Использование молекулярных маркеров

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

Классификация молекулярных маркеров

Основные направления использования молекулярных маркеров

Методы селекции, основанные на использовании ДНК-маркеров

Заключение

Список литературы

Введение

Роль молекулярных маркеров в трудно переоценить. С их помощью составлены подробные молекулярные карты генома человека и десятков видов растений и животных, на которые нанесены важнейшие гены, определяющие рост и развитие организмов, морфологические признаки, устойчивость к заболеваниям и другие свойства. Молекулярные маркеры широко используются в популяционной генетике, сравнительной генетике и геномике, в филогенетических исследованиях.

Благодаря молекулярным маркерам расширяются возможности медицинской диагностики, появляются новые более точные методы паспортизации пород животных и сортов растений. Использование молекулярных маркеров позволяет значительно ускорять процесс селекции. Для изучения данной темы мы рассмотрим:

-классификацию молекулярных маркеров;

-основные направления их использования;

-методы селекции, основанные на использовании ДНК-маркеров.

Классификация молекулярных маркеров

Молекулярные маркеры (синоним - ДНК-маркеры) - это генетические маркеры, анализируемые на уровне ДНК. ДНК-маркеры являются третьим поколением генетических маркеров. Им предшествовали белковые маркеры, а еще ранее - классические генетические маркеры. Классический генетический маркер соответствует гену, аллели которого имеют четко выраженные отличия на уровне фенотипа. Белковый маркер соответствует гену, аллели которого имеют отличия (разную молекулярную массу) на уровне белкового продукта. Молекулярный маркер соответствует гену или некодирующему участку генома, разные варианты (аллели) которого отличаются на уровне ДНК. Отличия на уровне ДНК (полиморфизм ДНК) могут быть выявлены:

Ш с помощью гибридизации с известными нуклеотидными последовательностями;

Ш при секвенировании нуклеотидной последовательности;

Ш при сравнении длины фрагментов, по-лученных с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР);

Ш в результате обработки ДНК эндонуклеазами рестрикции.

Впервые теоретическое обоснование использованию генетических маркеров («сигналей») дал около века назад А.С. Серебровский: «… сигналями мы называем удобные для менделистических наблюдений альтернативные гены с более или менее известной локализацией, которые, не оказывая воздействия на изучаемый трансгрессирующий признак и влияя достаточно определенным образом, облегчают генетический анализ этого признака, позволяя следить за наследованием того участка хромосомы, в котором эти сигнали расположе-ны» (Серебровский, 1970).

В настоящее время насчитывается несколько десятков типов молекулярных маркеров. Наиболее широко используемые ДНК-маркеры перечислены на рис. 1. Их разделяют на три группы, согласно основному методу анализа: маркеры, исследуемые с помощью (1) блот-гибридизации, (2) ПЦР и (3) ДНК-чипов.

Рис. 1 Схематическая классификация молекулярных маркеров и год их первого упоминания в публикации

Данная классификация отражает процесс «эволюции» ДНК-маркеров. Первая из трех перечисленных выше групп представляет собой первое поколение ДНК-маркеров, по-лучивших широкое распространение в 1980-е годы. В 1990-е годы ключевые позиции заняли ПЦР-маркеры, в 2000-е годы их существенно потеснили молекулярные маркеры, основанные на использовании ДНК-чипов. В последние 2-3 года для анализа полиморфизма ДНК все чаще используют метод прямого секвенирования генома или его отдельных участков.

К молекулярным маркерам наравне с классическими генетическими применяют термины «локус», «аллель», «доминантный», «кодоминантный». Аллели - различные варианты одного и того же молекулярного маркера, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом. Под различными вариантами понимают нуклеотидные последовательности, отличающиеся по длине или по нуклеотидным заменам. Молекулярные маркеры подразделяют на монолокусные и мультилокусные. Если метод анализа маркера позволяет выявлять оба аллеля, говорят о кодоминантном типе наследования данного маркера , если выявляется только один аллель - о доминантном наследовании .

Монолокусные маркеры наследуются чаще всего по кодоминантному типу, мультилокусные - по доминантному.

Основные классы молекулярных маркеров

1. AFLP(amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов.

2. CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) - расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности.

3. DArT(diversity array technology) - ДНК­чип технология для изучения разнообразия.

4. IRAP(inter­retrotransposon amplified polуmorphism) - полиморфизм амплифицированных последовательностей между ретротранспозонами.

5. ISSR(inter simple sequence repeats) - межмикросателлитные последовательности.

6. RAPD(random amplified polymorphic DNA) - случайно амплифицированная полиморфная ДНК.

7. RFLP(restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

8. SCAR(sequence characterized amplified region) - амплифицированная область, охарактеризованная нуклеотидной последовательностью.

9. SNP (single­nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм.

10. SSAP(sequence­specific amplification polymorphism) - полиморфизм сиквенсспецифичной амплификации.

11. SSCP(single strand conformation polуmorphism) - полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК.

12. SSR(simple sequence repeats) - простые повторяющиеся последовательности (микросателлиты).

13. STS(sequence tagged site) - сайт/локус, маркированный нуклеотидной последовательностью.

Основные направления использования молекулярных маркеров

Среди молекулярных маркеров различают маркеры с известной локализацией (в определенной хромосоме или участке хромосомы, или вблизи конкретного гена) и маркеры, о локализации которых ничего не известно (как правило, это мультилокусные маркеры). Как те, так и другие находят свое применение в генетических исследованиях и в селекции. Молекулярные маркеры с неизвестной локализацией нельзя использовать для маркирования определенного гена или хромосомы, зато их успешно применяют в филогенетических исследованиях, для паспортизации сортов растений и пород животных.

Основные направления использования монолокусных маркеров:

1. составление молекулярных карт хромосом и геномов;

2. картирование генов и QTL;

3. маркирование генов, хромосом и геномов;

4. сравнительная генетика и геномика;

5. отбор с помощью ДНК­маркеров в селекции;

6. геномная селекция (только SNP­маркеры);

7. молекулярная паспортизация сортов/пород;

8. диагностика заболеваний;

9. экологический мониторинг;

10. исследование генетического разнообразия;

11. филогенетические исследования

12. популяционная генетика.

Некоторые мультилокусные маркеры подходят для создания генетических карт (DArT- и AFLP-маркеры), а также для геномной селекции (DArT). Основные направления использования мультилокусных маркеров:

1. составление молекулярных карт хромосом и геномов (только AFLP­и DArT­маркеры);

2. картирование генов и QTL (только AFLP­и DArT­маркеры);

3. геномная селекция (DArT­маркеры);

4. молекулярная паспортизация сортов/пород;

5. экологический мониторинг;

6. исследование генетического разнообразия ;

7. филогенетические исследования;

8. популяционная генетика.

На выбор ДНК-маркеров подходящего типа для решения конкретной задачи влияют и такие характеристики, как уровень внутривидового полиморфизма и возможность автоматизации процесса анализа полиморфизма ДНК (рис. 2).

Рис. 2. Уровень внутривидового полиморфизма и возможность автоматизации анализа различных типов ДНК-маркеров

С внедрением ДНК-маркеров наибольший размах приобрели среди прочих такие направления, как построение молекулярных карт отдельных хромосом и геномов, картирование на них генов и локусов количественных признаков (QTL). В 1980 г. Дэвид Ботштейн совместно с Р. Уайтом, М. Школьником и Р. Дэвисом разработал первые монолокусные генетические маркеры на основе анализа полиморфизма ДНК (а именно полиморфизма длины рестрикционных фрагментов - RFLP) и показал, что с их помощью можно проводить построение генетических карт.

За этой пионерской работой последовало создание RFLP-карт различных видов животных и растений. Насколько эффективно RFLP-маркеры позволили продвинуться в картировании геномов, иллюстрирует следующий пример.

Первая RFLP -карта генома пшеницы содержала в 1,5 раза больше локусов и была в 1,2 раза длиннее прежней классической генетической карты, ставшей результатом трудов многих исследователей в течение нескольких десятилетий.

Выяснилось, что RFLP-маркеры, разработанные для одного вида, могут использоваться для анализа геномов родственных видов и родов. Таким образом, стало возможным сравнительное картирование геномов, благодаря которому внутри отдельных семейств удалось выявить ряды ортологичных генов и проследить преобразования структуры генома отдельных видов в ходе эволюции от общего предка. Результаты этих работ крайне важны для современных исследований в области сравнительной геномики.

Благодаря использованию RFLP-карт появилась возможность определять точное положение отдельных генов в геноме и клонировать их последовательности на основе картирования.

Пионером в области позиционного клонирования генов является американский исследователь Стивен Тэнксли. Под его руководством при использовании данного метода был впервые клонирован ген устойчивости к бактериальной пятнистости плодов томата. С. Тэнксли был первым и среди тех, кто оценил потенциальные преимущества отбора по генотипу и в 1983 г. одновременно с Жаком Бекманом предложил использовать ДНК-маркеры в селекции.

Однако массовое распространение работ по картированию генов, а также локусов количественных признаков произошло не в эпоху RFLP -маркеров (из-за их высокой стоимости и необходимости использования радиоактивно меченных проб), а с появлением более дешевых и удобных в применении ПЦР-маркеров. Среди ПЦР-маркеров наиболее подходящими и востребованными для картирования генов и геномов оказались микросателлитные (SSR) маркеры. Использовать гипервариабельные последовательности, состоящие из простых повторов, в качестве маркеров впервые предложил в 1989 г. немецкий исследователь Дитхард Таутц. Именно с ПЦР-маркеров началось широкое внедрение ДНК-маркеров в селекционный процесс. С помощью молекулярных маркеров можно проводить отбор по генотипу, тогда как в традиционной селекции отбор индивидуумов для скрещиваний осуществляется на основе анализа фенотипа. Отбор по генотипу имеет ряд преимуществ по сравнению с отбором по фенотипу.

Процесс генотипирования может быть полностью или частично автоматизирован, тогда как методы автоматического фенотипирования развиваются очень медленно. Приборы для автоматического анализа фенотипа отличаются узкой специализацией и очень высокой стоимостью, в то время как устройства, необходимые для анализа генотипа, дешевле их и являются универсальными.

Анализ проявления того или иного признака осуществляется на строго определенной стадии развития. Образцы для генотипирования можно отобрать практически в любой удобный момент. Отбор проб для выделения необходимого количества ДНК на ранних стадиях развития селектируемых организмов позволяет своевременно изымать из селекционного процесса значительное количество материала, не потратив на анализ и уход за ним лишних средств.

На результаты фенотипирования влияют различные факторы окружающей среды. Генотип не зависит от изменения условий среды. Если отбор ведется на основании анализа фенотипа, то при полном доминировании невозможно отличить доминантные гомозиготы от гетерозигот и, следовательно, выбрать индивидуумы для скрещивания в текущем поколении. С помощью ДНК-маркеров легко справиться с этой задачей.

Анализ ряда важных признаков растений проводится после стадии развития, на которой может быть осуществлена гибридизация, поэтому скрещивание отобранных образцов проводится уже в следующий вегетационный период. При использовании ДНК-маркеров можно подобрать подходящие пары и осуществить гибридизацию в текущем поколении. Это также ускоряет селекционный процесс.

Благодаря этим преимуществам применение молекулярных маркеров стало неотъемлемой частью селекционного процесса во многих странах мира.

Методы селекции, основанные на использовании ДНК-маркеров

маркер молекулярный монолокусный генетика

Методы селекции, в которых применяются ДНК-маркеры, разделяют на две основные группы: ОПМ и геномная селекция.

Метод ОПМ предполагает использование ДНК-маркеров, тесно сцепленных с целевым геном, вместо или вместе с фенотипическим анализом. Маркеры, тесно сцепленные с целевым геном, являются надежным инструментом для предсказания фенотипа. Отбор нужного аллеля целевого гена осуществляется на основе тесно сцепленного с ним аллеля соседнего маркерного локуса. Бульшая точность отбора достигается при использовании пары маркеров, расположенных вблизи гена по разные стороны от него (т. е. маркеров, фланкирующих целевой ген). Если ген отсеквенирован и выявлены различия нуклеотидной последовательности разных аллелей данного гена, то можно разработать так называемый «внутригенный маркер». Использование такого маркера позволит отбирать нужные генотипы с наиболее высокой точностью. При отсутствии внутригенного или тесно сцепленного с геном ДНК-маркера можно использовать более отдаленные маркеры, однако в таких случаях целесообразно сочетать ОПМ с последующим фенотипированием. Такой комбинированный подход называется «тандемным» отбором или маркер-направленным фенотипированием.

Метод ОПМ хорошо зарекомендовал себя при беккроссной и линейной селекции, а также при создании пирамид.

При беккроссной селекции можно вести отбор по внутригенному маркеру, по маркерам, тесно сцепленным с геном по генетическому фону, а также комбинировать отбор по генетическому фону с отбором по внутригенному маркеру или по маркерам, тесно сцепленным с геном (рис. 3).

Рис. 3. Условия расположения ДНК-маркеров (обозначены черными линиями), используемых при различных вариантах беккросной селекции, относительно селектируемого гена (белый прямоугольник)

Два первых метода позволяют вести отбор только по целевому гену, контролируя передачу нужного аллеля от донора реципиенту в череде поколений возвратных скрещиваний. Использование значительно большего числа маркеров, равномерно распределенных по геному, позволяет не только контролировать передачу целевого гена от донора реципиенту, но и ускорять восстановление генома реципиента.

Для использования ДНК-маркеров в селекции по тому или иному признаку требуется информация о нуклеотидных последовательностях генов, контролирующих данный признак, или, по крайней мере, о локализации их в геноме, а также о тесно сцепленных с ними маркерах. Если исходные данные отсутствуют, то необходимые подготовительные исследования (рис. 4) могут занять не один год.

Рис. 4 Схема подготовительных работ для дальнейшего применения метода ОПМ

С целью экономии времени и средств можно проводить молекулярно-генетический анализ и отбор одновременно. Такой подход, сочетающий метод беккроссной селекции с QTL-анализом отбором по генотипу в 1996 г. предложили использовать (рис. 5) С. Тэнксли и Дж. Нельсон.

Рис. 5 Схема подхода, сочетающего метод бек-кроссной селекции с QTL-анализом и отбором по генотипу

Снижение стоимости секвенирования нуклеотидных последовательностей и развитие методов высокопроизводительного секвенирования открыли возможность массовой реализации программ полногеномного секвенирования. Число видов растений и животных, геном которых полностью отсеквенирован (как модельных, так и тех, что используются в сельском хозяйстве), стремительно возрастает.

Секвенирование и сравнение генома разных представителей одного и того же вида (ресеквенирование генома) позволяют выявлять полиморфные участки генома и разрабатывать маркеры (как правило, SNP), равномерно и плотно покрывающие геном. К настоящему моменту разработаны полногеномные SNP-чипы для автоматического анализа полиморфизма ДНК некоторых видов животных и растений, имеющих сельскохозяйственное значение. Внедрение методов высокопроизводительного генотипирования сельскохозяйственных объектов открыло путь для применения нового метода селекции, основанного на анализе большого числа ДНК-маркеров, равномерно распределенных по геному, - геномной селекции (Смарагдов, 2009).

Помимо видов, чей геном уже отсеквенирован, появилась перспектива применения геномной селекции и в отношении тех видов растений и животных, геном которых еще не отсеквенирован или вовсе не изучен. Не так давно на примере пшеницы было продемонстрировано, что в геномной селекции может быть использован другой метод высокопроизводительного генотипирования - DArT-маркеры. DArT отличаются отSNP тем, что для их разработки не требуются данные по секвенированию генома.

Геномная селекция, как и ОПМ, подразумевает использование ДНК-маркеров и отбор по генотипу. Чем же геномная селекция принципиально отличается от ОПМ? Во-первых, для геномной селекции не требуются знания о генах, влияющих на признаки, а значит не нужны многолетние генетические исследования, предшествующие селекционному процессу. Во-вторых, геномная селекция имеет преимущество при отборе по признакам, имеющим сложный полигенный контроль, тогда как метод ОПМ, как правило, эффективен лишь в случае моно- или олигогенного контроля признаков. Тем не менее, если процесс геномной селекции приведет к не-желательной коселекции признаков (например, повышенной молочной продуктивности и предрасположенности к маститу у крупного рогатого скота), избежать дополнительных генетических исследований, подобных тем, что требуются для ОПМ , не удастся.

Процесс геномной селекции включает три этапа: анализ «тренировочных поколений» с использованием методов фенотипирования и генотипирования, выявле-ние корреляций между фенотипом и генотипом, дальнейший отбор по генотипу среди «кандидатов на селекцию» Установлено, что с помощью ДНК-маркеров можно отбирать устойчивые генные сети, сохраняющиеся в поколениях. Однако необходимыми условиями для успешного осуществления геномной селекции являются адекватное количество тренировочных поколений, используемых маркеров и правильное соотношение числа маркеров и исследуемых генотипов.

В настоящее время наиболее активно развиваются программы по геномной селекции свиньи, крупного рогатого скота и пшеницы Экономическую выгоду от геномной селекции хорошо иллюстрируют данные по селекции крупного рогатого скота. Геномная селекция позволяет сэкономить до 92 % средств, затрачиваемых на оценку быков-производителей, и сократить время оценки с 6 лет до 1 года и 9 месяцев.

Заключение

Еще в первые десятилетия развития генетики стало ясно, что генетические маркеры могут быть полезными при анализе сложных признаков. Однако низкая встречаемость и ряд других недостатков не позволили классическим генетическим маркерам, а впоследствии и белковым маркерам широко войти в селекционную практику. Последнее поколение генетических маркеров (молекулярные, или ДНК-маркеры) характеризуется более высокой частотой встречаемости в геноме и основано на универсальных, а значит широко востребованных и постоянно развивающихся методах анализа.

Молекулярные (или ДНК-) маркеры - это новое поколение генетических маркеров, отличающихся от прежних большим количеством и частой встречаемостью в геномах эукариот и основанных на универсальных, а значит широко востребованных и постоянно развивающихся методах анализа. Целесообразным и экономически оправданным оказалось использование ДНК-маркеров в прикладных областях, в частности в селекции, а их применение в фундаментальных исследованиях позволило выйти на новый уровень понимания организации и эволюции геномов изучаемых объектов.

Размещено на Allbest.ru