Производство вакцин против рожи свиней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь

Учреждение образования

Витебская ордена “Знак почета” государственная академия ветеринарной медицины

ПРОИЗВОДСТВО ВАКЦИН ПРОТИВ РОЖИ СВИНЕЙ

Витебск - 2011



ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Характеристика депонированной вакцины против рожи свиней

Технологическая схема производства биопрепарата

Приготовление питательных сред

Биологические свойства матрикса Конева, его поддержание и подготовка расплодки

Выращивание посевного материала

Выращивание производственной культуры

Составление серии вакцины

Фасовка и этикетировка вакцины

Упаковка, маркировка и хранение

Контроль вакцины

Сухая вакцина против рожи свиней с растворителем

Характеристика вакцины

Технологическая схема производства

Приготовление производственной питательной среды из гидролизата по Хоттингеру с добавлением мясной воды

Получение посевного материала

Получение расплодки на полужидком мясо-пептонном агаре

Получение сухого штамма ВР-2

Получение культуры штамма ВР-2 первой генерации

Получение культуры штамма ВР-2 второй генерации

Производственное культивирование

Составление серии вакцины

Расфасовка

Предварительное укупоривание

Замораживание

Высушивание

Обкатка флаконов

Этикетирование

Укладка и упаковывание

Контроль сухой вакцины против рожи свиней с растворителем

Список использованной литературы



ВВЕДЕНИЕ

Одним из слагаемых успешного развития свиноводства является эффективная борьба с болезнями животных, в том числе и с инфекционными (В.В. Максимович, 1996).

Вакцинация животных является одной из основных мер в системе профилактики - борьбы с заболеваниями, вызываемыми биологическими агентами, в том числе и бактериями. Ее эффективность определяется тем, что она воздействует на основной регулятор эпизоотического процесса - иммунитет в популяции восприимчивых животных (А.А. Гусев, С.С. Рыбаков, 1996).

Одной из наиболее распространенных инфекционных болезней на свиноводческих комплексах и фермах является рожа. Данное заболевание регистрируется во многих странах мира (А.Ф. Ображей, В.С. Тындык, 1995; К. Redhead et all., 1998), в том числе и в Республике Беларусь (В.Ф. Багрецов, 1996).

Разработкой и совершенствованием биопрепаратов против рожи свиней занимаются многие исследователи. Иммунизацию животных против указанной болезни проводят во многих странах мира.

Эффективность противорожистых биопрепаратов определяется антигенными свойствами вакцинных штаммов, используемых для их изготовления (N. Мowat, M. Rweyemanu, 1997) и высокой иммуногенностью препаратов (J. Kumar et all., 1998; Y. Shimoji et all., 1998).

Первые живые вакцины против рожи свиней создали Пастер и Тюлье в 1883 году путем аттенуации эризипелотриксов при пассажировании через организм кроликов. На основе этого принципа в России П.И. Боровский в 1897 году, а затем Д.Ф. Конев в 1904 и 1908 годах получили живые вакцины. Выделенную от голубей вирулентную культуру Д.Ф. Конев ослабил последовательным пассажированием через кроликов и получил матриксы 1-й и 2-й вакцины.

П.С. Соломкин в 1940 году освежил архивный образец 2-го матрикса Конева и после испытаний предложил его для изготовления живой вакцины.

М.Т. Коняев (1978) разработал рациональную схему применения живых вакцин против рожи свиней из 2-го матрикса Конева, штаммов К-2 и ВР-2.

Штамм ВР-2 был выделен в 1931 году в секции диагностики института Л. Пастера в Бухаресте из трупа свиньи, павшей от рожи, и постепенно аттенуирован пассажами на различных питательных средах. При этом штамм сохранил небольшую вирулентность для голубей и высокую иммуногенность для свиней (Н.М. Никифорова с соавт., 1981; R.V. Dushuk et all., 1994).

В целом многолетняя практика производства и применения живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 как в СССР, так и за рубежом показала ее высокую эффективность (Л.А. Подлесных с соавт., 1985; Р.В. Душук с соавт., 1989; Z. Kucerova, 1993).

Г.Д. Глуховцев (1960) предложил способ изготовления сухих вакцин против рожи свиней из слабовирулентного штамма ВР-2 и авирулентного штамма "Штауб".

Сухие вакцины, по сравнению с жидкими препаратами, обладали некоторыми преимуществами: увеличенным сроком годности - до 1 года, лучшей транспортабельностью и возможностью хранения при температуре ниже 0⁰С.

В настоящее время для активной специфической профилактики рожи свиней в странах СНГ, в том числе и в Республике Беларусь, осуществляется промышленное производство двух живых вакцин (сухая живая из штамма ВР-2 и депонированная из матрикса Конева).

Вакцина из штамма ВР-2 - сухая живая культура слабовирулентного штамма. Депонированная вакцина представляет собой жидкую культуру 2-го матрикса Конева, адсорбированную на фосфатном буферном растворе гидрата окиси алюминия.

В России производится инактивированная сорбированная вакцина, которую готовят путем инактивации формалином и сорбции на гидрат окиси алюминия баксуспензии возбудителя рожи свиней серологического типа В (Р.В. Душук с соавт., 1993).

Также разработана и изучена учеными ВГНКИ (Россия) эмульгированная вакцина против рожи свиней (Р.В. Душук с соавт., 1994).

Эмульгированная и инактивированная вакцины не получили широкого применения для профилактики рожи свиней в Республике Беларусь.



Характеристика депонированной вакцины против рожи свиней

Депонированная вакцина по своим физическим и иммунобиологическим свойствам должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 1.

Таблица 1

Физические и иммунобиологические свойства депонированной вакцины против рожи свиней

Наименование мероприятий	Характеристика и нормы
Внешний вид	Гомогенная, слегка вязкая, непроз-рачная взвесь с осадком на дне флакона
Цвет	Серовато-желтый
Наличие посторонних примесей, плесени, не разбивающегося осадка, трещин флаконов	Не допускается
Концентрация водородных ионов (рН)	7,0-7,6
Контроль на чистоту и типичность роста (стерильность)	Типичный рост рожистых бактерий. Рост посторонней микрофлоры не допускается
Безвредность	После иммунизации вакциной, голуби должны оставаться живыми
Вирулентность	После иммунизации вакциной, белые мыши должны гибнуть в течение 4-12 суток
Иммуногенность штамма матрикса Конева	Должен выдержать испытания
Определение объема	Допускается погрешность +3 %

Технологическая схема производства биопрепарата

Технологическая схема производства депонированной вакцины против рожи свиней:

ТП 1. Поддержание производственных штаммов. Получение бакгидролизатов

ТП 1.1 Приготовление выращивание рабочей расплодки на питательных средах

ТП 1.2 Приготовление

ТП 1.3 Приготовление

ТП 1.4 Приготовление экстрактов мясокостной муки

ТП 1.5 Приготовление мясной воды УМО. Упаковка, маркировка и хранение. В канализацию

ТП 1.6 Приготовление МПБ

ТП 1.7 Приготовление МПА

ТП 1.8 Приготовление агара Сабуро

ТП 1.9 Получение МПБ

2. Питательных сред на суспензии

2.1 Приготовление ТП питательной среды на основе мясных гидролизатов

2.2 Выращивание посевного материала - на основе мясного экстракта и гидролизатов крови

2.3 Выращивание производственных культур

3. Составление ТП сыворотки серии вакцины

ТП 4. Фасовка и этикетировка вакцины ОБО-1. Обезвреживание промывных вод и дефектной культуры грибы

Приготовление питательных сред

Для приготовления питательных сред в производстве вакцины используют мясо говяжье, поджелудочную железу крупного рогатого скота, свиные желудки, кровь убойных животных, фермент протосубтилин, пептон.

Мясо говяжье или кровь животных подвергают глубокому ферментативному гидролизу с целью получения легко усвояемых аминокислот.

Приготовление бульона Хоттингера

Фарш мышечной ткани крупного рогатого скота ресуспендируют в дистиллированной или деминерализованной воде в соотношении 1:1,5. На 1 дм³ смеси добавляют 200-300 г поджелудочной говяжьей железы, 10-20 г хлороформа (консервант). рН приготовленной смеси доводят раствором двууглекислой соды или раствором натрия гидроокиси. Ферментолиз ведут при рН 8,0 и температуре 38-42⁰С в течение 4-5 суток. Первые 6-8 часов перемешивают через каждый час, а затем 3-4 раза в сутки.

В процессе ферментолиза ежедневно определяют рН среды и подщелачивают ее 10%-ным раствором натрия гидроокиси или двууглекислой соды.

Биохимические показатели ферментолизата (перевара):

общий азот - 800 - 1200 мг%;

аминный азот - 600 - 900 мг%;

триптофан - 100 - 200 мг%.

Биохимические показатели контролируют согласно ГОСТ 20730-75 "Мясопептонный бульон для ветеринарных целей".

К полученному ферментолизату добавляют 5-10 см³/дм³ хлороформа. Смесь инкубируют при температуре 90-100⁰С в течение 30-40 минут, охлаждают до температуры 15-25⁰С, отстаивают в течение 24-48 часов.

Прозрачный надосадок декантируют и разводят дистиллированной или деминерализованной водой до содержания аминного азота 200-250 мг%, триптофана 60-80 мг%.

В приготовленный мясной гидролизат добавляют до 0,5% пептона, 0,5% натрия хлорида, 0,3% химически чистого двухосновного фосфорнокислого натрия.

К бульону Хоттингера добавляют 10% воды на выкипание. Среду кипятят в течение 30 минут, рН среды устанавливают 10%-ным раствором гидроокиси натрия или двууглекислой соды до рН 7,6-7,8.

Среду кипятят в течение 1 часа, отстаивают в варочном котле в течение 1-2 часов, фильтруют до полной прозрачности через плотный слой ваты и марли.

Приготовление двухкомпонентной питательной среды из гидролизатов белков крови

Для ее изготовления используют кровь убойных животных, форменные элементы - отходы сывороточного производства. Кровь предварительно путем сепарации (центрифугирования) разделяют на плазму и эритроцитарную массу, которые раздельно ферментируют, очищают и для приготовления среды смешивают в соотношении 1:1-1:2.

Для повышения выхода биомассы бактериальных клеток к питательной среде добавляют 18,7-22,5 мг/дм³ левамизола, 4-5 мг/дм³ никотиновой кислоты и пиридоксина гидрохлорида, 25 мг/дм³ тиамина хлорида, 8-10 мг/дм³ пантетената кальция, 50 мг/дм³ сульфата магния, 50 мг/дм³ тиосульфата натрия и др.

Приготовление производственной питательной среды на основе гидролизата по Хоттингеру

Гидролизат Хоттингера разводят очищенной водой до содержания в нем 500 мг% аминного азота. Смесь кипятят в варочном котле 10-18 минут. Далее смешивают в соотношении 1 : 1 гидролизат Хоттингера и мясную воду.

В смесь добавляют 0,5 % пептона, 0,2 % поваренной соли, 0,3 % дигидрофосфата калия, 1,8 % гидрофосфата натрия, 1-1,5 % желатина. После растворения всех ингредиентов, с помощью 10%-ного раствора натрия гидроокиси устанавливают рН среды 7,6-7,8.

Смесь повторно кипятят при перемешивании в течение 30-60 минут, отстаивают в течение 1,5-2 часа и фильтруют через бельтинг-ткань или через ватно-марлевый фильтр.

Среду разливают в бутыли или перекачивают в ферментер для культивирования.

Питательную среду стерилизуют при температуре 116-118⁰С в течение 45 минут.

Приготовление питательной среды на основе мясного экстракта и гидролизатов крови

2 части мясной воды смешивают с 0,65 частями гидролизата форменных элементов (компонент "А") и 0,35 частями гидролизата сыворотки крови (компонент "Б"), содержащими 400-500 мг% аминного азота.

В полученную смесь добавляют следующие компоненты по сухому веществу в процентах:

натрия хлорид - 0,2;

глюкоза - 0,1;

гидрофосфат натрия - 1,8;

дигидрат калия - 0,3;

желатин - 1.

Для повышения прироста биомассы и жизнеспособности культур добавляют в питательную среду магния сульфат, тиосульфат натрия, сульфат марганца, витамины группы В, биостимуляторы и бионормализаторы.

Биологические свойства матрикса Конева, его поддержание и подготовка расплодки

Для изготовления депонированной вакцины используют культуру рожи свиней из матрикса Конева.

Для изучения культуральных свойств и морфологии производят посев штамма на питательные среды: МПА, МПБ, агар и бульон Хоттингера. Посевы инкубируют при температуре 36-38⁰С в течение 20-24 часа.

На плотных питательных средах штамм матрикса Конева растет в виде нежных, росинчатых, просвечивающихся, круглых колоний с гладкой поверхностью (S-форма), на жидких - образует равномерное помутнение (муаровые волны) без пленок и пристеночного кольца.

В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, штамм имеет вид тонких, прямых или слегка изогнутых грамположительных палочек, расположенных поодиночно или соединенных попарно, с отсутствием нитей и других инволюционных форм.

Вирулентность матрикса Конева проверяют на белых мышах. Животные, зараженные баксуспензией подкожно в объеме 0,1 см³ (содержание живых клеток бактерий 3-0-50 млн.м.к./см³), должны погибнуть в срок от 4 до 12 суток.

Безвредность матрикса Конева проверяют на голубях, которых заражают баксуспезией в объеме 0,5 см³ (содержание живых клеток 150 млн.м.к.). Они должны оставаться живыми в течение 10 суток наблюдения.

Перед использованием лиофилизированный штамм ресуспендируют в МПБ и пересевают на МПБ во флаконы.

Для приготовления расплодки культуру высевают на полужидкий агар. Посевы инкубируют в течение 20-24 часов при температуре 36-38⁰С.

Нативную расплодку хранят в холодильнике в течение 1-2 месяцев.

Для приготовления сухой расплодки к культуре матрикса Конева, выращенной на жидкой питательной среде, добавляют в соотношении 4 : 1 50% раствор сахарозы на фосфатно-буферной основе, после чего замораживают при температуре -(50-60)⁰С в течение 16-24 часов и высушивают в вакууме (сублимация).

Сухую расплодку хранят в течение 1-3 лет при температуре 2-6⁰С.

Выращивание посевного материала

Выращивание посевного материала осуществляют во флаконах и баллонах.

Культуру матрикса Конева, выращенную при температуре 36-38⁰С в течение 20-24 часов во флаконе на МПА, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Далее засевают в дозе 10см³/дм³ на производственные среды в баллоны. Посевной материал выращивают в течение 16-24 часов при температуре 36-38⁰С.

рожа депонированный сухой вакцина



Выращивание производственной культуры

Производственные культуры выращивают на производственной среде в баллонах или ферментере.

В ферментер или баллон со стерильной производственной средой вносят 5-10% посевного материала. Засеянную питательную среду в ферментере перемешивают механической мешалкой (60 об/мин) в течение 2-3 минут.

Производственное культивирование матрикса Конева осуществляют при температуре 36-38⁰С в течение 18-20 часов.

В процессе культивирования микроорганизмов через каждые 2 часа проводят механическое перемешивание в течение 2-3 минут.

После окончания культивирования берут пробу культур рожистых бактерий для микроскопии мазков, определения рН, концентрации микробных клеток и морфологии культур.

Составление серии вакцины

Выращенную производственную культуру, соответствующую паспортным данным, разводят растворителем до 300-500 млн.м.к./см³ с добавлением 30% гидроокиси алюминия (концентрация гидроокиси алюминия 4%).

Для приготовления растворителя в фосфатный буфер добавляют до 0,1% агара и 1% желатина.

Для повышения иммуногенности и снижения реактогенности в состав вакцины вводят риботан, нуклеинат натрия и др.

Фасовка и этикетировка вакцины

Вакцину фасуют по 50, 100 и 200 см³ в чистые стерильные флаконы, обкатывают металлическими колпачками.

На флаконы наклеивают этикетку, на которой указывают:

наименование предприятия-изготовителя;

название вакцины;

количество ее во флаконе, номер серии и контроля;

срок годности;

условия хранения;

обозначение ТУ.

Упаковка, маркировка и хранение

Флаконы с вакциной обертывают бумагой или лигнином, а в холодное время года ватой или другими теплоизоляционными материалами и упаковывают в деревянные или картонные ящики массой брутто не более 25 кг.

Внутрь каждого ящика вкладывают наставление по применению вакцины и контрольный лист с указанием наименования вакцины, ее количество в ящике, номера серии, даты упаковки и фамилии упаковщика.

На каждый ящик наносят транспортную маркировку со следующими обозначениями: наименование предприятия-изготовителя и его адрес, название вакцины, количество флаконов в ящике, номера серии, даты изготовления, срока годности, условия хранения, обозначение ТУ, обозначение манипуляционных знаков по ГОСТ 14192-96 "Хрупкое. Осторожно", "Ограничение температуры".

Вакцину хранят в закрытом сухом месте при температуре 2-10⁰С в течение 10 месяцев.

Контроль вакцины

Каждую серию вакцины подвергают контролю:

на чистоту и типичность роста;

на безвредность на голубях;

на вирулентность на белых мышах;

на иммуногенность на свиньях.

Вакцину признают годной к применению, если в мазках из высевов вакцины при проверке на чистоту наблюдают типичный рост бактерий рожи; десять белых мышей, привитых в дозе 0,1 см³, погибают в срок от 4 до 12 суток, а пять голубей, иммунизированных в дозе 0,5 см³, в течение десяти суток остаются живыми.

Сухая вакцина против рожи свиней с растворителем

Характеристика вакцины

Вакцина по своим физическим и иммунобиологическим свойствам должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 2.

Таблица 2

Физические и иммунобиологические свойства вакцины

Наименование показателей	Характеристика и нормы
Внешний вид вакцины	Сухая масса в виде таблетки
Цвет вакцины	Беловато-желтый или серо-белый
Наличие механических примесей и других посторонних включений	Не допускается
Растворимость вакцины, мин, не более	3
Массовая доля влаги в вакцине, %	1,0-3,5
Контаминация вакцины посторон-ними микроорганизмами	Не допускается
Морфология вакцинного штамма	На МПА через 24 часа роста образуют гладкие нежные росинчатые колонии, а на МПБ равномерное помутнение
Количество живых бактерий во флако-не (ампуле) с вакциной вместимостью 5,0; 10,0; 20,0 и 50,0 см3 должно быть соответственно не менее, млрд.	1 м.к. 2 м.к. 4 м.к. 10 м.к.
Количество доз во флаконе (ампуле) при фасовке вакцины по 2,5; 5,0; 10,0 и 25,0 см3 должно быть не менее соответственно	5 10 20 50
Безвредность вакцины	Вакцина должна быть безвредной для белых мышей, привитых подкожно в дозе 100-120 млн. микр. тел
Иммуногенная активность вакцины	Вакцина должна предохранять на 11-12 день после иммунизации от гибели 8-10 белых мышей при их заражении контрольным штаммом № 149 рожистых бактерий в дозе 10 ЛД50 в объеме 0,1 см3

Технологическая схема производства

Технологическая схема производства вакцины представлена на рисунках 2 и 3.

ТП-1 Подготовка основного сырья

Обвалка мяса и обработка Взвешивание Измельчение мяса и под- Контроль поджелудочной железы сырья желудочной железы

ТП-2 Приготовление гидролизатат мяса пептона контроль контроль

ТП-3 Приготовление мясной воды Стерилизация Контроль

ТП-4 Приготовление производственной питательной среды

На основании гидролизата На основе гидролизата по Хоттин- Стерилизация по Хоттингеругеру с добавлением мясной воды Контроль

ТП-5 Получение посевного материала Работа со штаммами 1-ая генерация 2-ая генерация Контроль

ТП-6 Производственное культивирование В биореакторе В стеклянных баллонах Контроль

ТП-7 Составление серии Контроль культуры Ресуспендирование в защитной среде Контроль

ТП-8 Получение сухой вакцины Фасование Предварительная Замораживание Высушивание Обкатка флаконов, Этикетир-е Упаковка контроль упаковка запайка ампул контроль

ТП-9 Приготовление растворителя для вакцины на основе мясной воды Фасование Укупорка Стерилизация Контроль

ВР-1. Подготовка оборудования Настройка весов Мойка мясорубки

ВР-2. Подготовка оборудования Мойка реактора Контроль Проверка и настройка системы КИПиА

ВР-3. Подготовка оборудования Мойка котла Контроль Проверка и настройка системы КИПиА

ВР-4. Подготовка оборудования Мойка реактора Контроль Проверка и настройка системы КИПиА

ВР-5. Приготовление ингредиентов Приготовление раствора Приготовление Приготовление сыворотки крови глюкозы NаОН крупного рогатого скота или овец

ВР-6. Подготовка питательной среды для посевного материала Приготовление питательной среды Фасование, монтаж, стерилизация Контроль

ВР-7. Подготовка стеклянной посуды Монтаж Сушка Монтаж Стерилизация Контроль

ВР-8. Получение питательных сред для контроля чистоты культуры, стерильности ингредиентов Составление сред Расфасовывание Монтаж Стерилизация Контроль

ВР-9. Подготовка биореактора, баллонов для посевного материала

Обеззараживание Мойка, монтаж Проверка на герметичность Проверка и настройка Стерилизация Контроль системы КИПиА Контроль

ВР-10. Подготовка производственного биореактора, баллонов для посевного материала

Обеззараживание Мойка, монтаж Проверка на герметичность Проверка и настройка Стерилизация Контроль системы КИПиА Контроль

ВР-11.1 Подготовка биореактора для ресуспендирования

Обеззараживание Мойка, монтаж Проверка на герметичность Проверка и настройка Стерилизация системы КИПиА Контроль

ВР-11.2 Подготовка баллонов для ресуспендирования Обеззараживание Мойка, монтаж Контроль Стерилизация

ВР-12. Подготовка оборудования для ВР-13

ВР-13. Приготовление среды высушивания

ВР-14. Подготовка флаконов, кассет, пробирок и колпачков

Приготовление производственной питательной среды из гидролизата по Хоттингеру с добавлением мясной воды

Гидролизат Хоттингера разводят дистиллированной водой до содержания в нем 400-500 мг% аминного азота. Разведенный гидролизат кипятят в варочном котле 10-20 минут. Далее смешивают в соотношении 1 : 1 гидролизат Хоттингера и мясную воду. В смесь добавляют 0,5% пептона, 0,2% натрия хлорида, 0,3% дигидрофосфата калия, 1,8% гидрофосфата натрия, 1,5-2,0% желатина. После растворения всех ингредиентов, с помощью 10%-ного раствора натрия гидроокиси устанавливают рН среды 7,6-7,8.

Смесь повторно кипятят при перемешивании в течение 30-60 минут, отстаивают в течение 1,5-2 часа и фильтруют через бельтинг-ткань или через ватно-марлевый фильтр.

Среду разливают в баллоны для культивирования по 5-7 л, монтажируют ватно-марлевыми пробками, оснащенными сифоном и посевными трубками.

Питательную среду стерилизуют при давлении 0,08 МПа и температуре 116-118⁰С в течение 45 минут.

Готовая питательная среда должна иметь рН 7,4-7,6. Из каждого баллона готовой питательной среды для определения ее стерильности делают высевы по 1-2 см³ во флаконы и пробирки с МПБ, МППБ, МПА.



Получение посевного материала

Для изготовления живой сухой вакцины против рожи свиней с растворителем используют вакцинный штамм ВР-2.

Для определения культуральных свойств и морфологии штамма ВР-2 проводят высевы штамма на МПА или агар Хоттингера и МПБ и выдерживают 20-24 часа при температуре 36-37⁰С.

На твердых питательных средах штамм растет в виде нежных, росинчатых, просвечивающихся, круглых колоний с гладкой поверхностью (S-форма). На жидких средах образует равномерное помутнение (муаровые волны) без пленок и пристеночного кольца. В окрашенных по Граму мазках из агаровых и бульонных культур должны быть тонкие прямые или слегка изогнутые грамположительные палочки, расположенные поодиночке, или соединенные попарно с отсутствием нитей или других инволюционных форм.

Иммуногенные свойства вакцинного штамма ВР-2 проверяют на белых мышах и поросятах.

Белых мышей массой 17-18 г (по 12 мышей в группе) иммунизируют подкожно суточной культурой вакцинного штамма ВР-2, выращенной на МПБ, в разведениях от 10^-3 до 10^-7 на физиологическом растворе в дозах 4х10⁵, 4х10⁴, 4х10³, 4х10² живых микробных клеток в объеме по 0,2 см³. Заражение 10 вакцинированных мышей из каждой группы и 10 контрольных (не иммунизированных) проводят через 11-12 суток сухой стандартной заражающей культурой штамма возбудителя рожи свиней № 149 в дозе по 100 ЛД₅₀ в объеме 0,1 см³ подкожно. Наблюдение за мышами ведут в течение 10 суток. 10 контрольных мышей должны погибнуть в срок от 3 до 4 суток.

Поросят 2,5-3 месячного возраста в количестве 10 животных, не привитых против рожи, иммунизируют в дозе 200 млн. живых микробных клеток бульонной культурой вакцинного штамма ВР-2. Через 14-15 дней всех вакцинированных и контрольных (не иммунизированных) животных заражают внутрикожно вирулентной культурой возбудителя рожи. Контрольные поросята должны заболеть рожей.

Свойства вакцинного штамма рожи свиней ВР-2 определяют при получении штамма, а затем при изготовлении очередной расплодки на полужидком агаре (каждые 3 месяца).

Получение расплодки на полужидком мясо-пептонном агаре

Сухую культуру штамма ВР-2, полученную из ВГНКИ, из ампулы засевают во флакон вместимостью 100 см³ с мясо-пептонным бульоном. Культуру штамма инкубируют в термостате при температуре 36-37⁰С в течение 24 часов. Одновременно делают контрольные высевы в пробирки с МПБ, МПА, МППБ, агаром Сабуро. Контрольные посевы выдерживают в термостате 10 суток при температуре 36-37⁰С, а с агаром Сабуро - 10 дней при комнатной температуре.

Полученную культуру проверяют макро- и микроскопически на чистоту и типичность роста, затем культуру пересевают во флаконы с МПБ, делают посевы на пробирки МПБ, МПА, МППБ.

Культуру штамма ВР-2 инкубируют в термостате при температуре 36-37⁰С в течение 20-24 часов, Выращенную суточную культуру проверяют макро- и микроскопически, затем проводят посев пелей по Дригальскому на 4-6 пробирок и 2-4 чашки с 2% МПА.

Через 24 часа отбирают несколько колоний S-формы и делают посев в пробирки с 0,2% полужидким мясо-пептонным агаром в количестве, необходимом для работы. Выращивают в термостате при температуре 36-37⁰С в течение 24 часов. Штамм проверяют на чистоту, на культуральные свойства и морфологию.

Пробирки со штаммом парафинируют и хранят в холодильнике при температуре 62⁰С в течение 3-х месяцев.



Получение сухого штамма ВР-2

Культуру штамма ВР-2 из 1-2 пробирок с 0,2% МПА засевают в 100- граммовые флаконы с МПБ. Делают контрольные высевы на пробирки МПБ, МПА, МППБ. Посевы выдерживают 24 часа при температуре 36-37⁰С. Полученную суточную культуру, проверенную на чистоту, засевают в 3-литровые баллоны с МПБ. Выращивают 20-24 часа при температуре 36-37⁰С. После проверки на чистоту и типичность роста чистую культуру ВР-2 разводят защитной средой высушивания в соотношении 4 : 1. Фасовку производят в ампулы или флаконы по 1-5 см³, которые замораживают и лиофилизируют.

Получение культуры штамма ВР-2 первой генерации

Культуру штамма из 2-3 пробирок на 0,2% МПА засевают в 4-6 флаконов вместимостью 100 см³ с МПБ и одновременно для контроля в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым или минеральным маслом. Для контроля используют по две пробирки каждой среды. Флаконы с посевами инкубируют в течение 24 часов при температуре 36-37⁰С.

Получение культуры штамма ВР-2 второй генерации

Культуру штамма ВР-2 первой генерации, проверенную на чистоту, пересевают в бутыли вместимостью 3 л с МПБ в количестве 5-10% от объема МПБ. Одновременно проводят контрольные высевы на чистоту по 0,2 см³ в 2 пробирки с МПА, 2 пробирки с МПБ и 2 пробирки с МППБ под вазелиновым или минеральным маслом. Посевы помещают в термостат на 24 часа при температуре 36-37⁰С, а затем проверяют макро- и микроскопически на чистоту и типичность роста.



Производственное культивирование

Культуру штамма ВР-2 второй генерации пересевают в 16 литровые баллоны или биореактор с питательной средой содержащей глюкозу из расчета 0,2-0,3% сухого вещества и 2% стерильной сыворотки крови барана или крупного рогатого скота от объема питательной среды. В качестве стимулятора роста добавляют твин-80 в объеме 0,05%. Одновременно проводят контрольные высевы на чистоту по 0,5-1 см³ в 2 пробирки с МПА, 2 пробирки с МПБ и 2 пробирки с МППБ под вазелиновым или минеральным маслом. Посевы помещают в термостат на 24 часа при температуре 36-37⁰С, а затем проверяют макро- и микроскопически на чистоту и типичность роста.

После засева питательной среды ее тщательно перемешивают.

Выращивание вакцинного штамма в биореакторе проводят при температуре 36-37⁰С в течение 9-12 часов с периодическим перемешиванием по 2-3 минуты через каждые 2 часа. Засеянную культуру инкубируют при 36-37⁰С в течение 24-30 часов.

После окончания срока культивирования проводят контрольные высевы на чистоту по 0,5-1 см³ в 2 пробирки с МПА, в 2 пробирки с МПБ и 2 пробирки со средой Китта-Тароцци. Посевы помещают в термостат на 24 часа при температуре 36-37⁰С, а затем проверяют макро- и микроскопически на чистоту и типичность роста и определяют оптическую плотность культуры по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. После окончания процесса культивирования она должна быть 1-3 млрд/см³.

Составление серии вакцины

Бактериальную культуру смешивают с 50% стерильным раствором сахарозы на фосфатно-буферном растворе в соотношении 4 : 1. Полученную смесь перемешивают и контролируют на чистоту и типичность роста путем высева по 0,5-1,0 см³ на 2 пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым или минеральным маслом, агаром Сабуро и на 2 флакона с МПБ и МППБ. Высевы на агаре Сабуро выдерживают при температуре 18-20⁰С в течение 10 суток, а на МПА, МПБ, МППБ при температуре 36-37⁰С в течение 48 часов.

Расфасовка

Расфасовку проводят с соблюдением правил асептики в стерильные флаконы, установленные в кассеты с помощью полуавтоматов для расфасовки ил вручную с помощью шприцов в 5, 10, 20 и 50,0 флаконы. Погрешность расфасовки 3%.

Предварительное укупоривание

После расфасования флаконы в зависимости от типа сублиматора предварительно укупоривают пробками "УЛ-1" или накрывают тройным слоем стерильной марли и передают на замораживание. Операцию предварительного укупоривания флаконов пробками осуществляют при использовании сублиматоров типа ТГ-50,4, оснащенных укупорочными устройствами. В случаях использования сублиматоров без укупоривающих устройств, кассеты накрывают тройным слоем стерильной марли и бязевой салфеткой и передают на заморозку.

Замораживание

Расфасованную вакцину замораживают в холодильниках типа АСШ-28. Кассеты с вакциной помещают в предварительно охлажденную до минус 50-60⁰С холодильную камеру.

Контроль температуры в материале при замораживании осуществляют по трем датчикам, размещенным в местах максимально удаленных от вентилятора камеры и расположенным в центре кассет.

При достижении температуры равной минус 45-50⁰С материал выдерживают в течение 48-72 часов в холодильной камере при температуре в камере минус 50-60⁰С.

Высушивание

Кассеты с замороженным до минус 45-50⁰С материалом быстро перегружают в предварительно подготовленный сублиматор. Высушивание производят по следующей схеме:

после загрузки материала и подключения датчиков, контролирующих температуру материала и полок, сублиматор герметизируют и вакуумируют до остаточного давления в камере 40-60 мкм рт.ст (5-8 Ма);

температура материала на фазе сублимации, поддерживаемая в течение первых 12-15 часов сушки, минус 32-30⁰С;

температура полок в пределах (в зависимости от типа установки и достигнутого уровня вакуума) минус 30-20⁰С;

время сублимации до 0⁰С в материале - не менее 70% времени сушки;

максимальная температура материала при досушивании +25-28⁰С;

время досушивания при максимальной температуре материала - не более 10 часов;

общее время сушки 68-72 часа при расфасовке 5,0-10,0 см³ вакцины.

После окончания сушки выключают вакуум-насосы и заполняют камеру сублиматора очищенным сухим воздухом. Воздух подают в камеру стерильный через силикапельные фильтры или инертным газом.

Окончательное укупоривание флаконов производят механически с помощью прижимной плиты перед извлечением вакцины из камеры.

При использовании установок, не снабженных прижимными плитами (укупорочным устройством сублиматора), вакцину переносят в стерильный бокс, где укупоривают стерильными пробками.

Время окончания процесса сушки считают датой изготовления вакцины. Серией вакцины считают определенное количество препарата, изготовленного в процессе одного технологического цикла при одновременном выращивании культуры производственного штамма, с последующим одновременным ресуспендированием бактериальной массы в одной емкости, фасованием и высушиванием в одном аппарате, имеющего одинаковую концентрацию живых бактерий рожи, оформленное одним документом о качестве (паспортом) с указанием: наименования предприятия-изготовителя, препарата, номеров серии и госконтроля, даты изготовления, результатов испытания по показателям качества, срока годности, условий хранения, обозначения ТУ, номера и даты выдачи документа о качестве, заключении и подписи лица, выдавшего документ о качестве.

Обкатка флаконов

Флаконы с сухой вакциной, укупоренные пробками, вынимают из кассет сублиматора, вручную накладывают стерильные алюминиевые колпачки и передают на полуавтомат закаточный для их обкатки. Кассеты с флаконами, не укупоренными пробками, извлекают из камеры сублиматора и в условиях асептики осуществляют укупоривание, а затем вручную накладывают стерильные алюминиевые колпачки и обкатывают на закаточном полуавтомате.

Этикетирование

Закатанные флаконы с сухой вакциной передают на полуавтомат для печати текста по стеклу или наклеивают этикетки с указанием наименования предприятия-изготовителя, препарата, номера серии и контроля, даты изготовления, срока годности, условий хранения, количества доз во флаконе и обозначения технических условий, надпись "Для ветеринарной медицины".

Укладка и упаковывание

Флаконы с вакциной укладывают в картонные коробки по 10 штук с раздельными перегородками, обеспечивающими целостность препарата. В каждую коробку вкладывают наставление по применению вакцины и номер упаковщика. На коробку с флаконами наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное название вакцины, номер серии и контроля, количество флаконов в коробке, количество доз во флаконе, количество флаконов в коробке, дату изготовления (месяц, год), срок годности, условия хранения и обозначение технических условий.

Коробки с вакциной укладывают в деревянные ящики массой брутто не более 20 кг, которые, при условии транспортирования и хранения, должны обеспечить сохранность препарата. Внутрь каждого ящика вкладывают лист с указанием наименования вакцины и растворителя, количества флаконов вакцины и растворителя, даты упаковки, номера или фамилии упаковщика. В каждый ящик вкладывают растворитель из расчета 1 дм³ на 1000 доз вакцины.

На каждый ящик наносят транспортную маркировку со следующими обозначениями: наименование предприятия-изготовителя и его адрес, название вакцины и растворителя, количества флаконов вакцины и растворителя в ящике, номер серии вакцины и растворителя, дата изготовления, срок годности, условия хранения, манипуляционные знаки "Хрупкое. Осторожно", "Ограничение температуры", "Верх".

Совмещение транспортной маркировки и маркировки, характеризующей данные об упакованной продукции, на одной стороне транспортной тары не допускается.



Контроль сухой вакцины против рожи свиней с растворителем

Контроль биопрепарата проводят по следующим показателям: определение растворимости, массовой доли влаги в вакцине, контаминации вакцины посторонними микроорганизмами и морфологии вакцинного штамма, количества живых бактерий и доз во флаконе (ампуле), безвредности вакцины, ее иммунобиологической активности.

Определение растворимости. В каждый из 5 флаконов (ампул) с вакциной , отобранных для исследования, вместимостью 5, 10, 20 или 50 см³ добавляют соответственно по 2,5; 5,0; 10,0 и 25,0 см³ растворителя. Вакцина должна раствориться не более чем за 3 минуты с образованием гомогенной взвеси.

Определение массовой доли влаги в вакцине. Определение показателя производят по ГОСТ 24061-89. Массовая доля влаги в вакцине должна быть в пределах 1,0 - 3,5%.

Определение контаминации вакцины посторонними микроорганиз-мами и морфологии вакцинных штаммов. Из каждого флакона (ампулы) производят посевы в объеме 0,2 см³ в пробирки с МПБ, средой Китта-Тароцци и Сабуро и по 2 см³ во флаконы с МПБ и средой Китта-Тароцци и 3-4 чашки Петри с МПА по Дригальскому. Посевы на МПА и МПБ выдерживают в течение 24-48 часов при температуре 36-38⁰С, на агаре Сабуро - при температуре 18-22⁰С в течение 10 суток.

В посевах на МПБ, МПА в течение 48 часов и средах Китта-Тароцци и Сабуро в течении 10 суток не должно быть роста посторонних микроорганизмов. Вакцинный штамм должен давать на МПА через 48 часов роста гладкие колонии, на МПБ через 24 часа - равномерное нежное помутнение.

Определение количества живых бактерий и доз во флаконе (ампуле) с вакциной. Для испытания применяют 2 разведения вакцины: 10^-6 и 10^-7. Из каждого разведения проводят посевы по 0,1 см³ на МПА или агар Хоттингера в 3 чашках. Посевы выдерживают при температуре 37⁰С в течение 48 часов. После инкубирования подсчитывают количество выросших колоний в чашках по каждому разведению. Полученные показатели суммируют и делят на количество чашек Петри, определяя среднее количество живых бактерий для каждого разведения, содержащихся в 0,1 см³. Затем средние показатели увеличивают в 10 раз, получая количество живых микробных клеток по одному разведению вакцины. После этого добавляют столько нулей, каков показатель сделанного разведения, получая концентрацию микробных клеток исследуемой вакцины по данному разведению. Затем выводят среднюю концентрацию микробных клеток в 1 см³ вакцины, сложив результаты двух взятых разведений и разделив их на 2.

Количество живых бактерий во флаконах (ампулах) с вакциной вместимостью 5,; 10,0; 20,0 и 50, см³ должно быть соответственно не менее 1, 2, 4 и 10 млрд. м.к.

Количество доз вакцины устанавливают путем деления показателя количества живых бактерий во флаконе (ампуле) с вакциной на количество животных микробных клеток содержащихся в одной дозе.

Одна иммунизированная доза для свиней соответствует 150-200 млн. живых бактерий рожи.

Пример: В разведении 10^-7 в 3 чашках Петри выросло 45 колоний, следовательно: 45 : 3 х 10 х 10⁷ = 1,5 млрд. живых бактерий в 1 см³ вакцины.

В разведении 10^-6 в чашках Петри выросло 510 колоний, следовательно: 510 : 3 х 10 х 10⁶ = 1,7 млрд. живых бактерий в 1 см³ вакцины.

Средняя концентрация микробных клеток: (1,5 млрд.м.к.+1,7 млрд.м.к.) : 2 = 1,6 млрд.м.к. в 1 см³ вакцины.

Количество живых бактерий во флаконе (ампуле) при фасовке вакцины по 5 см³ будет соответствовать: 1,6 млрд.м.к. х 5 = 8 млрд.м.к.

Для определения количества доз во флаконе (ампуле), содержащем 5 см³ вакцины, количество живых микробных клеток, т.е. 8 млрд. делят на одну иммунизированную дозу для свиней, т.е. на 200 млн.м.к.: 8 млрд.м.к. : 200 млн.м.к. = 40 доз. Таким образом, во флаконе (ампуле), содержащем 8 млрд. живых микробных клеток при фасовке вакцины по 5 см³ содержится 40 доз.

Количество доз во флаконах (ампулах) при фасовке вакцины по 2,5; 5,0; 10,0 и 25,0 см³ должно быть соответственно не менее 5, 10, 20 и 50 доз.

Определение безвредности вакцины. Объединенную пробу вакцины разводят растворителем до концентрации 500-600 млн. живых микробных клеток в 1 см³. Подготовленную вакцину вводят подкожно в область спины 20 белым мышам массой 16-18 г по 0,2 см³ (100-120 млн. живых микробных клеток).

Вакцину считают безвредной, если все белые мыши останутся живыми в течение 10 суток наблюдения.

Определение иммуногенной активности вакцины. Для определения иммуногенной активности вакцины используют белых мышей, находящихся в опыте по проведению определения безвредности. Через 11-12 суток 10 вакцинированных и 10 контрольных (неиммунизированных) мышей аналогичной массы заражают подкожно стандартной бульонной культурой контрольного штамма № 149 возбудителя рожи свиней, разведенной физиологическим раствором в дозе по 10 ЛД₅₀ в объеме 0,1 см³.

Вакцина должна предохранять от гибели не менее 8 мышей из 10 вакцинированных животных, при гибели 10 контрольных мышей в течение 3-4 суток.



Список использованной литературы

1. Багрецов В.Ф. Аэрозольная вакцинация свиней против чумы и рожи // Учен. зап. / Витеб. гос. акад. вет. медицины. - Витебск, 1996. - Т. 33. - С. 51-52.

2. Гусев А.А., Рыбаков С.С. Достижения биотехнологии и защита животных от инфекционных заболеваний // 100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России: Тез. докл. науч-произв. конф., 27-30 августа 1996. - Курск, 1996. - С. 95-100.

3. Коняев М.Т. Зависимость эффективности использования противорожистых вакцин от их иммуногенности и схем применения // Науч. основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: Тез. докл. Всесоюз. конф., 24-25 октября 1978. - М., 1978. - С. 80-82.

4. Максимович В.В. Особенности эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в РБ и перспективы ее улучшения // Ветеринарные и зооинженерные проблемы животноводства: Материалы 1 международной науч.-практ. конф., Витебск, 1996 г. - Минск, 1996. - С. 121.

5. Никифорова Н.М., Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А. Рожа свиней // Ветеринарные препараты / Под ред. Д.Ф.Осидзе. - М., 1981. - С. 266-274.

6. Ображей А.Ф., Тындык В.С. Вакцинопрофилактика рожи свиней на Украине // Общ. Эпизоотология: иммунол., экол. и методол. пробл.: Материалы междун. Науч. Конф. - Харьков, 1995. - С. 438-440.

7. Определение сроков формирования иммунитета у животных, иммунизированных эмульгированной вакциной против рожи свиней / Душук Р.В., Полесных Л.А., Тихонов Л.И., Козырев Ю.А. // Сб. науч. тр. ВГНКИ / Всерос. гос. НИН контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов. - 1994. - Т. 55. - С. 21-26.

8. Профилактика и борьба с рожей свиней / Душук Р.В., Подлесных Л.А., Тихонов Л.И., Шаповалова Н.А. // Ветеринария. - 1993. - №7. - С. 52-56.

9. Специфическая профилактика рожи свиней / Р.В. Душук, Л.А Подлесных, О.Б. Дьяконов и др. // Ветеринария. - № 3. - С. 33-35.

10. Сухая живая вакцина против рожи свиней / Подлесных Л.А., Дьяконов О.Б., Душук Р.В. и др. // Ветеринария. - 1985. - № 3. - С. 31-33.

11. Construction and vaccine potential of acapsular mutants of Erysipelothrix rhusiopathiae: use of excision of Tn916 to inactivate a target gene / Shimoji Y., Mori Y., Sekizaki T. Et all. // Infection-and-immunity. - 1998. - V. 66 (7). - P. 3250-3254.

12. Kucerova Z. History and present state of swine erysipelas immunoprophylaxis. Properties of the WR-2 vaccine strain used for preparing the Erysen vaccine // Veterinarstvi. 1993. - Vol. 43 (10). - P. 383-387.

13. Кumar J., Rae K., Lindjaerv R. Optimizing the culture medium formula of Erysipelothrix rhusiopathiae // Veterinary-Medicine. - 1998. - P. 122-128.

14. Mowat N., Rweyemanu M. Vaccine manual. The production and quality control of veterinary vaccines for use in developins countries // Animal Prod. and Health Ser. - Rome, 1997. - S. 34-38.

15. Redhead K., Pugh C., Jensen N. Cross protection against Erysipelothrix rhusiopathiae serotype 10 induced by a serotype 1 and 2 vaccine // Veter. Rec. - 1998. - Vol. 142, N 22. - P. 612.

16. Vaccine prophylaxis of swine erysipelas / Dushuk R.V., Podlesnykh L.A., Tikhonov L.I. et all. // Proceedings: The 13^th International Pig Veterinary Society Congress, 26030 June 1994/ - Bangkok, 1994. - P. 229.

Размещено на Allbest.ru