Таблица 1. Изменение эффективности клонирования и численность стромальных клеток-предшественников в культурах селезёнки и костного мозга мышей под действием препарата профеталь*

Напротив, в случае добавлении профеталя, содержащего ч-АФП, непосредственно in vitro ЭКО-ф стромальных клеток-предшественников в культурах клеток костного мозга и селезёнки резко снижается: в селезёнке -- в 2 раза и в костном мозге -- дозозависимым образом максимально в 5 раз (табл. 2).

Таблица 2. Изменение эффективности клонирования в культурах клеток селезёнки и костного мозга мышей под действием препарата профеталь, содержащего б-фетопротеин

Примечание: Эксплантировано по 1-2х10⁷ клеток селезенки и по 1-3х10⁶ клеток костного мозга мышей на матрац площадью 25 см². В качестве фидера использовались облученные клетки костного мозга морских свинок в количестве 1х10⁷ клеток на культуру.

По-видимому, это связано с влиянием категории присутствующих в культурах нестромальных клеток, часть из которых (лимфоциты и макрофаги) оказывает ингибирующее действие на клоногенность КОК-ф [Горская Ю.Ф., Фриденштейн А.Я., Зорина А.И., 1992; Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю., 1992]. Это даёт возможность определённого опосредованного воздействия ч-АФП, входящего в состав препарата профеталь, на пул КОК-ф кроветворных и лимфоидных органов.

Результаты исследования влияния убитой вакцины стрептококка группы А 5-го типа на клоногенные свойства стромальных клеток-предшественников на модели гетеротопных трансплантатов клеток костного мозга мышей продемонстрировали, что численность КОК-ф и их ЭКО-ф в трансплантатах костного мозга от нормальных мышей, подсаженных иммунизированным животным (Н--И), снижаются в зависимости от возраста трансплантата в 4,5-6,5 и 1,6-5 раз соответственно по сравнению с такими же трансплантатами, подсаженными интактным реципиентам (Н--Н) (табл. 3).

Содержание КОК-Ф в 1,5-3-месячных трансплантатах костного мозга, взятого от животных, иммунизированных убитой вакциной стрептококка, и подсаженного нормальным мышам (И--Н), практически не отличается, а в 7-месячных трансплантатах снижается вдвое по сравнению с содержанием КОК-Ф в трансплантатах костного мозга от нормальных мышей СВА, подсаженного нормальным животным (Н--Н). Следовательно, развивающийся и существующий в подвергшемся иммунизации организме костномозговой орган (вариант Н--И) оказывается дефектным как по ЭКО-Ф (т.е. по концентрации), так и по содержанию стромальных клеток-предшественников.

Таблица 3. Изменение эффективности клонирования и численность стромальных клеток-предшественников в трансплантатах костного мозга интактных мышей и иммунизированных культурой стрептококка группы А

Антигены стрептококка оказывают влияние не только на клоногенные и пролиферативные, но и на остеогенные свойства стромальных клеток-предшественников костного мозга мышей. С одной стороны, наблюдается значительное увеличение толщины костных капсул в сформированных ими костномозговых органах у экспериментальных групп животных, особенно при пересадке трансплантатов от нормальных -- иммунным мышам (рис. 5). С другой стороны, в экспериментальных группах («иммунный донор -- нормальный реципиент» и «нормальный донор -- иммунный реципиент») отмечается заметное снижение содержания гликогена и повышение количества ШИК-позитивных гликозаминогликанов (выявляемых после обработки срезов амилазой) в межклеточном веществе костной ткани гетеротопных трансплантатов.

Известно, что мукополисахариды костного матрикса и его структура играют главную роль в фиксации фосфата кальция. Таким образом, снижение уровня гликогена, который используется при фосфорилировании, на фоне повышенного содержания гликозаминогликанов в костной ткани трансплантатов, пересаженных от иммунных нормальным животным и от нормальных в иммунный организм, в сочетании с пониженной активностью щелочной фосфатазы и более значительным разрастанием в эксперименте костной капсулы может свидетельствовать о задержке процесса обызвествления костной ткани гетеротопных трансплантатов под воздействием антигенов стрептококка группы А.

Существуют данные, что иммунизация животных антигенами приводит к резкому увеличению численности КОК-ф в лимфатических узлах и селезенке [Горская Ю.Ф., 1986]. В связи с этим представляется интересным, что содержание КОК-ф в используемом для трансплантации костном мозге бедра животных, иммунизированных убитой вакциной стрептококка группы А 5-го типа, также существенно (в 3,5 раза) превышает содержание КОК-Ф в костном мозге бедра нормальных мышей. Данное превышение не сказывается ни на величине образующегося из такого костного мозга трансплантата, ни на величинах ЭКО-Ф и содержании КОК-Ф в нём. Эти данные говорят о том, что, по-видимому, далеко не все КОК-Ф, численность которых увеличивается при введении антигенов, ответственны за трансплантабильность стромальной ткани при ее гетеротопной пересадке. Таким образом, сам по себе факт, что предназначенный для пересадки костный мозг обогащён КОК-ф, еще не свидетельствует о возможности более успешного формирования трансплантата.

Рис. 5. Микрофотографии гистологических препаратов почки с образованным костномозговым органом при трансплантации: а -- «Нормальный донор -- нормальный реципиент»; б -- «Нормальный донор -- иммунный реципиент». Окр. Шифф-йодной кислотой по Шабадашу (ок. 10, об. 40

Характеристика индуцибельных остеогенных стромальных клеток-предшественников, циркулирующих в биологических жидкостяхлабораторных животных

В крови морских свинок, перитонеальном, плевральном и перикардиальном транссудатах кроликов, морских свинок и крыс, а также в перитонеальном экссудате крыс выявлены клоногенные клетки, образующие в монослойных культурах колонии фибробластоподобных клеток (рис. 6). Количество их варьируется от 10⁵ среди циркулирующих лейкоцитов крови до 10х10⁵ от числа клеток перитонеального транссудата.

Обнаруженные в биологических жидкостях клоногенные клетки по своим характеристикам: степени зависимости от возраста и линии животных, от условий культивирования -- плотности эксплантированных клеток, наличия фидера (облучённых клеток аллогенного или сингенного костного мозга), состава газовой среды, по морфологии и диаметру образованных ими колоний, гистологическим и гистохимическим особенностям составляющих их элементов идентичны стромальным клеткам-предшественникам костного мозга.

Рис. 6. Монослойные культуры индуцибельных стромальных клеток-предшественников, циркулирующих:

а, б -- в крови морской свинки; в, г -- в плевральном транссудате крысы; д, е -- в перитонеальном транссудате крысы (12 суток инкубации

Микрофотографии колоний (а, в, д), сформированных индуцибельными остеогенными клетками-предшественниками (б, г, е). Окр. азуром II-эозином (а, в, д -- ок. 10, об. 2,5; б, г, е -- ок. 10, об. 4

Особенно высока степень корреляции (более 0,8) между клоногенными клетками костного мозга и перитонеального транссудата, перитонеального транссудата и экссудата крыс в отношении зависимости численности КОК-ф и значений ЭКО-ф в культурах от возраста животных и плотности эксплантированных клеток.

Анализ иммунофенотипа клеток, формирующих колонии в монослойных культурах клеточных элементов перитонеального транссудата мышей, демонстрирует преобладание CD80+ клеток (63,4%) и высокий уровень экспрессии на поверхности клеток главного комплекса гистосовместимости I типа (83,3%), а также наличие некоторого количества CD34+ клеток и клеточных форм, имеющих маркёры моноцитов-макрофагов (20,0 и 21,8% соответственно).

Полученные данные свидетельствует о том, что выявленные в монослойных культурах клеток крови, перитонеального, плеврального и перикардиального транссудатов клоногенные клетки по многим характеристикам в большинстве своём могут быть отнесены к популяции индуцибельных остеогенных стромальных клеток-предшественников.

В крови морских свинок, взятой из различных отделов сердечно-сосудистой системы, выявляется различное количество стромальных клеток-предшественников. Самый высокий уровень числа КОК-ф обнаруживается в крови, оттекающей от кроветворных органов. Наибольшей пролиферативной активностью обладают клоногенные предшественники фибробластов, циркулирующие в венозных отделах кровеносной системы.

Сравнительная характеристика детерминированных стромальныхклеток-предшественников костного мозга и индуцибельных остеогенных клеток, циркулирующих в перитонеальном транссудате и экссудате крыс

Численность клеток-предшественников стромы костного мозга на орган (бедро крысы), выявленных во всех видах культур, значительно превышает количество КОК-ф, обнаруженных в перитонеальном транссудате крыс. При этом значения эффективности клонирования индуцибельных КОК-ф транссудата крыс вполне сопоставимы с ЭКО-ф детерминированных остеогенных стромальных клеток-предшественников костного мозга и даже значительно превышают их уровень в некоторых возрастных группах экспериментальных животных, а также при определённой плотности эксплантированных клеток, преимущественно, в адгезивных типах культур без фидера и с добавлением фидера (рис. 7, 8).

При сравнении возрастных (по весу животных) изменений количества КОК-ф и значений ЭКО-ф во всех видах культур в целом выявлено, что если в костном мозге с возрастом количество КОК-ф и эффективность их клонирования значительно снижается, то в перитонеальном транссудате, напротив, показатели числа КОК-ф и ЭКО-ф повышаются, хотя и не достигают максимальных величин, характеризующих клетки-предшественники костного мозга (рис. 7).

Плотность эксплантируемых клеток во всех видах культур в целом оказывает одинаковое влияние на численность выявляемых КОК-ф и эффективность клонирования как клеток стромы костного мозга, так и находящихся в перитонеальном транссудате клеток-предшественников -- при превышении оптимальной плотности эксплантации снижаются оба показателя (рис. 8).

В перитонеальном экссудате крыс отмечаются довольно высокие и сравнимые с костным мозгом показатели численности КОК-ф и эффективности их клонирования во всех видах культур (особенно у животных старшего возраста), которые в значительной степени коррелируют с возрастом животных, плотностью эксплантированных клеток, наличием и концентрацией фидера, временем адгезии и временем забора жидкости с момента начала воспалительного процесса.

Лимфокин-активированные киллеры: морфология,иммунофенотип, функциональные свойства, источники генерации

В работе исследованы морфологические, электронно-микроскопические, иммунофенотипические и функциональные особенности лимфокин-активированных киллеров, генерированных под действием ИЛ-2 как из общепринятого источника -- мононуклеарных клеток периферической крови человека, так и из спленоцитов больных раком желудка, МЛ плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных с метастатическим поражением серозных оболочек, клеток лейкоцитарных инфильтратов паратуморальных областей поражённой метастазами печени онкобольных, и проведена их сравнительная характеристика.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что инкубация МЛ периферической крови здоровых доноров с ИЛ-2 в оптимальной концентрации (1000-2000 МЕ/мл) приводит к генерации активированных лимфоцитов, которые по морфологическим и функциональным характеристикам могут быть отнесены к ЛАК-клеткам. Цитологическое изучение мононуклеарных клеток при инкубации с ИЛ-2 выявило, что через 3 суток после активации в культуральной взвеси на фоне резкого уменьшения числа гранулярных лейкоцитов существенно возрастает количество лимфоцитов, которое продолжает прогрессивно увеличиваться до 10 суток (рис. 9).

В культуральной взвеси при фазовоконтрастной микроскопии выявляются колонии крупных клеток лимфоцитарного ряда (рис. 10 а). На 5-е сутки среди мононуклеаров преобладают бласты, пролимфоциты и пиронинофильные лимфоциты (рис. 10 б, в), причём большое количество бластных форм и активированных лимфоцитов сохраняется в течение всего срока исследования. Зрелые лимфоциты подвергаются бласттрансформации и в процессе дифференцировки активируются, о чём свидетельствует накопление РНК в цитоплазме, проявляющееся в её яркой пиронинофилии, исчезающей после обработки РНК-зой, и в появлении многочисленных ШИК-позитивных гранул (рис. 10 в, г).

На электронных микрофотографиях большинство клеток культуральной взвеси характеризуются как большие гранулярные лимфоциты с хорошо развитыми синтетическими органоидами: митохондриями, гранулярной ЭПС, полисомами и пластинчатым комплексом Гольджи (рис. 11 а).

Наряду с ЛАК при активации мононуклеаров периферической крови IL-2 на 3-и сутки в культурах появляются в достаточном кoличестве (24,82+0,06%) и сохраняются в течение всего исследования СD83+-клетки. Они имеют морфогистохимические (крупные размеры, эксцентрично расположенное ядро и вакуолизированную цитоплазму, содержащую пиронинофильный и ШИК-положительный компоненты) и электронно-микроскопические (ветвящиеся отростки, многочисленные вакуоли и активированный секреторный аппарат) признаки зрелых ДК (рис. 11 б).

Особенности иммунофенотипа ЛАК в виде повышенной экспрессии активационных молекул СD38, СD25, молекул НLА-DR и молекул адгезии СD58 также отражают процесс активации лимфоцитов (см. табл. 4). Он продолжается в течение 6-9 суток, после чего, согласно данным исследования иммунофенотипа (преобладание в популяции ЛАК СD3+-клеток, снижение уровня экспрессии активационных антигенов и молекул адгезии к 10-м суткам), происходит дифференцировка ЛАК в зрелые Т-лимфоциты.

Результаты исследований показывают, что генерированные клетки обладают значительно более высокой (в 1,5-2,5 раза) киллерной активностью, чем интактные МНК, по отношению к линии опухолевых клеток К-562. Это подтверждает принадлежность полученных клеток к ЛАК, способным активно лизировать клетки-мишени. Таким образом, исследования подтверждают целесообразность использования ЛАК на 3-5-е сутки инкубации применения в адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований, поскольку в данные сроки выявлено максимальное количество типичных ЛАК с высокой цитотоксической активностью, которые сохраняют пролиферативные способности в течение 10 суток.

Таблица 4. Влияние интерлейкина-2 на иммунофенотип мононуклеарныхлейкоцитовпериферической крови человека(Уровень экспрессии поверхностных кластеров детерминации, p±s_p,%)

Примечание: Различия по сравнению с данными при отсутствии активации значимы:* -- при р <0,05; ** -- при p<0,001.

Исследована также возможность генерации активированных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров с использованием профеталя (ПФТ), содержащего в качестве основного компонента человеческий б-фетопротеин. Проведён сравнительный анализ действия данного препарата, IL-2 и ФГА на функциональные свойства мононуклеарных лейкоцитов в культурах. В результате экспериментов установлено, что по способности активировать МЛ крови человека с образованием клеток, характеризующихся высоким противоопухолевым цитотоксическим и пролиферативным потенциалом, профеталь превышает такие классические активаторы и митогены, как ИЛ-2 и ФГА (рис. 12).

Эффект повышения цитотоксической активности МЛ по отношению к опухолевым клеткам линии К-562 обусловлен индукцией под действием препарата профеталь одновременно и ЦТЛ (CD8+), и НК-клеток (CD16+, CD56+).

Таблица 5. Влияние интерлейкина-2 и препарата профеталь на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров(Уровень экспрессии поверхностных кластеров детерминации, p±s_p,%)

Активация мононуклеаров при коинкубации с ПФТ подтверждается также усилением экспрессии на их поверхности дифференцировочных, костимулирующих и адгезивных молекул (CD38, CD56, CD58, HLA-DR) в 2-6 раз по сравнению с интактными МЛ и ЛАК-клетками (табл. 5).

Выявлено, что и при культивировании в бессывороточных средах профеталь в указанных дозах также повышает уровень митотической активности мононуклеаров периферической крови доноров по сравнению со спонтанной пролиферацией МЛ на 55-58% и пролиферативной способностью ЛАК-клеток -- на 37-39% (см. рис. 13). Эти данные могут рассматриваться как проявление бласттрансформации зрелых лимфоцитов периферической крови под АФП, которая сопровождается также появлением в культурах CD34⁺/CD45⁺ клеток (до 28%). Мононуклеарные лейкоциты, активированные профеталем, дают двойное окрашивание моноклональными антителами к данным антигенам (рис. 14), чего не наблюдается в контрольных культурах МЛ.

При микроскопическом исследовании в культурах МЛ периферической крови, коинкубированных с препаратом профеталь в бессывороточной среде, начиная с 3-х суток выявляются кластеры крупных клеток, не прилипающих к стеклу. Морфогистохимические и электронно-микроскопические исследования МЛ культуральной взвеси показывают, что в культурах, активированных ПФТ, преобладают бластные формы, характеризующиеся высоким содержанием РНК и синтетических органоидов (рис. 15 а, г), что является показателем повышенной функциональной активности клеток. Высокий уровень пролиферативного потенциала МЛ подтверждается наличием большого числа клеток, находящихся в состоянии деления (рис. 15 а, б). Обработка активированных профеталем МЛ магнитными шариками, нагруженными моноклональными антителами к CD34, приводит к появлению в культурах розеток, в центре которых выявляются клетки типа лимфоцитов и бластных форм (рис. 15 в).

При исследовании цитокинового уровня в супернатантах культуры активированных профеталем мононуклеарных лейкоцитов селезёнки мышей через 24 часа инкубации количество IL-1в, IL-6, IL-10, IL-12 значительно превышает контрольный уровень и в 2-6 раз -- уровень продукции данных цитокинов ЛАК-клетками.

Таким образом, с помощью морфологических и функциональных методов показано, что под влиянием человеческого б-фетопротеина, содержащегося в препарате профеталь, в выявленных эффективных дозах (от 0,01 до 10,0 мкг/мл) и использованных в опытах условиях культивирования ex vivo может происходить стимуляция цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов, дифференцировка НКТ-клеток, повышенная выработка цитокинов, пролиферация и бласттрансформация МЛ периферической крови с образованием CD34⁺/CD45⁺ гемопоэтических клеток-предшественников.

В последнее пятнадцать лет появились работы, которые подтвердили, что АФП служит в качестве двойного регулятора роста, способного как к усилению, так и к ингибированию его [Mizejewski G.J. et al., 1990]. Следовательно, препарат профеталь является весьма активным иммуномодулирующим фактором, что свидетельствуют о возможности использования его свойств для экстракорпоральной генерации активированных лимфоцитов, которые могут применяться в иммунотерапии злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний наряду с традиционными ЛАК.

Морфологическая, иммунофенотипическая и функциональнаяхарактеристика интактных и активированных мононуклеарныхлейкоцитов экссудатов и лейкоцитарных инфильтратов печени онкологических больных и заражённых опухолью мышей

Важное значение для оценки эффективности лечения и прогноза онкологического заболевания с метастатичким процессом в серозные оболочки имеет количественный и качественный состав лимфоцитов экссудата. Обычно в метастатическом плевральном экссудате больных содержится небольшое количество зрелых (неактивированных) форм лимфоцитов, которых недостаточно для лизиса значительного числа опухолевых клеток.

При анализе иммунофенотипа МНК экссудатов выявляется экспрессия маркёров зрелых лимфоцитов СD3, но отсутствует экспрессия активационных маркеров СD4, СD16, СD25, СD56, СD57, НLА-DR, обнаруживается невысокая экспрессия молекул адгезии СD58.

Мониторинг экстракорпоральной генерации ЛАК из мононуклеарных клеток плеврального экссудата онкологических больных показал, что при активации интерлейкином-2 на 3-и сутки происходит пролиферация лимфоцитов, появляются лимфоидные элементы различной степени зрелости, регистрируются единичные митозы, возрастает число крупных активированных лимфоцитов, пролимфоцитов, появляются клетки типа иммунобластов (рис. 16 а, б). На 5-е сутки коинкубации мононуклеаров с IL-2 в культурах повышается количество митозов, число бластных форм увеличивается в 20 раз, пролимфоцитов -- в 5 и активированных пиронинофильных лимфоцитов -- в 3 раза. Цитоплазма и ядрышки данных клеток, принадлежащих, по-видимому, к популяции ЛАК, имеют ярко пиронинофильную окраску, исчезающую при обработке РНК-зой, что свидетельствует о повышенном содержании в клетках РНК, и, следовательно, об их активной синтетической функции.

Спонтанная цитотоксическая активность лимфоцитов плеврального экссудата по отношению к линии эритробластного лейкоза человека К-562 составляет 45%, а при их инкубации с IL-2 повышалается до 90%.

Коинкубация лимфоцитов с IL-2 приводит к увеличению активированных форм лимфоцитов СD25⁺, СD56⁺, НLA-DR⁺, и повышается уровень экспрессии адгезивных молекул СD57, СD58. Кроме того, удается установить, что около 70% лимфоцитов составляют Т-клетки, 35% относятся к СD8⁺ (т.е. могут представлять цитотоксическую субпопуляцию), а 25% являются натуральными киллерами (CD16+, СD56⁺), которые играют важную роль в лизисе опухолевых клеток. Однако уровень экспрессии поверхностных антигенов популяции ЛАК, полученной из МЛ плеврального экссудата онкологических больных, не достигал уровня экспрессии ЛАК, генерированных из периферической крови здоровых доноров.

Мононуклеарные лейкоциты печени онкологических больных, выделенные из параметастатических участков, по иммунологическому фенотипу и цитотоксической активности существенно отличаются от клеток лейкоцитарных инфильтратов интактных областей и МЛ периферической крови тех же больных. Они имеют наиболее высокий уровнь НК-активности и обладают способностью лизировать аутологичные опухолевые клетки (табл. 6).

Таблица 6. Цитотоксическая и НК-активность мононуклеарных лейкоцитов печении периферической крови онкологических больных с метастазами в печень (p±s_p,%)

Данные клетки представлены молодыми и активированными (пиронинофильными) формами лимфоидного ряда (рис. 17).

Под действием IL-2 данные клетки могут дифференцироваться в ЛАК-клетки. Генерированные из этого источника ЛАК-клетки обладают более высоким уровнем НК-активности, чем ЛАК, полученные из МЛ интактных участков печени и МНПК онкологических больных и здоровых доноров (см. табл. 7). В популяции ЛАК, генерированных из НКТ печени, преобладают клетки, экспрессирующие маркёры НК-клеток, молекулы адгезии и антигены активации.

Цитоиммунохимические исследования лейкоцитарных инфильтратов на гистологических срезах поражённой метастазами печени онкологических больных с помощью моноклональных антител (МкАТ) показали наличие большого количества клеток, экспрессирующих на своей поверхности маркёры гранулоцитов (CD15), клеток мезенхимного происхождения (WIM), Т-лимфоцитов (CD3), макрофагов (CD68), предшественников Т и В-лимфоцитов (TdT), лимфоцитов и макрофагов (OLA), маркёра пролиферации -- Ki67.

Таблица 7. Иммунофенотип активированных ИЛ-2 мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из печени и крови онкологических больных(Уровень экспрессии антигенов, %)

При цитоиммунохимическом исследовании печени мышей, заражённых опухолью CAO-1, в лейкоцитарных инфильтратах параметастатических областей выявляется значительно большее количество CD15+, WIM+, CD3+, CD68+, TdT+, OLA+, Ki67+ клеток, чем в печени онкологических больных, а также выявляются клетки, экспрессирующие стволовоклеточные антигены (CD10 -- CALLA common), pan-B-маркёры -- CD20.

МЛ, выделенные из печени мышей после имплантации опухолевых клеток рака яичников СаО-1 в паренхиму органа, проявляют в более высокую степень НК-активности (в 2-2,5 раза) и цитотоксического потенциала по отношению к аутологичным опухолевым клеткам, чем лимфоциты селезёнки. В большинстве своём они экспрессируют CD3 и НК-маркёры (см. рис 18).

Следовательно, мононуклеарные лейкоциты, инфильтрирующие пораженную опухолевым процессом печень и циркулирующие в экссудатах онкологических больных могут дифференцироваться в НКТ, а при стимуляции ИЛ-2 -- в активные ЛАК-клетки, которые играют важную роль в противоопухолевом иммунитете. Этот может быть использовано для разработки методов локорегионарной адъювантной иммунотерапии метастазов в печень и серозные оболочки.

Источники генерации, индукторы созревания, морфологические,иммунофенотипические и функциональные особенностиантигенпрезентирующих дендритных клеток

При стандартных условиях культивирования с добавлением коктейля цитокинов: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-4 и фактора некроза опухолей в течение 7 суток из моноцитов/макрофагов крови или стволовых клеток костного мозга генерируются антигенпрезентирующие ДК с эксцентрично расположенным ядром, характерными ветвящимися отростками, выраженной вакуолизацией цитоплазмы, развитым комплексом Гольджи и рибосомальным аппаратом (рис. 19).

Морфологические и фенотипические признаки свидетельствуют об активности белоксинезирующего и лизомального аппаратов, высокой вероятности межклеточных контактов за счет развитой системы цитоплазматических отростков и выраженной экспрессии активационных антигенов, что позволяет отнести рассматриваемые клетки к субпопуляции зрелых ДК. Генерированные из данных источников ДК демонстрируют также высокий уровень экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и маркеры костимулирующих антигенов.

Результаты исследований свидетельствуют о возможности получения зрелых ДК также из стволовых клеток эмбриональной печени мышей при использовании в качестве индукторов созревания ДК фактора некроза опухолей и поливалентной вакцины Иммуновак ВП-4, которые почти в одинаковой степени оказывают влияние на процесс созревания дендритных клеток.

Генерированные дендритные клетки имеют типичные морфологические и электронно-микроскопические характеристики, отражающие повышенные синтетические функции, и иммунофенотип (CD34-, CD38+, CD40+, CD80+, CD86+, МНСI+, МНСII+, F4/80-+). В мазках культуральной взвеси они выявляются в виде крупных клеток овальной формы с эксцентрично расположенным ядром и пиронинофильными ядрышками, вакуолизированной цитоплазмой, имеющей ШИК-позитивный компонент и ярко пиронинофильную окраску за счёт повышенного содержания в ней РНК (см. рис. 20).

Обнаружена способность таких ДК стимулировать пролиферацию сингенных мононуклеарных лейкоцитов. Антигенная стимуляция ДК, полученных из клеток-предшественников эмбриональной печени мышей, лизатом опухолевых клеток линии YAC-1 приводит к дифференцировке in vitro иммунных лимфоцитов, обладающих высокой цитотоксической активностью по отношению к клеткам данной опухолевой линии. Эти факты свидетельствует о возможности использования генерированных из стволовых клеток эмбриональной печени дендритных клеток для разработки ДК-вакцины с целью применения в биотерапии онкологических заболеваний.

Сравнительное изучение использования в качестве индукторов созревания дендритных клеток, полученных из клеток-предшественников костного мозга мышей, иммуномодуляторов микробного происхождения (ЛПС Klepsiella pneumoniae)и в качестве контроля -- TNF-б показывает, что эти факторы в равной степени приводят к созреванию ДК, в процессе которого изменяется их иммунофенотип. В культурах увеличивается количество клеток, экспрессирующих на своей поверхности активационные, костимулирующие молекулы и маркёры гистосовместимости I и II типов.

Генерированные данным образом клетки обладают всеми морфологическими, иммунофенотипическими и функциональными признаками зрелых ДК, лишь незначительными нюансами отличаясь от ДК, полученных из моноцитов/макрофагов периферической крови человека и клеток-предшественников эмбриональной печени мышей. Зрелые дендритные клетки имеют более высокую концентрацию ШИК-положительного компонента в цитоплазме, уровень которой снижается и почти выравнивается в клетках разной степени зрелости после обработки амилазой, что свидетельствует о повышенном содержании гликогена в зрелых ДК по сравнению с незрелыми формами (рис. 21 а, б). Электронные микрофотографии демонстрируют высокий уровень синтетических процессов в зрелых ДК, генерированных из клеток-предшественников костного мозга мышей (рис. 21 в, г).

При созревании ДК уменьшается их фагоцитарная активность, а в культуральной среде достоверно повышается уровень содержания цитокинов, регулирующих дифференцировку лимфоцитов (IL-1в, IL-6, IL-12, INF-г, TNF-б), и снижается количество цитокинов, действующих на дифференцировку самих ДК (IL-4), уровень IL-2, IL-10 остаётся без изменений (табл. 8).

Таблица 8. Индукция цитокинов дендритными клетками, генерированными из клеток-предшественников костного мозга мышей (пкг/мл)

Примечание: Достоверность различий между группами: * -- p<0,05; ** -- p<0,001.

Зрелые дендритные клетки, стимулированные исследуемыми препаратами, способны повышать цитотоксическую активность лимфоцитов после обработки лизатом клеток опухоли Эрлиха и мышиной лимфомы YAC-1 и усиливать пролиферативные способности сингенных мононуклеарных лейкоцитов.

Дендритные клетки, полученные в опытах из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров, при активации их препаратом профеталь, имели иммунофенотипические признаки зрелых ДК: высокий уровень маркёров антигенного представления (CDla), костимулирующих молекул (CD80), адгезивных молекул (CD11с) и, наконец, основной показатель зрелости ДК -- высокий уровень экспрессии антигена терминальной дифференцировки CD83. При этом показатели экспрессии данных кластеров детерминации были не ниже, чем у клеток, генерированных при использовании общепринятого индуктора созревания ДК --TNF-б.

Данные морфологических исследований соответствовали функциональным и иммунофенотипическим критериям, характеризующим клетки, полученные в культурах при действиипрофеталя, как зрелые ДК (рис. 22). Электронномикроскопические исследования полученных дендритных клеток выявляли типичные ДК с многочисленными отростками, теснейшим образом контактирующими с клетками лимфоидного ряда (рис. 22 в). Эксцентрично расположенные ядра содержали хроматин, конденсирующийся вблизи ядерной мембраны. В цитоплазме и крупных ядрышках при обработке по Бернару определялось большое количество РНК (рис. 22 г).

Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о возможности получения зрелых ДК из различных источников (моноциты периферической крови, бластные формы больных острым миелоидным лейкозом, клетки-предшественники эмбриональной печени и костного мозга взрослых животных) при использовании в качестве индуктора созревания как общепринятых цитокинов (фактора некроза опухолей), так и иммуномодуляторов бактериального происхождения (поливалентной вакцины Иммуновак ВП-4, бактериальных липополисахаридных комплексов) иммуномодуляторов, содержащих человеческий б-фетопротеин (препарат профеталь). Все виды ДК, генерированные из разных источников и с применением в качестве индукторов созревания различных цитокинов и иммуномодуляторов, имеют морфологические и иммунофенотипические признаки зрелых ДК, обладают способностью усиливать пролиферативную и цитотоксическую способность сингенных мононуклеарных лейкоцитов в культурах. Данные факты свидетельствует о возможности использования генерируемых изученными способами дендритных клеток для разработки ДК-вакцины с целью применения в биотерапии онкологических и инфекционных заболеваний.

клетка индуцибельный молекула лимфоцит

Полученные результаты свидетельствуют о том, что под влиянием различных регуляторных факторов: ростовых колониестимулирующих факторов, бактериальных антигенов, липополисахаридных комплексов бактериального происхождения, цитокинов, человеческого б-фетопротеин в составе препарата профеталь, -- стромальные клетки-предшественники и связанные с ними иммунокомпетентные клетки способны изменять свои морфологические, иммунофенотипические и функциональные свойства. Таким образом, путём подбора оптимальных доз эффективно действующих иммуномодулирующих препаратов ex vivo можно вызывать направленную дифференцировку клеток с формированием клеточных форм, обладающих различно выраженной биологической активностью. Изученные способы генерации клеток с заданными свойствами могут быть использованы для разработки методов, применяемых в адоптивной иммуноклеточной терапии патологических состояний разнообразного генеза.

Выводы

1. Стромальные клетки-предшественники костного мозга и клоногенные клетки, обнаруженные в биологических жидкостях, в равной степени зависимы от условий культивирования: плотности эксплантируемых клеток, времени адгезии, состава газовой среды, наличия или отсутствия фидера (облучённых гемопоэтических клеток), его происхождения. Эффективность клонирования КОК-ф зависит от стимулирующего или индуцирующего воздействия присутствующих в культурах кроветворных клеток.

2. В онтогенезе по мере старения организма происходит снижение численности и эффективности клонирования стромальных клеток-предшественников в кроветворных и лимфоидных органах у мышей, морских свинок и крыс, при этом у крыс повышается их уровень в перитонеальном транссудате и экссудате.

3. На иммунофенотип, клоногенные и остеогенные свойства КОК-ф костного мозга и селезёнки существенное влияние оказывают введение препарата профеталь, содержащего в качестве основного компонента человеческий б-фетопротеин, а также вакцинация антигенами стрептококка.

4. Индуцибельные клоногенные клетки, обнаруженные в биологических жидкостях (крови, плевральном, перикардиальном и перитонеальном транссудатах и перитонеальном экссудате), по многим характеристикам: уровню эффективности клонирования, зависимости её от возраста и вида лабораторных животных, плотности эксплантируемых клеток, по морфологии формируемых ими колоний, -- коррелируют и сопоставимы с детерминированными стромальными клетками костного мозга.

5. Киллерная активность и пролиферативный потенциал мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека повышаются под действием содержащего человеческий б-фетопротеин препарата профеталь, более значительно, чем под влиянием классических митогенов -- фитогемагглютинина и интерлейкина-2. При этом реакция бласттрансформации сопровождается образованием CD34+/CD45+ гемопоэтических клеток-предшественников. Максимальное количество активированных лимфоцитов с высокой цитотоксической активностью достигается на 3-5-е сутки коинкубации с иммуномодуляторами.

6. Мононуклеарные лейкоциты печени онкологических больных, выделенные из параметастатических участков, обладая более высокой НК-активностью, по своему иммунологическому фенотипу и морфологии существенно отличаются от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови этих же больных и могут быть отнесены к популяции НКТ-клеток. Под действием интерлейкина-2 мононуклеарные лейкоциты печени, плеврального и перитонеального экссудатов онкологических больных дифференцируются в лимфокин-активированные киллеры.

7. Дендритные клетки, генерированные из различных источников: моноцитов крови человека, клеток-предшественников печени эмбрионов и костного мозга мышей СВА, -- обладают сходными морфологическими, иммунофенотипическими и функциональными характеристиками. Их созревание может индуцироваться как общепринятым набором цитокинов, так и бактериальными липополисахаридными комплексами и человеческим б-фетопротеином в составе препарата профеталь. Полученные дендритные клетки имеют иммунофенотипические признаки зрелых ДК: CDla+, CD80+, CD11с+ и высокий уровень экспрессии антигена терминальной дифференцировки CD83.

8. Зрелые дендритные клетки, генерированные из клеток-предшественников костного мозга мышей СВА, продуцируют спектр цитокинов, регулирующих дифференцировку лимфоцитов (IL-1в, IL-6, IL-12, INF-г, TNF-б), и усиливают пролиферативную и цитотоксическую активность сингенных мононуклеарных лейкоцитов.

9. При инкубации лимфоцитов со зрелыми ДК, нагруженными опухолевыми антигенами, происходит дифференцировка цитотоксических лимфоцитов, обладающих высокой избирательной киллерной активностью, в основном, по отношению к тем опухолевым линиям, из которых были получены лизаты для обработки ДК.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фриденштейн А.Я., Лебединская О.В. Потребность стволовых клеток стромы костного мозга в стимуляции гемопоэтическими клетками // Российские морфологические ведомости. ВРИО АГЭ. -- Москва. -- 1992. -- С. 260.

2. Лебединская О.В., Кочурова И.А. Морфология колоний стромальных фибробластов красного костного мозга крыс // Пермский медицинский журнал. -- 1997. -- Т. XIV. -- № 1 -- С. 46-51.

3. Лебединская О.В. Клетки-предшественники стромальных фибробластов, циркулирующие в крови // Пермский медицинский журнал. -- 1998. -- Т. XV. -- № 4. ---- С. 9-13.

4. Лебединская О.В., Оленев В.А. Исследование эффективности колониеобразования методом компьютерного моделирования // Пермский медицинский журнал. -- 1999. -- Т. XVI. -- № 1. -- С. 11-13.

5. Лебединская О.В. Клоногенные предшественники стромальных фибробластов, циркулирующие в биологических жидкостях // Российские морфологические ведомости. ВРИО АГЭ. -- Москва. -- 1999. -- № 1-2. -- с. 90-92.

6. Халтурина Е.О., Лебединская О.В., Шубина И.Ж., Доненко Ф.В., Райхлин Н.Т., Киселевский М.В. Морфологические особенности и иммунофенотип дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови человека // Морфология. -- 2004. -- № 3. -- С. 89-92.

7. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В. Морфологические и фенотипические особенности дендритных клеток, генерированных из клеток эмбриональной печени мышей // Морфологические ведомости. -- 2004. -- № 3-4. -- С. 41-45.

8. Киселевский М.В., Лебединская О.В. Адоптивная иммунотерапия злокачественных новообразований с использованием лимфокин-активированных киллеров и дендритных клеток // Пермский медицинский журнал. -- 2004. -- № 3. -- С. 116-127.

9. Вершинина М.Ю., Халтурина Е.О., Доненко Ф.В., Патютко Ю.И., Забежинский Д.А., Титов К.С., Кузовлев Е.Н., Лебединская О.В., Воробьёв А.А., Киселевский М.В. Сравнительная функциональная и иммунофенотипическая характеристики лимфокин активированных киллеров (ЛАК), полученных из натуральных киллеров Т-(НКТ)-клеток у больных с опухолевым поражением печени // Вестник РАМН. -- 2004. -- № 12. -- С. 32-36.

10. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю., Лациник Н.В., Нестеренко В.Г. Возрастные изменения количества стромальных клеток-предшественников в костном мозге животных // Морфология. -- 2004. -- № 6 -- С. 46-49.

11. Лебединская О.В., Халтурина Е.О., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Леонова О.Г., Попенко В.И., Мелехин С.В., Киселевский М.В. Морфологические и функциональные особенности лимфокин-активированных киллеров, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови человека // Морфология. -- 2005. -- № 1. -- С. 28-32.

12. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Родионов С.Ю, Лебединская Е.А., Гаврилова Т.В., Карамзин А.М., Киселевский М.В.Получение активированных лимфоцитов из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека под воздействием альфа-фетопротеина // Сибирский онкологический журнал. -- 2005. -- № 1. -- С. 40-46.

13. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Киселевский М.В.Функциональная активность и морфологическая характеристика лимфокин-активированных киллеров // Пермский медицинский журнал. -- 2005. -- № 1. -- С. 6-12.

14. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Нестеренко В.Г. Морфо-гистохимическая характеристика трансплантатов и колоний стромальных клеток-предшественников (КОК-Ф) в культурах гетеротопных трансплантатов костного мозга мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы А // Морфологические ведомости. -- 2005. -- № 1-2. -- С. 99-103.

15. Горская Ю.Ф., Нестеренко В.Г., Лебединская О.В. Потребность культуральных потомков стромальных костномозговых клеток-предшественников (КОК-Ф) кроликов в тромбоцитарных ростовых факторах // Клеточные технологии в биологии и медицине. -- 2005. -- № 2. -- С. 113-116.

16. Лебединская О.В., Горская Ю.Ф., Шуклина Е.Ю., Лациник Н.В., Нестеренко В.Г. Анализ изменений количества стромальных клеток-предшественников в тимусе и селезёнке животных различных возрастных групп // Морфология. -- 2005. -- Т. 127. -- № 3. -- С. 41-44.

17. Горская Ю.Ф., Данилова Т.А., Лебединская О.В., Нестеренко В.Г. Численность стромальных клеток-предшественников (КОК-Ф) в гетеротопных трансплантатах костного мозга мышей, иммунизированных антигенами стрептококка группы А // Бюлл. экспер. биол. и мед. -- 2005. -- Т. 140. -- № 7. -- С. 77-80.

18. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Амоджолов Б.С., Доненко Ф.В., Семёнов Б.Ф. Особенности иммунофенотипа и функциональной активности дендритных клеток, генерированных из клеток эмбриональной печени мышей // Молекулярная медицина. -- 2005. -- № 2. -- С. 51-57.

19. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Лебединская Е.А., Гаврилова Т.В., Киселевский М.В. Влияние препарата «Профеталь» на функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов и дендритных клеток человека // Медицинская иммунология. -- 2005. -- Т. 7. -- № 5-6. -- С. 525-534.

20. Лебединская О.В., Патютко Ю.И., Забежинский Д.А., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Вершинина М.Ю., Киселевский М.В. Морфофункциональные особенности натуральных киллеров Т-клеток (НКТ) у больных с опухолевыми поражениями печени // Сибирский онкологический журнал. -- 2005. -- № 3. -- С. 24-31.

21. Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Киселевский М.В., Лебединская Е.А. Функциональная активность дендритных клеток, генерированных из клеток эмбриональной печени мышей // Пермский медицинский журнал. -- 2005. -- Т. 2. -- № 2. -- С. 13-21.

22. Лебединская О.В, Ахматова Н.К., Мелехин С.В., Верескунов А.М., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Влияние лектина клещевины на морфологию лимфоидных органов лабораторных животных и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов крови человека // Морфологические ведомости. -- 2005 -- № 3-4. -- С. 53-58.

23. Лебединская О.В., Черешнев В.А., Гаврилова Т.В., Лебединская Е.А., Родионов С.Ю., Шубина И.Ж., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Сравнительнаый анализ возможности экстракорпоральной генерации активированных лимфоцитов периферической крови человека с применением препарата «Профеталь» и интерлейкина-2 // Вестник Уральской медицинской академической науки -- 2005. -- № 4. -- С. 52-58.

24. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Макашин А.И., Семенова И.Б., Семенов Б.Ф. Генерация дендритных клеток с использованием в качестве индуктора созревания иммуномодуляторов бактериального происхождения // ЖМЭИ. -- 2005. -- № 5. -- С. 57-62.

25. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В, Макашин А.И., Семенова И.Б., Курбатова Е.А., Егорова Н.Б., Семенов Б.Ф. Влияние дендритных клеток, генерированных при помощи иммуномодуляторов микробного происхождения, на пролиферативную и цитотоксическую активность лимфоцитов // ЖМЭИ. -- 2005. -- № 6. -- С. 58-62.

26. Ахматова Н.К., Кузовлев Е.Н., Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Макашин А.И., Киселевский М.В. Цитотоксическая активность натуральных киллеров Т-(НКТ)-клеток у мышей с опухолевым поражением печени // Бюлл. эксп. биол. и мед. -- 2006. -- Т. 141. -- № 1. -- С. 76-79.

27. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Ахматов А.Т., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Динамика экспрессии поверхностных молекул лимфоцитов под воздействием бактериального иммуномодулятора // Вестник Уральской медицинской академической науки. -- 2006. -- № 1. -- С. 10-13.

28. Ахматова Н.К., Семёнова И.Б., Курбатова Е.А., Лебединская О.В., Егорова Н.Б., Шубина И.Ж., Киселевский М.В., Семёнов Б.Ф. Фагоцитарная активность дендритных клеток, генерированных из клеток костного мозга мышей // Вестник Уральской медицинской академической науки. -- 2006. -- № 1. -- С. 14-18.

29. Черешнев В.А., Лебединская О.В., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Лебединская Е.А., Гаврилова Т.В., Киселевский М.В. Иммуномодулирующее действие препарата «Профеталь» на мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека и генерированные из них дендритные клетки // Иммунология. -- 2006. -- Т. 27. -- № 3. -- С. 132-141.

30. Лебединская О.В., Велижева Н.П., Доненко Ф.В., Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Лебединская Е.А., Киселевский М.В. Влияние препарата профеталь на дифференцировку и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. -- 2006. -- № 2. -- С. 108-117.

31. Родионов С.Ю., Лебединская О.В., Киселевский М.В., Штиль А.А., Черешнева М.В., Черешнев В.А., Тараненко Л.А., Гаврилова Т.В., Орлов О.А., Шур Н.Н., Е.Г.Орлова К вопросу о механизмах противоопухолевой активности альфа-фетопротеина человека in vitro // Сибирский онкологический журнал. -- 2006. -- № 3. -- Т. 19 -- С.41-47.

32. Лебединская О.В. Кочурова И.А. Колониеобразующие клетки плевральной жидкости // Депонировано в ВИНИТИ 17.03.97 № 803-897.

33. Лебединская О.В., Кочурова И.А., Мелехин С.В., Щербаков Р.В. Клоногенные предшественники фибробластов в плевральной и перикардиальной жидкостях морских свинок // Депонировано в ВИНИТИ 28.07.98 № 2443-В98.

Размещено на Allbest.ru