Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Физиологические особенности действия брассиностероидов

1.1 Характеристика брассиностероидов

1.2 Ростостимулирующая активность брассиностероидов

1.3 Молекулярно-генетический анализ действия брассинотероидов

2. Антистрессовое действие брассиностероидов

2.1 Протекторная роль брассиностероидов при воздействии различных стрессовых агентов

Выводы

Список литературы



Введение

Исследование гормональной регуляции жизни растений - одна из одна из центральных задач мировой физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений. Это связано с тем, что вся жизнь растительных организмов проходит под контролем фитогормонов. Регуляторы роста важны в реакции растений на внешние воздействия и формировании устойчивости растений к экстремальным условиям [Кулаева, Кузнецов, 2004].

Поиск новых эффективных регуляторов роста в сельском хозяйстве активно ведется с целью повышения продуктивности и устойчивости растений к неблагоприятным факторам произрастания, стимуляции плодо- и корнеобразования, улучшения биохимического состава плодов, и увеличения сроков их хранения. Выявление наиболее эффективных регуляторов роста, оптимальных способов их использования является актуальной задачей современной агрохимии. Производство экологически безопасной продукции, которая будет соответствовать установленным общегигиеническим, токсикологическим нормативам, не влияющей негативно на здоровье человека - первоочередное требование. Преимущество регуляторов роста является экологическая чистота, высокая степень распада [Солиев и др., 2012].В Улучшение сельскохозяйственного производства имеет цель получение качественного продовольствия в условиях антропогенного воздействия на окружающую среду [Ибрагим МохамедСалехМохамед Али,Байрамбеков, 2010].

В научной литературе широко обсуждается способность брассиностероидов регулировать рост и развитие растений в процессе онтогенеза. Известно, что они изменяют активность ферментов, мембранный потенциал, активируют синтез белков и нуклеиновых кислот, регулируют метаболизм аминокислот и жирных кислот, влияют на гормональный статус растительного организма, стимулирую растяжение и деление клеток. Среди преимуществ брассиностероидов можно отметить их способность вызывать эффекты антистрессового действия в чрезвычайно низких концентрациях, по сравнению с другими гормонами. Однако механизмы стресс-протекторного действия стероидных фитогормонов остаются в настоящее время практически не исследованными [Ефимова и др., 2013].

Цель:

Получить аналитические данные по защитному действию брассиностероидов в условиях абиотических стрессов при выращивании сельскохозяйственных культур.

Задачи:

1. Описать полученные в вегетационных экспериментах ответные реакции растений при воздействии на них стрессовых агентов (пестицидов)

2. Оценить роль эпибрассинолида как фактора адаптации к изменяющимся условиям внешней среды

3. Провести анализ результатов в учетом защитного действия эпибрассинолида

4. Биотестирование гербицида раундап и его характеристика

5. Провести экспериментальные лабораторные исследования на тест-культуре по влиянию ЭБ на растения при его совместном применении с гербицидом раундап.

6. Микробиологические характеристики (смыв с листа, ризосфера и почва) экспериментальных объектов при воздействии исследуемых факторов (эпибрассинолид, раундап).



1. Физиологические особенности действия брассиностероидов

1.1 Характеристика брассиностероидов

Давно имело место мнение, что основные группы фитогормонов ауксины, цитокинины, гиббереллины, АБК и этилен не исчерпывают свой набор. О существовании гормонов стероидной формы были высказаны догадки в середине сороковых годов ХIХ века. Проводились многочисленные биотесты с применением эстрогена и тестостерона, однако результаты получались весьма специфичными из-за высокой концентрации гормонов. Основная задача состояла в выделении гормонов из растений, осуществление которой происходило на протяжении долгого времени. В 1979 г. Гроув с соавторами выделил фитогормон стероидной формы в виде масляного экстракта, обнаруженный в пыльце рапса (Brassicanapus) и стимулирующий рост проростков в длину вторго междоузлия фасоли. Для того чтобы выделить 4 миллиграмма стероидного соединения необходимо было собрать 10 кг пыльцы рапса. Из липидной фракции Brassicanapusкристаллическое вещество стероидной природы. От латинского название рапса фитогормон стал называться брассинолидом (Рис. 1.), а вещества имеющее схожее молекулярное строение и схожее физиологическое воздействие стали называть брассиностероидами, которых в настоящее время выделяют порядка шестидесяти соединений.

Рисунок 1. - Брассинолид - первый выделенный брассиностероид

БС является производным 5-б-холестан, для которого характерно структурное сходство со стероидными гормонами животных эстрогена, тестостерона, экдизона. БС являются характерными соединениями для всего царства растений БС обнаружили во всех органах растений, исключая корни, особенно отмечены повышенные концентрации в генеративных органах (от 5 до 190 нг/г сырой массы). Брассиностероиды способны к дистанционному транспорту, подтверждением этого факта являются данные о транслокации экзогенных меченных БС. В настоящее время брассиностероиды рассматриваются в качестве эффективных эндогенных регуляторов роста, что связано с большим количеством факторов оказания физиологического воздействия на растения, включающие в себя ростстимулирующее и защитное действие по отношению к стрессовым агентам [Шакирова, 2001; Чуб, 2003].

1.2 Ростстимулирующая активность брассиностероидов

С момента открытия брассиностероидов было известно об их ростстимулирующем действии, в связи с этим проводился ряд фитотестов характерный для «классических» фитогормонов, результаты которых имели как положительный, так и отрицательный эффект. Для биотестирования использовались весьма низкие концентрации БС (10^-6 - 10^-12), что является отличительной чертой от групп других фитогормонов. Анализ ростстимулирующего действия БС полон противоречивых данных, связанный с различием действующей концентрации, сроков обработки и восприимчивостью разных групп растений.

Для того, чтобы выделить ростстимулирующее действие брассиностероидов применяют специфические биотесты. Высокая физиологическая активность БС проявляется в чувствительном тесте по изменению угла отклонения листовой пластинки риса от влагалища листа. БС оказывает стимулирующий эффект на деление и растяжение клеток, тем самым способствуя сильной активизации роста растения. 24-эпибрассинолид существенно ускоряет деление изолированных протопластов китайской капусты. БС взаимодействует с другими фитогормонами, способствуя регуляции ростовых процессов, и имеет влияние на эндогенный гормональный статус. Был проведен ряд тест-систем, в ходе которых проявился синергический эффект ИУК и БС, аддитивный эффект на элонгацию клеток гиббереллина и БС.

При обработке клетки экзогенными фитогормонами регистрируется гиперполяризация мембран и активация протонной помпы, при применении БС процесс индуцирования растяжения клеток также связан с связан с вышеупомянутыми процессами. БС способен активировать АТФ-азу. Влияние БС на протонную помпу опосредованно через модификацию липидного окружения АТФ-азного комплекса.

Активность белково-нуклеидного обмена клеток интенсифицирует ростовые процессы. Обработка БС гипокотилей и эпикотелей сои, а также проростков арабитопсиса вызывается активизацию транскрипции более 50 генов и усиление синтеза полипептидов. К благоприятному физиологическому воздействию на растения брассинолида относят стимуляцию фотосинтетической активности клеток, повышению уровня растворимых белков и углеводов. Показано возрастание активности растворимости инвертазы в изолированных семядолях риса и клеточно-стеночной инвертазы в суспензионной культуре клеток томата. БС участвует в дифференциации сосудов ксилемы: в наномолярных концентрациях БС увеличивает формирование элементов трахеид, обработанных ауксином и цитокинином отрезков топинамбура до десяти раз.

Учитывая результаты различных фитотестов можно сделать вывод что БС - эндогенные регуляторы роста - включаются в регуляцию разнообразных процессов жизнедеятельности растений, характеризуются множественными проявлениями физиологического действия и отвечают всем критериям фитогормонов. Высказывается мнение о лидирующей роли БС [Шакирова, 2001].

1.3 Молекулярно - генетический анализ действия брассиностероидов

Исследователи имеют БС - мутанты арабидопсиса, гороха и томата, разделяющиеся на два класса. К первому относятся БС - дефектные, содержащие гены, кодирующие факторы, вовлекающиеся в разные этапы по пути синтеза БС. Ко второму классу относят БС - нечувствительные, которые теряют активность факторов, участвующих в восприятии БС - сигнала. Использование второго класса мутантов выявляет отклонение от нормального развития растений, однако экзогенное внесение БС способствует нормализации жизненных процессов растений. Мутанты используются для изучения спектра индуцируемых БС генов. Первый клонированный ген именуется BRU1, специфически регулирующий БС зоны растяжения эпикотелей сои [Шакирова, 2001].



2. Антистрессовое действие брассиностероидов

2.1 Протекторная роль брассиностероидов при воздействии различных стрессовых агентов

Большая роль в регуляции процессов обмена у растительных организмов принадлежит как фитогормонам, так и их синтетическим аналогам. В связи с этим актуально изучение механизмов действия регуляторов роста.

Ксенобиотики, выступая в качестве стрессора, могут ускорять процесс старения растения. Этот биологический отрегулированный процесс - заключительный этап в жизни растительных тканей. Старение приводит к структурным, биохимическим и молекулярным изменениям в растительном организме. Последняя фаза онтогенеза растений состоит из последовательности физиологических процессов, которые приводят к потере нескольких органов растений. Старение составляет неотъемлемую часть нормального развития растения. Этот процесс может наблюдаться на различных организационных уровнях (клетка, ткань, орган). Ксенобиотики могут привести к преждевременной смерти растения, однако у растений включается пассивный защитный механизм. С целью изоляции от всего организма, в определенных органах (например, в листьях) концентрируются токсичные для растения вещества. Для устранения стрессора ускоряется процесс старения этого органа, следующим этапом является гибель органа и его ампутация. Возможен другой активный механизм. Растение устраняет ксенобиотики путем выделения их через корни и устьица в окружающую среду[Delmail, Labrousse, 2012].

Было проведено исследование действия эпибрассинолида и мелафена на физиолого-биохимические процессы картофеля, где было установлено, что при обработке регуляторами роста увеличивается интенсивность транспирации, содержание каратиноидов, снижается продукция ПОЛ (перикисное окисление липидов), увеличивается концентрация сахарозы в клубнях картофеля. Показано, что повышение активности нециклического фотофосфорилирования хлоропластов связано с участием эпибрассинолида. На фоне вышеописанного процесса происходит возрастание активности антиокислительных ферментов в листьях картофеля, в том числе пероксидазы. Авторы исследования полагают, что действие фитогормонов может положительно сказаться на урожае растения картофеля. [Кириллова, Бобровская,2010].

С целью снижения себестоимости продукции и затрат на возделывание льнарассмотрено влияние защитно-стимулирующих комплексов на урожай и качество волокна. Применение эпибрассинолида не приводит к накоплению тяжелых металлов (Fe, Cd, Co,Cr,Hg, Cu, Mn, Zn, Pb) в семенах льна, что позволяет продукции соответствовать требованиям экологической безопасности. В ходе исследований рассматривалось действие 24-эпибрассинолида при увеличении его концентрации с 5 до 50 мг/га (прибавка урожая 10-30%) и в смеси с иодидом калия. В результате исследований было установлено, что при использовании 24-эпибрассинолида в совокупности с иодидом калия наблюдаются наиболее высокие урожаи льна (прибавка до 40%). Также отмечена увеличившаяся устойчивость растений к полеганию, увеличению массы 1000 семян и числа коробочек на растении, улучшаются физико-механические свойства волокна. Используемые защитно-стимулирующие комплексы имеют структуру сходную с природной. С этим фактом связывают агроэкологическую эффективность фитогормонов. При использовании рекомендуемых доз обеспечивается возможность снижения доз традиционных средств химической защиты или же их полной замены растений, что позволяет снизить пестицидную нагрузку и как следствие получить экологически чистую продукцию [Захаренко и др.,2009].

Развитие биотехнологий растений позволило производить большое количество безвирусных растений. Последней стадией в этом процессе является доращиваниерегенерантов растений на твердой питательной среде, затем в грунте или на жидких средах. При этом наблюдаются большие потери регенерантов, которые составляют от 10 до 80%. Возможным способом снижения данного процесса является внесение регуляторов роста. Изучено влияние 24-эпибрассинолида на повышение устойчивости регенерантов щавеля кислого в периоды доращивания и акклиматизации с последующим переносом в тепличные условия.(Табл. 1.) Установлено, что фитогормон в концентрации 0,5 мг/л увеличивает продолжительность культивирования регенерантов без смены питательной среды в 2 раза, а также снижает гибель эксплантов. Входе исследований был сделан следующий вывод. При доращивании у регенерантов, выращиваемых без 24-эпибрассинолида на начальных стадиях наблюдалось более активное развитие листостебельной части, в развитии же корневой системы различия не были найдены. Предположили, что повышение устойчивости на начальных стадиях акклиматизации связано со снижением темпов развития «зеленой» части и перехода от резких ростовых процессов к усилению общего развития. [Скапцов, Куцев, 2013]

Таблица 1.

Сочетание длинного светового дня и низких ночных температур, характерные для климата Карелии, является стрессовым фактором для растений. В связи с этим на растении томат был проведен ряд исследований с применением регулятора роста эпин-экстра, который способствует преодолению неблагоприятных экологических условий. В ходе экспериментов было установлено положительное влияние фитогормона на развитие и продуктивность растений томата, а именно - приживаемость рассады при низкой температуре почвы, стимуляция роста растений, закладка соцветий и плодообразование, предотвращение опадения генеративных органов. Также фитогормон влияет на урожайность: раннюю на 23-41%, общую за оборот на 14-45%. Помимо вышеуказанных положительных эффектов наблюдается повышенная устойчивость томата к серой гнили, которая наносит значительный вред культуре в период плодоношения, снижая урожайность и качество плодов. [Будыкина и др., 2006].

На базе Таджикского аграрного университета им. Ш. Шотемура изучалось влияние различных концентраций регулятора роста Эпин-экстра(р) на коэффициент всхожести и энергию прорастания семян. На следующем этапе интерес состоял в получении ростков, проявляющих устойчивость по отношению к стрессовым факторам, и, следовательно, получении высокого урожая томатов. Изучалось три сорта томата Волгоградский, Асстол и Новичок. При определении энергии прорастания четкой закономерности реакции проростков томата не наблюдалось, что видимо объясняется сортовыми особенностями растения томата и качеством посевного материала (Рис 2). Энергия прорастания сорта Волгоградский значительно ниже сортов Асстол и Новичок. Отклик на внесение концентраций фитогормона (д.в. 0,005; 0,03; 0,5;0,1) также проявлялся разнообразно.



Рисунок 2. Энергия прорастания семян сортов томата в зависимости от концентрации регулятора роста Эпин-экстра (р).

При рассмотрении коэффициента всхожести при воздействии препарата Эпин-экстра(р) установилась некоторая закономерность, увеличение всхожести семян у исследуемых сортов томата наблюдается при концентрациях 0,005 и 0,05%. Научный и практический интерес представляет изучение роста и развития проростов томата под воздействием фитогормонов. Для оценки этих показателей производили измерения длины проростков и корней, их биомассы. Показано, что Эпин-экстра (р) в концентрации от 0,005 до 0,05 эффективно влияет на энергию прорастания семян и получение полноценных ростков, проявляющих устойчивость к стрессовым абиотическим факторам, и способствует повышению урожая томата. В результате лабораторных исследований было установлено, что использование различных концентраций фитогормона не привело к увеличению скорости прорастания семян у семян через два дня после посева [Солиев и др., 2012].

Испытывались регуляторы роста Циркон и Эпин-экстра, микроудобрения Феровит на эфиромасличных культурах с целью повышения урожая и увеличения содержания эфирного масла. Исследователей интересовали такие культуры как мята перечная (Mentapiperita),мелисса лекарственная(Melissaofficinalis), шалфей лекарственный(Salviaofficinalis), тысячелистник обыкновенный (Achilleamillefolium), которые необходимы в парфюмерной, ликеро-водочной, фармацевтической и пищевой промышленности. В ходе исследований были получены следующие результаты. При обработке регуляторами роста, Цирконом и Эпином-экстра, растения мяты наблюдалось увеличение урожая надземной массы на 18-19%; содержание эфирного масла возрастало на 26-35%. Шалфей опрыскивали Цирконом, после чего оба показателя выросли на 35%, у тысячелистника повысилась урожайность на 29%, однако количество эфирного масла осталось на уровне контроля. Для мелиссы было установлено, что в условиях Нечерноземной зоны следует проводить обработку вегетирующих растений регулятором роста Циркон за 7-10 дней до уборки [Пушкина и др., 2010].

Почвенное засоление является одним из часто встречаемых стрессовых факторов. Последствия засоления проявляются в снижении продуктивности агроценозов, в экономических потерях. Одним из потенциальных способов защиты растений от хлоридного засоления является обработка фитогормонами, среди которых наибольший интерес, как отмечают авторы статьи являются брассиностероиды. В статье описывается изучение действия эпибрассинолида при хлоридном засолении, которое обусловлено низким водным потенциалом почвенного раствора, токсичностью ионов и дисбалансом питательных элементов (Рис 3).

Рисунок 3. Суточные проростки редиса.

Длину гипокотиля и корня, содержание фотосинтетических пигментов и пролина в растениях рапса оценивали через неделю (на 7-е сутки) от начала прорастания семени в условиях засоления. Экспериментально установлено, что хлоридное засоление оказывало неблагоприятное воздействие, выраженное в подавлении роста осевых органов рапса, уменьшению накопления фотосинтетических пигментов (хлорофилла а и в, каратиноидов) и стимуляции аккумуляции пролина (в 70 раз). При применении эпибрассинолида (10^-10 и 10^-8М) было отмечена релаксация к засолению. Идет обсуждение возможных механизмов стресс-протекторного действия эпибрассинолида при засолении. Поддержание оптимального водного режима и интактной структуры макромолекул при стрессе - условие выживания растений. Для предотвращения действия стрессовых агентов необходимы индукция синтеза макромолекул или оптимизация среды внутри клетки за счет накопления осмолитов (аминокислоты, сахара, сахаро-спирты и бетаины). В основе формирования этих механизмов адаптации лежит дифференциальная экспрессия генов. При формировании защитных механизмов необходимо сохранение энергетических ресурсов. Авторы статьи предположили, что эпибрассинолид повышал солеустойчивость проростов рапса и в то же время снижал уровень пролина. Вероятно, ЭБЛ способствовал синтезу антиоксидантных ферментов, которые проявляли протекторное действие эффективнее пролина. Также авторы предположили, что иная причина защитного действия эпиббрассинолида заключена в зависимом от действия фитогормона изменении кальциевого гомеостаза, связанное с возможностью растения исключать Na⁺или проявлять резистентность к Na⁺. Снижение токсического действия хлоридного засоления при воздействии брассиностероидов может быть связано с привлечение ионов кальция не только из внутриклеточных пулов, но и из апопласта[Ефимова и др., 2013].

Изучено влияние брассиностероидов на формирование стебля и устойчивость к полеганию ярового ячменя. При проведении обработки семян различных сортов тест-культуры эпибрассинолидом и гомобрассинолидом в концентрации 5-10 мг/л всхожесть семян увеличивается на 20%, что связано с увеличением активности альфа-амилазы эндосперма ячменя. Преимущество брассиностероидов относительно гиббереллина, который также отвечает за индукцию активности альфа-амилазы, что их действие проявляется в концентрации на 2-4 порядка ниже. При опрыскивании растений ячменя была отмечена стимуляция роста стебля и повышение его прочности. Установлено, что в проростках ячменя в зависимости от концентрации регуляторов роста усиливается поступление ионов кальция, а содержание калия уменьшается. При определении содержания белка и крахмала прямой зависимости выявлено не было, действие эпибрассинолида и гомобрассинолида проявлялось в зависимости от сорта растений и фазы их обработки. Автор предполагает, что происходит перераспределение у растения ячменя потока пластических веществ и усиление аттрагирующей способности колоса, особенно боковых колосьев [Агеева, 2000].

24 - эпибрассинолид используют в фитосанитарных технологиях. Биологически активные вещества являются перспективным приёмом снижения вредоносности фитопатогенов. Этот прием получил название фитоиммунокоррекция. Механизм действия эпибрассинолида заключается в его элиситорных свойствах. Брассиностероид, выступая в роли иммунокорректора, вызывает усиление иммунного статуса растения, а также повышает ростовую активность, улучшает качественные показатели, усиливает устойчивость к повреждениям и вредителям. В целом фитоиммунокоррекцию можно отнести к компенсационной защите, при которой комплекс позитивных воздействий на растения определенного средства снижает ущерб, наносимый вредными организмами [Алёхин и др., 2010].

Материалы и методы

Сорные растения - один из основных факторов снижения урожайности сельскохозяйственных культур. В повышении урожайности важное место принадлежит защите от сорной растительности. Гербициды являются агентами высокой опасности для человека и служат основой развития проблем экологического порядка. Исключить негативное влияние гербицидов на растения можно, используя фитогормоны, которые влияют на регуляцию роста растений, оказывая иммунномодифицирующее действие.Фитогормоны не способны защищать растения от сорной растительности, так же, как и гербициды, поэтому разумно их совместное применение [Козлов и др., 2010].

Брассиностероиды (БС) - группа стероидных фитогормонов. В настоящее время препараты на основе брассинолида (БЛ), 24 - эпибрассинолида (ЭБЛ), 28 - гомобрассинолида (ГБЛ), 28-норбрассинолида и других БС под разными торговыми названиями производятся в Китае, Японии, Индии, Беларуси и России. В России в 1995 г. был зарегистрирован препарат эпин-экстра (ННПП «НЭСТ М»), содержащий в качестве действующего вещества высокоочищенный ЭБЛ, синтезированный по оригинальной методике. Данный препарат является одним из немногих современных препаратов нового поколения, созданных с целью повышения урожайности и качества продукции, из числа зарегистрированных и доведенных до стадии практического применения [Будыкина и др. 2012].

Ураган Форте - неселективный, послевсходовый гербицид. Предназначен для сплошного уничтожения однолетних и многолетних сорняков, а также древесно-кустарниковой растительности. Препарат используют при освоении участков, для подготовки участков к посеву следующего года, под газоны, а также вдоль дорожек, заборов, теплиц. Специальная формула обеспечивает наилучшее действие глифосата в разнообразных ситуациях. Принцип действия: гербицид Ураган Форте впитывается в растение через надземные части: листья и стебли. Препарат проникает в растения в течение 2-3 часов и легко перемещается по всему растению, прекращая его рост. Средство от сорняков Раундап нарушает процесс синтеза аминокислот, в результате чего растение погибает. Видимые симптомы проявляются через 7-10 дней, а через 2-3 недели (в зависимости от погодных условий и физиологического состояния растений) происходит полная гибель сорняков. Злаковый сорняк более чувствителен к препарату, чем широколистный. Преимущества гербицида Ураган Форте: препарат нового поколения, один из наиболее эффективных среди различных форм глифосата; не поступает в растения через почву, не препятствует прорастанию семян; средство разлагается на природные вещества: углекислый газ, воду, фосфаты, аммоний. Сорняки, обработанные гербицидом не отрастают вновь. Ураган Форте - глифосат в виде калийной соли, обладающий высокой водорастворимостью, благодаря чему повышается эффективность и скорость воздействия. Состав: ВР, 500 г/л глифосата кислоты. Применение средства от сорняков Ураган Форте: средство применяется с весны до поздней осени по зеленым сорнякам [Бакиров, 2008; Егоров и др., 2010; Стецов, Садовникова, 2013].

Гербицид Глифосат (коммерческое название Roundap, фирма Monsanto) ингибирует ЕПШФ синтазу.Шикиматный путь синтеза ароматических аминокислот. Предшественник образования ароматических аминокислот является эритрозо-4-фосфат и фосфоенолпируват. Эти два соединения конденсируются с формированием циклического дегидрохината, что сопровождается освобождением обеих фосфатных групп. После отщепления воды и восстановления карбонильной группы образуется шикимат.Далее 3-гидроксильная группа защищается посредством фосфорилирования, 5-гидроксильная группа шикимата реагирует с фосфоенолпируватом, что даёт енольный эфир -- 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат (ЕПШФ). Из него в результате отщепления фосфата образуется хоризмат. Хоризмат далее может использоваться в двух путях биосинтеза. Глифосат- структурный аналог фосфоенолпирувата, является очень сильным ингибитором ЕПШФ-синтазы (енолпирувил-шикимат-3-фосфат синтаза). Глифосат специфично ингибирует синтез ароматических аминокислот. Он не оказывает (или лишь слабое действие) действие на другие ферменты. Блокирование шикиматного пути может оказывать на растение летальное действие. Шикиматный путь у животных отсутствует, поэтому негативного влияния не происходит.В почве легко разлагается микоорганизмами. В первом случае у нас специфичное действие Глифосата происходит за счет угнетения синтеза всех 3-х ароматических аминокислот: триптофана и (тирозина+фенилаланина).А во втором случае, синтез триптофана (который идет с участием ЕПШФ-синтазы, но по другому пути нежели триозина и фенилаланина) не ингибируется. Триптофан является прикурсором (предшественником) синтеза фитогормона ауксина. Гормон роста, прежде всего, воздействющий на формирование корневой системы [Хелдт, 2011].

Календула лекарственная - ноготки лекарственные (Calendulaofficinalis) - однолетнее травянистое растение, семействоастровые. У календулы стержневая корневая система, стебель прямостоячий высотой 25 - 75 см, ветвистый почти от основания. Листья очередные, удлиненные (от 2 до 14,3 см), нижние черешковые, верхние сидячие. Цветки собраны в крупные корзинки, достигающие - 9,0 см в диаметре у махровых форм и5,0 см - у немахровых форм. Корзинки расположены одиночно на концах стебля и его разветвлениях. Краевые цветки язычковые, пестичные, оранжево-красной окраски, срединные- трубчатые, тычиночные, оранжевой, бордовой, коричнево-красной окраски. Плоды - семянки разной формы и величины - ладьевидные, серповидные и червеобразные длиной от 2,5 - 14,5 мм. Посевной материал преимущественно состоит из червеобразных семян. Масса 1000 семян составляет 1,5 - 2,5 г.[Карпинская, 2004]. Календула лекарственная широко культивируется как декоративное растение. Влекарственных целях возделываются сорта с махровыми формами цветов оранжево-красного цвета, так как содержание каротина в них в два раза больше, чем в бледно окрашенных цветах. Цветочные корзинки содержат каротиноиды (до 3,2 мг%), эфирные масла (около 0,02 %), дубильные вещества (до 4,45%), витамин С, флавоноиды (до 3,5%) и другие вещества [Ушанова и др., 2001].Препараты на основе цветков данного растения обладают широким спектром биологической активности, включая противовоспалительное, спазмолитическое, желчегонное, противомикробное, успокаивающее, противоотечное, противотоксическое, гипосенсибилизирующее,антимитотическое, репаративное, противовирусное, ранозаживляющее действие[Шарова, Куркин, 2007].Календула нашла широкое применение в народной медицине и в гомеопатии. Используют сырье календулы в косметической и пищевой промышленности. Лекарственное сырье - цветочные корзинки. Цветки ноготков содержат многие ценные для человека биологически активные вещества виолоксантин, лакопин, цитраксантин, рубиксантин, флавоксантин, флавоноиды. Горькое вещество календин -10 %, смолы около 3,4 %, слизь до 4%, яблочную кислоту - 6,8 %, альбумин до 0,64 %, незначительное количество салициловой кислоты, алколоиды, эфирное масло около 0,02 %, придающее цветкам приятный специфический запах. Основные действующие вещества - каратиноиды и флаваноиды. Соцветия накапливают микроэлименты К, Cа., Fе, Mn, Cu, Zn, Mo,Ni, В - 48,40 мг/г.На листья,стебель и соцветия календулы определена биохимаческая характеристика. Сухое вещество составляет 11,3%; моно - сахара 2,24%, сумма сахаров - 3,36%; аскорбиновая кислота - 28,4 мг%; каротин 45, 4 мг% [Карпинская, Сенчило, 2004].

Эксперимент I.

Эксперимент проводился на территории вегетационного домика МГУ 2013 г. Опыт был поставлен следующим образом: в субстрат были высажена рассада календулы сорта махровая, а затем пересажены в сосудысчерноземом. Почва в сосудах - рН 6,5; содержание гумуса 8 %; Р2О5 11, 3 мг/100 г. почвы; К2О 26,8 мг/100 г. почвы. 17 июля (обрабатывали раундапом) 18 июля (обрабатывали эпибрассинолидом) вегетирующие растения были политы растворами: 1В пестицидом раундап, 2В раундап + эпибрассинолид, 3В фитогормоном эпибрассинолид, К - вода соответственно.

На протяжении эксперимента происходила фиксация стадий развития генеративных органов календулы, а именно: появление бутонов, цветков, и количество отцветших экземпляров. Также производилась регулярная фотосъемка каждого из вариантов после внесения активных веществ на протяжении двух месяцев. В связи с длительным вегетационным периодом календулы материал был зафиксирован в конце октября.

В лаборатории под руководством Семеновой Т.А. было определено влияние внесения в почву пестицида и фитогормона на структуру комплекса микромицетов в почве и на листьях календулы. Проведен сравнительный микологический анализ почвы с внесением пестицида раундапа, фитогормона эпинбрассинолида, их комбинации и контрольной почвы, а также анализ эпифитной микобиоты на листьях календулы, выращенной на исследуемых почвах. Численность и видовой состав почвенной микобиоты определяли методом посева из серийных разведений (1:100, 1:1000, 1:10000) на твердую агаризованную среду Чапека; видовой состав грибов на листьях календулы определяли методами влажных камер и отпечатков [Дудка, 1982]. Повторность трехкратная. Видовую идентификацию микромицетов проводили с использованием общепринятых определителей [Domsch, Gams, 1993; Pitt, 1979].

ЭксперименII.

Опыт 1,2

Провести сравнительную характеристику длины проростков семян редиса в зависимости от добавляемых растворов раундапа в различных концентрациях и эпибрассинолида.

Cемена редиса (Raphanussativus, сорт Жара) и ячменя (Hordeumvulgare) замачивали в дистиллированной воде в течение 24 часов. Семена после замачивания распределяли в чашки Петри на фильтровальной бумаге. Заливали 7-ю кубиками раствора с известными концентрациями. Концентрация ЭБЛ была выбрана на основе рекомендации фирмы разработчика препарата ННПП «НЭСТ М» в двух вариантах для сравнения действия на тест-культуры (10^-8 и 10^-9 М). Концентрация гербицида раундап была подобрана в различных вариантах с целью определения рабочей концентрации (0,5; 1; 3; 6 мл/л - 1 опыт и 0,05; 0,1; 0,5 - 2 опыт).Затем семена редиса и ячменя проращивали в термостате при температуре 23С. По прошествии 72 часов учитывали энергию прорастания семян, определяли длину корня и колеоптиля (у редиса) и гипокотиля (у ячменя). Опыт проводили в 3-кратной повторности, в каждой по 10 семян. Биотестирование выполнено в соответствии с методикой «Определение суммарной токсичности почвы, растительной продукции биотестированием», представленной в практикуме по агрохимии, [Минеев и др., 2001]. Для фитогормона была проведена корректировка метода.

Опыт 3. Оценить протекторное действие эпибрассинолида при совместном использовании с гербицидом раундап при различных концентрациях в биотестах.

Cемена редиса (Raphanussativus, сорт Жара) и ячменя (Hordeumvulgare) замачивали в стаканчиках с растворами с известной концентрацией в течение 24 часов. Концентрация ЭБЛ (10^-9 М) и раундапа (0,05 мл/л) была подобрана на основе проведенных опытов 1 и 2. Семена после замачивания распределяли в чашки Петри на фильтровальной бумаге. Заливали 7-ю кубиками раствора,затем семена редиса проращивали в термостате при температуре 23С. По прошествии 72 часов учитывали энергию прорастания семян, определяли длину корня и гипокотиля. Опыт проводили в 3-кратной повторности, в каждой по 10 семян.

II.2. Результаты

Вегетационный экспериментI.



Рисунок 4. Динамика цветения календулы

На графике (Рис. 4.) наибольшее количество цветков в течение всего периода вегетации было зафиксировано в контрольном варианте. В промежутке между первыми числами августа и началом сентября, как видно на графике, четкого распределения между первым, вторым и третьим вариантами не наблюдается. В дальнейшем происходит дифференциация. 1 вариант, в который был внесен только пестицид, отмечен вторым по количеству генеративных органов. Далее идет 3 вариант, в который вносили только фитогормон и 2 вариант с пестицидом и регулятором роста. У варианта 2 на момент фиксации растительного материала отмечено большее количество цветков, чем у 3 варианта. Таким образом, показано, что большее количество цветков календулы мы наблюдаем в вариантах, которые не подвергались обработке пестицидом и/или фитогормоном.

В ходе сравнительного микологичесого анализа почвы с внесением пестицида раундапа, фитогормона эпинбрассинолида, их комбинации и контрольной почвы, а также анализа эпифитной микобиоты на листьях календулы, выращенной на исследуемых почвах эксперимента было выявлено, что в контрольной почве численность микобиоты максимальна и составляет 130 тыс. КОЕ/г почвы, внесение фитогормона не отразилось на численности 125 тыс. КОЕ/г почвы. При внесении пестицида отмечена минимальная численность микобиоты 70 тыс. КОЕ/г почвы. В почве, где пестицид и контроль были внесены комбинированно численность микобиоты составила 100 тыс. КОЕ/г почвы. Наиболее встречаемые виды: Clonostahiysrosea и Rhisopusarrhisus. При анализе эпифитной микобиоты на листьях показано различие видового разообразия грибов на растении и в почве. Максимальное разнообразие отмечено в контрольном образце, немного ниже при добавлении пестицида, и значительное снижение видового разнообразия грибов наблюдается в вариантах, где вносился фитогормон. Снижение числа видов эпифитных грибов, которые могут оказывать патогенное воздействие на растение, возможно свидетельствует о повышении устойчивости растения к заболеваниям, вызываемых грибами. Наиболее встречаемые видыCladospirumcladospories, Alternariaalternate, Aureobasidiumpullulans. (Табл. 2.)

Таблица 2. Структура почвенной и эпифитной микобиоты.

№ пробы	1		2		3		4
Варианты	пестицид	пест.+фитогорм.	фитогормон	контроль
Субстрат	почва	лист	почва	лист	почва	лист	почва	лист
тыс.КОЕ/г.почвы	70		100		125		130
числовидов	6	6	4	4	4	4	7	8
Alternariaalternata		+		+		+	5	+
Aspergilluscandidus					25
Aureobasidiumpullulans		+		+		+		+
Botrytis cinerea						+
Cladosporiumcladosporioides		+++		+++		+++		+++
Clonostachysrosea	35		80		85		65
Cylidrocarpondidimum							10
Fusariumpoae				+
Fusarium sp.	5							+
Penicilliumjanczewskii					5		25
Penicilliumvulpinum							10
Penicillium sp. 1	5
Penicillium sp. 2		+						+
Phoma sp.	5	+
Rhizopusorizae	10		5		10		10
Talaromycespurpurogenus	10
Trichodermaatroviride		+	10				5	+
Неидентифированныймикромицет			5

Лабораторный эксперимент II.

Опыт 1.

При подборе рабочей концентрации раундапа для последующих опытов, был обнаружен токсичный эффект на растение. Ураган, при наименьшей концентрации действующего вещества глифосат 0,5 мг/мл оказал ингибирующее действие 65% на длину корня. Результаты, полученные при добавлении более высоких концентраций пестицида, имеют близкие значения. Диапазон ингибирующего действия не превышает 13%. Токсичное действие, оказанное на среднюю длину корней редиса при концентрациях 1 мг/мл и 3 мг/мл,6 мг/мл составляет 65%, 72% и 78% соответственно. Для растения ячменя влияние раундапа было оказано иначе. Если у корней редиса токсических эффект проявился не дифференцировано относительно концентраций, то относительно длины корней ячменя отмечается четкая зависимость - чем выше концентрация 0.5мг/мл, 1 мг/мл и 3 мг/мл,6 мг/мл, тем выше, оказываемый эффект гербицидом 27%, 48%, 88% и в последнем варианте ячмень не пророс из-за слишком высокой концентрации раундапа. Так же прямо пропорционально увеличение пестицидной нагрузки сказывалось на длине колеоптиля редиса. Ингибирующий эффект, оказываемый пестицидом, превысил допустимые значения для последующего применения рассматриваемых концентраций.

брассиностероид пестицид раундап растение

Рисунок 5. Длина корней редиса (%) по биотесту 1

Рисунок 6. Длина корней ячменя (%) по биотесту 1

Рисунок 7. Длина колеоптилей редиса (%) по биотесту 1

Опыт 2

Эпин-экстра в концентрациях 10^-8 и 10^-9 М активизировал рост проростков редиса в условиях оптимальной температуры и проращивания в дистиллированной воде. По сравнению с контролем средняя длина корня увеличилась на 13% и 20% соответственно. При применении эпина-экстра было отмечено стимулирующее действие брассиностероида. В этом опыте необходимо было рассмотреть ингибирующее действие инсектицида при проращивании семян в растворах с соответствующими концентрациями глифосата. В связи с тем, что в опыте 1 отмечен высокий токсичный эффект, была включена пониженная концентрация действующего вещества пестицида, составляющая 0,05 мг/мл и 0,1мг/мл. Ингибирующее действие, оказываемое пестицидом составило для средней длины корня 53%, 63%, 57% для концентраций 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл соответственно. Токсичный эффект при концентрациях 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл ранжирован не значительно. Диапазон ингибурующего действия составляет 10%. Наиболее выражено токсичный эффект проявляется при концентрации 0,1 мг/мл.

Рисунок 8. Длина корней редиса (%) по биотесту 2

Опыт 3

При выполнении опыта 1 и 2 токсичный эффект, оказываемый на проростки редиса, оказался высоким. В связи с этим для опыта 3 концентрация глифосата была выбрана с самым низким значением 0,05 мг/мл. Рассмотрим воздействие фитогоромона и/или пестицида на длину корней редиса. В случае изначального замачивания семян в контроле и последующем проращивании в растворе глифосата наблюдается токсическое действие пестицида, составляющее 40%. Эпин-экстра оказал стимуляцию 20% в варианте, в который изначально добавили гормон роста, а затем проращивали в контроле; в другом варианте, где также первоочерёдно добавляли фитогормон, но в при распределении семян в чашки Петри заливали раствором раундапа. В данном случае проявился ингибирующий эффект 25%.При сопоставлении двух вариантов, где в первом случае семена замачивали в контроле, а во втором в фитогормоне, затем оба варианта проращивались при пестицидной нагрузке, регулятор роста проявляет протекторное действие 15% относительно первого варианта. Основываясь на данных, полученных в ходе эксперимента, можно сделать предположение, что действие эпибрассинолида наиболее эффективно проявляется после стрессовой нагрузки. В варианте, где семена изначально замачивали в раундапе, а потом заливали раствором эпибрассинолида протекторное действие относительно контроля составило 105%. При замачивании семян в раундапе, и распределении на контроль происходит стимуляция роста корней 50%. Возможно это связано с тем, что пестицид оказал ингибирующего эффекта на ЕПШФ-синтазу,но синтез триптофана не был затронут, более того, так как в результате отмечена стимуляция корней, можно предположить, что глифосат способствовал более активному синтезу аминокислоты триптофана.

Рисунок 9. Длина корня редиса (%) по биотесту 3

Проанализировали воздействие фитогоромона и/или пестицида на длину гипокотиля ячменя. В случае изначального замачивания семян в контроле и последующем проращивании в растворе глифосата наблюдается токсическое действие пестицида, составляющее 15%. Эпин-экстра оказал стимуляцию 25% в варианте, в который изначально добавили гормон роста, а затем проращивали в контроле; в другом варианте, где также первоочерёдно добавляли фитогормон, но в при распределении семян в чашки Петри заливали раствором раундапа такжепроявился стимулирующий эффект 5%, близкий со значением контроля. При сопоставлении двух вариантов, где в первом случае семена замачивали в контроле, а во втором в фитогормоне, затем оба варианта проращивались при пестицидной нагрузке, регулятор роста проявляет протекторное действие 20% относительно первого варианта. Основываясь на данных, полученных в ходе эксперимента, можно сделать предположение, что действие эпибрассинолида наиболее эффективно проявляется после стрессовой нагрузки. В варианте, где семена изначально замачивали в раундапе, а потом заливали раствором эпибрассинолида протекторное действие относительно контроля составило 20%. При проведении биотестирования 2 токсический эффект проявился только в варианте, где семена замачивались в контроле, а затем проращивались при воздействии раствора раундапа. При замачивании семян в раундапе, и распределении на контроль ингибирующий эффект составляет лишь 2%.

Рисунок 10. Длина гипокотиля ячменя (%) по биотесту 3

Оценили воздействие фитогоромона и/или пестицида на длину корней ячменя. В случае изначального замачивания семян в контроле и последующем проращивании в растворе глифосата наблюдается токсическое действие пестицида, составляющее 48%, что на 8% больше чем у корней редиса. Эпин-экстра оказал стимуляцию 19% в варианте, в который изначально добавили гормон роста, а затем проращивали в контроле; в другом варианте, где также первоочерёдно добавляли фитогормон, но в при распределении семян в чашки Петри заливали раствором раундапа. В данном случае проявился ингибирующий эффект 34%. При сопоставлении двух вариантов, где в первом случае семена замачивали в контроле, а во втором в фитогормоне, затем оба варианта проращивались при пестицидной нагрузке, регулятор роста проявляет протекторное действие 14% относительно первого варианта. Основываясь на данных, полученных в ходе эксперимента, можно сделать предположение, что действие эпибрассинолида наиболее эффективно проявляется после стрессовой нагрузки. В варианте, где семена изначально замачивали в раундапе, а потом заливали раствором эпибрассинолида протекторное действие относительно контроля составило 11%.При замачивании семян в раундапе, и распределении на контроль происходит стимуляция роста корней 20%. При сопоставлении данных, полученных в ходе биотестирования двух тест-культур редиса и ячменя действие, оказываемые фитогормоном и/или пестицидом оказали весьма близкие значения.

Рисунок 11.Длина корня ячменя (%) по биотесту 3



Выводы

· Эпибрассинолид имеет широкий спектр протекторного действия в условиях абиотических стрессов.

· В настоящее время вопрос совместного использования эпибрассионолида с пестицидам мало освещен в научной литературе, что позволяет сделать заключение об актуальности продолжения дальнейших исследований.

· С лекарственной культурой в вегетационном эксперименте использование гербицида и фитогормона на динамику цветения календулы не установлено.

· Экзогенное внесение фитогормона в почву восстановило почвенную микобиоту после применения пестицида.

· ЭБ в конценрации 10^-9 М стимулировал показатели тест-систем в биотестах.

· Действие Раундапа (0,05 мг/л) было не однозначно, в зависимости от способа его использования в фитотесте.



Список литературы

1. AhmadiMousavi E., ManochehriKalantari K., Jafari S. R. Change of Some Osmolytes Accumulation in Water-Stressed Colza (Brassica Napus L.) as Affected by 24-Epibrassinolide // Iranian Journal of Scince& Technology. 2009. Vol. 33. № А1. P. 1-11.

2. Delmail D., Labrousse P. Plant Ageing, a Counteracting Agent to Xenobiotic Stress // Senescence. 2012. Р. 89-106.

3. Domsh K.H., Gams W. Compendium of soil Fungi. IHW-Verlag. 1993 860 P.

4. Pitt J.I. The Genus Pennicillium and its teleomorphic states Eupeniccilium and Talaromyces. L.:Acad.press. 1979. 634 P.

5. Агеева Л.Ф. Влияние брассиностероидов на формирование стебля и устойчивость к полеганию ярового ячменя. Москва. 2000. С.98

6. Алехин В.Т., Рябчинская Т.А., Бобрешова И.Ю., Харченко Г.Л., Саранцева Н.А. Новый препарат для стимуляции иммунитета и повышения продуктивности растений // Защита и карантин растений. 2010. № 3. С. 44-46.

7. Бакиров Ф.Г. Эффективность осеннего применения гербицида раундап при выращивании яровой пшеницы по стерне в засушливой степи Оренбуржья // Известия Оренбургского государственного аграрного университета №2(18). 2008. С 19-20.

8. Будыкина Н. П., Шибаева Т. Г., Титов А. Ф. Влияние эпина экстра - синтетического аналога 24-эпибрассинолида на стрессоустойчивость и продуктивность растений огурца (CucumissativusL.) // Труды Карельского научного центра РАН. 2012. №2. С. 47-55.

9. Будыкина Н.П., Алексеева Т.Ф., Гоголева Т.С., Малеванная Н,Н. Применение эпина экстра на культуре томата в пленочных теплицах в Карелии // Гавриш №3/2006 С. 18-20.

10. Ганс-Вальтер Хелдт Биохимия растенийМ.: Издательство Бином, 2011.

11. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова думка. 1982. 550 С.

12. Егоров А.Б., Бубнов А.А. Павлюченкова Л.Н. Гербициды для борьбы с борщевиком сосновского // Защита и карантин растений. 2010. №3. С 74-75.

13. Ефимова М.В., А.В. Мануйлова, Малофий М.К., Карташов А.В., Кузнецов В.В. Влияние брассиностероидов на формирование защитных реакций проростков рапса в условиях засоления // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013 №1 (21) С. 118-128.

14. Захаренко А.В., Белопухов С.Л., Дмитревская И.И., Разумеева Л.П. Влияние защитно-стимулирующих комплексов на урожай льна и качество волокна // Достижения науки и техники АПК, №9-2009 С. 34-37.

15. Карпинская Е.В. Влияние густоты посадки на продуктивность соцветий календулы лекарственной // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы. Материалы II международной конференции Минск. 2004. С. 170-172.

16. Карпинская Е.В., Сенчило В.И. Биохимический состав надземной фитомассы календулы лекарственной в зависимости от уровня минерального питания // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы. Материалы II международной конференции Минск. 2004. С.172-173.

17. Козлов Ю.В., Самсонова Н.Е., Новикова Н.Е. Сравнительная оценка Мивала-Агро, брассиностероидных препаратов и протравителя семян при выращивании яровых зерновых на дерново-подзолистой почве // Вестник ОрелГАУ. 2010. №2(23). С. 54-59.

18. Кулаева О. Н., Кузнецов В. В. Новейшие достижения и перспективы изучения механизма действия фитогормонов и их участия в сигнальных системах целого растения // Информационный биллютень РФФИ. 2004. Приложение №12.

19. Минеев В. Г., Сычев В. Г., Амельянчик О.А., Болышева Т.Н., Гомонова Н. Ф., Дурынина Е. П., Егоров В. С., Егорова Е. В., Едемская Н. Л., Карпова Е. А., Прижукова В. Г. Практикум по агрохимии. М.: Издательство МГУ, 2001.

20. Пушкина Г.П., Маланкина Е. Л., Тхаганов Р.Р., Морозов А.И. Эффективность применения регуляторов роста и микроудобрений на эфиромасличных культурах // Достижения науки и техники АПК, №07-2010 С. 17-19.

21. Скапцов М.В., Куцев М.Г. Влияние 24-эпибрассинолида на продолжительность культивирования щавеля (RumexacetosaL.) invitro // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. №2(22) С.52-56

22. Солиев Ш.Т, Расулов Б. Р., Алиев К. Влияние регулятора роста эпин-экстра(р) на посевные качества и формирование проростков томата // Известия академии наук республики Таджикистан отделение биологических и медицинских наук №2 (179), 2012 С. 66-72.

23. Стецов Г.Я., Садовникова Н.Н. Применение раундапа в паровом поле для борьбы с вьюнком полевым (СonvolvulusarvansisL.) // Вестник Атайского государственного аграрного университета №8(106). 2013. С. 5-7.

24. Ушанова В.М., Воронин В.М., Репях С.М. Исследование влияния компонентов лекарственного растительного сырья на состав получаемых экстрактов // Химия растительного сырья. 2001. №3. С.105-110.

25. Чуб В. В. Глава 7 "Рост и развитие растений" учебника кафедры физиологии растений МГУ им. Ломоносова [Электронный ресурс] // http://herba.msu.ru: [сайт]. URL: http://herba.msu.ru/ russian/departments/physiology/spezkursi/chub/7-2-8-1.html (дата обращения: 24.08.2013).

26. Шакирова Ф. М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и её регуляция / Уфа: Гилем, 2001. 160 с.

Размещено на Allbest.ru