы молодые растения кукурузы (Zea mays L.) гибридов Коллективный 160 МВ, Коллективный 172 МВ, Краснодарский 194 МВ, РОСС 199 МВ, РОСС 299 МВ.

В работе использованы следующие регуляторы роста: 6-бензиламинопурин (6-БАП) фирмы ISN (США); тидиазурон (ТДЗ) - [N-фенил-(1,3,5тиазол-5ил)мочевина] (ДРОПП) - препарат фирмы «Шеринг» (Германия); цитодеф (1-фенил-3-(1,2,4-триазол-4-ил)мочевина), разработанный во ВНИИ химических средств защиты растений; эпибрассинолид (ЭБ) - препарат Эпин-Экстра (производитель - ННПП «НЭСТ М», Москва); Рибав-Экстра (РЭ) - 60% спиртовой экстракт продуктов метаболизма микоризных грибов, выделенных из корней женьшеня, который содержит комплекс природных аминокислот и биологически активных веществ (ЗАО «Сельхозэкосервис», Москва); иммуноцитофит (ИЦФ) - смесь этиловых эфиров высших жирных кислот и мочевины (ЗАО «Агропромышленная компания «ГИНКГО»).

Постановка эксперимента. Семена замачивали 8-12 ч в различных концентрациях регуляторов роста, промывали водой и проращивали в растильнях на воде при оптимальной (около 25°С) или пониженной (от 10 до 16°С) температуре. Растения выращивали в рулонной культуре на растворе Кнопа [Журбицкий, Ильин, 1968] или в почвенной культуре (среднесуглинистый деградированный чернозем, 2 кг/сосуд) при температуре 25°С, освещении люминесцентными лампами (плотность потока фотонов около 80 мкМ м-2 с-1), фотопериоде 16 ч. При изучении действия и последействия гипо-и гипертермии часть сосудов с 7-дневными растениями подвергали действию пониженных (2-3°С) или повышенных (43-45°С) температур (20 ч или 24 ч), контроль выдерживали при температуре 25°С; определения физиологических параметров проводили сразу после завершения стрессового воздействия, а также спустя 1 или 6 суток после возврата растений в оптимальную температуру. В ряде опытов проводили обработку 7-дневных растений регуляторами роста перед стрессовым воздействием. Часть опытов проводили на высечках листьев, которые помещали в стрессовые условия (неблагоприятные температуры) на короткие интервалы времени (до 4 ч), после чего проводили биохимические измерения.

Методы исследования. Определение прорастания семян и характеристик роста проводили спустя 3 суток после закладки опыта (энергия прорастания), 7 суток (всхожесть) и 10 суток. До и после стрессорного воздействия у 10 растений каждой группы определяли высоту стебля (надземной части), количество листьев, а также степень повреждения листовой поверхности.

Проницаемость клеточных мембран определяли по выходу электролитов из высечек листьев в дистиллированную воду на кондуктометре ОК-102 («Radelkis» Венгрия) по методике [Зауралов, Лукаткин, 1985; Гришенкова, Лукаткин, 2005]. Устойчивость к стрессору оценивали по степени повреждения клеточных мембран после воздействия неблагоприятного фактора, рассчитывая «коэффициент повреждаемости» (КП): КП =( LD - L0) / (100 - L0)*100%, где LD - выход электролитов из ткани, подвергнутой стрессу, в процентах от полного выхода электролитов; L0 - выход электролитов из ткани контрольных растений, в процентах от полного выхода электролитов.

Интенсивность ПОЛ в листьях растений оценивали по накоплению продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой [Лукаткин, Голованова, 1988].

Скорость генерации супероксидного анион-радикала определяли по окислению адреналина в адренохром [Purvis et al., 1995] с использованием коэффициента молярной экстинкции (е = 4020 M-1.см-1).

Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли по ([Kumar, Knowles, 1993] с модификациями) по снижению концентрации Н2О2 с использованием коэффициента молярной экстинкции е = 39,4 мМ-1см-1.

Активность СОД (КФ 1.15.1.1) определяли в цитозольной фракции по ([Kumar, Knowles, 1993] с модификациями) по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным радикалом. За единицу активности СОД принимали 50% ингибирование образования формазана.

Активность аскорбат-пероксидазы (КФ 1.11.1.11) определяли по методике ([Nakano, Asada, 1981] с модификациями) по окислению аскорбата в присутствии перекиси водорода.

Активность глутатионредуктазы определяли в присутствии окисленного глутатиона (GSSG) и NADРH+ по изменению оптической плотности при длине волны 340 нм, с последующим пересчетом на концентрацию оставшегося в смеси окисленного глутатиона по калибровочной кривой [Okane et al., 1996].

Определение общей антиоксидантной активности проводили по цветной реакции радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидрацила (DPPH) с полифенолами [Jainu, Shyamala Devi, 2005; Coban, Konuklugil, 2005; Manosroi et al., 2005]. Процент ингибирования радикалов DPPH образцами рассчитывали по формуле:

Ингибирование DPPH (%) = [(Ас(0) - АА(t)) / Ас(0)] ? 100%, где Ас(0) - оптическая плотность контроля; АА(t) - оптическая плотность опыта со световым инкубированием реакционной смеси 30 минут.

Повторности и статистическая обработка результатов. Опыты проводили не менее 3 раз, в каждом опыте было от 3 до 20 биологических повторностей. Результаты обрабатывали статистически по стандартным методикам [Лакин, 1980] с использованием компьютерных программ Statistica, BIOSTAT, Microsoft Excell. В таблицах и на графиках представлены средние арифметические из всех повторностей опытов с их стандартными ошибками. Сравнение вариантов проводили по t-критерию Стьюдента при 5% уровне значимости

2. Результаты и обсуждение

Изучение действия гипо- и гипертермии на физиологические и биохимические процессы в растениях.

Пониженные температуры (10-16 єC) оказали существенное тормозящее влияние на прорастание семян теплолюбивой кукурузы и длину осевых органов. 20-часовое воздействие температур 43-45 или 3°С на растения кукурузы приводило в последующем к снижению роста, увеличению выхода электролитов и появлению визуальных повреждений листа (подсыханию краев и кончиков листовой пластинки). Выдерживание растений кукурузы при пониженных температурах (2-3°С, 24 ч) повышало проницаемость мембран, интенсивность ПОЛ, генерацию супероксидного анион-радикала О в листьях, но снижало антиоксидантную активность и изменяло активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы, аскорбатпероксидазы. В динамике охлаждения растений и высечек листьев выявлен нелинейный характер происходящих при неблагоприятных температурах физиологических и биохимических изменений.

Показано, что повышение проницаемости мембран вследствие гипотермии растений кукурузы различалось у разных гибридов (табл. 1). Высокие значения выхода электролитов и коэффициента повреждаемости зарегистрированы у гибрида РОСС 299 МВ, который на этом основании можно считать слабо устойчивым к пониженной температуре; средние значения - у гибридов.

Коллективный 172 МВ и РОСС 199 МВ (следовательно, относительно холодоустойчивых), и наименьшие - у гибридов Коллективный 160 МВ и Краснодарский 194 МВ, которые на этом основании считаем наиболее холодоустойчивыми.

Таблица 1. Влияние охлаждения (2єС) на выход электролитов из листовой ткани различных гибридов кукурузы (фаза 2-3 листьев)

Степень изменений физиологических показателей зависела от возраста растений, а также интенсивности и длительности стрессового воздействия. Неконтролируемое усиление генерации АФК (О2?), происходящее в растениях в неблагоприятных температурных условиях, индуцирует возникновение в клетках окислительного стресса. Антиоксидантная система растений кукурузы вовлечена в противодействие окислительному стрессу.

Влияние регуляторов роста на устойчивость растений кукурузы к неблагоприятным температурам.

Изучение влияния синтетических цитокининовых препаратов на устойчивость кукурузы к гипо- и гипертермии. Предпосевная обработка семян кукурузы гибрида Краснодарский 194 МВ препаратом 6-БАП с последующим выдерживанием растений в стрессовых температурах стимулировала (в концентрации 10 нМ) рост побега (только при высокой температуре) и корня. Интенсивность ПОЛ в последействии всех температурных режимов существенно снижена (Рисунок 1). Наименьшее содержание МДА на фоне пониженной температуры (3°С) выявлено в проростках кукурузы, семена которых были обработаны препаратом 6-БАП в концентрациях 1 и 5 мкМ, а повышенной (45єС) температуры - 1 мкМ. Это свидетельствует об эффективности 6-БАП как термопротекторного соединения. Механизмы такого действия 6-БАП включают его влияние на состояние мембран [Лукаткин, 2002а], активацию работы белоксинтезирующего аппарата [Титов, Таланова, 2009], экспрессию генов, участвующих в раннем ответе на температурный стресс [Романов, 2009], способность активировать антиоксидантные ферменты [Wang et al., 2009].

Рисунок 1. Содержание МДА в листьях кукурузы гибрида Краснодарский 194 МВ в зависимости от концентраций препарата 6-БАП и температурных условий при прорастании семян

Оптимальными при низкотемпературном проращивании семян кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ оказались концентрации тидиазурона 10-8-10-11 М, где наблюдалась тенденция к повышению энергии прорастания и всхожести семян. В последействии кратковременной (20 ч) гипо- и гипертермии, приводящей к торможению роста и повреждению листьев, обработка ТДЗ увеличивала (или проявляла тенденцию к возрастанию) рост корня, побега и листьев, и снижала повреждение листьев, максимально - в концентрации 10-10 М, а также уменьшала температуро-индуцированный выход ионов из клеток, особенно в концентрации 10-11 М. Количественная оценка повреждающих эффектов температуры на состояние клеточных мембран (на основе КП) показала прогрессирующее с уменьшением концентрации ТДЗ снижение величины КП относительно водного контроля после прогрева или охлаждения растений, особенно выраженное в самой малой концентрации - 10-11 М (Рисунок 2).

Препарат цитодеф положительно повлиял на прорастание семян, рост корня и побега кукурузы гибрида РОСС 299 МВ при температурах 25°С и 16°С, особенно в концентрации 10-9 М. Выход электролитов из высечек листьев подвергнутых охлаждению проростков (а также КП) были самыми низкими при обработке цитодефом в концентрации 10-9 М. Это свидетельствует о высокой термопротекторной эффективности синтетических цитокининовых препаратов.

Сходные эффекты уменьшения проницаемости клеточных мембран и образования МДА получены в опытах с обработкой молодых растений кукурузы гибрида РОСС 199 МВ тидиазуроном (10-8 М) и цитодефом (10-7 М/л) перед 24-часовым воздействием температуры 2єС. Более эффективным при обработке растений перед гипотермией оказался цитодеф.

Рисунок 2. Коэффициент повреждаемости клеток листьев кукурузы, обработанной разными концентрациями тидиазурона, после воздействия температуры 43°С (А) или 3°С (Б)

Влияние эпибрассинолида на устойчивость кукурузы к неблагоприятным температурам. После обработки семян гибрида Коллективный 172 МВ растворами ЭБ (от 10-7 до 10-10 М) наблюдали тенденцию к повышению энергии прорастания и всхожести при концентрациях 10-8-10-10 М ЭБ. Воздействие температур 43°С или 3°С приводило к снижению роста корней и побегов относительно 25°С; обработка ЭБ почти во всех вариантах показала тенденцию к усилению роста, максимально при 10-10 М. Степень повреждения листовой поверхности после прогрева проростков была самой низкой вследствие обработки 10-10 М ЭБ, после охлаждения - 10-8 и 10-10 М. Прирост осевых органов был максимальным при концентрации 10-9 М ЭБ в условиях оптимальной температуры, 10-9 М (прирост корня) и 10-10 М (прирост побега) после повышенных температур (43°С), и 10-9 М ЭБ в последействии охлаждения (3°С) (табл. 2).

Предпосевная обработка эпибрассинолидом способствовала снижению индуцированного температурой выхода ионов из клеток (особенно в концентрации 10-10 М). Величина КП после прогрева или охлаждения в вариантах с обработкой ЭБ была на уровне водного контроля или ниже его. В последействии теплового стресса величина КП снижалась прогрессирующе с уменьшением концентрации ЭБ. При действии пониженной температуры ЭБ был высокоэффективен в дозах 10-9 и 10-10 М. Таким образом, термопротекторная эффективность препарата ЭБ (по состоянию клеточных мембран) наиболее высока в наномолярной дозе 10-10 М.

Таблица 2. Влияние регулятора роста эпибрассинолида на прирост осевых органов кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ в последействии обработки различными температурами

Влияние Рибав-Экстра на устойчивость растений к неблагоприятным температурам. Рибав-Экстра - препарат, который стимулирует развитие микоризы, усиливая рост корневой системы и улучшая состояние растений [Толмачева, Михеева, 2008]. Оптимальной для прорастания семян кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ (как при оптимальной, так и пониженной температурах) оказалась концентрация РЭ 1 мкл/л, где наблюдали повышение энергии прорастания и всхожести относительно контроля, а также увеличение длины корня и побега. Препарат РЭ положительно повлиял на состояние растений кукурузы после температурного стресса (43 или 3°С). В последействии охлаждения длина корня была максимальной в варианте 1 мкл/л РЭ, побега - от 0,1 до 10 мкл/л РЭ. После экспозиции растений при 43°С обработка РЭ также проявила тенденцию к улучшению роста осевых органов и листьев, снижению степени повреждения листовой поверхности, наиболее эффективно при дозе РЭ 1 мкл/л. Предпосевная обработка некоторыми концентрациями РЭ способствовала снижению индуцированного температурой выхода электролитов из клеток (особенно в дозе 0,1 мкл/л). Расчет КП показал высокую эффективность препарата Рибав-Экстра в концентрации 0,1 мкл/л как сразу после прогрева или охлаждения, так и в последействии неблагоприятной температуры (Рисунок 3).

Интенсивность ПОЛ, выраженная в % к водному контролю, изменялась в проростках кукурузы при обработке РЭ (табл. 3). При комнатной температуре минимальный уровень ПОЛ отмечен при концентрации Рибав-Экстра 0,1 мкл/л. Однако после воздействия пониженной и повышенной температур более эффективными оказались концентрации 100 мкл/л (для обеих температур), а также 0,01 (3°С) и 0,0001 мкл/л (43°С).

Рисунок 3. Коэффициент повреждаемости листьев кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ, обработанной разными концентрациями препарата Рибав-Экстра, после воздействия температуры 43°С (А) или 3°С (Б)

Таблица 3. Интенсивность ПОЛ (% к водному контролю) молодых растений кукурузы гибрида РОСС-299 в зависимости от концентраций регулятора роста Рибав-Экстра и температуры

Таким образом, на основании анализа действия и последействия температурных стрессоров на клеточные мембраны можно видеть термопротекторный эффект препарата РЭ, наиболее значительный - в нанодозе 0,1 мкл/л.

Влияние иммуноцитофита на устойчивость растений кукурузы гибрида РОСС 299 МВ к гипо- и гипертермии. При подборе эффективных концентраций ИЦФ использовали диапазон от 2Ч10-12 М до 2Ч10-7 М. Положительное влияние ИЦФ на рост корней и побегов кукурузы выявлено при пониженной (3єC) температуре, наиболее эффективной оказалась концентрация 2Ч10-10 М. При повышенной температуре (44єC) обработка ИЦФ не оказала эффекта. По интенсивности ПОЛ, как косвенного признака повреждений, при пониженных температурах эффективны были две концентрации - 2Ч10-12 и 2Ч10-10 М, при повышенной температуре - только доза 2Ч10-12 М. При выражении интенсивности ПОЛ в процентах к температурному контролю лучший результат показал препарат в дозах 2Ч10-12 и 2Ч10-10 М (Рисунок 4).

Рисунок 4. Влияние различных концентраций регулятора роста Иммуноцитофит на интенсивность ПОЛ в листьях проростков кукурузы после температурного стресса

Таким образом, все изученные препараты (как синтетические, так и природные РР) оказали положительное воздействие на молодые растения кукурузы на фоне пониженных и повышенных температур. Однако эффективные концентрации РР, максимально повышающие термоустойчивость проростков, сильно варьировали в зависимости от температурного воздействия, стадии развития (возраста) растения, сорта, что необходимо учитывать при разработке рекомендаций к практическому использованию.

Использование изученных препаратов в целях повышения термоустойчивости кукурузы может быть перспективным на территориях с высокой вероятностью попадания растений на ранних этапах развития в условия стрессовых температур (как пониженных, так и пониженных).

Механизмы индуцирующего повышенную стрессоустойчивость действия регуляторов роста.

Влияние регуляторов роста на возникновение и интенсивность окислительного стресса при действии гипо- и гипертермии.

Как было показано в предыдущих разделах, в основе стрессорных реакций растений кукурузы при действии как гипо-, так и гипертермии лежит возникновение окислительного стресса. Поэтому для выяснения механизмов индуцирующего повышенную стрессоустойчивость действия регуляторов роста анализировали генерацию потенциально опасной АФК - О2? в разных условиях.

Обработка семян кукурузы (гибрид Краснодарский 194 МВ) регулятором 6-БАП оказала положительный эффект на снижение генерации О2яќ на фоне всех температур; в последействии неблагоприятных температур эффективность препарата выражена сильнее, особенно при низких концентрациях (1-100 нМ) (Рисунок 5). Почти все концентрации 6-БАП оказали положительное действие на подавление генерации О2яќ, однако эффекты концентраций препарата различались при температурных обработках: при действии пониженной температуры наименьшая скорость генерации О2яќ наблюдалась при дозе 6-БАП 0,1 мкМ, а повышенной температуры - 1 и 10 нМ 6-БАП.

Рисунок 5. Скорость генерации О2яќ в листьях кукурузы (гибрид Краснодарский 194 МВ) в зависимости от концентраций 6-БАП и температурных условий опыта, нормированная к водному контролю

При обработке семян кукурузы гибрида Коллективный 160 МВ тидиазуроном концентраций 10-11-10-6 М, дальнейшем выращивании в водной культуре до возраста 7 суток и воздействии гипо- и гипертермии уровень О2? варировал; предпосевная обработка растворами тидиазурона почти всегда уменьшала скорость генерации О2Ї, и в большинстве вариантов уровень супероксида был ниже водного контроля. Наиболее эффективно ослабляла влияние гипо- и гипертермии на генерацию О2? обработка тидиазуроном в концентрации 10-11 М. В листьях растений, обработанных тидиазуроном, концентрация МДА почти всегда была достоверно ниже необработанного варианта (табл. 4). Обработка семян тидиазуроном наиболее эффективно снижала уровень МДА на фоне гипотермии в концентрации 10-10 М, а после гипертермии - в концентрации 10-11 М.

Таблица 4. Влияние тидиазурона на интенсивность ПОЛ в листьях кукурузы гибрида Коллективный 160 МВ после температурного воздействия, мкМ МДА/ г сырой массы

Обработка 7-дневных растений кукурузы гибрида РОСС 199 МВ, выращенных в почвенной культуре, растворами тидиазурона (10 нМ) или цитодефа (100 нМ) перед гипертермией (43°С, 24 ч), привела к значительному понижению генерации О2? и образования МДА относительно водного контроля; более высокая эффективность на снижение окислительного стресса, вызванного прогревом, показана для тидиазурона.

При обработке семян кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ препаратом Рибав-Экстра (от 10-4 до 10-8 %) с последующим действием неблагоприятных температур большинство концентраций РЭ снижало образование О2яќ. В варианте пониженной (3єС) температуры наименьшая скорость генерации О2яќ наблюдалась при концентрациях 10-7 и 10 -6 % , а повышенной (45єС) - 10-7 %. Выявлена интересная тенденция влияния концентраций Рибав-Экстра на интенсивность ПОЛ: при оптимальной температуре эффективность препарата повышалась со снижением дозы РЭ (минимальное содержание МДА - при концентрации 10-8 %); в последействии пониженной температуры выявлено два пика - при самой низкой и самой высокой дозах РЭ; а в последействии повышенной температуры эффективность препарата повышалась с увеличением дозы РЭ. Т. е. единой закономерности влияния разных концентраций регулятора роста Рибав-Экстра на уровень ПОЛ при действии гипо- и гипертермии не выявлено.

Таким образом, обработка семян регуляторами роста способствовала лучшей адаптации растений кукурузы к действию гипо- и гипертермии, снижая стационарный уровень супероксида и возрастающего на основе АФК ПОЛ.

Влияние регуляторов роста на антиоксидантную активность растительных клеток после воздействия неблагоприятных температур. Обработка семян кукурузы гибрида РОСС 299 МВ различными концентрациями регуляторов роста (6-БАП, РЭ, ИЦФ) изменяла АОА при действии температурных стрессоров. Так, в проростках кукурузы, выращенных из обработанных 6-БАП семян, при оптимальной температуре (25єC) антиоксидантная активность препарата проявлялась лишь в двух концентрациях - 10 нМ и 0,1 мкМ (Рисунок 6).

Рисунок 6. Влияние обработки семян препаратом 6-БАП и последействия разных температур на АОА в проростках кукурузы

Однако в последействии пониженной (3єC) и повышенной (45єC) температур АОА достоверно повышалась почти при всех концентрациях 6-БАП, наиболее сильно - при концентрациях 0,1 мкМ и 10 нМ (3єC) , 1 нМ и 10 нМ (45єC). Предпосевная обработка семян различными концентрациями Иммуноцитофита повлияла на антиоксидантную активность в листьях кукурузы (табл. 5). При оптимальной и повышенной температуре эффективна концентрация 2Ч10-11 М, тогда как при пониженной температуре - 2Ч10-10 М.

Таблица 5. Антиоксидантная активность молодых растений кукурузы в зависимости от концентраций регулятора роста Иммуноцитофит и температуры, % к водному контролю

Антиоксидантная активность кукурузы, выращенной из обработанных препаратом Рибав-Экстра семян, варьировала в зависимости от действия температурного стресса (Рисунок 7). Если при комнатной температуре наибольшее влияние на уровень АОА оказала концентрация 10-7 % РЭ, то после пониженной температуры - концентрации 10-8 и 10-6 %, а повышенной - 10-6%.

Таким образом, обработка семян кукурузы синтетическими и природными регуляторами роста способствовала значительному повышению антиоксидантной активности в проростках кукурузы в последействии неблагоприятных температурных условий и ТМ. Очевидно, что это может быть одним из основных механизмов противодействия растений стрессовым факторам, индуцируемого обработкой регуляторами роста; повышение АОА в клетках растений позволяет эффективно снижать тяжесть стрессового воздействия.

Рисунок 7. Уровень АОА в растениях кукурузы в зависимости от концентрации РЭ и температуры

Влияние регуляторов роста на активность антиоксидантных ферментов в условиях стрессорных воздействий. Одна из причин повреждающего действия гипо- и гипертермии - возникновение окислительного стресса, выражающееся в появлении больших доз АФК. Основную роль в элиминации АФК играют антиоксидантные ферменты, в первую очередь СОД, которая снижает концентрацию О2•? в 104 раз, а также АПО и каталаза, устраняющие избыток перекисей, образованных СОД из О2•? [Мерзляк, 1989; Лукаткин, 2002].

Обработка семян кукурузы гибрида РОСС 199 МВ цитокининовыми РР (10-11 М тидиазуроном и 10-10 М цитодефом) приводила к изменению активности антиоксидантных ферментов после 24-часового охлаждения 7-дневных растений (табл. 6). При этом предпосевная обработка тидиазуроном индуцировала более высокую активность СОД и каталазы, а цитодефом - более выраженную нормализацию АПО (относительно необработанного РР варианта) в растениях кукурузы, подвергнутых гипотермии. Наиболее значительное воздействие цитокиновых препаратов выявлено для глутатионредуктазы, активность которой значительно возрастала (относительно водного контроля) вследствие обработки тидиазуроном и цитодефом, как при нормальной температуре, так и после гипотермии. Возможно, цитокининовые препараты (в больше степени тидиазурон) оказывают противодействие окислительному стрессу через активацию глутатионового цикла. Сравнение цитокининовых препаратов по влиянию на активность антиоксидантных ферментов у растений кукурузы при гипотермии показало более высокую эффективность тидиазурона.

Таблица 6. Влияние цитокининовых препаратов на активность антиоксидантных ферментов в листьях кукурузы сразу после 24-часовой гипотермии (2єС)

В опыте с 20-часовой гипо- или гипертермией кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ спустя 6 суток выявлено небольшое понижение (не всегда достоверное) активности СОД, каталазы и глутатионредуктазы, и повышение - АПО (табл. 7). Обработка семян кукурузы эпибрассинолидом (10-10 М) и Рибав-Экстра (0,1 мкл/л) (концентрации выбраны как оптимальные на основании предыдущих опытов) способствовала повышению активности антиоксидантных ферментов в листьях кукурузы относительно водного контроля, как в оптимальных температурных условиях, так и после кратковременного выдерживания в условиях неблагоприятных температур. Активность СОД в последействии прогрева при 43°С наиболее значительно (почти в два раза к водному контролю) усилил эпибрассинолид (после гипотермии различия между РЭ и ЭБ недостоверны). Обработка ЭБ и РЭ несколько повышала активность каталазы, но до уровня неохлажденного контроля активность в большинстве вариантов опыта не возвращалась (различий между РР не обнаружено).

Таблица 7. Активность антиоксидантных ферментов в листьях кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ после кратковременного температурного воздействия

Активность АПО в проростках кукурузы после гипо- и гипертермии существенно превышала водный контроль, что свидетельствует об усилении синтеза изоформ фермента, направленных на снижение концентрации перекиси и защиту от окислительного стресса [Лукаткин, 2002; Edwin, Sheeja, 2005]. Предварительная обработка семян кукурузы регуляторами роста несколько снижала (более значительно ЭБ) активность фермента относительно водных вариантов соответствующих температурных обработок. Очевидно, стабилизация активности АПО указывает на снижение тяжести окислительного стресса в клетках листьев кукурузы, подвергнутой гипо- и гипертермии, вследствие обработки РР.

Активность глутатионредуктазы в листьях кукурузы после гипо- и гипертермии значительно снижалась. Предварительная обработка семян регуляторами роста (эпибрассинолидом и Рибав-Экстра) повышала активность ГР, т.е. способствовала нормализации активности фермента.

Таким образом, кратковременное действие неблагоприятных температур (как гипо-, так и гипертермии) индуцирует окислительный стресс в растениях кукурузы, проявляющийся увеличением уровня АФК и интенсивности ПОЛ; при этом в клетках включаются защитные механизмы, и типичный ответ растений на возникновение окислительного стресса - активация антиоксидантной защиты (в т.ч. ферментативной). При обработке регуляторами роста реакция на действие гипо- и гипертермии выражена слабее, чем в контроле. Очевидно, РР могут повышать резистентность растений к абиотическим стрессорам посредством снижения соотношения про/антиоксидантов в растительных клетках.

Заключение

В последнее время достигнуты существенные успехи в выяснении физиолого-биохимических реакций растений на действие неблагоприятных факторов среды, которые проявляются в изменениях на клеточном, субклеточном и молекулярно-генетическом уровнях. Эффекты абиотических факторов на растения является следствием комбинированного воздействия конкретного стрессора на метаболизм и структуры растительных клеток. Полученные данные показывают, что окислительный стресс, индуцированный неблагоприятными температурами, является одним из компонентов (возможно, наиболее важным) сложного механизма стрессорного воздействия на растения. Окислительный стресс в растениях, подвергнутых действию неблагоприятных температур, тесно связан и с другими механизмами повреждения. Перекисное окисление мембранных липидов приводит к изменениям транспортных характеристик клеточных мембран у растений, подвергнутых температурному стрессу, способствует деструкции клеточных органелл.

Регулирование роста и развития растений с помощью физиологически активных веществ позволяет оказывать направленное влияние на этапы онтогенеза с целью мобилизации генетических возможностей растительного организма и, в конечном итоге, повышать продуктивность и качество урожая сельскохозяйственных культур. Кроме стимуляции роста и развития, регуляторы роста играют большую роль в становлении защитных реакций к стрессам (в том числе к воздействию неблагоприятных температур); они позволяют индуцировать у растений комплексную устойчивость ко многим неблагоприятным факторам среды. В настоящее время уделяется большое внимание разработке и применению регуляторов роста растений нового поколения, обладающим широким спектром физиологической активности. При этом анализируются как синтетические препараты, так и РР на основе природным веществ, которые получены из высших растений, грибов и микроорганизмов.

В работе продемонстрировано, что изменения физиологических и биохимических процессов в клетках растений кукурузы при действии абиотического (температурного) стрессового фактора связаны с индукцией окислительного стресса. Представлены исследования по влиянию наномолярных концентраций РР на растения кукурузы при гипо- и гипертермии. Действие изученных регуляторов роста на растения кукурузы неоднозначно и зависело от исходного окислительного статуса. Обнаружено сходное воздействие РР, принадлежащих к разным классам, на снижение тяжести стрессового воздействия, в основе которого лежит противодействие окислительному стрессу. На этой основе нами предложена схема предполагаемого действия экзогенных РР на адаптацию растений к действию неблагоприятных факторов среды (Рисунок 8), включающая следующие этапы: обработка регулятором роста - кратковременное действие стрессора - активация антиоксидантной защиты - повышение уровней низкомолекулярных антиоксидантов и активности антиоксидантных ферментов - развитие толерантности к последующему, более сильному действию стрессора той же природы - формирование кросс-адаптации (устойчивости к другим стресс-факторам) - развитие устойчивости растений к действию стресс-факторов абиотической и антропогенной природы. Предложенная схема может быть использована для обоснования способов направленного повышения стрессоустойчивости растений экзогенными воздействиями.

Рисунок 8. Предполагаемая схема действия экзогенной обработки регуляторами роста на адаптацию растений к действию неблагоприятных факторов среды

Выводы:

1 Выявлено стрессорное воздействие гипо- и гипертермии на изменения физиологических и биохимических параметров у растений кукурузы, проявлявшееся в снижении морфофизиологических показателей, значительном повышении проницаемости клеточных мембран в листьях, усилении генерации активированных форм кислорода и перекисного окисления липидов, снижении общей антиоксидантной активности, изменениях активности антиоксидантных ферментов. Совокупность выявленных изменений свидетельствует о возникновении в клетках кукурузы окислительного стресса при гипо- и гипертермии.

2 Синтетические регуляторы роста цитокининовой природы (6-бензиламинопурин, цитодеф, тидиазурон), а также эпибрассинолид и природные регуляторы - Рибав-Экстра и иммуноцитофит - способствовали улучшению физиологических и биохимических характеристик растений кукурузы как в оптимальных условиях, так и при стрессорном действии и последействии гипо- и гипертермии. При этом отмечены различия в эффективности препаратов, зависящие от генотипа растения и его возраста, интенсивности стрессового воздействия, а также концентрации препарата.

3 Предпосевная обработка регуляторами роста различной природы индуцировала повышенные всхожесть, рост и сниженную проницаемость мембран растений кукурузы, подвергнутых действию неблагоприятных температур.

4 Обработка семян регуляторами роста приводила к ослаблению тяжести окислительного стресса при гипо- и гипертермии, что выявлено по интенсивности генерации активированных форм кислорода (супероксидного анион-радикала) и перекисного окисления липидов в листьях кукурузы.

5 Экзогенные регуляторы роста способствовали возрастанию общей антиоксидантной активности тканей кукурузы, особенно выраженному при гипо-и гипертермии, и нормализации активности антиоксидантных ферментов при действии стресса.

6 Проведен скрининг регуляторов роста, способствующих повышению термоустойчивости растений, и подобраны оптимальные концентрации: тидиазурон - 10-10 и 10-11 М, 6-БАП - 10 нМ и 0,1 мкМ, цитодеф - 10-9 и 10-10 М, эпибрассинолид - 10-9 и 10-10 М, Рибав-Экстра - 10-5 и 10-6%, иммуноцитофит - 2Ч10-10 и 2Ч10-11 М. Эффективные концентрации зависели от физиологических особенностей растений, стрессирующего воздействия и его интенсивности.

Литература

1. Лукаткин А.С., Погодина Д.Н., Каштанова Н.Н., Лукаткин А.А., Сакалаускайте Ю., Духовскис П. Влияние 6-бензиламинопурина на проростки кукурузы при действии неблагоприятных температур // Агрохимия. - 2013. - № 2.- С. 42-48.

2. Лукаткин А.С., Каштанова Н.Н., Котлова Т.А. Влияние препарата Рибав-Экстра на рост и проницаемость мембран у проростков кукурузы в условиях температурного стресса // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского.- 2013. - №1, ч. 1. - С. 151-157.

3. Лукаткин А.С., Каштанова Н.Н., Духовскис П. Влияние эпибрассинолида на термоустойчивость проростков кукурузы // Агрохимия. - 2013. - № 6. - С. 24-31.

4. Лукаткин А.С., Каштанова Н.Н. Влияние тидиазурона на термоустойчивость растений кукурузы // Труды Карельского научного центра РАН. - 2013. -№ 3.- С. 129-135.

5. Лукаткин А.С., Каштанова Н.Н., Духовскис П. Изменение роста и проницаемости мембран у проростков кукурузы под влиянием эпибрассинолида и тяжелых металлов //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2013. № 3. С. 16-18.

6. Каштанова Н.Н. Модификация ответа культурных растений на абиотические стрессы действием синтетических регуляторов роста // Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали VІІ Міжнародної конференції молодих учених (20 - 23 листопада 2012 р., м. Харків, Україна). - Харків: ФОП Шаповалова Т.М., 2012.- С. 212

7. Лукаткин А.С., Погодина Д.Н., Каштанова Н.Н. Модификация про- и антиоксидантной активности в листьях кукурузы при действии температуры и регуляторов роста // Естествознание в регионах: проблемы, поиски, решения: материалы междунар. науч. конф. «Регионы в условиях неустойчивого развития» (Кострома - Шарья, 1-3 ноября 2012 г.) : в 2 т. Т. 1 / сост. и отв. ред. Ю.А. Дорогова, И.Г. Криницын, С.А. Кусманов, А.П. Липаев, К.С. Ситников. - Кострома : КГУ им. Н. А. Некрасова, 2012. - С. 181-182.

8. Семенова А.С., Каштанова Н.Н., Гарькова Н.Н., Лукаткин А.С. Влияние обработки гербицидом паракват на интенсивность перекисного окисления липидов в листьях злаков // Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем: Материалы X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Книга 1. (г. Киров, 4-5 декабря 2012г.). - Киров: ООО «Лобань», 2012. - С. 194-196.

9. Лукаткин А.С., Каштанова Н.Н., Семенова А.С. Экзогенный эпибрассинолид способствует адаптации проростков кукурузы к неблагоприятным условиям выращивания // Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем: Материалы X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Книга 1. (г. Киров, 4-5 декабря 2012г.). - Киров: ООО «Лобань», 2012. - С. 170-173.

10. Каштанова Н.Н. Синтетические регуляторы роста снижают токсические эффекты тяжелых металлов на растения огурца и кукурузы // ХII международная конференция «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов». - Киев, 2012. - С. 72-73.

11. Каштанова Н.Н., Лукаткин А.С. Влияние синтетических аналогов цитокининов на проявления окислительного стресса в клетках огурца при действии неблагоприятных факторов среды // Клеточная биология и биотехнология растений: тез. докл. Междунар. науч.-практич. конф., 13-15 февр. 2013 г., Минск, Беларусь = International conference «Plant Cell Biology and Biotechnology», Minsk, February 13-15, 2013 / ред. совет: В.В. Демидчик [и др.]. -- Минск: Изд. центр БГУ, 2013.- С. 72.

12. Каштанова Н.Н., Лукаткин А. С. Влияние обработки семян огурца тидиазуроном на про- и антиоксидантные свойства проростков при действии тяжелых металлов // Бизнес. Наука. Экология родного края: проблемы и пути их решения: Матер. Всеросс. науч.-практич. конф.-выставки экологических проектов с междунар. участием (г. Киров, 18-20 апреля 2013 г.). - Киров: Изд-во ООО «Веси», 2013.- С. 183-185.

13. Каштанова Н.Н., Стржалка К., Лукаткин А.С. Анализ резистентности растений огурца к тяжелым металлам при действии экзогенных регуляторов роста // Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов: материалы Всерос. (с междунар. участием) науч. конф., Саранск, 15-17 мая 2013 г.- Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2013. - С. 92-95.

14. Каштанова Н.Н., Сазанова К.А., Семенова А.С., Лукаткин А. С. Экзогенные регуляторы роста повышают резистентность растений к абиотическим стрессорам посредством изменения про/антиоксидантного состояния // Инновацинные направления современной физиологии растений: тез. докл. Всерос. науч. конф. с междунар. участием. Москва, Россия, 2-6 июня 2013 г. - М., 2013. С. 282.

15. Каштанова Н.Н., Лукаткин А.С. Активация кислорода в клетках растений абиотическими стрессорами и ее подавление экзогенными регуляторами роста // Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений: Первый международный симпозиум (Казань, 17-20 сентября 2013 г.). Тез. докл.- Казань: Изд-во "ФизтехПРЕСС" КФТИ КазНЦ РАН, 2013.- С. 75.

Размещено на Allbest.ru