Размещено на http://allbest.ru

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

УДК 619:576.851.45:636.21

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТА КЛІНІКО-ЕПІЗООТОЛОГІЧНЕ ЗНАЧЕННЯ P.MULTOCIDA В РЕСПІРАТОРНІЙ ПАТОЛОГІЇ ТЕЛЯТ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

ЗАБОЛОТНЯ ВАЛЕНТИНА ПАВЛІВНА

Харків - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Кримському державному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, професор Ковальов Василь Львович, Кримський державний аграрний університет,

завідувач кафедри мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти доктор ветеринарних наук, професор Апатенко Володимир Максимович, Харківська державна зооветеринарна академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології і основ ветеринарної справи

кандидат ветеринарних наук, доцент Доценко Валерій Олександрович, Луганський національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології і фармакології

Провідна установа Білоцерківський державний аграрний університет, кафедра мікробіології, вірусології та зоології, м. Біла Церква

Захист дисертації відбудеться “ 12 ” червня 2002 р. о 13єє годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, Харків, вулиця Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, Харків, вулиця Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “ 7 ” травня 2002 р.

Вчений секретар

доктор ветеринарних наукА.Ф.Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з головних умов успішного розвитку тваринництва є ефективна боротьба з інфекційними захворюваннями тварин, і зокрема захист молодняка від респіраторних інфекційних хвороб (Ковалёв В.Л., 1997, 1999; Завірюха А., 1999; Лемещенко Г. та ін., 1999).

У телят 1-6 місячного віку в структурі захворюваності переважають респіраторні хвороби вірусної та бактеріальної етіології (Апатенко В.М., 1991, 1998; Ковалёв В.Л., Гуренко И.А., 1999; Кучерявенко Л.І., Стеценко В.І., 2000; Eriksen L. e.a., 1999). Вважається, що найбільш важкі форми бронхо-легеневої патології викликають бактерії, які ускладнюють вірусні, хламідійні й мікоплазменні інфекції, і зумовлюють важкий перебіг асоційованих бронхопневмоній з летальним кінцем (Атамась В.А., 1989; Апатенко В.М., 1995; Erler W. e.a., 1980, 1997; Aalback B. e.a., 1999).

Експериментально встановлено, що в 80% випадків первинних бактеріальних пневмоній у телят перших місяців життя обумовлені P.multocida (Джупина С.И., Колосов А.А., 1992; Шегидевич Э.А., 1993; Мазур Т.В., 1996; Масимов Н.А., 1998; Девришов Д.А., 2000; Dabo S. e.a., 1997; Sanger H., 1998).

Найбільш розповсюдженими формами пастерельозів серед телят є легеневий пастерельоз, обумовлений P.multocida серотипами Д і А та геморагічна септицемія, викликана серотипом В (Конопаткин А.А., Владимиров В.В., 1993; Душук Р.В. и др., 1998; Carter G.R. e.a., 1981; Dorobantu R., 1989). Значне розповсюдження пастерельозної інфекції зумовлено високою чутливістю тварин до збудника, широкою циркуляцією пастерел серед сприйнятливого поголів'я та тривалим пастерелоносійством, а також недосконалістю засобів специфічної профілактики й заходів боротьби (Бакулов И.А., 2000; Hunt M.L. e.a., 2000).

Незважаючи на досягнення у вивченні інфекційної респіраторної патології телят, багато питань етіологічної структури, патогенезу та епізоотичного значення бактеріальних патогенів, і насамперед P.multocida, як домінуючого бактеріального етіофактора бронхопневмоній вивчені недостатньо (Ярцев М.Я., 1996, 1998; Юров К.П., 1999; Borkowska-Opacka B. e.a., 1999). Подальше ретельне вивчення етіопатогенезу, епізоотології легеневих пастерельозів телят та біологічних властивостей збудника, як однієї з найбільш важливих нозологічних складових при змішаних інфекційних захворюваннях респіраторної системи, має важливе наукове і практичне значення в удосконаленні діагностики та профілактики хвороби.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконувалась згідно тематичного плану Кримського ДАУ “Науково-обгрунтована система ведення сільського господарства в Криму в період виходу з кризи і переходу до ринку” (Розділ 5/5), затвердженого 26 січня 1995 р. (1995-2000). Держреєстрація №0199И004288.

Мета і задачі досліджень. Метою роботи було визначення етіологічної ролі P.multocida при респіраторній патології телят в тваринницьких господарствах і вивчення біологічних властивостей збудника та клініко-епізоотологічних особливостей легеневого пастерельозу. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

Визначити етіопатогенетичне значення P.multocida при масових респіраторних захворюваннях телят 1-6 місячного віку.

Вивчити клініко-епізоотологічні особливості легеневих пастерельозів телят у тваринницьких господарствах.

Виготовити гіперімунні діагностичні сироватки на капсульні та соматичні антигени P.multocida для серологічної типізації збудника в РНГА та РА.

Виділити культури P.multocida від хворих тварин і вивчити основні біологічні властивості в порівнянні з референтними штамами.

Розробити способи тривалого збереження епізоотичних культур P.multocida з метою запобігання дисоціації збудника при пересівах.

Об'єкт дослідження - клініко-епізоотологічні особливості захворювання телят на легеневий пастерельоз.

Предмет дослідження: етіопатогенетичне значення P.multocida в респіраторній патології телят і вивчення біологічних властивостей збудника легеневого пастерельозу, серологічна типізація виділених культур, моніторинг епізоотичного стану в господарствах, а також бактеріологічна ізоляція польових культур пастерел і розробка методів їх тривалого збереження.

Методи досліджень. В роботі використовували бактеріологічні (індикація та ідентифікація виділених культур), серологічні (РНГА і РА, капсульні антигени готовили по Iordache A. e.a., 1980, а соматичні по Namioka S. & Murata M., 1964), патологоанатомічний методи та біохімічно досліджували сироватки крові від хворих телят по І.П.Кондрахіну (1997). Статистичні методи (аналіз вірогідності експериментальної вибірки генеральної сукупності даних) проводили за допомогою методичних посібників І.П. Ашмаріна (1961) і Г.Ф. Лакіна (1990).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено етіопатогенетичне значення P.multocida при респіраторних захворюваннях телят 1-6 місячного віку в господарствах Херсонської області та АР Крим. Показана домінуюча етіологічна роль цього збудника у виникненні первинних специфічних бронхопневмоній телят. Установлені клініко-епізоотологічні особливості перебігу легеневих пастерельозів в тваринницьких господарствах, стадійність розвитку змішаних респіраторних хвороб телят, яка пов'язана зі зміною вірусно-бактеріальних асоціацій. Визначено серотипову належність пастерел, які беруть участь в епізоотичному процесі легеневих форм пастерельозу. Виявлено неоднорідність польових культур пастерел по капсульним і соматичним антигенам збудника, що циркулює в неблагополучних по респіраторним хворобам господарствах. Показано залежність між ступенем вірулентності і тканинним тропізмом збудника, а також пригнічення імунної реактивності макроорганізму під впливом P.multocida.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені способи збереження нативних біологічних властивостей пастерел на тривалий час (до 2 років і більше) методами кріоконсервації та ліофілізації, що необхідно для використання епізоотичних і виробничих штамів збудника, при виготовленні протипастерельозних вакцин. Розроблено та впроваджено методичні рекомендації по ліофілізації пастерел. Запропоновано 2 варіанта кількісного обліку пастерел у суспензіях методом посіву десятикратних розведень на елективні живильні середовища. На 5% кров'яному МПА підраховували колонії і виражали концентрацію пастерел в КУО/см³, в бульйоні Хотингера враховували помутніння та прозорість бульйону, результат логарифмували й виражали в НВЧ/см³. Застосовано серологічний моніторинг в РНГА з виготовленими нами капсульними еритроцитарними діагностикумами для визначення епізоотичної ситуації по легеневому пастерельозу телят. На капсульні та соматичні антигени одержано гіперімунні діагностичні сироватки, які застосовували для типізації антигенної структури P.multocida серотипів А, В і Д.

Результати та висновки дисертаційної роботи щодо біологічних властивостей P.multocida, клінічних особливостей перебігу хвороби в різних вікових групах, епізоотологічного моніторингу легеневого пастерельозу з використанням РНГА, ізоляції та серотипізації пастерелл, вивчення вірулентності на лабораторних тваринах, а також патогенної дії різних серотипів P.multocida на телятах використовуються для підготовки студентів у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача полягає у безпосередньому виконанні всього обсягу наукових експериментів, епізоотологічних, серологічних, бактеріологічних і патологоанатомічних досліджень, статистичній обробці та аналізу первинних даних, формулюванні наукових положень і висновків.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися та обговорювалися на засіданнях Вченої Ради факультету ветеринарної медицини Кримського ДАУ (1999-2001), науковій сесії Россільгоспакадемії (м. Москва, 1999), Кримській республіканській науковій конференції “Актуальні проблеми АПК Криму” (м. Сімферополь, 1999), Міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарна наука на порозі XXI століття” (м. Харьків, 2000), Всеросійській конференції “Наукові основи виробництва ветеринарних біологічних препаратів” (м. Щьолково, 2000), Міжвузівській науковій конференції “Проблеми АПК у роботах учених Криму” (м. Сімферополь, 2000), Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарного обслуговування свійських тварин”(м. Київ, 2001), розширеному засіданні кафедри мікробіології та вірусології Кримського ДАУ (м. Сімферополь, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, з них 9 у фахових виданнях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація об'ємом 142 сторінки комп'ютерного тексту, містить 32 таблиці, 4 рисунки, 2 фотографії. Робота складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, власні дослідження (3 розділи), їх аналіз і узагальнення, висновки, пропозиції виробництву, список використаної літератури, що містить 309 джерел, у тому числі 119 іноземних авторів, додатки.

біологічний тварина респіраторний хвороба

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Робота виконувалась протягом 1998-2001 років на кафедрі мікробіології та вірусології Кримського державного аграрного університету, в бактеріологічному відділі Кримської республіканської державної лабораторії ветеринарної медицини, в бактеріологічному відділі Кримської дослідної станції ІЕКВМ і в 4-х господарствах Херсонської області (КСП “Україна” та КСП “Росія”) і АР Крим (учгосп “Комунар” та КСП “Пригородне”). Вивчили біологічні властивості польових культур P.multocida, які були ізольовані від телят з респіраторним синдромом, в порівнянні з референтними штамами пастерел серотипів А, В і Д.

Для культивування P.multocida використовували елективні живильні середовища - бульйон Хотингера та 5% кровяний МПА. Підтримували культури в умовах лабораторії протягом 6-8 місяців з періодичними пересівами в напіврідкий агар через кожні 4-6 тижнів.

При вивченні культуральних властивостей пастерел визначали кількість живих мікробних клітин (ЖМК) в суспензіях квантально-альтернативним титруванням і виражали в найбільш вірогідному числі (НВЧ) та посівом десятикратного розведення на 5% кровяний МПА і виражали в колонієутворюючих одиницях (КУО), а також розраховували час генерації бактеріальних культур в експоненційній фазі росту.

Ферментативні властивості пастерельозних культур вивчали загальноприйнятими методами, досліджували склад гліколітичних і протеолітичних ферментів.

Для зберігання бактеріальних культур на довгостроковий термін застосували метод кріоконсервації у кріопротекторах і метод ліофілізації збудника пастерельозу в захисно-суспензійних середовищах висушування.

Добові бактеріальні культури суспендували в цукрово-желатиновому середовищі висушування з гідролізованим желатином, розливали в ампули по 1см³, проморожували при -52єС протягом доби та сублімували 32 години на установці для ліофілізації. Життєздатність ліофілізованих препаратів вивчали культуральним методом на кров'яному МПА і виражали у відсотковому відношенні до вихідної бактеріальної суспензії. Залишкову вологість ліофілізованих культур визначали прискореним методом.

Всього було досліджено 528 хворих телят клініко-епізоотичними методами. Пневмонію визначали клінічними методами та біохімічним тестом сироватки крові по І.П. Кондрахіну (1997). Для індикації та ідентифікації бактеріальних збудників бронхопневмоній провели бактеріологічне дослідження (загальновідомими методами) 300 зразків досліджуваного біоматеріалу від померлих, вимушено-забитих та клінічно здорових телят 1-6 місячного віку.

Видову належність бактерій встановлювали по визначнику Bergey (1997). З метою визначення вірулентності польових ізолятів збудників бронхолегеневих захворювань телят, інфікували 1224 безпорідних білих мишей вагою 16-18г. Пастерелоносійство у тварин визначали методом біопроби на білих мишах.

При порівняльному вивченні біологічних властивостей (визначенні LD₅₀ по Керберу-Ашмаріну) польових культур і референтних штамів P.multocida використовували для інфікування 240 безпорідних білих мишей вагою 16-18г, 104 кроля породи шиншила вагою 1,5-1,8 кг, 96 короткошерстних морських свинок вагою 250-280г та 64 курчат 120-денного віку. При вивченні імуносупресивних властивостей польових культур P.multocida використовували 56 кролів породи шиншила вагою 3,0-3,5 кг.

З метою отримання діагностичних пастерельозних сироваток гіперімунізували референтними штамами 36 кролів породи шиншила вагою 3,0-3,5 кг. Для цього приготували капсульні (Iordache A. e.a., 1980) та соматичні (Namioka S. & Murata M., 1964) антигени. Типування культур пастерел і серологічну діагностику пастерельозу проводили в РНГА і РА. Додатково сероваріантну належність пастерел визначали в тесті серозахисту на білих мишах із гіперімунними сироватками (Масимов Н.М., 1992).

Біометричну обробку отриманого цифрового матеріалу проводили з використанням методичних посібників І.П. Ашмаріна (1961) і Г.Ф. Лакіна (1990). Визначали середні величини виборок (арифметичні та геометричні), їх статистичні помилки та вірогідний інтервал із рівнем значимості оцінок до Р<0,01.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Оптимізація умов культивування та зберігання P.multocida, приготування гіперімунних діагностичних сироваток

Для визначення елективних живильних середовищ, культури P.multocida серотипів А, В і Д засівали в рідкі та щільні середовища, культивували 12 годин при 37?С і визначали кількість бактерій.

Кращим рідким середовищем для пастерел був бульйон Хотингера, а щільним - кров'яний агар.

Культуральні властивості P.multocida вивчали в бульйоні Хотингера, визначали швидкість росту культур і термін генерації (табл.1).

Таблиця 1

Порівняльна характеристика накопичення референтних штамів P.multocida в бульйоні Хотингера, НВЧ (lg/см³)

Дані таблиці 1 свідчать, що серотип В має найбільшу тенденцію росту та накопичувальну активність, серотип А зростає повільніше, серотип Д має найменшу енергію росту. Це положення підтверджується розрахунковими даними терміну генерації культур. Розрахункова тривалість одного поділу (генерації) серотипу В становила 22 хвилини, серотипу А - 30 хвилин, серотипу Д - 100 хвилин.

Продовжуючи аналіз таблиці 1 можна відзначити, що експоненційний період для серотипу В закінчився через 7 годин культивування, серотипу А - 8 годин, серотипу Д - 9 годин. В наступні часи кількість живих мікробних клітин (ЖМК) не збільшилась протягом усього терміну спостереження - 48 годин.

Спостереження за ростом P.multocida в рідких живильних середовищах свідчать, що пастерели швидко ростуть. Бульйонні культури починають старіти з 24-36 години, в них швидко розвивається дисоціація. Робота з дисоційованими культурами не коректна, тому в наших дослідженнях ми користувалися 12-24 годинними культурами пастерел у бульйоні Хотингера.

У зв'язку з зазначеним, ми провели порівняльне випробовування трьох способів зберігання культур пастерелл: метод періодичних пересівів у напіврідкий агар (НРА), кріоконсервація та ліофілізація.

Найбільш простим способом тривалого підтримування P.multocida є метод періодичних пересівів в НРА. Ми провели 14 таких пасажів із пересівами через 4 тижні. Через 6 місяців пасажування знизилася життєздатнісь культур і з'явилися ознаки дисоціації. При подальшому пасажуванні дисоційованих культур на безсироваткових середовищах відбулося її відмирання. Серотип В загинув через 9 місяців періодичних пересівів, серотип А - через 11 місяців, серотип Д - через 13 місяців.

Другий спосіб зберігання культур пастерел, який ми випробували - це кріоконсервація. Як кріопротектор використовували 30% стерильний гліцерин, стерильну дефібриновану кров барана та стерильну нативну кров морської свинки, взятої ex tempore. Через рік зберігання культури повністю відновлювали свої вихідні властивості. Різниці в захисній дії кріопротекторів не виявлено, але 30% гліцерин був більш зручнішим.

При ліофілізації P.multocida, яку проводили в технологічному режимі прийнятому в біопромисловості для сушки ентеробактерій, випробовували 5 варіантів протективних наповнювачів - 15% сироватку крові великої рогатої худоби, знежирене молоко, цукрозо-желатинове (ЦЖ), цукрозо-желатиново-агарове (ЦЖА) та середовище висушування, де желатину гідролізували.

Установлено, що найкращі захисні властивості мало середовище висушування, де желатинозу гідролізували. В ній після ліофілізації залишалось 78% життєздатних бактерій з вихідної кількості. В інших середовищах виживання було нижчим і складало відповідно: 68% в ЦЖА; 62% в ЦЖ; 38% у знежиреному молоці та 36% в 15% сироватці крові великої рогатої худоби.

В середовищі висушування, де желатину гідролізували, референтні штами P.multocida висушували і зберігали при 4-6?С протягом двох років (термін спостереження). Культури повністю відновлювали свої біологічні властивості.

Наступним етапом нашої роботи було приготування діагностичних гіперімунних сироваток на капсульні (К-АГ) та соматичні (О-АГ) антигени з референтних штамів пастерел. Для отримання антисироваток підібрали 6 груп кроликів вагою 3,0-3,5 кг. Їх гіперімунізували культурою P.multocida згідно загальноприйнятих схем по Iordache A. e.a. (1980) і Сидорову М.А. та ін. (1984). Капсульні антигени готували по методу Carter G. (1955), соматичні - по методу Namioka S. & Murata M. (1964).

Після закінчення гіперімунізації кроликів знекровлювали і готували сироватки. Активність та специфічність сироваток перевіряли в серологічних реакціях. В РНГА гомологічні сироватки з К-АГ реагували на ++ у розведенні 1:64-1:128, гетерологічні сироватки - 1:2-1:4. В РА гомологічні сироватки з О-АГ реагували на ++ у розведенні 1:1600-1:3200, гетерологічні - 1:25-1:50. Сироватки консервували 3% розчином борної кислоти і зберігали в холодильнику при 4-6?С.

Епізоотологічний моніторинг бактеріальних респіраторних хвороб телят у господарствах Херсонської області та АР Крим

Вивчення етіологічної структури респіраторних захворювань телят 1-6 місячного віку провели в 4-х господарствах Херсонської області та АР Крим.

У місячному віці, після переводу телят із профілакторія в телятник, у структурі загальної захворюванності переважали респіраторні інфекційні хвороби, від легких форм гострих респіраторних захворювань до пневмоній з летальним кінцем.

Для оцінки загальної епізоотичної ситуації по легеневим пастерельозам провели серологічний моніторинг. В кожному господарстві відібрали по 30 телят-аналогів за віком 2-4 місяці та досліджували сироватку крові на наявність антитіл до капсульного антигену P.multocida в РНГА. Антитіла до К-АГ пастерел виявили у 85-94% телят з титрами в РНГА від 1:2 до 1:64, при цьому середній геометричний титр по серотипу А склав 2,85±0,22 log₂ або 1:7,5 (n=106); по серотипу В - 2,94±0,22 log₂ або 1:7,5 (n=102); по серотипу Д - 3,01±0,21 log₂ або 1:8 (n=113). Отримані дані свідчать про напруженність епізоотичної ситуації по легеневому пастерельозу та про те, що в досліджуваних господарствах циркулюють всі три серотипи пастерел.

Для визначення видового складу збудників пневмоній провели бактеріологічне дослідження патологічного матеріалу від телят у віці 1-6 місяців, хворих на пневмонію. Патологічний матеріал відбирали в чотирьох господарствах протягом двох років. Усього було досліджено 226 хворих на пневмонію телят. Із них загинуло 27 телят (11,9%) у віці 1-3 місяці від гострого перебігу бактеріальних пневмоній; 73 тварини (32%) були вимушено забиті в 2-4 місячному віці з тієї ж причини та 126 телят (55,8%) були забиті як санітарний брак через хронічний перебіг пневмоній.

Узагальнені дані бактеріологічного дослідження патологічного матеріалу від хворих на пневмонію телят наведені на секторних діаграмах. Від телят, які загинули в 1-3 місячному віці що хворіли прогресуючими пневмоніями з гострим перебігом виділили 66,7% культур P.multocida, 11,1% P.haemolytica, 7,4% Ps.aeruginosa та 14,8% Str.pneumonia. Від вимушено забитих телят 2-4 місячного віку, які хворіли прогресуючими гострими та підгострими пневмоніями виділили 75,3% культур P.multocida, по 8,2% P.haemolytica та Str.pneumonia, по 4,1% Ps.aeruginosa та Staph.aureus (рис.2). У 4-6 місячних телят, що хворіли на хронічні пневмонії виділяли більш різноманітну мікрофлору: 38,8% P.multocida, 17,5% Ps.aeruginosa, 14,3% Str.pneumonia, 9,6% S.dublin, 7,9% Staph.aureus, 4,8% Str.epidermidis, 3,9% P.vulgaris, 3,2% E.coli та (рис.3).

Аналізуючи отримані дані можна відзначити, що домінуюче місце серед бактеріальних збудників пневмоній займала P.multocida. Етіологічне значення цього мікроба дуже велике у віці 1-4 місяців, так як від 66,7 до 75,3% випадків причиною пневмоній була P.multocida. У телят старшого віку (4-6 місяців) збільшується частота виявлення гнійних мікроорганізмів, коків та паличок, але все ж таки питома вага P.multocida, як причинного фактору пневмоній, залишається достатньо високою і складає 38,8%.

Необхідно відмітити, що крім P.multocida в інфекційній патології органів дихання телят, суттєву роль мають інші бактеріальні патогени: гемолітичні пастерели, стрепто- та стафілококи, грамнегативні ентеробактерії. Їх питома вага в розвитку пневмоній менша ніж у P.multocida, але вони постійно циркулюють серед сприйнятливих тварин і регулярно виділяються з патологічного матеріалу. При цьому бактерії, збудники пневмоній, локалізуються в уражених легенях в різних комбінаціях. Так, P.multocida зустрічалась в асоціаціях з Ps.aeruginosa, S.dublin, Staph.aureus і Str.epidermidis.

Домінуюче значення серед бактеріальних збудників пневмонії в телят займала P.multocida, як по частоті виділень з патматеріалу - 122 культури (54%), так і по кількості ізолювання чистих культур із асоціацій мікроорганізмів - 83 культури. Слід зазначити, що з легень та внутрішніх органів виділяли P.multocida, а тільки з уражених легень - P.haemolytica. Польові варіанти P.multocida були вірулентними по відношенню до білих мишей, а P.haemolytica авірулентні. Коки та грамнегативні палички виділялись з уражених легень та внутрішніх органів як в чистому вигляді так і в асоціаціях. Проведені дослідження показують, що польові культури P.multocida мали капсулу. Серологічними та біологічними методами визначили їх серотипову належність по капсульному антигену.

Як свідчать дані найбільше значення в етіології пастерельозних пневмоній має серотип Д (до 79,6% випадків), серотип А зустрічається рідше (до 44,4% випадків) і ще рідше реєструється серотип В (від 0 до 16,6% випадків).

Для більш детального вивчення клініко-епізоотичної ситуації по респіраторним хворобам телят бактеріальної етіології здійснювали тривалі клінічні спостереження за перебігом хвороби. В КСП “Україна” сформували групу телят по принципу аналогів з 30 голів двотижневого віку та спостерігали за ними протягом двох місяців.

У телят віком 25-30 і 60-70 днів досліджували сироватку крові на наявність антитіл до капсульного антигену P.multocida. Антитіла виявили у всіх телят в титрах від 1:2 до 1:64, що свідчить про напруженість епізоотичного процесу легеневого пастерельозу, при цьому висота титрів не відображала індивідуального клінічного стану тварин і не корелювала з перебігом захворювання. В місячному віці переважали антитіла проти К-АГ серотипу А, їх накопичення склало 2,75±0,17 log₂, а у двомісячному віці збільшилося значення титрів антитіл проти К-АГ серотипу Д і склало 3,40±0,24 log₂. Перша хвиля пневмоній виникла протягом першого місяця перебування телят в телятнику. Легеневим пастерельозом в період від 30 до 90 днів захворіло 14 телят (46,7%), із них загинуло троє (10%) та четверо (13,3%) були вимушено забиті. В епізоотичному процесі пастерельозних пневмоній брали участь три серотипи P.multocida сумісно циркулюючих в одному господарстві. Наші дослідження свідчать, що серед ізольованих культур пастерел домінував серотип А, який викликав важкий перебіг крупозних пневмоній. Культуру пастерел серотипу В виділили при гострій катарально-геморагічній пневмонії. Патогенну культуру P.multocida серотипу Д виділили при діагностичному забої телят із хронічною пневмонією. З уражених легень ізолювали 2 культури P.haemolytica.

Таким чином, від 30 телят за якими спостерігали в КСП “Україна” протягом 2-х місяців, було виділено 6 культур P.multocida із патологічного матеріалу (з них 1 культуру віднесли до серотипу В, ще 1 - до серотипу Д і 4 - до серотипу А; 2 культури P.haemolytica були ізольовані тільки з уражених легень та 2 культури P.multocida висіяли з носового слизу. Важливо відмітити, що P.multocida виділялась з легень, регіонарних лімфовузлів, селезінки та печінки, P.haemolytica - тільки з уражених легень.

Вивчення біологічних властивостей і тканинного тропізму польових культур P.multocida

В чотирьох раніше описаних господарствах відібрали 16 телят 2-3 місячного віку з типовими клінічними ознаками пневмонії, вперше захворівших на запалення легень. Три теля загинуло від гострої катарально-геморагічної пневмонії, останні були вимушено забиті з діагнозом крупозної пневмонії.

Прижиттєво у всіх хворих телят провели бактеріальні дослідження проб носового слизу. Були виділені чисті та змішані культури бактерій. Облігатним учасником мікробної асоціації носового слизу хворих на пастерельозну пневмонію телят, була P.multocida. При цьому в 56,3% випадків пастерела була виділена в чистій культурі.

Одночасно провели порівняльне бактеріальне дослідження носового слизу у такої ж кількості здорових телят, що знаходилися в тих же приміщеннях, що й здорові тварини.

Суттєвої різниці у видовому складі мікрофлори, виділеної з носового слизу в хворих та здорових тварин не виявлено.

В кількісному співвідношенні у хворих тварин домінували асоціації грамнегативних бактерій - пастерели, ентеробактерії, синьогнійна паличка з очевидною перевагою P.multocida. У здорових тварин домінувала грампозитивна мікрофлора - стафіло- і стрептококи. P.multocida зустрічалась рідко і тільки в асоціаціях.

Для більш поглибленого вивчення етіопатогенезу легеневого пастерельозу провели бактеріологічне дослідження патологічного матеріалу від 16 телят.

Було виділено 16 чистих культур P.multocida. Пастерели регулярно виділялись з уражених легень та регіонарних лімфовузлів. З легень частина культур була ізольована в асоціаціях із коками та грамнегативними дрібними паличками. З регіонарних лімфовузлів ізолювали чисті культури P.multocida, саме в цих культурах вивчили біологічні властивості. З інших біологічних матеріалів культури пастерел виділялись нерегулярно.

Із селезінки культури P.multocida ізолювали у 10 випадках (62,5%), трубчастих кісток - у 9 (56,3%), печінки - у 7 (43,8%) та в трьох випадках (18,8%) з крові серця телят, що загинули від гострого перебігу легеневого пастерельозу з явищами септицемії. Зведені дані, що характеризують інтенсивність пастерельозного процесу представлені в таблиці 2.

Дані таблиці свідчать, що з 16 культур P.multocida 7 культур (43,8%) нами віднесено до серотипу А, 6 культур (37,5%) - до серотипу Д та 3 культури (18,8%) - до серотипу В. Усі виділені культури вірулентні для білих мишей. В крові тварин пастерели серотипу

В розмножуються найбільш інтенсивно і накопичення живих мікробних клітин склало 1,1-1,5·10⁹ КУО/см³, що відповідає інтенсивності росту в бульйоні Хотингера 12-18 годинної культури. Серотип В найбільш активно заселяє організм телят, викликає скороплинний та летальний легеневий пастерельоз із явищами септицемії. Серотипи А і Д також викликають легеневий пастерельоз але без вираженої фази розмноження в крові, із найбільшим накопиченням P.multocida в легенях. Найменшу колонізуючу активність мав серотип Д.

Таблиця 2

Серотипова належність, вірулентність та накопичення P.multocida

в органах і тканинах хворих телят (n=16)

У виділених культур вивчали антигенні характеристики 16 польових ізолятів P.multocida по соматичним антигенам в порівняльному аспекті між собою та референтними штамами в РА з гіперімунними сироватками. Референтні штами пастерел з гомологічними сироватками реагували в розведенні 1:1600-1:3200, із гетерологічними - в розведені 1:25-1:50. Польові культури P.multocida серотипу А, які були виділені в Херсонській області, в перехресних реакціях аглютинації з гіперімунними сироватками на власні соматичні антигени реагували в розведенні 1:800-1:3200, а з гіперімунними сироватками референтних штамів і польовими культурами P.multocida серотипу А, які були виділені в АР Крим - в розведенні 1:25-1:50. Аналогічна ситуація спостерігалася по серотипу Д. Польові культури P.multocida серотипу Д виділені в Херсонській області, в перехресних реакціях аглютинації з гіперімунними сироватками на власні соматичні антигени реагували в розведенні 1:1600-1:3200, а з гіперімунними сироватками референтних штамів і польовими культурами пастерел серотипу Д, які були виділені в АР Крим - в розведенні 1:50-1:100. Польові культури P.multocida серотипу В виділені в Херсонській області та АР Крим, а також референтний штам серотипу В були серологічно ідентичними по О-АГ і в перехресних реакціях аглютинації з гіперімунними сироватками мали титри 1:1600-1:3200.

При вивченні антигенних характеристик виділених 16 польових ізолятів пастерел по соматичним антигенам в порівняльному аспекті між собою та референтними штамами в РА з гіперімунними сироватками на соматичні антигени референтних штамів P.multocida серотипів А і Д було виявлено неспівпадання між польовими та референтними штамами по соматичним антигенам. Це потрібно враховувати при конструюванні біологічних препаратів із місцевих штамів P.multocida серотипів А і Д.

Із 16 польових культур пастерел відібрали 3 серотипи А, Д, В із найбільш характерними властивостями та вивчили вірулентність в порівнянні з референтними штамами за методом Кербера-Ашмаріна. Дані про кількісні значення LD₅₀ подані в таблиці 3.

Таблиця 3

Визначення LD₅₀ в колонієутворюючих одиницях P.multocida для білих мишей

При порівняльному вивченні вірулентних властивостей польових культур і референтних штамів P.multocida на білих мишах суттєвої різниці не встановлено.

Заслуговують на увагу досліди по вивченню імуносупресивної властивості пастерел, зокрема польової культури № 3 серотипу Д.

Для цього провели дослід на 56 кролях. З польової культури P.multocida серотипу А приготували інактивований емульсійний бактерин, яким в різних дозах прищепили кролів. Після формування імунитету, через 21 добу, половину дослідного поголів'я (28 кролів) заразили несмертельною дозою пастерел серотипу Д (0,65?10⁹м.к.), який викликав легеневий пастерельоз. Після одужання заражених, всіх 56 імунізованих кролів заразили безумовно летальною дозою (10 LD₅₀) гомологічної культури пастерел серотипу А. По Керберу-Ашмаріну розрахували і порівняли величини ImD₅₀ в обох групах, які склали відповідно 186?10⁶м.к. для кролів, що перехворіли на пастерельоз і 62?10⁶м.к. - для інтактних.

Різність одержаних величин ImD₅₀ на одне розведення вакцинного препарату з кроком 3, свідчить про імуносупресивний вплив P.multocida серотипу Д на організм кролів, а також про те, що пастерели серотипів А і Д, які були виділені від хворих телят не створюють перехресного серотипового захисту при інфікуванні кролів, що треба враховувати при проведенні оздоровчих заходів в господарствах.

ВИСНОВКИ

АНОТАЦІЯ

Заболотня В.П. Біологічні властивості та клініко-епізоотологічне значення P.multocida в респіраторній патології телят. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03. - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2002.

Визначено етіопатогенетичне значення респіраторних захворювань телят 1-6 місячного віку і встановлена стадійність у розвитку респіраторного синдрому, яка обумовлена зміною мікробних популяцій, що корелює з клініко-епізоотологічним проявом інфекційної патології респіраторної системи.

Встановлено, що 44% тварин в досліджуваній групі захворіло бактеріальними пневмоніями, до 75,4% викликаними P.multocida, з них серотипом А - 44,4%, серотипом В - 16,6%, серотипом Д - 39% випадків. Захворювання протікало важко, переважно гостро у формі крупозної пневмонії з летальністю до 11,9%.

У телят до 4-х місячного віку виділено P.multocida серотипу А в 44,4% і серотипу Д в 38,8% випадків; у 4-6 місячних телят виділення пастерел серотипу А зменшилося до 20,4%, а серотипу Д збільшилося до 79,6%, який мав домінуюче значення в поширенні легеневих пастерельозів, викликаючи переважно хронічний перебіг хвороби.

Культуру P.multocida серотипу В в місячному віці виділили в 16,6% випадків, з наступним зменшенням частоти виділення.

Від хворих телят ми виділили 112 культур P.multocida і вивчили їхні біологічні властивості.

Епізоотичні культури були вірулентними для лабораторних тварин (білих мишей і кроликів) і в організмі телят мали виражений тропізм до легеневої тканини, де накопичення бактерій складало від 2,4·10⁷ до 0,95·10⁹ КУО/см³.

Ключові слова: P.multocida, легеневий пастерельоз, асоційовані інфекції, антигенний плюралізм, тканинний тропізм, вірулентність, серологічна типізація, епізоотологічний моніторинг, ліофілізація.

АННОТАЦИЯ

Заболотняя В.П. Биологические свойства и клинико-эпизоотологическая значимость P.multocida в респираторной патологии телят. - Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03. - ветеринарная микробиология и вирусология. - Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 2002.

Одной из основных проблем ветеринарной медицины являются респираторные заболевания молодняка сельскохозяйственных животных в 1-6 месячном возрасте. Нами изучен этиопатогенез легочного пастереллеза и установлена стадийность респираторного синдрома обусловленная сменой микробных популяций, что коррелирует с клинико-эпизоотологическим проявлением инфекционной патологии респираторной системы.

После перевода группы телят, в месячном возрасте, из профилактория в телятник, часть животных (44%) заболели бактериальными пневмониями до 75,4% вызванными P.multocida, из них серотипом А - 44,4%, серотипом В - 16,6%, серотипом Д - 39% случаев. Заболевание протекало тяжело, преимущественно остро в форме крупозной пневмонии, летальность до 11,9%. После выздоровления наблюдаются остаточные воспалительные явления, часто с рецидивированием пневмоний.

В 2-4 месячном возрасте по-прежнему доминируют пастерелезные пневмонии, но возникают они у отдельных животных в результате индивидуального снижения резистентности, обычно под влиянием абиогенных неблагоприятных факторов условий содержания. У телят 1-4 месячного возраста виделяли P.multocida серотип А в 44,4% случаев и серотип Д в 38,8% случаев; в 4-6 месячных телят выделение пастерелл серотипа А уменьшилось до 20,4%, а серотипа Д увеличилось до 79,6%, он имел главное значение в распространении легочных пастереллезов, вызывая преимущественно хроническое течение болезни. Культуры P.multocida серотипа В в месячном возрасте выделены в 16,6% случаев, с последующим уменьшением выделения.

В результате иммуносупрессивного влияния пастерелл на организм телят, на хронические вялотекущие патереллезные пневмонии в 4-6 месячном возрасте наслаиваются вторичные бактериальные инфекции, обусловленные условно-патогенными, гноеродными микроорганизмами, что ведет к трудноизлечимым гнойно-некротическим пневмониям.

От больных телят мы выделили 112 культур P. multocida и изучили их биологические свойства. Эпизоотические культуры были вирулентными для лабораторных животных (белых мышей и кроликов) и в организме телят обладали выраженным тропизмом к легочной ткани, где накопление бактерий составляло от 2,4•10⁷ до 0,95•10⁹ КОЕ/г.

P.multocida серотипа В наиболее активно заселяли макроорганизм и вызывали скоротечный и летальный легочной пастереллез, тогда как серотипы А и Д вызывали легочной пастереллез у телят в острой и хронической формах. Эпизоотические культуры P.multocida имели сходные с референтными штаммами морфо-тинкториальные, биохимические и культуральные свойства, но отличались от них и между собой по соматическим антигенам, что необходимо учитывать при конструировании вакцинных препаратов из местных штаммов. Для предотвращения диссоциации и потери нативных биологических свойств необходимо сохранять культуру P. multocida методом лиофилизации.

Ключевые слова: P.multocida, легочной пастереллез, асоциированные инфекции, антигенный плюрализм, тканевой тропизм, вирулентность, серологическая типизация, эпизоотологический мониторинг, лиофилизация.

ANNOTATION

Zabolotnaya V.P. Biological qualities and clinical-epizootic importance of P.multocida in respiratory pathology of calves. - Handwriting.

The dissertation is presented for conferring a scientific degree of the candidate of veterinary sciences in speciality 16.00.03 - veterinary microbiology and virology. - The Institute of experimental and clinical veterinary medicine, Kharkiv, 2002.