Носители противоопухолевых препаратов на основе синтетических полипептидов

Изучение противоопухолевой активности пептида (XLVII) проведенное в Институте кардиологии МЗ РФ на клеточной культуре рака толстого кишечника линии Colo показало, что инкубация опухолевых клеток с исследуемым соединением приводит к достоверному снижению скорости синтеза ДНК, свидетельствующему о наличии антипролиферативной активности. Результаты исследования противоопухолевой активности аналогов (XLIX) и (L) на клетках карциномы молочной железы человека (MCF-7; Институт экспериментальной медицины РАМН) подтверждают полученные нами данные относительно влияния пальмитоильной группировки на свойства пептидного носителя. При этом только пептид (L) обладает выраженным цитотоксическим действием.

Следует отметить, что в последующих работах была показана эффективность применения RGD-пептидов для направленного транспорта доксорубицина к опухолевым клеткам (Ruoslahti, et.al. 1998). Эти данные дополнительно подтверждают полученные нами результаты и свидетельствуют о возможности использования рассматриваемых соединений в системах адресной доставки лекарственных препаратов.

Таким образом, пептидные носители, содержащие последовательность RGD являются перспективными для направленного транспорта лекарственных соединений при патологических состояниях, сопровождающихся локальной активацией тромбоцитов (атеросклерозе, тромбообразовании, формировании метастазов). Кроме того, в случае онкологических заболеваний такие соединения могут быть использованы как непосредственно, так и в сочетании с цитотоксическими аналогами люлиберина, воздействующими на клетки первичной опухоли.

7. Использование полипептидных носителей для доставки «суицидного» гена в опухолевые клетки

Одним из перспективных и быстро развивающихся направлений является генная терапия опухолевых заболеваний, основанная на применении носителей, обеспечивающих избирательное воздействие на опухолевые клетки. В частности, большой интерес представляет разработка методов переноса так называемых «суицидных» генов, к числу которых относится ген тимидинкиназы вируса простого герпеса. При этом злокачественные клетки приобретают способность фосфорилировать противовирусный препарат ганцикловир, что приводит к прекращению синтеза ДНК. Наличие эффекта гибели соседних опухолевых клеток позволяет многократно усилить терапевтическое действие.

В данном исследовании нами была поставлена задача разработать систему адресной доставки «суицидных» генов, основанную на применении аналогов люлиберина и провести сравнительное изучение эффективности новых пептидных носителей и известных из литературы аналогов. В ходе экспериментов использовали нековалентные комплексы пептидов с репортерными генами -галактозидазы и люциферазы или «суицидным» геном тимидинкиназы. При этом оценивалось влияние структуры носителя, соотношения пептид - ДНК и ряда других факторов на способность комплекса к проникновению в клетки гепатокарциномы человека HepG2, содержащие рецепторы люлиберина. В качестве пептидов сравнения были использованы соединения (LII)-(LIV), представленные на рис. 13.

Хорошо известная из литературы двухкомпонентная система состоит из катионного пептида (LI) и аналога гемагглютинина вируса гриппа (LII), (Gottschalk, et.al. 1996). В этом случае проникновение комплекса в клетку происходит путем эндоцитоза, а основная роль гидрофобного пептида (LII) связана со способностью вызывать разрушение образующихся эндосом за счет литической активности, проявляющейся при кислых значениях pH.

Пептид (LIII) и флуоресцентно меченый аналог (LVI), содержат участок последовательности (47-57) белка Tat вируса иммунодефицита человека относящийся к так называемым «доменам трансдукции» белков. В данном случае в литературе нет единого мнения по поводу механизма действия такого рода носителей. Кроме того, на момент проведения работы отсутствовали систематические данные относительно возможности применения их комплексов с ДНК.

Для оценки избирательности действия пептидных носителей на основе аналогов люлиберина, был проведен синтез конъюгата катионного пептида (LI) с фрагментом (95-98) a-цепи фибриногена, последовательности RGDF (пептид (LV)). В этом случае проникновение комплекса через мембрану происходит при участии рецепторов, расположенных на поверхности как нормальных, так и опухолевых клеток.

Поскольку непосредственное применение аналогов люлиберина для доставки «суицидных» генов невозможно из-за неспособности к электростатическому взаимодействию с ДНК, нами были выбраны пептиды (XLII)-(XLIV), (LVI) и (LVII), содержащие сигнал ядерной локализации. При этом для оценки влияния структуры пептидного носителя на эффективность переноса гена в экспериментах использовали аналоги, обладающие как агонистической ((LVII)), так и антагонистической активностью.

Известно, что доксорубицин и его аналоги образуют стабильные комплексы с ДНК. Поэтому, теоретически, существует возможность создания систем доставки гена на основе конъюгатов полипептидов и антрациклиновых антибиотиков. Применение таких носителей для доставки «суицидных» генов может привести к уменьшению побочных эффектов и повышению эффективности противоопухолевого действия. Для проверки обоснованности этих соображений нами был получен цитотоксический аналог пептида (XXVI), содержащий доксорубицин (соединение (LVIII)).

Рис. 14. Схема синтеза аналога (LV).

Синтез пептидных носителей проводили твердофазным методом на полимере Меррифильда и 4-метилбензгидриламино-полимере с помощью Boc/Bzl-стратегии или комбинации Boc/Bzl и Fmoc/Bu^t-стратегии. В случае аналога (LV) использовали метод фрагментной конденсации на твердой фазе. При этом защищенный пептид RGDF получали классическим синтезом в растворе с последующей модификацией монопентахлорфениловым эфиром глутаровой кислоты (рис. 14). Фрагментную конденсацию проводили DIC/HOBt методом при использовании 1.5 кратного избытка ацилирующего агента, в объеме набухания полимерного носителя, что позволяет существенно повысить полноту прохождения реакции (Rinnovб, et.al. 1999).

При получении аналога (LIV), содержащего флуоресцентную метку использовали 4(5)-карбоксифлуоресцеин. Реакцию конденсации проводили на твердой фазе, DIC/HOBt методом. При этом для уменьшения возможного влияния флуоресцентной метки на свойства аналога в качестве спейсерной группировки использовали диглицин. Присоединение доксорубицина к пептиду (XXVI) осуществляли в растворе по методике, аналогичной использованной в работах Шелли (Nagy, et.al. 1996).

Сравнительное изучение эффективности полученных пептидных носителей проводили в Институте экспериментальной медицины РАМН. Подбор оптимального соотношения компонентов при образовании комплекса пептид/ДНК осуществляли с помощью метода гель-ретардации.

В ходе предварительных экспериментов было показано, что применение пептида (LI) обеспечивает перенос репортерных генов в клетки HepG2 в результате эндоцитоза. При этом добавление аналога (LII) приводит к 2-х - 3-х кратному увеличению эффективности системы.

Аналогичные результаты получены в случае пептида (LIII), для которого была показана возможность образования стабильного комплекса с ДНК и определено оптимальное соотношение компонентов. Сравнительное изучение скорости и условий проникновения через клеточную мембрану флуоресцентно меченого пептида (LIV) и его комплекса с ДНК показывает, что перенос гена происходит в результате эндоцитоза. В тоже время свободный пептид проникает в клетку более эффективно.

Результаты экспериментов по доставке плазмидной ДНК в клетки млекопитающих показывают достаточно высокую и сопоставимую эффективность действия соединений (LI) и (LIII) in vitro. Вместе с тем опыты in vivo, проведенные на мышах линии C57B1/6 не привели к положительным результатам (Акифьев Б.Н., 2004 г.).

При разработке системы направленной доставки «суицидных» генов в опухолевые клетки нами были использованы пептидные носители на основе аналогов люлиберина, содержащих сигнал ядерной локализации или доксорубицин. Если в первом случае образование комплексов с ДНК происходит в результате электростатического взаимодействия, то доксорубицин, по литературным данным, образует прочные водородные связи с остатками аденина и гуанина. При этом наличие такого связывания для соединения (LVIII) подтверждается как методом гель-ретардации, так и данными УФ спектроскопии.

Рис. 15. Влияние соотношения пептид/ДНК на эффективность переноса гена люциферазы в клетки HepG2. * - В присутствии «аларелина». RLU - относительные световые единицы.

В предварительных экспериментах возможность применения аналогов люлиберина в качестве носителей ДНК была исследована на примере доставки гена люциферазы в клетки HepG2 (рис. 15). При этом последовательность ядерной локализации (пептид (LX)) образует стабильные комплексы, которые могут быть использованы для доставки гена в ядро, но не способны самостоятельно проникать через клеточную мембрану. В тоже время в случае аналога (LX) (NLS белка Rev ВИЧ) комплексы пептид/ДНК эффективно переносятся через мембрану в результате эндоцитоза, что делает его непригодным для адресной доставки «суицидных генов». При использовании аналога (LVII) эффективность системы зависит от состава комплекса, достигая максимальной величины при соотношении пептид/ДНК 1:1.

Для доказательства механизма действия пептидного носителя был использован суперактивный аналог «аларелин», обладающий высоким сродством к рецептору люлиберина, но не способный связываться с ДНК. Добавление «аларелина» приводит к достоверному снижения уровня переноса гена, что свидетельствует в пользу избирательного проникновения комплексов в исследуемые клетки, происходящего при участии специфических рецепторов.

На рис. 16 представлено влияние структуры пептидного носителя на эффективность доставки в опухолевые клетки гена люциферазы. При этом одним из наиболее существенных факторов является способ присоединения сигнала ядерной локализации. Вопреки ожиданиям, в случае аналога (XLIII), где для этого используется положение 6 природной последовательности, уровень люциферазной активности оказался значительно ниже по сравнению с пептидом (XLII), содержащим NLS в N-концевой части молекулы. Низкие величины активности, полученные при использовании аналогов (XLIV) и (LVIII) могут объясняться наличием выраженного цитотоксического действия у комплексов пептид/ДНК.

Рис. 16. Влияние структуры пептидного носителя на эффективность доставки люциферазного гена в клетки HepG2. Соотношение пептид/ДНК 1:1.

Полученные результаты и данные экспериментов in vitro, в которых варьировалось соотношение ДНК и пептида (LVIII) свидетельствуют о возможности практического применения пептидных носителей, содержащих доксорубицин. При этом особенный интерес представляет их использование в системах адресной доставки «суицидных» генов в опухолевые клетки.

Сравнительное изучение действия различных по структуре пептидных носителей проводили на примере доставки «суицидного» гена тимидинкиназы в клетки HepG2 (рис. 17). При этом критерием эффективности служил процент опухолевых клеток, погибших в результате последующей обработки ацикловиром. Применение известной из литературы двухкомпонентной системы, состоящей из катионного пептида (LI), и аналога гемагглютинина вируса гриппа (LII), приводило к гибели приблизительно половины клеток по сравнению с 6-12% в контроле.

Рис. 17. Влияние структуры носителя «суицидного» гена на количество клеток HepG2, погибших в результате обработки ацикловиром.

Значительно лучшие результаты были получены для гибридного аналога (LV), способного, благодаря наличию последовательности RGDF, связываться с рецепторами (интегринами), расположенными на поверхности клеточной мембраны. В этом случае проникновение комплексов пептид/ДНК происходит более эффективно, что приводит к полному уничтожению злокачественных клеток. Вместе с тем, для повышения избирательности действия пептидного носителя необходимо использовать аналоги последовательности RGDF, селективно взаимодействующие с рецепторами опухолевых клеток. При этом анализ литературных данных показывает, что такая модификация будет приводить к существенному усложнению структуры препарата.

Использование аналогов люлиберина (соединения (LVI) и (LVII)) для доставки «суицидного» гена показывает, что определяющее влияние на эффективность пептидного носителя оказывает природа последовательности, участвующей в процессе взаимодействия с рецептором. При этом повышенное содержание рецепторов люлиберина, отсутствующих в большинстве нормальных тканей делает возможным не только полное уничтожение злокачественных клеток, но и обеспечение высокой избирательности действия.

Полученные предварительные данные показывают, что пептидные носители на основе аналогов люлиберина эффективны не только в экспериментах in vitro, но и in vivo, что свидетельствует о перспективности их применения в системах адресной доставки «суицидных» генов в опухолевые клетки.

Заключение

Проведенные в ходе работы исследования показывают, что применение носителей на основе синтетических полипептидов позволяет значительно повысить эффективность и избирательность действия противоопухолевых препаратов. При этом выбор структуры носителя и способа присоединения цитотоксического агента проводиться с учетом особенностей их биологического действия, включая связывание с рецепторами, расположенными на поверхности опухолевых клеток, проникновение через мембрану и последующее взаимодействие с внутриклеточными мишенями.

Одним из перспективных направлений является использование пальмитоильной группировки для повышения цитотоксической активности синтетических полипептидов. Такие соединения не оказывают влияния на клетки нормальных тканей, что позволяет синтезировать полипептидные носители, обладающие собственным, избирательным цитотоксическим действием.

Включение в состав полипептидного носителя сигналов ядерной локализации делает возможной доставку ряда химиотерапевтических агентов непосредственно к внутриклеточным мишеням действия, к числу которых относится ДНК и ферменты, принимающие участие в синтезе нуклеиновых кислот. В ходе работы показано, что такая модификация структуры носителя позволяет не только добиться повышения эффективности действия цитотоксических агентов in vitro, но и приводит к образованию стабильных комплексов пептид/ДНК, которые могут быть использованы в системах адресной доставки генов в опухолевые клетки.

Интересные возможности открываются в результате исследования конъюгатов полипептидных носителей с доксорубицином или другими интеркалирующими агентами. Такие соединения, обладающие высокой противоопухолевой активностью, могут быть использованы для доставки генов в злокачественные клетки, поскольку образуют прочные комплексы с ДНК за счет водородных связей. При этом уменьшается токсическое воздействие доксорубицина на нормальные ткани и создаются условия для проявления синергического противоопухолевого действия компонентов системы.

Полученные результаты позволяют сформулировать основные принципы, используемые при разработке полипептидных носителей противоопухолевых препаратов. Данные биологических испытаний показывают что синтетические полипептиды являются перспективным типом носителей позволяющим значительно повысить эффективность лекарственных соединений в результате их направленной доставки к клеткам-мишеням и проявления собственной биологической активности.

Выводы

Предложен новый подход к решению проблемы адресной доставки противоопухолевых препаратов, основанный на использовании в качестве носителей синтетических полипептидов, обладающих собственной цитотоксической активностью. Возможности практического применения таких соединений исследованы на примере люлиберина и фрагментов -цепи фибриногена.

С целью установления взаимосвязи структура - активность проведен синтез серии аналогов люлиберина, содержащих N-концевую гидрофобную группировку. Впервые показано, что включение остатка пальмитиновой кислоты в структуру полипептидного носителя приводит к повышению противоопухолевой активности как in vitro, так и in vivo.

Разработана новая стратегия получения противоопухолевых соединений на основе аналогов люлиберина, принципиальной особенностью которой является введение цитотоксических группировок в положения 1 или 6 природной последовательности в сочетании с заменой отдельных аминокислотных остатков в N-концевой части молекулы.

Предложен простой и эффективный метод синтеза конъюгатов полипептидных носителей с 5-фторурацилом, основанный на применении активированных производных 1-карбоксиметил-5-фторурацила. На примере аналогов люлиберина впервые показано, что такой подход может быть использован для повышения противоопухолевой активности пептидов in vivo.

Синтезированы новые аналоги люлиберина, обладающие комплексным воздействием на опухолевые клетки благодаря направленной доставке химиотерапевтического агента, гормональной, иммуностимулирующей и собственной цитотоксической активности. Впервые установлено, что стимуляция иммунной системы происходит в результате непосредственного взаимодействия аналогов люлиберина с регуляторным участком последовательности гена интерлейкина-2.

Установлено, что включение в структуру полипептидного носителя последовательности, обеспечивающей его направленный транспорт в ядро клетки (сигнала ядерной локализации) приводит к существенному повышению противоопухолевой активности in vitro.

На примере использования 5-фторурацила и группировки NO в качестве биологически активных соединений показано, что аналоги фрагментов -цепи фибриногена являются перспективными носителями для направленного транспорта лекарственных препаратов к пораженным органам и тканям.

Впервые установлено, что аналоги люлиберина, содержащие последовательность ядерной локализации или интеркалирующие агенты, в отличие от немодифицированных соединений, способны к образованию стабильных комплексов пептид/ДНК. В экспериментах in vitro показано, что применение полипептидных носителей, обладающих противоопухолевой активностью, в составе систем доставки «суицидных» генов позволяет повысить эффективность воздействия на опухолевые клетки.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах

Буров С.В., Кауров О.А., Мартынов В.Ф. Синтез [D-Phe(NO₂)²; Pro³; D-Ala⁶] и [D-Phe(NH₂)²; Pro³; D-Ala⁶] люлиберина // Хим. прир. соедин. 1980. N 5. С. 706-714.

Буров С.В., Николаев С.В., Смирнова М.П., Лупанова Г.Е., Бобров Ю.Ф., Неволин-Лопатин А.М., Китаев Е.М. Синтез биологически активных аналогов люлиберина с укороченной аминокислотной последовательностью // Хим. прир. соедин. 1982. N 6. С. 768-773.

Буров С.В., Мартынов В.Ф., Николаев С.В., Смирнова М.П., Корхов В.В. Аналоги люлиберина, проявляющие ингибирующее действие на ход процессов овуляции у животных. Авт. св. N 1028663, 1983 (приоритет от 23 июня 1981 г.).

Буров С.В., Николаев С.В., Корхов В.В., Макушева В.П., Лупанова Г.Е. Новые направления синтеза биологически активных аналогов люлиберина // Хим. прир. соедин. 1983. N 3. С. 398-399.

Бахарев В.Д., Есипов А.С., Буров С.В., Папсуевич О.С., Чипенс Г.И. Неклассические эффекты люлиберина, подтверждающие многоадресность нейропептидов // Ж. высшей нервной деят. 1985. Т. XXXV. Вып. 1. С. 164-169.

Николаев С.В., Буров С.В., Мартынов В.Ф., Подушка С.Б., Казанский Б.Н. Аналоги люлиберина, проявляющие стимулирующее действие на процессы овуляции и икрометание у рыб. Авт. св. N 1389240, 1987 (приоритет от 10 ноября 1985 г.).

Korkhov V.V., Makusheva V.P., Lupanova G.E., Burov S.V., Nikolaev S.V. Investigation of the influence of a cyclic luliberin analog on ovulation // Neurosci. Behav. Physiol. 1986. V. 16. N. 6. P. 516-519.

Буров С.В., Николаев С.В., Корхов В.В., Лупанова Г.Е., Макушева В.П. Синтез и исследование биологической активности укороченных аналогов люлиберина // Хим. прир. соедин. 1987. N 4. С. 590-595.

Николаев С.В., Буров С.В., Бахарев В.Д., Макушева В.П., Корхов В.В. Синтез нового циклического аналога люлиберина // Хим. прир. соедин. 1990. N 6. С. 805-810.

Казакова Т.Б., Мюльберг А.А., Буров С.В., Головко О.И., Гришина Т.В., Морозов В.М., Неустроева Л.Ч., Гущин Г.В. Иммуномодулирующие пептиды, регуляция образования интерлейкина-2 и возможный ее механизм // Бюлл. эксп. билогии и медицины. 1991. Т. CXII. N 7. С. 89-91.

Nikolaiev S.V., Sirotkin A.V., Nitray J., Burov S.V. Effects of LF-RH and its chemical analogues on oxytocin, vasopressin and oestradiol secretion by bovine granulosa cells in vitro // Physiol. Res. 1991. V. 40. P. 622.

Sirotkin A.V., Nitray J., Nikolaiev S.V., Burov S.V. The action of LH-releasing hormone and five analogues on oestradiol, oxytocin and vasopressin secretion by bovine granulosa cells in culture // J. of Endocrinol. 1993. V. 136. P. 491-496.

Sirotkin A.V., Nitray J., Nikolaiev S.V., Burov S.V., Bulla J. Studuum vplyvu LH-RH (Luteinizacny releasing hormon) a jeho analogov na secreciu estradiolu bunkami granulozy vajecnikov krav in vitro. The study of influence of LH-RH and its analogues on oestradiol secretion by granulosa cells ovaries in vitro // J. Farm. Anim. Sci. 1993. V. XXVI. P. 33-36.

Семко Т.В., Буров С.В., Веселкина О.С., Власов Г.П. Синтез и исследование противоопухолевой активности укороченных аналогов люлиберина // Хим. прир. соедин. 1994. N 5. С. 655-662.

Власов Г.П., Буров С.В., Семко Т.В. Декапептид, обладающий противоопухолевой активностью. Патент N 2084458 (приоритет от 27 мая 1993 г).

Гуревич В.С., Буров С.В., Попов Ю.Г., Семко Т.В., Власов Г.П. Способ направленного транспорта фармакологических препаратов путем их конюгации с аргинил-глицил-аспартил (RGD) содержащими пептидами. Патент N 2119354 (приоритет от 5 января 1996 г).

Казакова Т.Б., Буров С.В., Головко О.И., Гришина Т.В., Новикова Н.С., Мюльберг А.А., Семко Т.В., Корнева Е.А. Биологическая активность аналогов пептидного гормона - люлиберина в регуляции иммунного ответа Т-лимфоцитов // Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1996. Т. 122. N 9. С. 334-337.

Gurevich V.S., Lominadze D., Adeagbo A.S.O., Burov S.V., Popov Y.G., Miller F.N., Schuschke D.A. Usage of RGD peptide for targeted nitric oxide delivery // Platelets. 1996. V.7. N 1. P. 83-84.

Gurevich V.S., Lominadze D.G., Adeagbo A.S.O., Burov S.V., Popov Y.G., Leko M.V., Miller F.K., Shuschke D.A. Antitrombotic and vasorelaxant properties of a novel synthetic RGD peptide containing nitric oxide // Pharmacology. 1997. 55. P. 1-9.

Ignatovich I.A., Dizhe E.B., Pavlotskaya A.V., Akifiev B.N., Burov S.V., Orlov S.V., Perevozchikov A.P. Complexes of plasmid DNA with basic domain 47-57 of the HIV-1 Tat protein are transferred to mammalian cells by endocytosis-mediated pathways // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. N. 43. P. 42625-42636.