Генетические и биохимические особенности вирусных заболеваний на примере гепатита

В результате интеграции вирусы долгое время не проявляют себя. При изучении оказывается, что присутствие вирусов можно обнаружить по появлению новых антигенов на поверхностях клеток (поверхностные антигены). Клетки, содержащие в своем составе онкогенные вирусы, трансформируются, приобретают способность к безудержному росту, что является признаком злокачественности. Предполагается что трансформацию вызывает специальный белок, который закодирован в геноме вируса. Беспорядочное деление приводит к образованию очагов, или фокусов, трансформации. Когда это происходит в организме, возникает предрак. Появление на клеточных мембранах поверхностных опухолевых антигенов делает их «чужими» для организма, и они начинают распознаваться иммунной системой как мишень. [23]

Опухоли чаще возникают у пожилых людей, когда иммунная система становится менее активной. Возможно, скорость деления трансформированных клеток, которая носит безудержный характер, обгоняет иммунный ответ. Онкогенные трансформирующие вирусы подавляют иммунную систему или обладают иммуносупрессорным действием. Изучение опухолеродных вирусов позволило выявить в их составе онкогены - раковые гены, вследствие деятельности которых нормальные клетки в опухолевые. Онкогенные (опухолеродные) вирусы, согласно их молекулярной структуре генома, подразделяются на две категории: первая, содержащая в качестве генома ДНК; вторая - РНК. Онкогенные вирусы, обладающие ДНК-геномом, распределены по нескольким группам и обладают онкогенными свойствами.

Такие вирусы способны индуцировать опухоли у позвоночных, а также трансформировать культуры клеток. Они являются обязательной составной частью генетического аппарата вирусов и выполняют функции, необходимые для размножения самих вирусов. К ДНК-содержащим онкогенным вирусам относятся паповавирусы, аденовирусы, герпесвирусы и вирусы гепатита (гепаднавирусы). Онкогенные РНК- содержащие вирусы являются членами одного семейства - ретровирусов, которые не нужны для размножения вирусов. Они нередко делают их дефектными, неспособными к размножению без вируса - помощника. Это семейство включает все вирусы, имеющие в качестве генома РНК и содержащие фермент РНК - зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу). Эти онкогены имеют клеточное происхождение (и в нормальной клетке имеются гены, сходные с вирусными онкогенами). Поэтому их нередко называют протоонкогенами. Всвязи с тем, что геном онкогенных вирусов входит в состав клеточного генома (интегрирует с ним), то интеграция является обязательной стадией размножения опухолеродных РНК - содержащих вирусов (онковирусов). В ходе репликации (размножения) геном онковируса может захватывать близлежащие клеточные гены, которые становятся вирусными онкогенами.[25]

Подобные процессы происходят и без участия вирусов, роль которых выполняют блуждающие гены, или транспозоны, имеющиеся в нормальных клетках. Они могут перемещаться в разные места генома. Их важной особенностью является наличие особых структур - промоторов, стимулирующих транскрипцию соседних с ними генов. При перемещении они могут захватывать соседние гены и перемещать их в соседние участки генома.

Таким образом, транспозоны могут либо переносить клеточные гены в необычные для них места, либо с помощью промоторов заставлять функционировать «молчащие гены». Эти гены играют важную роль в нормальной жизнедеятельности клеток (включая размножение), то перенос их в новое место или под сильный промотор (стимулятор синтеза и-РНК для синтеза соответствующих белков) резко нарушает жизнедеятельность клеток. При этом вирусные клеточные онкогены, происходящие от нормальных клеточных генов, претерпевают изменения вследствие мутации. Все ретровирусы имеют общие химические, биофизические и морфологические свойства, относящие их к одному семейству. Вирионы разных групп ретровирусов содержат 60-70% белков: в их числе продукты генов (gag- внутренние структурные белки, pol - обратная транскриптаза и env - белки вирусной оболочки) ; 35-40 % липидов (происходящих из клеточной мембраны); 2-4% углеводов и 1% РНК. По ультраструктуре ( морфологии) ретро-вирусы подразделяются на четыре типа A, B, C и D. Геномная РНК ретро-вирусов («плюс» -цепь РНК или положительный геном) представляет собой 60-70 Б-димерный комплекс двух идентичных субъединиц размером 8-10 тысяч оснований, которые по своей структуре соответствуют молекуле и-РНК. В 60-70 Б-комплекс входят две молекулы клеточной т-РНК. [33]

Для того, чтобы различать определенные трансформирующие элементы вирусного генома, используют трехбуквенные обозначения каждого из онкогенов. Обозначения трансформирующих последовательностей происходит от названия вируса, в котором впервые они были обнаружены, и не означает их специфичности для клетки-мишени или функции онкобелка. Родственные, но неидентичные вирусные онкогены часто обнаруживаются в независимых вирусных изоляторах, поэтому их названия соответствует первоисточнику, к которому добавляется лишь сокращенное наименование вирусного штамма. Вирусные и родственные им клеточные последовательности обозначают: “V” - вирусный и “C” -клеточный онкогены; вирусные и клеточные трансформирующие последовательности обозначают: Онк-ген или онкоген (то есть вирусный) или протоонкоген - его клеточный «родственник». Все индуцируемые вирусными онкогенами неопластические процессы имеют следующие патоморфологичекие характеристики: а) саркомы, возникающие из соединительно-тканных (мезенхимальных) элементов; б) лейкозы, связанные с трансформацией гемопоэтических клеток; в) карциномы (рак молочной железы у мышей).[33]

В настоящее время выделены три группы онкогенных вирусов, являющихся этиологическими факторами неопластических заболеваний человека.Это ретро-вирус Т лимфолейкоза взрослых людей, а также герпес-вирусы и вирусы гепатита В.[13]

1.2.3 Классификация и генетические особенности инфекционного процесса вирусов гепатита

Вирусные гепатиты -- группа заболеваний с общими клиническими синдромами -- представляют собой серьезнейшую глобальную проблему. Только гепатитом А ежегодно в странах СНГ заболевало более 1 млн человек. Сколько человек ежегодно инфицируется вирусом гепатита В, сказать трудно во всяком случае не менее 50 млн человек. Если еще несколько лет тому назад в мире насчитывалось примерно 200 млн носителей вируса гепатита В, то теперь, по данным ВОЗ, носителей вируса гепатита В в мире более 2 млрд человек. Гепатит А занимает по уровню заболеваемости и причиняемому экономическому ущербу одно из первых мест среди инфекционных болезней человека.[12]

Впервые инфекционный гепатит был выделен в самостоятельную нозологическую единицу в 1888 г. выдающимся русским врачом С. II. Боткиным. Он сумел дифференцировать инфекционный гепатит (катаральную желтуху) от других болезней печени, сопровождающихся желтухой. Поэтому в нашей стране инфекционный гепатит в течение многих десятилетий называли болезнью Боткина. Заражение инфекционным гепатитом происходит фекально-оральным путем. Однако, начиная с 30-х гг. XX в., а именно, после того как начались массовые заболевания желтухой среди привитых против желтой лихорадки, стало ясно, что существуют две этиологически и эпидемиологически разные формы гепатита; одну из них назвали инфекционным гепатитом, а другую -- сывороточным, поскольку заражение в последнем случае связывали с парентеральными манипуляциями. Следует сказать, что название «сывороточный гепатит» явно не совсем удачное, так как последний тоже является инфекционным заболеванием, как и инфекционный гепатит. Поэтому еще в 1947 г. Ф. Мак-Каллум предложил называть инфекционный гепатит гепатитом А, а сывороточный гепатит -- гепатитом В. Это предложение было узаконено ВОЗ только в 1973 г.[15]

В 1974 г. была выделена еще одна форма вирусного гепатита, а именно гепатит ни А ни В, а в 1977 г. был обнаружен возбудитель дельта-гепатита. Тот факт, что инфекционный и сывороточный гепатиты вызываются вирусами, был установлен давно в опытах на добровольцах, однако их истинные возбудители были обнаружены в 70-х гг. XX в. Это обусловлено тем, что, во-первых, указанные вирусы долгое время не удавалось выращивать в культурах клеток, во-вторых, долгое время не могли обнаружить восприимчивых к ним животных.[17]

Вирусный гепатит А -- инфекционная болезнь человека, характеризующаяся преимущественным поражением печени и проявляющаяся клинически интоксикацией и желтухой. Вирус гепатита А был обнаружен в 1973 г. С. Фейнстоном с помощью метода иммунной электронной микроскопии и путем заражения обезьян - шимпанзе и мармозеток.

Вирус гепатита А имеет сферическую форму, диаметр вириона -- 27 нм. Геном представлен однонитевой позитивной РНК с м. м. 2,6 МД. Суперкапсид отсутствует. Тип симметрии кубический -- икосаэдр. Капсид имеет 32 капсомера, он образован четырьмя полипептидами (VP1--VP4). По своим свойствам вирус гепатита А отнесен к роду Heparnovirus, семейству Picornaviridae. В антигенном отношении вирус гепатита A (HAV -- hepatitis A virus) является однородным. Н AV хорошо размножается в организме шимпанзе, павианов, гамадрилов и игрунковых обезьян (мармозеток). Длительное время вирус не умели культивировать. Лишь в 1980-х гг. удалось получить культуры клеток, в которых HAV размножается. Вначале для этих Целей использовали перевиваемые линии клеток почки эмбриона макака-резус (культура FRhK-4), а сейчас -- перевиваемую линию клеток почек зеленых мартышек (культура 4647).[13]

Гепатит В -- инфекционное заболевание человека, характеризующееся избирательным поражением печени вирусом. Эта форма гепатита является наиболее опасной по своим последствиям среди всех известных форм вирусных гепатитов. Его возбудителем является вирус гепатита В (HBV).

Впервые антиген вируса гепатита В был обнаружен Б. Блюмбергом в 1964 г. в сыворотке крови австралийского аборигена, а сам возбудитель был обнаружен в 1970 г. Д. Дейном и получил название частиц Дейна, поскольку не было полной уверенности в том, что это действительно вирус, а не его компоненты. В последующем все сомнения отпали, так как в составе частиц Дейна были обнаружены геномная ДНК и вирусная ДНК-зависимая ДНК-полимераза. В составе вириона имеются три основных антигена, для которых в 1974 г. были введены следующие обозначения:[13]

Поверхностный антиген -- HBsAg -- существует в виде трех морфологически различных вариантов: 1) представляет суперкапсид цельного вириона; 2) в большом количестве встречается в виде частиц диаметром 20 нм, имеющих сферическую форму; 3) в виде нитей длиной 230 нм. Химически они идентичны. В составе HBsAg имеется один общий антиген а и две пары взаимоисключающих типоспецифических детерминантов: А/у и w/r, поэтому существуют четыре основных субтипа HBsAg (и соответственно HBV): adw, adr, ayw и ауг. Антиген а обеспечивает формирование общего перекрестного иммунитета ко всем субтипам вируса.

Собственно вирион -- частица Дейна -- имеет сферическую форму и диаметр 42 нм. Суперкапсид вириона состоит из трех белков: главного (основного), большого и среднего. Геном заключен в капсид и представлен двунитевой кольцевидной ДНК с м. м. 1,6 МД. ДНК состоит приблизительно из 3200 нуклеотидов, однако ее «плюс»-нить на 20--50 % короче «минус»-нити. С 5'-концом длинной нити ковалентно связан вирусспецифический белок. 5'-концы обеих нитей комплементарны и образуют «липкие» последовательности длиной в 300 нуклеотидов, благодаря чему нити замыкаются в кольцо. Содержание Г + Ц в вирионной ДНК 48--49 мол %. В сердцевине вириона находится кроме геномной ДНК-вирусная ДНК-зависимая ДНК-полимераза. «Минус»-нить ДНК HBV содержит всего четыре гена (S, С, Р и X), но они организованы очень компактно Гены S, С, Р, X сильно перекрываются и контролируют синтез следующих продуктов. Ген S кодирует синтез главного белка оболочки и содержит всю информацию о поверхностном антигене HBsAg. Кроме того, он кодирует синтез среднего и большого белков оболочки. Белки содержат общий СООН-конец, но их трансляция начинается с трех различных инициаторных кодонов. Ген С кодирует синтез капсидных белков (HBcAg и HBeAg); хотя эти белки кодируются одним геном, пути их трансляции различны. Ген Р -- самый большой. Он включает в себя часть всех трех других генов и кодирует ферменты, необходимые для репликации вируса. В частности, он кодирует обратную транскриптазу, домен фермента РНК-азы Н, 5'-концевой белок «минус»-цепи. Ген X кодирует белки, регулирующие экспрессию (выражение) всех вирусных генов, в частности белок с м. м. 17 кД, который является трансактиватором транскрипции генов.[35]

Белки, образующие поверхностный антиген, существуют в гликозилированной (gp) и негликозилированной форме. Гликозили-рованными являются gp27, gp33, gp36 и gp42 (цифры обозначают м. м. в кД). Суперкапсид HBV состоит из главного, или основного, S-белка (92 %); среднего М-белка (4 %) и большого, или длинного, L-белка (1 %).

Главный белок -- p24/gp27, или основной белок (белок S), является основным компонентом оболочки HBV. В отсутствие других оболочечных белков он полимеризуется и образует сферические частицы диаметром 20 нм, которые состоят из 100 полипептидных молекул. Большой белок -- p39/gp42, или длинный белок (белок L), присутствует во всех трех формах HBsAg. Он играет важную роль в морфогенезе вирионов и в выходе их из клетки. L-белок содержит последовательность белка М, которая на N-конце дополнена последовательностями из 108 (ayw) или 119 (adw, adr, ауг) аминокислотных остатков, кодируемых npe-Sl-областью S-гена.

Средний белок -- gp33/gp36, или белок М, также присутствует во всех трех морфологических формах HBsAg. Белок М содержит на N-конце участок из 55 аминокислотных остатков, кодируемых пре-52-областью S-гена. Предполагается, что этот участок играет важную роль в распознавании вирусом гепатита В клеток печени ограниченного круга хозяев (человек, обезьяна шимпанзе). Последовательности белков, кодируемых npe-S-областями S-гена, обладают высокой иммуногенностью, а их детерминанты расположены на поверхности вириона. Поэтому антитела против этих антигенов играют важную роль в формировании иммунитета против гепатита В.[18]

Синтез вирусных белков жестко контролируется на уровне транскрипции и трансляции. При транскрипции вирусного генома синтезируются два типа мРНК:

а) меньшая -- 2100 нуклеотидов -- кодирует главный и средний белки оболочки;

б) большая -- 3500 нуклеотидов, т. е. длиннее самой геномной ДНК; она содержит концевые повторы длиной 100 нуклеотидов. Этот вид мРНК кодирует белок капсида и продукты гена Р. Она также является матрицей для репликации вирусной ДНК. В составе генома есть энхансеры (усилители транскрипции) -- регуляторные элементы, которые активируют экспрессию всех вирусных генов и действуют преимущественно в клетках печени. В частности, ген S экспрессируется на очень высоДругие регуляториые элементы вируса гепатита В модулируют (контролируют) уровни синтеза отдельных белков. Например, большой белок синтезируется лишь в малом количестве. Больше всего его на поверхности инфекционных вирионов. А главный белок и, в меньшей степени, средний белок синтезируются в огромном количестве и покидают клетки в составе частиц поверхностного антигена, которых в сыворотке крови содержится во много раз больше, чем зрелых вирионов. Количество частиц поверхностного антигена может составлять 10¹¹--10¹³ на 1 мл крови (несколько сотен мкг).[25]

Вирус гепатита В выделен в новое семейство вирусов -- Hepadnaviridae, род Orthohepadnavirus. Сходные с ним гепаднавирусы обнаружены у различных животных (земляных белок, сурков, бурундуков, пекинских уток).[25]

Репродукция гепаднавирусов происходит несколько необычным образом. В частности, репликация геномной ДНК происходит через промежуточное звено -- РНК, т. е. с механизмом обратной транскрипции.[16]

Вирус проникает в клетку с помощью механизма рецепторо-посредованного эндоцитоза (окаймленная ямка -> окаймленный пузырек -> лизосома -> выход нуклеокапсида и проникновение вирусного генома в ядро гепатоцита). В ходе проникновения в клетку происходит удлинение (достраивание) короткой («плюс») цепи ДНК. В ядре клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует РНК размером 3500 нуклеотидов (прегеном) и мРНК, меньшие по размерам, для синтеза вирусных белков. Затем прегеном и вирусная ДНК-полимераза упаковываются во вновь синтезированный капсид, который переносится в цитоплазму. Здесь и происходит обратная транскрипция прегенома. На нем синтезируется новая «ми-нус» - нить ДНК. После завершения синтеза «минус»-нити ДНК прегеномная РНК разрушается. Вирионная ДНК-полимераза на «минус»-цепи синтезирует «плюс»-цепь. Вирусная ДНК, теперь уже двухцепочечная, может существовать в клетке довольно долго и возвращаться в ядро для следующего цикла репликации. Если новая вирусная частица не подвергается дальнейшей репликации, то сформировавшийся нуклеокапсид, проходя через мембрану клетки, покрывается суперкапсидом, отпочковывается от клетки, и в нем немедленно прекращается удлинение короткой «плюс»-цепи ДНК. Вот почему длина этой нити варьирует. При типичной острой форме гепатита В в крови последовательно появляются следующие серологические маркеры: HBsAg, HBeAg и антитела (IgM, IgG): анти-HBcAg. анти-HBeAg и анти-HBsAg.[15]

В составе вируса гепатита В нет онкогена, однако установлено, что, внедряясь в клеточную хромосому (в разные ее участки), вирусная ДНК может индуцировать в них различные генетические перестройки -- делеции, транслокации, амплификации, которые и могут стать причиной развития рака печени -- одного из самых тяжких последствий вирусного гепатита В.[17]

Вирус гепатита Е (HEV) имеет сферическую форму, диаметр 27--34 нм, тип симметрии нуклеокапсида икосаэдрический, наружной оболочки нет. Геном представлен одноцепочечной нефрагментированной позитивной РНК из 7500 оснований, содержит три открытые рамки считывания, кодирующие вирусспецифические белки. На поверхности вириона имеются вдавления, напоминающие чаши (греч. calyx), поэтому первоначально вирус был включен в семейство Cahciviridae (род Hepavirus). Более подробное изучение генома HEV показало, что нуклеотидная последовательность его РНК уникальна и имеет лишь некоторое сходство с вирусом краснухи. HEV имеет и ряд других существенных отличий от калицивирусов. Поэтому в 1998 г. было решено исключить его из семейства Cahciviridae и отнести его к неклассифицированным вирусам. Возможно, что это самостоятельный вид отдельного семейства.[21]

Источник инфекции -- только человек, возбудитель выделяется с испражнениями. Механизм заражения -- фекально-оральный. Основной путь заражения -- через загрязненную испражнениями воду. Заражающая доза по сравнению с вирусом гепатита А существенно выше. Восприимчивость к вирусу HEV всеобщая. Эпидемии могут охватить десятки тысяч людей при нарушении питьевого режима, особенно во время сезонных работ летом и осенью.[25]

Клинически болезнь протекает легче, чем гепатит А, перехода в хроническую форму не отмечено. У 85--90 % больных гепатит Е протекает в легкой или средней тяжести форме, часто бессимптомно. Однако у беременных женщин гепатит Е протекает тяжело -- с летальностью до 20 %.

Для диагностики используют метод иммунной электронной микроскопии; предложена тест-система для обнаружения антител к антигенам HEV. Постинфекционный иммунитет прочный, пожизненный, обусловлен вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти. Для специфической профилактики предложена цельновирионная вакцина и разрабатываются живые и рекомбинантные вакцины.[13]

Вирус гепатита С (HCV) относится к семейству Flavmridae, роду Hepacivirus; имеет суперкапсид, форма сферическая, диаметр 55--65 нм. Геном представлен однонитевой нефрагментированной РНК позитивной полярности длиной 9500--10 000 нуклеотидов. Образующийся при репликации вируса полипротеиновый предшественник разрезается клеточной и вирусной протеазами на белки: С (нуклеопротеин), 2 белка оболочки и 6 неструктурных белков, необходимых для регуляции репродукции вируса. Вирус отличается высокой изменчивостью всех генов. Известно до 14 геновариантов и более 50 их подтипов. Геновариант вируса определяет течение инфекции, переход ее в хроническую форму и в последующем -- развитие цирроза и карциномы печени. Наиболее опасны геноварианты lb и 4а. В России циркулируют генотипы lb, 2а, 2Ь и За. Вирус гепатита С распространен повсеместно. По данным ВОЗ, около 1 % населения планеты инфицировано HCV.Источником инфекции является только человек. Вирус у больных и носителей обнаруживается в 100 % случаев в крови (2/3 всех посттрансфузионных гепатитов вызывает HCV), в 50 % -- в слюне, в 25 % -- в сперме, в 5 % -- в моче. Это определяет пути заражения.[14]

Клиническое течение гепатита С легче, чем гепатита В. Вирус С называют «мягким убийцей». Желтуха наблюдается в 25 % случаев; до 70 % случаев заболевания протекают в скрытой форме. Независимо от тяжести течения в 50--80 % случаев гепатит С принимает хроническую форму, а у таких больных в 20 % случаев впоследствии развиваются цирроз, карцинома. В опытах на мышах установлено, что вирус гепатита С помимо гепатоцитов может поражать и нервные клетки, вызывая тяжелейшие последствия.Вирус в культуре клеток размножается плохо, поэтому диагностика его затруднена. Это один из немногих вирусов, для которых определение РНК -- единственный способ идентификации.[18]

Вирус гепатита G (HGV) открыт в 1995 г., относится к семейству Flaviviridae (род Hepacivirus). Геном вируса G -- одноцепочечная нефрагментированная позитивная РНК длиной 9500 оснований. Структурная организация генома вируса G подобна таковой HVC. Геном содержит одну большую рамку считывания, которая кодирует полипротеин-предшественник, содержащий около 2800 аминокислотных остатков. Он разрезается клеточной и вирусной протеазами с образованием двух структурных и не менее пяти неструктурных белков. Гены, кодирующие структурные белки (cor и env), прилегают к 5'-концу вирусной РНК, а гены неструктурных белков (хеликазы, протеазы, полимеразы) -- к З'-концу. Установлено, что неструктурные гены HGV сходны с генами вируса гепатита С, а также вирусов GBV-A и GBV-B. Все эти вирусы выделены в один род Hepacivirus семейства Flaviviridae. По строению структурных генов HGV не имеют ничего общего с GBV-A и HCV и лишь отдаленно напоминают GBV-B. Вирус гепатита G оказался идентичным вирусу GBV-C, выделенному также при изучении субпопуляции вирусов GBV от обезьян тамаринов, через которых пассировали РНК-вирус от больного острым гепатитом неустановленной этиологии, имевшего инициалы GB; в честь него все эти вирусы и получили название вирусов гепатита GBV-A, GBV-B, GBV-C. Вирус HGV (GB-C) имеет дефектный сог-белок и обладает менее выраженной изменчивостью, чем HCV. Выделено 3 типа и 5 субтипов генома HGV. Доминирует генотип 2а, в том числе и на территории России, Казахстана и Киргизии. Маркеры вируса G обнаружены у 2 % населения этих стран. Вирус G обнаруживается в разных странах мира у 1-2 % доноров крови, т. е. чаще, чем вирус гепатита С. Подобно гепатоцитным вирусам HBV/HCV этот вирус способен к персистенции, но реже ведет к хронической патологии, и протекает эта персистенция, вероятно, по типу здорового носительства. Острые клинические проявления гепатита G также менее тяжелы, чем при гепатитах В и С. Для диагностики гепатита G используют ЦПР и ИФМ.[22]

Вирус открыт японским ученым Т. Нисизавой (Т. Nishizava) [и др.] в 1997 г. в сыворотке больного (ТТ -- инициалы больного), но не в виде вириона, а как фрагмент его геномной однонитевой кольцевидной минус-ДНК размером 2,6 кД. Вирион диаметром 30--50 нм лишен липидной оболочки, капсид имеет кубический тип симметрии. ДНК содержит три открытые рамки считывания и нетранслируемый участок, содержащий много инвертированных повторов, за счет которого и происходят внутригеномные перестройки. Дифференцировано более 16 генотипов. Вирус идентифицирован как первый представитель нового семейства Circinoviridae. Диагностика основана на выявлении вирусной ДНК с помощью ПЦР. Вирусоносительство среди населения достигает 80 % и обнаруживается у 15--30 % людей с заболеваниями печени. Вирус способен размножаться в гепатоцитах, передается гемотрансфузионно и фекально-оральным путем. Однако вопрос о том, действительно ли вирус ТТ является возбудителем гепатита, остается открытым; высказываются различные версии. К числу возможных возбудителей гепатита относится также группа SEN-вирусов (SENV) (SEN-A--SEN-H.[23]

Таким образом, вирусные гепатиты - инфекционные болезни, которые характеризуются специфическим клиническим развитием и в разной степени нарушают функции печени. Наиболее опасные формы вирусных гепатитов В, С, D, для которых характерно острое и хроническое течение, что является первичными причинами цирроза и рака печени.

2. Материал и методы исследований

2.1 Место проведения исследований

Исследования проводились в биохимической лаборатории инфекционной больницы 1.Самарканда.

2.2 Материал исследования

Материалами исследования служила периферическая кровь 10 взрослых людей с диагнозом гепатит А, гепатит В, взятых для проведения биохимических исследований.

2.3 Методы исследования

Биохимические исследования проводились следующими методами:

2.3.1 Гемиглобин-цианидный метод

Основан на превращении гемоглобина в циан-метгемоглобин (стойкое соединение) при добавлении к крови реактива. Концентрацию циан-метгемоглобина измеряют фото-метрически. Его принцип сводится к следующему: гемоглобин, взаимодействуя с ацетон-циан-гидрином, в присутствии железосинеро-дистого калия K₃[Fe(CN)₆] образует гемиглобин-цианид красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина в пробе крови. Образующийся с ацетон-циан-гидридом окрашенный циан-метгемоглобин (гемиглобин-цианид) определяют колориметрически. Для этого в пробирку к 5 мл трансформирующего раствора, содержащего указанные реактивы (железосинеродистый калий и ацетон-ангидрид), добавляют 0,02 мл крови. При этом кровь разводится в 251 раз. Оставляют пробирки на 10 мин при комнатной температуре. Фотометрируют при зеленом светофильтре (длина волны 500--560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против дистиллированной воды. Стандартный раствор фотометрируют при тех же условиях, что и опытную пробу. Приготовленные разведения фотометрируют против дистиллированной воды («холостая» проба). Концентрацию гемоглобина крови рассчитывают по формуле:

где Е_оп -- экстинкция опытной пробы;

Е_ст--экстинкция стандартного раствора;

С--концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%;

К--коэффициент разведения крови;

0,01--коэффициент для пересчета в мг/% в г/л.

2.3.2 Метод подсчета эритроцитов в счетной камере

В строго определенном объеме камеры подсчитывают под микроскопом клеточные элементы, а затем производят пересчет полученного результата на 1 мкл крови. Кровь предварительно разводят с целью уменьшения числа клеток, подлежащих счету. Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирки. Для этого берут 0,02 мл крови, разведенной в 200 раз в 4,0 мл изотонического раствора натрия хлорида. Перед заполнением камеры взвесью крови в изотоническом растворе содержимое пробирки несколько раз встряхивают. Пипеткой набирают небольшой объем взвеси крови и выпускают 1-2 капли на фильтровальную бумагу. После этого подносят каплю разведенной крови к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно заполняла всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в боковые бороздки. После заполнения камеры ее оставляют на 1-2 минуты в горизонтальном положении для оседания эритроцитов. Подсчет эритроцитов проводят при малом увеличении микроскопа (например объектив 8x, окуляр 10x), в несколько затемненном поле зрения (при прикрытой диафрагме и опущенном конденсоре). Эритроциты подсчитывают в 5 расположенных по диагонали сетки квадратах, разделенных на малые, т. е. в 80 малых квадратах. Количество эритроцитов в 1 мкл (1 мм³) крови рассчитывают по следующей формуле Х=а х 10⁴, т.е. количество эритроцитов в 1 мкл (Х) равно числу форменных элементов крови, подсчитанных в 80 малых квадратах, умноженному на 104 [39].

2.3.3 Микро-метод в модификации Панченкова - для определения СОЭ

Принцип метода состоит в том, что смесь крови с цитратом при стоянии разделяется на два слоя: нижний - эритроциты, верхний - плазма. При этом СОЭ, т.е. величина столбика плазмы, бывает различной в зависимости от изменения физико-химических свойств крови. Для определения СОЭ перед использованием химически чистый капилляр промывают цитратом натрия и заполняют им пробирку на ј (до метки 0,75). Кровью набирают полный капилляр и переносят в пробирку с цитратом. При этом получают соотношение крови и цитрата 4:1. Перемешивают содержимое пробирки и набирают до метки 0 смесь крови и цитрата. Капилляр устанавливают в штатив строго вертикально. Через час отмечают скорость оседания эритроцитов по высоте отстоявшегося слоя плазмы в миллиметрах.хъ

2.3.4 Метод подсчета в камере Горяева и подсчета в мазках крови по Фанио - используются при подсчете количества тромбоцитов

Для подсчета тромбоцитов в камере исследуемую кровь разводят в 200 раз, для чего в сухую пробирку наливают 4 мл 1% раствора оксалата аммония. Перемешивают и оставляют на 25-30 минут для гемолиза эритроцитов и затем заполняют счетную камеру. Производят подсчет тромбоцитов в 25 больших квадратах. Расчет производят по формуле: Х = а * 2000, где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах. Метод подсчета тромбоцитов по Фанио основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов. Капилляр Панченкова промывают 14% раствором сульфата магния или 6% раствором этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА). Набирают реактив до метки 75 и переносят его в серологическую пробирку. Кровь из пальца берут тем же капилляром до метки 0 и перемешивают ее с реактивом. Одновременно берут кровь для подсчета эритроцитов. Из смеси крови с реактивом готовят тонкие мазки, высушивают их на воздухе, подписывают, фиксируют и окрашивают краской Романовского в течение 1--2 ч, Краску смывают водопроводной водой, мазки высушивают на воздухе. При окраске по Романовскому тромбоциты окрашиваются в фиолетовый цвет, эритроциты -- в розовый. Окрашенный мазок микроскопируют с иммерсионной системой (ок. 7 или 10, об. 90), конденсор поднят, диафрагма открыта. Иммерсионное масло наносят на край мазка в наиболее тонкой его части, ближе к «метелочке». Подсчет эритроцитов и тромбоцитов ведут одновременно, при этом прибегают к ограничению поля зрения, для чего в окуляр вкладывают кружок из черной бумаги с прорезанным посередине его ромбическим отверстием. В ограниченном поле зрения должно быть видно около 50 эритроцитов. Среди них располагаются отдельные тромбоциты, которые встречаются не в каждом поле зрения. Сосчитав 1000 эритроцитов, суммируют общее количество встретившихся тромбоцитов. Определяют количество эритроцитов в 1 л крови. Количества тромбоцитов рассчитывают по формуле Х = а*в/1000, где х--количество тромбоцитов в 1 л крови; а--количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов; в--количество эритроцитов в 1 л крови.

2.3.5 Подсчет лейкоцитов в счетной камере Горяева - используют для подсчета количества лейкоцитов

Каплю крови, разведенной в 20 раз раствором уксусной кислоты, помещают в подготовленную счетную камеру Горяева. Заполненную камеру оставляют на 1 минуту для оседания лейкоцитов, а затем устанавливают на столик микроскопа и при малом увеличении подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах сетки Горяева, не разделенных на малые квадраты и полосы. Расчет общего количества лейкоцитов проводят по формуле X = a x 50, т.е., количество лейкоцитов в 1 мкл равно числу клеток, посчитанных в 100 больших квадратах, умноженному на 50. Подсчет лейкоцитарной формулы (процентное соотношение различных видов лейкоцитов в периферической крови) проводят при иммерсионной микроскопии окрашенных по Романовскому-Гимзе (смесь краски азур II, водорастворимого эозина, метиленового спирта и эозина) мазков. Эта окраска позволяет хорошо дифференцировать ядро и цитоплазму. Микроскопию мазков проводят по следующей методике. Мазок передвигают от верхнего края к нижнему, затем отодвигают на 2-3 поля зрения вдоль края и идут в обратном направлении до верхнего края и т. д. Идентифицируют и подсчитывают не менее 100 лейкоцитов. Если при этом обнаруживаются какие-либо отклонения от нормы (появление дегенеративных форм клеток, не выявляемых у здорового человека, изменение нормального соотношения различных типов лейкоцитов), обязательно просматривают еще 100 лейкоцитов по описанной методике. Полученные результаты регистрируют с помощью клавишного счетчика [ 39].

Для изучения генетических особенностей заболеваемости использовался генеалогический метод, который позволяет преодолеть сложности, возникающие в связи с невозможностью скрещивания и малоплодностью человека. Генеалогический метод позволяет выяснить родственные связи и проследить наследование нормальных или патологических признаков среди близких и дальних родственников в данной семье на основе составления родословной -- генеалогии.

При составлении родословных исследуется пробанд - индивид с признаками наследственной патологии, выявленный первым. Вслед за пробандом обследуются родители и сибсы (братья и сестры). В дальнейшем родословные расширяются за счет других родственников, охваченных клинико-генеалогическим изучением. При графическом составлении родословной используются стандартные символы. Медико-статистический анализ был проведен за период с 2009 по 2011 год. Данные были получены в управлении статистики Самаркандской области.

Рисунок 3. Стандартные обозначения, принятые при составлении родословных.

3. Результаты исследований

3.1 Биохимико-генетические исследования заболеваемости вирусными гепатитами А и Б

При многих острых и хронических заболеваниях внутренних органов оценка результатов биохимического исследования крови, особенно в динамике - в процессе развития болезни имеют большую диагностическую и прогностическую ценность. Изменения различных биохимических показателей, являясь в большинстве случаев неспецифическими позволяют судить о характере и степени нарушения процессов метаболизма как в целом организме, так и в отдельных органах сопоставление этой информации с клинической картиной заболевания и результаты других лабораторных и инструментальных метод исследования дает возможность оценить функциональное состояние внутренних органов, системы гомеостаза, составить представление о характере патологического процесса и его активности.

Биохимические и лабораторные исследования играют существенную роль для установления природы вирусного гепатита и его этнологии. Совокупность полученных данных о показателях обмена билирубина, сывороточных белков и ферментов позволяют обнаружить воспалительные процессы, происходящие в организме человека. Эти критерии не специфичны, но существенны для оценки функционального состояния печени. Мы изучали биохимические показатели крови больных с разными формами гепатитов, проходивших обследование и последующее лечение в отделениях инфекционных заболеваний инфекционной больницы. Для обследования были взяты 10 больных в возрасте от 20 до 40 лет с диагнозами гепатита А и В.

Вирус гепатита А.

Вирус гепатита В.

Рисунок 4. Вирусы гепатита А и В.

Изучение и анализ биохимических показателей периферической крови больных гепатитом А показал достоверное снижение уровня гемоглобина, количества эритроцитов и лимфоцитов, что связано с анемическими синдромами. Установлено достоверное увеличение содержания общего, прямого, непрямого билирубина, что является одним из ранних цитолитических процессов в печени.

Определение активности аланинаминотрансферазы является высокочувствительным показателем цитолиза гепатоцитов, что определяет ее ведущую роль в диагностике гепатитов разной этиологии. Достоверное увеличение АЛТ (аланинаминотрансферазы) является показателем заболеваемости гепатитом и означает начало массового некроза клеток печени.

Изучение и анализ биохимических показателей периферической крови больных гепатитом В показал также достоверное снижение уровня гемоглобина, количества лейкоцитов и лимфоцитов, сопровождающееся снижением иммунной деятельности организма. Показатели общего, прямого и непрямого билирубина и АЛТ увеличены в 4-8 раз. Установлено, что гепатит В протекает намного тяжелее и переход его в хроническую форму может стать причиной первичного рака печени.

Вирусная инфекция гепатита В диагностируется по обнаружению HBs- антигена в крови больного. Цитотоксические Т-лимфоциты атакуют зараженные клетки печени, несущие вирусные антигены, что является причинами разрушения печени.

Таким образом, анализ периферической крови больных гепатитами А и В показал достоверное уменьшение гемоглобина, увеличение билирубина и АЛТ в 4-8 раз, ясно выраженную картину лейкопении и снижение иммунной деятельности организма больных. Высокий уровень билирубина в крови и АЛТ является одним из главных биохимических показателей гепатита А и В, но играют роль только при развитии желтухи. Безжелтушная форма и преджелтушная фаза вирусных гепатитов в большинстве своем остаются неопознанными.

Таблица 3.1. Биохимические показатели периферической крови здоровых и больных гепатитом B.

Рисунок 5. Биохимические показатели периферической крови здоровых людей

Рисунок 6. Биохимические показатели периферической крови здоровых и больных гепатитом B

Таблица 3.2. Биохимические показатели периферической крови здоровых и больных гепатитом A.

Рисунок 7. Биохимические показатели периферической крови здоровых и больных гепатитом A

К наиболее опасным формам относят вирусные гепатиты В, С, Переход заболевания в хроническую форму предполагает ухудшение прогноза заболевания и длительное развитие воспалительных процессов в печени. Хронические формы вирусных гепатитов считают одними из самых распространенных причин цирроза печени и первичного рака.

Мы с помощью генеалогического метода на примере одной семьи изучали наследование гепатита В у одного из пациентов В-ва, который является вторым ребенком в семье, возраста 26 лет, женат, есть 1 ребенок, проживает в городе Самарканде. В его семье никто из братьев, сестер и его родители гепатитами (А, В, С) не болели. Установлено, что гепатитами В и А болел дедушка со стороны матери и родной брат отца.. У бабушки со стороны отца была злокачественная опухоль груди. У родных сестер со стороны матери и отца наблюдались спонтанные аборты и выкидыши.

Таким образом, анализ генеалогических данных пациента больного гепатитом В позволяет предполагать некоторую наследственную предрасположенность к заболеванию. Установлена роль вируса гепатита как этиологического фактора канцерогенеза. Повышенная частота спонтанных абортов часто обусловлена хромосомными аномалиями.

Рисунок 8

3.2 Медико-статистические показатели заболеваемости гепатитами по Самаркандской области

Основными статистическими показателями, свидетельствующими о причинах распространения инфекционными заболеваниями, в том числе гепатитами являются показатели заболеваемости и смертности. Структура их различна для каждого пола и возраста, что определяется физиологическими особенностями организма и подверженности факторам риска.

Согласно современной классификации различают гепатиты: инфекционные вирусные гепатиты, бактериальные, токсические (алкогольные, лекарственные), аутоиммунный, лучевой. Наиболее часто встречаются именно вирусные гепатиты. По данным ВОЗ (2010) наблюдается пандемическое распространение вирусного гепатита В, в развивающихся странах Африки и Азии заболеваемость вирусным гепатитом А среди детей достигает 100%.

Изучение заболеваемости гепатитом А за 2009-2011 года показало, что максимальная частота заболеваемости за этот период характерна для города Самарканда, Булунгурского, Джамбайского, Нарпайского и Тайлякского района, с максимальной частотой встречаемости в Джамбайском (134,14) и Пайарыкском районах (136,79), наименьшая для Иштыханского (34,88) и Пасдаргомского районов (29,88), эта же тенденция сохраняется и в 2011 (таблица 3.3.)

Форма гепатита В в 2011 с наибольшей частотой встречается в Самаркандском, Ургутском районах и в городе Каттакургане (3,28-3,39). В Акдарьинском, Джамбайском, Пасдаргомском и Тайлякском районах форма гепатита В не была установлена.

Мы изучали медико-статистические показатели заболеваемости гепатитами А и В в городе Самарканде и Каттакурган, а также по районам Самаркандской области. Изучение заболеваемости вирусными гепатитами А и В по Самаркандской области за 2008-2010 года показало, что с наибольшей частотой они встречаются в Ургутском, Тайлякском, Пайарыкском и Джамбайском районах и в городе Самарканде (106,66-137,68) по интенсивному показателю за 2010 год, наименьшая, в Пасдаргомском, Иштыханском, Нурабадском районах (29,81-42,77).

Эта тенденция сохраняется и в 2011 году. Выявлено некоторое снижение частоты заболеваемости гепатитами А, В, С по сравнению с 2009 годом.

Таким образом, изучение частоты заболеваемости гепатитами А и В за период 2009-2011 годов по районам Самаркандской области было установлено, что они с наибольшей частотой встречается в Ургутском, Тайлякском, Пайарыкском и Джамбайском районах и в городе Самарканде, наименьшая в Пастдаргомском, Иштыханском и Нурабадском районах Форма гепатита В встречается значительно реже.

Таблица 3.3. Статистические показатели заболеваемости гепатитом А по Самаркандской области за 2009-2011 года.

Таблица 3.4. Статистические показатели заболеваемости гепатитом В по Самаркандской области за 2009-2011 года.

Таблица 3.5. Статистические показатели заболеваемости гепатитами по Самаркандской области за 2009-2011 года.

вирус генетический гепатит биохимический

Выводы

1.Изучена классификация, химический состав и строение вирусов, структурная организация которых характеризуется наличием или отсутствием липопротеиновых оболочек и типом симметрии капсиды. В связи с этим выделяют две большие группы вирусов ДНК содержащие и РНК содержащие вирусы.

2.Рассмотренны типы вирусных инфекций на клеточном и организменном уровнях. На клеточном уровне их делят на автономные и абортивные, которые протекают в виде острой или хронической инфекции. На организменном уровне вирусные инфекции делятся на очаговые и генерализованные, которые протекают в острой и персистентной форме. Наибольшую опасность представляют медленные инфекции, ведущие к летальному исходу.

3. Изучены генетические особенности вирусных заболеваний. Установлены три группы онкогенных вирусов, являющихся этиологическими факторами неопластических заболеваний человека - это ретро-вирусы Т лимфолейкоза взрослых людей, герпес вирусы и вирусы гепатита В.

4. Рассмотрена классификация и генетические особенности вирусов гепатитов, наиболее опасными из которых являются вирусы В, С, D. Переход заболевания в хроническую форму предполагает ухудшение прогноза заболевания и длительное развитие воспалительных процессов в печени. Хронические формы вирусных гепатитов считают одними из самых распространенных причин цирроза печени и первичного рака..

5. Изучены биохимические особенности инфекционного процесса гепатита. Анализ периферической крови больных гепатитами А и В показал достоверное уменьшение гемоглобина, количества лейкоцитов, лимфоцитов, увеличение содержания общего, прямого, непрямого билирубина и АЛТ. Высокий уровень билирубина и АЛТ в крови является одним из главных биохимических показателей цитолиза гепатоцитов, что определяет их ведущую роль в диагностике гепатитов разной этиологии.

6. Проведение генеалогического анализа больных гепатитом В позволяет предположить некоторую наследственную предрасположенность к заболеванию. Повышенная частота спонтанных абортов и выкидышей в семьях обусловлена хромосомными аномалиями.

7. Изучение частоты заболеваемости гепатитами А и В за период 2009-2011 годов по районам Самаркандской области было установлено, что они с наибольшей частотой встречается в Ургутском, Тайлякском, Пайарыкском и Джамбайском районах и в городе Самарканде. В Самаркандской области форма гепатита А встречается с наибольшей частотой.

Рекомендации:

1. Разработка и широкое использование современных молекулярно-генетических методов для точной идентификации вирусных инфекций, в том числе разных форм гепатита..

2. Анализ, как донорской крови, так и препаратов, приготовленных на ее основе, на маркеры вируса гепатита В. Разработка использование высокоэффективных вакцин против вируса гепатита В и других его форм.

3. Материалы исследований данной работы могут быть использованы в профилактической и просветительской деятельности среди учащихся школ, лицеев и колледжей.

Список используемой литературы

1.Ада Г. Вакцины и вакцинация. Международный медицинский журнал-2002-№1.

2. Блашкович Д. Круговорот вирусов. Прага: Изд. Чех АН, 1970, 140 с.

3. Букринская А.Г. «Вирусология» - М: медицина, 1986 -336 с.

4. Букринский М.И. Строение генома и экспрессия генов вируса иммунодефицита человека. (Обзор иностранной литературы). «Вопросы вирусологии», 1987, 649-656 с.

5. Бутонин Е.Г. «Биохимические константы биологических жидкостей человека» справочное пособие, 1995, 53с.

6. Гаврилов О.К., Шишков В.П., Хохлова М.П., Саутинова В.О. Современное состояние проблемы лейкозов. // Клиническая медицина, 1981, № 1. - с. 6-9

7. Губергриц А.Я. Клиническая оценка данных лабораторных исследований», 1949 176 с.

8. Гусева С.А. Воднюк В.П. Бальшин М.Д. Болезни системы крови. К.: Логос 2001 с 248-542

9. Долгов В.В. Луговская С.А. Морозова В.Т. и др. Лабораторная диагностика анемий. Пособие для врачей. Тверь 2001 с 7-22

10. Домарадский И.В. Основы вирусологии для экологов. М, 2007, 80 с.

11. Домшлак М.Ч. Путешествие в неведомый мир. //Первое сентября, 2003,

12. Еримов Г.И. Общая вирусология. М, 1998, 657-742 с.

13. Жданов В.М. и Львов Д.К. Экология возбудителей инфекционных болезней - М, 1984, 272 с.