Хориоретинальная дистрофия: особенности развития у преждевременно стареющих крыс oxys и её коррекция митохондриальным антиоксидантом

Степень патологических изменений хрусталиков, выраженная в баллах, снизилась, соответственно, в 2, 3 и в 8,7 раза. Согласно парным зависимым сравнениям состояния хрусталиков до и после приёма препарата, у животных, получавших дозу 10 нмоль/кг крыс OXYS к возрасту 3-м мес. катаракта всё-таки развивалась (р<0,005). На фоне приёма 50 и 250 нмоль/кг SkQ1 прогрессирования заболевания не было (р=0,135 и р=0,62, соответственно). Более того, степень прозрачности хрусталиков в возрасте 3 мес. у них была достоверно ниже, чем в возрасте 5-6 недель (p<0,05).

В следующем эксперименте мы показали эффективность длительного приема SkQ1. Животные получали его с возраста 1,5 до 24 мес. (до возраста 12 мес. n=30, >12 мес. n=10) и периодически осматривались (проведено 7 осмотров).

Длительные наблюдения подтвердили, что ХРД и катаракта у крыс OXYS с возрастом прогрессируют и развиваются параллельно, что затрудняет осмотры глазного дна у животных с развитой катарактой. Как видим на рис. 15, у крыс OXYS, получавших SkQ1в дозе 250 нмоль/кг, и в 24 мес. заболеваемость сохранилась на уровне полуторамесячных животных.

Достоверным был и профилактический эффект SkQ1 в дозах 10 и 50 нмоль/кг: он существенно изменил характер течения заболевания - снизил процент глаз с выраженными стадиями заболевания, что повлияло и на среднестатистический показатель - выраженность изменений хрусталиков и сетчатки в баллах.

Рис. 15. Влияние длительного приёма SkQ1 (с возраста 1,5 мес.) на развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS. По оси ординат - выраженность патологических изменений. * - достоверные отличия по сравнению с контрольными животными.

Результаты клинических наблюдений подтверждены данными ЭРГ (рис. 16). Показательным явилось трёхкратное снижение амплитуды b- волны ЭРГ (рис.17), значительное снижение активности общей ЭРГ, вплоть до полного её угнетения, что свидетельствует о грубом поражении всех слоёв сетчатки у 24 месячных крыс OXYS. На фоне приема 250 нмоль/кг SkQ1 амплитуда была такой же, как у 3-месячных крыс OXYS, что свидетельствует об адекватности биоэлектрического ответа сетчатки, сохранности её фоторецепторного аппарата.

Высокую эффективность длительного профилактического приёма SkQ1 в дозе 250 нмоль/кг подтвердили и морфологические исследования сетчатки 24-месячных крыс OXYS. Отмечено уменьшение фиброзных изменений стромы сосудистой оболочки, сохранение просвета не только мелких, но и крупных хориоидальных сосудов, что, возможно, обеспечивало полноценную трофику наружных слоев сетчатки, отсутствие отёка и сохранность нормального расположения её ганглиозных клеток. Отмечалось сохранение наружного ядерного слоя, толщина которого в заднем полюсе достигала 8-10 рядов, в то время как у контрольных крыс OXYS этот слой полностью отсутствовал.

В области, где визуализировались наружный и внутренний ядерные слои, у получавших 250 нмоль/кг SkQ1 крыс OXYS были сохранены палочки, которые имели укороченный вид (рис. 18). Слой ретинального пигментного эпителия сохранялся в этих участках, и лишь местами выявлялась его отслойка.

Рис. 16. ЭРГ контрольных крыс OXYS в возрасте 3 и 24 мес. и 24-месячных крыс OXYS, получавших с возраста 1,5 мес. 250 нмоль/кг SkQ1.

Рис. 17. Амплитуда b волны ЭРГ контрольных крыс OXYS в возраст 3 и 24 мес. и 24-месячных, получавших с возраста 1,5 мес. 250 нмоль/кг SkQ1.

* - достоверные отличия от 3-месячных,

# - от контрольных 24-месячных крыс.

Таким образом, продемонстрирована зависимость эффективности препарата от дозы, выявлена оптимальная доза (250 нмоль/кг), полностью предотвращающая развитие патологических изменений сетчатки и хрусталиков. Длительный приём препарата положительно повлиял и на общее состояние крыс OXYS, в том числе на одно из характерных проявлений старения - изменения качества шерстного покрова. Признаков негативного влияния на общее клиническое состояние и поведенческие реакции животных при длительном применении SkQ1 не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии кумулятивной токсичности.

Рис. 18. Хориоретинальный комплекс двухгодовалых крыс Вистар (а), OXYS (б) и OXYS (с), получавших SkQ1с возраста 1,5 мес. в дозе 250 нмоль/кг. а -нормальная сетчатка, слои: (1) палочки, (2) наружный ядерный слой, (3) наружный плексиформный, (4) внутренний ядерный слой, (5) внутренний плексиформный, (6) ганглионарные клетки. б- нет фоторецепторов (все слои отсутствуют). в - дифференциация слоёв сохранена. Окраска ГЭ. Ч400.

Поскольку оптимальная лечебная форма препаратов в клинической офтальмологической практике - капли, мы исследовали возможность применения SkQ1 в инстилляционной форме. После предварительного осмотра с возраста 1,5 мес. крысы Вистар и OXYS были разделены на группы (n = 15), которые получали препарат в каплях с концентрацией SkQ1 10, 50 или 250 нМ (контрольные животные - физиологический раствор). На момент начала лечения изменения хрусталиков были диагностированы у 16% крыс OXYS, признаки начальной стадии ВМД - у 14% (рис.19).

Рис 19. Влияние капель SkQ1 на развитие ХРД и катаракты у крыс OXYS.

* - достоверные отличия от контрольных животных, # - достоверные отличия по сравнению с предыдущим обследованием, зависимые парные сравнения. По оси ординат - выраженность патологических изменений.

К возрасту 3 мес. у 85% контрольных крыс OXYS развивалась ХРД, в 5 мес. изменения сетчатки и сосудистого русла регистрировались у 100% животных. Изменения носили начальный характер и были представлены отёком центральной зоны глазного дна, точечными геморрагиями, атрофией хориокапилярного слоя и мягкими ишемическими очагами. Инстилляции 10 нМ SkQ1 затормозили, а в концентрации 250 нМ полностью предупредили развитие патологических изменений. В 3 мес. наблюдалась зависимость эффекта препарата от дозы (F2,87=8,8; p<0.0003), в 5 мес. выраженность изменений сетчатки у крыс, получавших различающуюся в 25 раз дозу препарата, была одинаковой (рис. 19). ХРД всё-таки развивалась, но имела менее выраженные стадии.

К возрасту 5 мес. заболеваемость крыс OXYS катарактой достигла 100%. Инстилляции 10 нМ SkQ1 существенно снизили выраженность изменений, а 250 нМ SkQ1 полностью предупредили их развитие. В этом возрасте эффект не зависел от концентрации капель. Парные сравнения данных биомикроскопии показали, что состояние хрусталиков оставалось таким же, как и в 1,5 мес.

Таким образом, установлена способность SkQ1 в каплях предупреждать развитие патологических изменений хрусталиков и сетчатки.

6.2. Оценка лечебного потенциала SkQ1

Оценивая способность SkQ1 влиять на состояние сетчатки и хрусталиков животных с уже развитыми клиническими признаками катаракты и ХРД, проведено 5 экспериментов. Эффект препарата исследовался на крысах OXYS разного возраста (от 7 до 12 мес.), получавших после предварительного осмотра препарат с кормом или в виде капель. При оценке результатов лечения проводили зависимые парные сравнения - сопоставляли состояние конкретно каждого глаза до и после лечения.

6.2.1. Эффекты SkQ1 при его приёме с кормом

Опыт 1 выполнен на 48 крысах Вистар и OXYS в возрасте 10,5 мес. Половина животных в течение 1,5 мес. получала по 50 нмоль/кг SkQ на кг, остальные служили контролем.

Рис. 20. Влияние 45-дневного курса SkQ1 (50 нмоль на кг массы тела с кормом) на состояние хрусталиков и сетчатки крыс Вистар и OXYS. # - достоверные межлинейные различия, * - достоверные отличия от контрольных животных.

Зависимые парные сравнения показали, что у контрольных крыс OXYS увеличилась интенсивность помутнений хрусталиков (р<0,04) и прогрессировала стадия дистрофии сетчатки (р<0,01), в то время как под влиянием SkQ1 выраженность этих изменений значительно снизилась. В сетчатке животных этой группы наблюдалось уменьшение отёка, количества и площади ишемических очагов, рассасывание кровоизлияний. У крыс Вистар препарат не влиял на состояние хрусталиков, изменений глазного дна не наблюдали (рис. 20). Опыт 2 выполнен на 38 крысах-самцах OXYS (76 глаз) с выраженными патологическими изменениями глаз. С возраста 7,5 мес. после осмотра все животные в течение 3 мес. получали с кормом SkQ1 по 250 нмоль/кг массы тела в сутки. При осмотрах в возрасте 9,5 мес. и 10,5 мес. парные зависимые сравнения выявили снижение выраженности изменений, как хрусталиков, так и сетчатки (рис. 21).

Рис. 21. Изменение хрусталиков и сетчатки у крыс OXYS на фоне приема SkQ1 (250 нмоль/кг с кормом в течение 2 и 3 мес.). # - значимые изменения по сравнению с состоянием при предыдущем осмотре (зависимые парные сравнения).

На фоне лечения произошло уменьшение интенсивности заднекапсулярных помутнений, ограничение локализации их преимущественно в области капсулы и освобождение от помутнений области коры и глубжележащих отделов хрусталика. Аналогично развивалась ситуация и с изменениями сетчатки. В 38 глазах (50%) животных отмечено значительное снижение отёка макулярной области и резорбция ишемических очагов, в 18 (24%) полностью исчезли мелкие петехиальные кровоизлияния и в 3 (4%) случаях имела место полная регрессия изменений сетчатки и офтальмоскопически данных за макулярную дистрофию не было.

Рис. 22. Глазное дно крыс OXYS после лечения SkQ1 (250 нмоль/кг в течение 3 мес. с кормом).

К концу 3-месячного курса лечения у всех крыс OXYS наблюдалась положительная динамика. Прозрачность хрусталиков увеличилась, обозначилась отчётливая биомикроскопическая картина: помутнение уменьшалось в размерах и визуализировалось в виде локальных изменений в заднекапсулярной области. При ядерной локализации интенсивность визуализации изменений настолько снизилась, что видимая биомикроскопически, не поддавалась чёткой фоторегистрации доступными методами. На глазном дне в 22 глазах (28%) офтальмоскопически имела место полная регрессия изменений, а у 28 (73%) животных отмечен переход из второй в первую стадию процесса. На рис. 22 представлены фотографии глазного дна крыс OXYS после курса лечения SkQ1.

Опыт 3 выполнен на 60 крысах-самцах Вистар и OXYS, половина которых с возраста 8 мес. получали SkQ1 по 250 нмоль/кг с кормом ежедневно. У контрольных животных патологические изменения хрусталиков и сетчатки прогрессировали, SkQ1 достоверно снизил выраженность патологических изменений и хрусталиков, и сетчатки (рис. 23).

Рис. 23. Влияние приёма с кормом 250 нмоль/кг SkQ1 на состояние сетчатки и хрусталиков крыс OXYS. По оси ординат - выраженность патологических изменений. * - значимые отличия по сравнению с состоянием при предыдущем осмотре (зависимые парные сравнения).

Рис. 24. Распределение контрольных и опытных крыс OXYS по стадиям развития катаракты.

Опыт 4 выполнен на 60 крысах-самцах OXYS и Вистар в возрасте 12 мес., половина которых получала по 250 нмоль на кг массы тела SkQ1 с кормом в течение 45 дней. На момент начала лечения у крыс OXYS признаки помутнения хрусталиков присутствовали у 100% животных (рис. 24). В 34% глаз изменения соответствовали 2-м, в 66% - одному баллу. После полутора месяцев приёма SkQ1 в 12,5% глаз крыс OXYS хрусталики восстановили прозрачность, в 72% соответствовали помутнения соответствовали одному баллу и только в 15,5% - двум баллам.

Через 3,5 месяцев лечения уже в 59% хрусталиков крыс OXYS не было выявлено патологических изменений, в 41% глаз изменения хрусталиков соответствовали 1 баллу и в 3% (один глаз) - двум баллам (рис. 24б). Таким образом, в результате лечения количество глаз с изменениями, соответствующих 2 баллам, снизилось на порядок. В контрольной группе крыс OXYS количество животных со второй стадией достигло 60%, а у 5% крыс была диагностирована полная катаракта, соответствующая 3 баллам (рис. 24а).

У крыс Вистар изменений сетчатки не было выявлено ни при предварительном осмотре, ни после лечения. Катаракта на момент начала лечения у крыс Вистар присутствовала: по возможности, в группу подбирались животные с изменениями хрусталиков для проверки независимости эффектов препарата от генотипа. В 50% глаз крыс контрольной группы и в 54% опытной при предварительном обследовании были выявлены признаки помутнения хрусталиков. Катаракта у крыс Вистар проявлялась небольшими очаговыми стационарными помутнениями, которые не прогрессировали. Процент глаз с изменениями хрусталиков за период наблюдений вырос в контрольной группе до 83%. После 1,5 мес. приёма SkQ1 количество глаз с катарактой снизилось вдвое, но через 3,5 мес. лечения количество глаз с изменениями достигло 43%. Тем не менее, если заболеваемость контрольных крыс Вистар выросла в 1,7 раза, то на фоне приёма SkQ1 она была ниже, чем до начала лечения.

У крыс OXYS на момент начала эксперимента глаз заболеваемость ХРД составила 100%,дистрофические изменения присутствовали в разной степени у всех животных. За период наблюдения в группе контрольных крыс OXYS процент животных с изменениями глазного дна, соответствующими 2-м баллам, вырос с 18 до 43% (рис. 25). На фоне приёма SkQ1 через 1,5 мес. патологические изменения сетчатки отсутствовали в 25%, через 3,5 месяца - в 81% глаз крыс OXYS. При этом изменений, соответствующих второй стадии заболевания, выявлено не было. Таким образом, заболеваемость со 100% снизилась до 18% (рис. 25).

Таким образом, в 4 независимых экспериментах продемонстрирована способность SkQ1 при его приёме с кормом снижать выраженность уже развитых патологических изменений хрусталиков и сетчатки и/или нормализовать их состояние.

Рис. 25. Распределение контрольных и опытных крыс OXYS по стадиям развития ХРД.

6.2.2. Лечебный эффект капель SkQ1

Исследование лечебного эффекта капель SkQ1 проведено на 4 группах: три эксперимента на взрослых животных в возрасте 8-10 мес. и один на старых в возрасте 20-22 мес. с развитыми стадиями катаракты и ХРД. Опытные крысы получали 250 нМ раствор SkQ1, контрольным закапывали физиологический раствор.

Рис. 26. Влияние капель SkQ1 (250 нМ) на состояние хрусталиков и сетчатки крыс Вистар и OXYS. Начало приёма для крыс Вистар - 10 мес., OXYS - 8 мес. * - отличия достоверны при зависимых парных сравнениях состояния глаз до начала лечения, ^# - по сравнению с предыдущим обследованием.

Опыт 1 выполнен на 18 крысах OXYS в возрасте 8 мес. и 20 Вистар в возрасте 10 мес. Крыс Вистар отбирали по наличию патологических изменений хрусталиков. Эффект инстилляций 250 нМ SkQ1 оценивали через 21, 35 и 60 дней лечения. Препарат повлиял на выраженность патологических изменений хрусталиков крыс OXYS (F_3,114=37,9, p<0,000), интенсивность которых уже через 21 день лечения SkQ1 снизилась в 1,7 раза (p<0,012), через 35 дней лечения была в 3,3 раза менее выраженной, чем у контрольных животных и оставалась на том же уровне через 60 дней (рис. 26). У крыс Вистар значимых изменений состояния хрусталиков выявлено не было.

Рис. 28. Влияние капель SkQ1 (250 нМ) на состояние сетчатки и хрусталиков крыс OXYS. Начало приёма с возраста 9 мес. * - статистически значимые изменения по сравнению с состоянием на момент начала эксперимента (зависимые парные сравнения, p<0,0005).

Выраженность патологических изменений сетчатки при осмотре через 21 день лечения SkQ1 у крыс OXYS снизилась вдвое, через 35 - в 5,2 раза, а через 60 - в 15 раз. Наблюдалось исчезновение или уменьшение отёка, клинически менее выраженными стали проявления отслойки нейроэпителия, рассосались петехиальные кровоизлияния, произошла резорбция ишемических очагов, в 2-3 раза снизилось количество твёрдых экссудатов.

Опыт 2 выполнен на 60 крысах Вистар и OXYS, половина которых в течение 3,5 мес. получала 250 нМ капли SkQ1 с возраста 9 мес. У контрольных крыс OXYS патологические изменения хрусталиков и сетчатки прогрессировали (рис. 27). Лечение каплями SkQ1 в течение 1,5 мес. снизило выраженность патологических изменений хрусталиков и сетчатки вдвое. Лечебный эффект сохранялся на фоне терапии в течение 3,5 месяцев и проявился в уменьшении отёка, количества и площади ишемических очагов, рассасывании кровоизлияний: у 12 животных (23 глаза, 77%) геморрагии рассосались полностью, а у 3 (4 глаза, 13%) - частично.

Опыт 3 выполнен на крысах OXYS в возрасте 12 мес. (n=50), половина которых в течение 2 мес. получала 250 нМ SkQ1 в каплях, вторая половина служила контролем. К возрасту 14 мес. у контрольных крыс OXYS количество глаз со 2-й стадией катаракты выросло в 1,5 раза. Зависимые парные сравнения показали, что у крыс OXYS, получавших SkQ1 в каплях, выраженность патологических изменений хрусталиков достоверно снизилась (p<0,000). В 22% глаз признаков катаракты не обнаружено. Препарат позитивно повлиял и на состояние сетчатки (p<0,0001): количество глаз без патологических изменений выросло втрое, не было зарегистрировано и дистрофических изменений, соответствующих 2-й стадии заболевания. У контрольных крыс OXYS признаки ХРД прогрессировали (рис. 29).

Рис. 29. Влияние капель SkQ1 (250 нМ) на распределение глаз крыс OXYS по выраженности патологических изменений хрусталиков и сетчатки. По оси ординат - процент глаз с изменениями разной степени выраженности. Прием препарата с 12 мес., обследование в 14 мес.

В этом опыте было проведено ультраструктурное исследование хориоретинального комплекса крыс OXYS, патологические изменения сетчатки которых оценивалась в 2 балла, а после лечения 250 нМ каплями SkQ1 не были выявлены (Нероев В.В., 2008). У контрольных крыс OXYS количество полноценных капилляров в хориоидее было в 7 раз меньше, чем у крыс Вистар и присутствовали сосуды с признаками полной деградации. Под влиянием капель SkQ1 количество полноценных хориокапилляров на единицу длины сетчатки глаза возросло с 2,33 до 9 (p<0,001), а сосудов с признаками деградации - снизилось с 6,67 до 2,33(p<0,01), произошло восстановление структуры мембраны Бруха. У крыс OXYS, получавших SkQ1, увеличилось количество клеток пигментного эпителия и восстановилась их функциональную активность, о чем свидетельствовало появление большого числа фагосом, практически полностью отсутствующих в клетках пигментного эпителия контрольных крыс OXYS. Следствием этого явилась интенсификация удаления из клеток палочек отработанных наружных сегментов фоторецепторов и, следовательно, запуск обновления фоторецепторного слоя.

Опыт 4 выполнен на крысах Вистар в возрасте 22 мес. (n=12) и OXYS в возрасте 20 мес. (n=10) с тяжелыми поражениями хрусталиков и сетчатки. В 8% глаз крыс Вистар изменений хрусталиков не было, а в 25% они были представлены нежными периферическими помутнениями в заднекапсулярной области и не могли быть строго отнесены к 1 стадии катаракты. В связи с этим мы ввели промежуточную стадию - 0,5. 50% глаз соответствовали 1 стадии катаракты, 17% - 2-й. Через месяц лечения SkQ1 мы уже не выявили глаз без изменений, стадии «0,5» всё также соответствовало 25% глаз, 1-й стадии - 62,5%, второй - 12,5%. У крыс OXYS до лечения в 11% глаз катаракта соответствовала 1-й стадии, 47% - второй и 42% - 3-й с полной утратой прозрачности хрусталика. Через месяц лечения выявлено прогрессирование катаракты у крыс OXYS: уже в 63% глаз изменения хрусталиков соответствовали 2-й, в 37% - 3-ей стадии заболевания.

Выраженное помутнение хрусталиков у старых крыс OXYS не позволило дать объективную оценку состояния глазного дна и влияния на него препарата. В целом результаты ожидаемы - не приходилось надеяться на позитивные изменения в потерявших прозрачность хрусталиках с развитой ядерной катарактой и разрушенной сетчаткой. В целом же результаты настоящего раздела убеждают в том, что SkQ1 обладает терапевтическим потенциалом - способен нормализовать состояние хрусталиков и глазного дна животных и/или снижать выраженность патологических изменений. Эффект препарата зависит от возраста животных и выраженности патологических изменений. Восприимчивыми к лечению оказались животные с начальными стадиями заболевания: у них наблюдалось стойкое улучшение состояния хрусталиков и сетчатки и/или его нормализация. У старых животных с более выраженными изменениями на глазном дне и развитой ядерной катарактой лечебный эффект практически отсутствовал.

6.3. Связь терапевтических эффектов SkQ1 с его влиянием на содержание в крови продуктов ПОЛ и экспрессию гена VEGF во внутренних оболочках глаз крыс OXYS

Известно, что антиоксиданты в высоких концентрациях могут выступать как прооксиданты. Показано (Antonenko Y.N. et al., 2008; Скулачев В.П., 2007), что SkQ1 отличает широкий «коридор» концентраций, в котором он проявляет свойства эффективного антиоксиданта и в водной, и в липидной фазах, причем в очень низких концентрациях. Во всех наших экспериментах мы использовали наномолярные концентрации и получили терапевтический эффект. При длительном приёме SkQ1 он был минимальным при дозе 10 нмоль/кг. Однако, если профилактический приём препарата в дозах 50 и 250 нмоль/кг в течение года не повлиял на содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови, то у животных, получавших SkQ1 в дозе 10 нмоль/кг, этот показатель оказался выше, чем в контроле: у крыс Вистар в 1,7, у OXYS - в 1,6 раз (p<0,003).

Напомним, что по содержанию продуктов ПОЛ в сыворотке крови крысы Вистар и OXYS разного возраста в настоящее время не различается. Такие результаты указывают на ограниченность прогностической ценности исследования содержания продуктов ПОЛ в крови в диагностических целях и для оценки терапевтических эффектов антиоксидантов. Эффекты SkQ1, как и других антиоксидантов, не ограничиваются влиянием на уровень окислительных повреждений. Влияя на АФК-зависимые пути сигнальной трансдукции, они изменяют «настройку» редокс-зависимых генных сетей: воспалительного ответа, антиоксидантного ответа, теплового шока, апоптоза, метаболизма железа, остановки клеточного цикла (Drцge W., 2002). Изменения экспрессии ключевых для развития ВМД и катаракты генов под влиянием SkQ1 были выявлены в нашей работе.

Для оценки связи терапевтических эффектов SkQ1 с его влиянием на экспрессию гена VEGF у крыс OXYS проведено два эксперимента. В них оценивали: 1) эффект профилактического приёма SkQ1 в критический для развития дистрофии сетчатки период с 1,5 до 3 мес. в дозе 250 нмоль/кг с кормом; 2) лечебный эффект 3-месячного курса капель SkQ1 (250 нМ), приём с возраста 9 мес. Влияние препарата на экспрессию гена VEGF сопоставляли с клиническим эффектом препарата.

Рис. 30. Влияние профилактического приёма SkQ1 на уровень экспрессии гена VEGF в тканях внутренних оболочек глаза крыс OXYS и Вистар. Начало приёма Приём препарата с 1,5 мес. по 250 нмоль/кг в течение 45 дней с кормом. # - достоверные отличия с Вистар (p<0,016), * - достоверное отличие с контролем (р<0,044).

Профилактический приём SkQ1 полностью предупредил развитие катаракты и дистрофии у крыс OXYS. Он не повлиял на экспрессию гена VEGF у крыс Вистар, в то время как у 3-месячных крыс OXYS на фоне приёма антиоксиданта этот показатель был таким же, как у контрольных крыс Вистар (рис. 30). Можно полагать, такой эффект был связан со способностью препарата предупреждать развитие характерных для крыс OXYS дистрофических изменений пигментного эпителия и склеротические изменения хориоидеи. Сопоставление уровня экспрессии гена VEGF с выраженностью патологических изменений сетчатки выявило тесную отрицательную связь между этими параметрами: r = -0,61, p<0,03. Таким образом, на ранних стадиях развития заболевания выраженность патологических изменений у крыс OXYS зависит от уровня экспрессии гена VEGF.

Рис. 31. Уровень экспрессии гена VEGF в тканях внутренних оболочек глаза контрольных и получавших с возраста 9 до 12 мес. 250 нМ капли SkQ1 крыс OXYS и Вистар. * - отличие достоверно по сравнению с контролем (р<0,019).

Экспрессию гена VEGF при лечении каплями SkQ1 (250 нМ) исследовали на крысах OXYS и Вистар в возрасте 9 мес. Препарат оказывал лечебный эффект (см. раздел 4.2, рис. 28). У крыс Вистар под влиянием капель SkQ1 наблюдалась тенденция к повышению экспрессии гена VEGF (р<0,075). У крыс OXYS она, напротив, достоверно снизилась (рис. 31). Принципиально важно, что уровень экспрессии гена VEGF, как и при профилактическом приеме препарата 3-месячными крысами OXYS, зависел от выраженности патологических изменений, но связь оказалась положительной (r=0,69, p<0,03).

В этом же опыте мы оценили влияние SkQ1 на экспрессию б-кристаллинов - основных структурных белков хрусталика (более 90% водорастворимых белков). б-кристаллины обеспечивают прозрачность хрусталиков как его структурные компоненты, выполняют роль шаперонов, предотвращают апоптоз. Снижение их экспрессии нарушает плотность и укладку волокон, светорассеивание хрусталика и приводит к агрегации кристаллинов других групп, неокисленное состояние которых обеспечивается шаперонной активностью б-кристаллинов. Снижение экспрессии генов типично для сенильной катаракты и связано с повреждениями эпителиального слоя хрусталика. Предполагается, что снижение крыс OXYS экспрессии генов б-кристаллинов (Румянцева Ю.В., Фурсова А.Ж. и др., 2008) и развитие катаракты у крыс OXYS также сопряжено с дистрофическими изменениями эпителия хрусталика, несостоятельностью его дренажной и пластической функций, причины которой пока не известны (Колосова Н.Г. и др., 2003). В пользу связи патогенеза катаракты с окислительным стрессом свидетельствует то, что приём SkQ1 в каплях не только улучшил состояние хрусталиков крыс OXYS, но и повысил в них экспрессию генов б-кристаллинов. Экспрессия гена бА-кристаллина была в 2,7 раза выше, чем у контрольных крыс OXYS и достигла уровня крыс Вистар. Экспрессия бВ-кристаллина увеличилась 3,4 раза по сравнению с контролем, но оставалась в 5 раз меньше, чем у крыс Вистар. При этом корреляционный анализ показал, что выраженность патологических изменений хрусталиков у крыс OXYS завиcит от уровня экспрессии генов бА-(r = -0,53, p<0,012) и бВ кристаллинов (r = - 0,60, p<0,003) (рис.32).

Рис. 32. Влияние 250 нМ капель SkQ1 (приём с 9 мес. в течение 3,5 мес.) на экспрессию генов бА- (а) и бВ-кристаллинов (б) в хрусталиках крыс Вистар и OXYS. # - статистически значимые межлинейные различия, * - статистически значимый эффект препарата

Таким образом, установлено, что митохондриальный антиоксидант SkQ1 эффективен как в профилактике, так и в лечении ХРД и катаракты у крыс OXYS. При профилактическом приеме он предотвращает их развитие, а при лечении - снижает выраженность патологических изменений и/или приводит к их полному исчезновению. Его лечебный эффект в отношении катаракты связан с повышением уровня экспрессии основных белков хрусталиков б-кристаллинов, в основе которого могут лежать восстановление эпителия хрусталиков и активизация энергетических процессов в нём. В отношении ХРД эффект SkQ1 связан с влиянием на уровень экспрессии гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс OXYS, который антиоксидант нормализовал. Важно, что препарат не влиял на этот показатель у крыс Вистар. Направленность изменений (повышение или понижение экспрессии VEGF) у крыс OXYS зависела от возраста животных и стадии заболевания. Во всех случаях терапевтический эффект SkQ1 был связан с нормализацией состояния сосудов хориоидеи и сетчатки, с предупреждением дистрофических изменений пигментного эпителия и восстановлением его функций.

Таким образом, результаты наших исследований указывают на то, что ключевую роль в развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS могут играть: а) нарушения структурно-функционального состояния мембраны Бруха и клеток пигментного эпителия, уменьшение количества полноценных митохондрий в них; б) инволюция эндотелия капилляров хориоидеи, их метаболическая несостоятельностью на фоне снижения уровня экспрессии гена фактора роста сосудистого эндотелия VEGF в клетках пигментного эпителия в критический для развития ХРД период; в) развитие атрофических процессов в эндотелии хориокапилляров, облитерация их просвета со значительной регрессией хориоидального кровообращения, следствием которых становится дальнейшее поражение клеток пигментного эпителия и поражение фоторецепторной системы с полной атрофией наружных слоёв.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу связи преждевременного старения крыс OXYS с дисфункцией митохондрий. Способность SkQ1 влиять на развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS свидетельствует о том, что их развитие зависит от скорости образования АФК внутри митохондрий. Направленно изменяя её, проникающий в митохондрии антиоксидант SkQ1 способен влиять на реализацию программы старения и не только предупреждать развитие катаракты и ХРД, но обеспечивать структурно-функциональные предпосылки к восстановлению зрительной функции: нормализацию микроциркуляции в хориоидее и фагоцитарной функции клеток пигментного эпителия, нормализацию организации мембраны Бруха, а, следовательно, гематоофтальмического барьера. Все эти изменения происходили на фоне существенного увеличения содержания в клетках митохондрий, формирования мощного хондриома, отличающегося большой протяженностью и развитой системой крист (Сапрунова В.Б., 2008, Нероев В.В. и др., 2008).

Невозможность изучать молекулярные механизмы развития ВМД на ранних бессимптомных стадиях, этические и правовые нормы, не позволяющие оценивать их в динамике развития заболевания, ограничивают возможности исследования этиологии и патогенеза ВМД и катаракты у людей. Как показали наши исследования, уникальные возможности для изучения этиологии, патогенеза ВМД, его молекулярно-генетических механизмов открывает использование линии крыс OXYS - полноценной модели сенильной ВМД и катаракты. Опыт оценки терапевтического потенциала митохондриального антиоксиданта SkQ1 убеждает в высокой эффективности использования модели для объективной оценки эффективности новых терапевтических воздействий.

ВЫВОДЫ

1. У крыс OXYS параллельно развиваются катаракта и хориоретинальная дистрофия, которые по клиническим проявлениям биомикроскопической и офтальмоскопической картины соответствуют изменениям хрусталика и сетчатки у пациентов с сенильной катарактой и возрастной макулярной дистрофией.

2. Установлены критические периоды развития катаракты и возрастной макулярной дистрофии у крыс OXYS: первые признаки этих заболеваний зарегистрированы в 5-6 недель, активно прогрессирует с возраста 12 месяцев и достигают выраженных стадий, предполагающих потерю или существенное ухудшение остроты зрения к 14-18 месяцам.

3. У крыс OXYS развитие хориоретинальной дистрофии связано с нарушениями кровообращения и транскапиллярного обмена в хориокапиллярах и вызванной этим хронической ишемией, ведущей к структурно-функциональным изменениям пигментного эпителия, дистрофическим изменениям мембраны Бруха и, как следствие, гибели клеток фоторецепторного слоя.

4. Развитие дистрофии сетчатки у крыс OXYS связано с изменениями экспрессии гена VEGF в клетках пигментного эпителия:

а) первичные признаки заболевания формируются на фоне его двукратного снижения по сравнению с контролем, когда между тяжестью заболевания и уровнем экспрессией гена VEGF формируется отрицательная связь;

б) в период формирования выраженных патологических изменений средние величины уровня экспрессии гена VEGF не отличается от контрольных, но между ним и выраженностью патологических изменений связь становится положительной.

5. Развитие катаракты и хориоретинальной дистрофии у крыс OXYS с различной эффективностью предупреждают препараты с антиоксидантной активностью, что свидетельствует в пользу адекватности модели, а также о связи патогенеза катаракты и ХРД.

5. Митохондриально направленный антиоксидант SkQ1 при его приеме с кормом и в виде капель в коньюнктивальную полость предупреждает развитие катаракты и дистрофии сетчатки и снижает тяжесть течения этих заболеваний у крыс OXYS. Лечебный эффект SkQ1 наиболее существенно выражен при начальных, не имеющих грубых органических изменений стадиях заболевания.

6. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при ХРД у крыс OXYS связан с нормализацией уровня экспрессии гена VEGF, восстановлением микроциркуляции на фоне снижения признаков склероза и облитерации сосудов, которые обеспечивают трофику и в результате - сохранность фоторецепторов сетчатки.

7. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при лечении катаракты связан с увеличением уровня экспрессии генов б-кристаллинов.

8. Линия преждевременно стареющих крыс OXYS - адекватная модель для исследования этиологии и патогенеза катаракты и ВМД, для оценки эффективности новых способов профилактики и лечения этих заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фурсова А.Ж. Опыт лечения макулярной дегенерации сетчатки в отделении микрохирургии глаза ГНОКБ (1992-1997) / А.Ж Фурсова // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в здравоохранении: Тезисы научно-практической конференции. - Новосибирск.-1998. - С. 28-29.

2. Колосова Н.Г. Преждевременно стареющие крысы OXYS как модель сенильной катаракты человека / Н.Г. Колосова, П.А.Лебедев, А.Ж.Фурсова, Т.С.Морозкова, О.Г. Гусаревич // Успехи геронтологии. - 2003. -Т. 12. - С. 143-148.

3. Гусаревич О.Г. Изучение влияния Офтан Катахрома на развитие макулярной дегенерации сетчатки (экспериментальное исследование) / О. Г. Гусаревич, А.Ж.Фурсова, Н.Г.Колосова// Клиническая офтальмология. - 2003. - Т. 4. - С. 186-190.

4. Фурсова А.Ж. Крысы OXYS - универсальная модель старения органа зрения / А.Ж. Фурсова, П.А. Лебедев, О.Г. Гусаревич, Колосова Н.Г. // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты: Тезисы Всероссийской научно-практической конференции.- Новосибирск, 2004. - С. 311-312.

5. Фурсова, А.Ж. Возможности использования диодного лазера в лечении сосудистой патологии сетчатки / А.Ж Фурсова, Н.В. Чубарь, О.Г. Гусаревич //Сибирский консилиум.- 2004. -.№ 6 (36).-С.52-55.

6. Lebedev Р.A. Interaction between oxidative stress and cataractogenesis in senescence-accelerated OXYS rats / Р.A. Lebedev, A.Zh.Fursova, N.G. Kolosova. // International conference Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health. - Smolensk, 2003. - P. 149.

7. Фурсова А.Ж. Экспериментальная макулодистрофия и катарактогенез у преждевременно стареющих крыс OXYS на фоне окислительного стресса / А.Ж.Фурсова, О.Г Гусаревич, Н.Г. Колосова // Тезисы межрегиональной конференции офтальмологов. - Красноярск, 2003. - С. 58-59.

8. Колосова Н.Г. Макулодистрофия и катарактогенез у преждевременно стареющих крыс OXYS, их связь с окислительным стрессом /Н.Г. Колосова, А.Ж. Фурсова, П.А Лебедев, О.Г. Гусаревич // Офтальмологический журнал. - 2004. - № 3. - С. 237-242.

9. Фурсова А.Ж. Экстракт черники в профилактике макулярной дегенерации и катаракты у крыс OXYS / А.Ж. Фурсова, О.Г. Гусаревич, А.М Гончар, Н.А.Трофимова, Н.Г.Колосова // Успехи геронтологии. - 2005. - Вып. 16.--С. 76-79.

10. Фурсова А.Ж. Сравнительная эффективность реваскуляризирующих операций в лечении дегенеративных изменений сетчатки / А.Ж. Фурсова, О.Г. Гусаревич //Тезисы V Всероссийского съезда офтальмологов.-Москва, 2005.- С 346-347.

11. Фурсова А.Ж. Опыт диодной лазеркоагуляции сетчатки в лечении патологии макулярной области / А.Ж Фурсова, О.Г Гусаревич // Тезисы V Всероссийского съезда офтальмологов. - Москва, 2005.- С. 404-406.

12. Гусаревич О.Г. Центральная инволюционная хориоретинальная дистрофия / О.Г Гусаревич., А.Ж Фурсова. // Пептидные биорегуляторы в офтальмологии: Тезисы докладов научно-практической конференции.- Москва, 2005. - С.36-39.

13. Гусаревич О.Г. Ретиналамин в лечении центральной инволюционной хориоретинальной дистрофии / О.Г. Гусаревич, А.Ж.Фурсова //Тера-медика. - 2005. - № 3.- С 46-53.

14. Колосова Н.Г. Разнонаправленное влияние антиоксидантов на тревожность крыс Вистар и OXYS / Н.Г.Колосова, Н.А.Трофимова, А.Ж.Фурсова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 141, № 6. - С. 59-62.

15. Фурсова А.Ж. Анализ изменения основных гемодинамических показателей орбиты при различных методах лечения ишемических заболеваний сетчатки и зрительного нерва / А.Ж.Фурсова, О.Г.Фенькова, О.Г. Гусаревич //Современные методы диагностики в офтальмологии. Анатомо-физиологические основы патологии органа зрения. Сборник статей под ред. Х.П. Тахчиди.- Москва.- 2006.- С.134-135.

16. Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 as therapeutic approach for cataract and retinal dystrophy / N.G.. Kolosova, A.J.Fursova, N.A. Trofimova, V.P. Skulachev // «Basic science for medicine»: 3 Intern. Conference. - Novosibirsk, 2007. - P. 33.

17. Опыт использования препарата черники для лечения центральной хориоретинальной дегенерации / А.Ж.Фурсова, О.Г. Гусаревич, А.М.Гончар, Н.Г.Колосова // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - №1 (123). - С. 92-96.

18. Румянцева Ю.В. Возрастные изменения физико-химических характеристик хрусталиков и катарактогенез у крыс OXYS / Ю.В.Румянцева, А.Ж.Фурсова, Н.Г. Колосова // Сибирский консилиум. - 2007. - № 7 (62). - С. 230-231.

19. Фурсова А.Ж. Дистрофия сетчатки и катарактогенез у преждевременно стареющих крыс OXYS, их связь с окислительным стрессом / А.Ж.Фурсова, Ю.В. Румянцева, Н.Г. Колосова // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: Материалы XV международной конф. - Гурзуф, 2007. - С. 429-430.

20. Румянцева Ю.В. Снижение экспрессии генов а-кристаллинов в хрусталиках предшествует манифестации окислительного стресса при развитии катаракты у крыс OXYS / Ю.В. Румянцева, А.Ж Фурсова., Н.Г. Колосова // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека: Материалы 5-й национальной конференции. - Смоленск, 2007. - С. 397-399.

21. Профилактика и лечение катаракты и дистрофии сетчатки у крыс OXYS митохондриально направленным антиоксидантом SkQ1 Н.Г.Колосова, А.Ж.Фурсова, Н.А Трофимова, В.П. Скулачёв // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека: Материалы 5-й национальной конференции. - Смоленск, 2007. - С. 395-397

22. Deaminated UV filter 3-hydroxykynurenine O-beta-D-glucoside is found in cataractous human lenses / O.A. Snytnikova, A.Zh Fursova , EI Chernyak , Vasiliev V.G., Morozov S.V., Kolosova N.G., Y.P Tsentalovich // Experimental Eye Research. -2008. - № 86(6).- Р.951-956.

23. Изменения физико-химических характеристик и экспрессии генов б-криссталинов в хрусталиках крыс OXYS при развитии катаракты / Ю.В. Румянцева., А.Ж. Фурсова, Л.А. Федосеева, Н.Г. Колосова // Биохимия.-2008.- Т. 73, вып. 11.- С. 1467 - 1475.

24. Клинико-морфологические особенности хориоретинальной дегенерации у преждевременно стареющих крыс линии OXYS / А.А. Жданкина, А.Ж.Фурсова, С.В. Логвинов, Н.Г.Колосова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145, № 10. - С. 435-438.

25. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. Связанные с возрастом заболевания глаз. 1. SkQ возвращает зрение слепым животным / В.В. Нероев, М.М. Архипова, Л.Е. Бакеев, А.Ж. Фурсова, Э.Н. Григорян, А.Ю. Гришанова, Е.Н. Иомдина, Ж.Н. Иващенко, Л.А. Катаргина, Хорошилова, И.П. Маслова, О.В. Килина, Н.Г. Колосова, Е.П. Копенкин, С.С. Коршунов, Н.А. Ковалева, Ю.П. Новикова, П.П. Филиппов, Д.И. Пилипенко, О.В Робустова., В.Б. Сапрунова, И.И. Сенин, М.В. Скулачев, Л.Ф. Сотникова, Н.А. Стефанова, Н.К. Тихомирова, И.В. Цапенко, А.И. Щипанова, Р.А. Зиновкин, В.П. Скулачев // Биохимия. - 2008. - Т. 73, № 12. - С. 1641-1654.

26. Kolosova N.G. Dietary supplementation with bilberry extract prevents macular degeneration and cataracts in senescent accelerated OXYS rats / N.G. Kolosova, A.Z. Fursova, N.A. Stefanova. // Planta Medica. - 2008. -№74.- P. 288.

27. Марковец А.М. Экспрессия гена VEGF-A в сетчатке крыс OXYS при развитии дистрофии сетчатки в лечении митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ 1 / А.М.Марковец, А.Ж.Фурсова, Н.Г.Колосова // Фундаментальные науки - медицине: Тезисы научно-практической конференции. - Новосибирск, 2008. - С. 40.

28. Румянцева Ю.В. Экспрессия генов кристаллинов в хрусталиках крыс OXYS при развитии катаракты на фоне лечения митохондриально направленным антиоксидантом SkQ1 / Ю.В.Румянцева, Н.Г.Колосова, А.Ж Фурсова. //Тезисы. IVсъезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С. 232.

29. Митохондриально направленный антиоксидант SkQ1 в профилактике преждевременного старения крыс OXYS / Н.Г. Колосова, Т.Г. Амстиславская, Н.А. Стефанова, А.Ж. Фурсова // Тезисы. IVсъезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С.333.

30. Mitochondria-targeted antioxidant SkQ1: therapeutic approach for cataract and its connection with elevation of crystalline genes expression/ Yu.V Rumyantseva., A.J.Fursova, N.G Kolosova. // Ageing and individual life history : 6th European Congress of Biogerontology. - Netherlands, Noordwijkerhout, 2008. - P.30

Размещено на Allbest.ru