Исследование системы крови животных. Определение количества лейкоцитов

При исследовании крови не ограничиваются только подсчетом абсолютного количества форменных элементов. Необходимо также определять величину, форму, структуру ядра и цитоплазмы, наличие разных включений в цитоплазме клеток. Важным представляется и определение соотношения между различными формами отдельных клеток крови.

Для этого следует хорошо знать морфологию форменных элементов крови, а также схему кроветворения. Дело в том, что при целом ряде заболеваний в крови животных появляются как морфологически измененные, так и незрелые клетки. Особенно важное значение приобретают эти знания при исследовании костномозгового пунктата.

Изготовление, фиксация и окрашивание мазков крови

Изготовление мазков крови (очень кратко).

Фиксация мазков (цель, чем фиксируются).

Окраска мазков. Следует помнить, что основа успешного исследование морфологических особенностей клеток - это правильно и четко окрашенный мазок крови. Посредством окраски четко выявляется структура как ядра, так и цитоплазмы клетки. Принцип методов окраски мазков крови открыт русским ученым-паразитологом Д.Л.Романовским в 1891 г. Он заключается в том, что структуры клетки избирательно, по-разному поглощают три краски: азур I, метиленовую синь и эозин. Именно эти краски составляют основу способа окраски мазков крови по Романовскому, который часто называют способом Романовского-Гимзы.

Известно, что структуры и органеллы клетки обладают кислой, щелочной и нейтральной реакцией. Согласно законов химии кислые компоненты хорошо взаимодействуют со щелочными красителями, щелочные - с кислыми, а нейтральные и с теми, и с другими.

В процессе окраски, ядро клетки, богатое нуклеопротеидами и нуклеиновыми кислотами, окрашивается основными красками базофильно (фиолетово-красный или синий цвет) с избирательным поглощением азура. Цитоплазма молодых клеток богата, как правило, нуклеиновыми кислотами и поглощает преимущественно метиленовую синь. Цитоплазма зрелых клеток (в основном нейтрофилов и эозинофилов) щелочная и окрашивается эозином в розово-красный цвет.

Однако для получения именно такой окраски необходимо соблюдать ряд условий. Прежде всего, дистиллированная вода, используемая для разбавления краски должна иметь строго нейтральную реакцию, а лучше всего использовать буферные растворы (фосфатный). Требуется точно выдерживать время окраски и, при этом, следить за температурой в помещении. И еще, рабочий раствор краски Романовского из концентрата следует готовить непосредственно перед употреблением.

Кроме окраски мазков крови по Романовскому можно использовать и другие способы, которых предложено великое множество.

Окраска по Лейшману (состав краски - 1 г смеси в равных соотношениях азура I, метиленовой сини и эозина желтого на 100 мл метанола). При этом окрашивают нефиксированный мазок, на который наливают 2 мл краски, затем через 3-5 мин. добавляют равное количество нейтральной воды и докрашивают еще 5-10 мин. Этим способом хорошо окрашивается зернистость цитоплазмы и слабо красится ядро. Поэтому мазки лучше потом еще докрасить по Романовскому. Способ чаще используют при окрашивании мазков крови птиц.

Окраска по Май-Грюнвальду (состав краски - по 0,5 г эозина и метиленовой сини, 100 мл метанола, 50 мл глицерина). Раствор наносят на нефиксированный мазок на 3 мин., затем к нему приливают равное количество нейтральной дистиллированной воды и еще красят 10-15 мин. Эритроциты и зернистость гранулоцитов при этом окрашиваются в розово-красный цвет, ядра прокрашиваются плохо и имеют слабо-голубой цвет. Поэтому лучше использовать двухмоментный способ окраски, который, по автору, называется методом Паппенгейма. Им мы и будем пользоваться на ЛПЗ.

При этом, на нефиксированный мазок крови наносят 2,0 мл неразбавленной краски Май-Грюнвальда. Через 3 минуты к краске на мазке добавляют 2 мл дистиллированной воды. Через 1 минуту краску с препарата сливают сразу же на мазок, не высушивая, наносят разбавленный в 10 раз фосфатным буфером концентрат краски Романовского. Мазок докрашивают в течение 10-13 мин. Затем промывают под слабой струей водопроводной воды и высушивают (можно фильтровальной бумагой).

С целью обнаружения различных изменений и включений в клетках крови используют и другие методы: по Браше и Фельгену - для выявления нуклеиновых кислот; по Шабодашу - для выявления гикогена; по Гольдману - для выявления липидов; по Гомори - для выявления кислой и щелочной фосфатазы и др. Но в заключение вопроса должен заметить, что механизм окраски клеток до настоящего времени еще полностью не изучен.

5. Морфология лейкоцитов крови у животных разных видов

В зависимости от свойств цитоплазмы и характера зернистости лейкоциты разделяют на гранулоциты (зернистые) -- базофилы, эозинофилы и нейтрофилы, и агранулоциты (незернистые) -- лимфоциты и моноциты.

Базофилы круглой или немного овальной формы, имеют величину 10-14 мкм. У зрелых форм ядро полиморфное, плохо заметное, с неясными очертаниями, окрашено в слабо-фиолетовый цвет с бордовым оттенком или в фиолетовый цвет. Цитоплазма слабо окрашена в розовый или бледно-фиолетовый цвет вследствие выхождения вещества гранул, которые разрушаются при окраске мазка. Гранулы круглой или расплывчатой формы, окрашены в темно- фиолетовый, темно-синий или черный цвет, они обычно разрушены с образованием вакуолей.

Эозинофилы круглой формы, величиной 10-25 мкм. Цитоплазма слабоголубая, содержит розово-красную или ярко-красную зернистость круглой или слегка овальной формы. Характер ядра зависит от степени зрелости клетки: у зрелых форм оно сегментированное, у молодых -- округлое; окрашено в фиолетовый цвет. У лошадей, крупного рогатого скота и свиней ядро чаще состоит из двух сегментов, а у овец, коз и собак -- из трех. Наиболее крупные гранулы у лошадей и собак. У кошек гранулы расположены в цитоплазме зозинофилов очень густо и нередко имеют палочковидную форму неодинаковой величины. При растворении гранул на месте их образуются вакуоли, в раздавленных клетках гранулы лежат свободно, «рассыпавшись».

Нейтрофилы имеют круглую форму, размером 10-15 мкм. По степени зрелости различают миелоциты, юные (метамиелоциты), палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы.

Миелоциты (М) характеризуются неравномерно окрашенным в фиолетовый цвет круглым или овальным ядром, расположенным часто эксцентрически. Цитоплазма окрашена или в бледно-синеватый или розовый цвет, в ней содержится мелкая зернистость розового цвета. В крови здоровых животных не встречаются.

Юные нейтрофилы имеют бобовидные или колбасовидное ядро, неравномерно окрашенное в фиолетовый цвет (светлые участки перемежаются с темными) Цитоплазма розового цвета, иногда плохо прокрашенная, содержит мелкую, нежную зернистость розового цвета. У взрослых здоровых животных в периферической крови они, как правило, не обнаруживаются.

Палочкоядерные нейтрофилы относятся к зрелым формам и у здоровых животных постоянно встречаются в крови. Ядро вытянуто в виде палочки, которая может быть изогнута в виде подковы, дужки, латинской буквы S, на концах булавовидно вздуто, в отдельных местах наблюдаются перехваты, окрашивается неравномерно в темно-фиолетовый цвет. Цитоплазма розового цвета с мелкой розоватой зернистостью (часто плохо видна).

Сегментоядерные нейтрофилы отличаются от палочкоядерных лишь характером ядра, которое состоит из 2--5 сегментов, между которыми имеются перемычки; окрашивается в темно-фиолетовый цвет.

Лимфоциты по величине разделяют на малые (до 10 мкм), средние (10-- 14 мкм) и большие (15-25 мкм). Они имеют круглое ядро темно-фиолетового цвета. Цитоплазма слабо-голубого цвета, вокруг ядра имеет зону просветления (перинуклеарная зона); у малых лимфоцитов ее может быть очень мало («голоядерные» лимфоциты); иногда в цитоплазме содержатся азурофильные зерна ярко-красного цвета. У здоровых животных в переферической крови преобладают малые лимфоциты, а средние и большие составляют не более 5--6%; в отдельных случаях они могут даже отсутствовать.

Моноциты являются самыми крупными клетками периферической крови (15-25 мкм), округлой или нередко неправильной формы. Ядро разнообразной формы -- в виде подковы, бабочки, трилистника, бобовидное с выбухтовываниями, но может быть сильно лопастным и грубо сегментированным, неравномерно окрашивается в слабо-фиолетовый цвет с темно-фиолетовыми пятнами («пятнистое»). Цитоплазма серо-дымчатого, серо-синеватого, голубовато- серого цвета, со светло-фиолетовым оттенком, вблизи от ядра содержит мелкую пылевидную зернистость.

Размещено на Allbest.ru