Клинико-экспериментальное обоснование применения интерлейкина-1L для профилактики и терапии поражений при радиационных авариях

Таблица 5 Динамика общего числа лейкоцитов в периферической крови белых беспородных мышей, подвергнутых острому ?-облучению в дозе 6 Гр при профилактическом (за 24 ч) применении интерлейкина-1в в дозе 50 мкг/кг, х 10⁹/л (n = 10 в каждой группе)

Таким образом, под влиянием ИЛ-1в выраженность пострадиационной лейкопении была меньше, чем у облученного контроля, а также наблюдалось более быстрое восстановление числа лейкоцитов в периферической крови.

Оценка влияния ИЛ-1? на количественный состав лейкоцитов периферической крови крыс проводилась при пролонгированном ?-облучении лучами Co-60 в дозе 10 Гр (мощность дозы облучения составила 1 Р/мин). Обследование экспериментальных животных опытных и контрольных групп с оценкой гематологических показателей проводили до облучения (дважды), а также через 3 сут и далее каждые 5-е сутки в течение 30 сут после облучения.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, внешнее облучение в дозе 10 Гр с мощностью дозы 1 Р/мин приводило к резкому снижению общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс в ранние сроки после радиационного воздействия.

Таблица 6 Динамика общего числа лейкоцитов в периферической крови белых беспородных крыс, подвергшихся пролонгированному ?-облучении в дозе 10 Гр, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1в в дозе 1 мкг/кг, х 10⁹/л (n = 10 в каждой группе)

Профилактическое введение ИЛ-1? за 24 ч до радиационного воздействия уменьшало глубину постлучевого снижения общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс в ранние сроки после облучения. Так, через 3 сут после облучения общее число лейкоцитов у животных, получивших ИЛ-1?, составляло 40 % от исходного уровня, что почти в 2,5 раза больше, чем у незащищенных крыс. Через 5 сут уровень лейкоцитов у этих животных был лишь 16 % от исходных значений, но все равно почти в 1,5 раза превышал значения аналогичного показателя в контрольной группе. Восстановление числа лейкоцитов до нормы у животных, защищенных предварительным введением ИЛ-1?, происходило к 17 сут эксперимента, а развития лейкоцитоза у этих крыс в течение срока наблюдения не отмечалось.

Позитивное влияние на содержание лейкоцитов в периферической крови облученных крыс препарат оказывал и при его использовании через 1 ч после окончания радиационного воздействия. Так, лечебное применение ИЛ-1? предотвращало снижение уровня лейкоцитов в ранние сроки после радиационного воздействия: через 5 сут после облучения значения этого показателя у леченых крыс были на 86 % выше, чем у нелеченых животных. Восстановление числа лейкоцитов происходило, начиная с 17 сут наблюдения, при этом так же, как и в случае профилактического применения препарата, отсутствовала фаза лейкоцитоза, развивавшегося у животных контрольной группы (только облучение) на 17-22 сут опыта.

Динамика содержания нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови облученных животных, получавших с профилактической или лечебной целью ИЛ-1?, практически полностью повторяла изменения, регистрировавшиеся при изучении общего числа лейкоцитов.

Следует также отметить, что более эффективно препарат влиял на количество нейтрофилов. Так, введение ИЛ-1? не допускало их резкого постлучевого снижения в ранние сроки после облучения: через 3 сут уровень нейтрофилов превышал показатели контрольной группы более чем в 3 раза в случае профилактического применения препарата и в 2 раза при его лечебном использовании. Восстановление количества нейтрофилов при применении ИЛ-1? в качестве средства ранней терапии лучевых поражений начиналось уже с 5 сут наблюдения, а к 12 сут препарат, введенный за 24 ч до облучения, не вызывал нейтрофилёза, в отличие от данных без введения ИЛ -1?.

Изучение влияния на количество клеток крови профилактического и лечебного применения ИЛ-1? в условиях сочетанного внешнего и внутреннего облучения в дозе 10 Зв проводили на 30 белых беспородных крысах-самцах.

Установлено, что максимальное падение уровня лейкоцитов (до 22 % от значений необлученных животных) регистрировалось на 5 сут после радиационного воздействия. Через 7 сут после облучения наблюдался незначительный абортивный подъем, а через 12 сут количество лейкоцитов вновь снижалось. Восстановление числа лейкоцитов начиналось с 17 сут, а нормальных (на уровне биологического контроля) значений этот показатель достигал через 22-30 сут после облучения (табл. 7).

Таблица 7 Динамика общего числа лейкоцитов периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых сочетанному внешнему и внутреннему облучению в дозе 10 Зв, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1в в дозе 1 мкг/кг, х 10⁹/л (n = 10 в каждой группе)

Рекомбинантный ИЛ-1?, введенный за 24 ч до или через 1 ч после сочетанного радиационного воздействия, снижал выраженность лейкопении на 5 сут наблюдения. Применение препарата как с профилактической, так и с лечебной целью способствовало также ускорению восстановления уровня лейкоцитов в периферической крови облученных животных. Значимые отличия этого показателя, по сравнению с контролем, регистрировались уже на 12 и 17 сут эксперимента, а, начиная с 22 сут, уровень лейкоцитов в крови получавших препарат крыс незначительно превышал значения, зарегистрированные у этих же крыс до радиационного воздействия.

Рис. 4 Динамика абсолютного количества нейтрофилов в периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых сочетанному внешнему и внутреннему облучению в дозе 10 Зв, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1в в дозе 1 мкг/кг, х 10⁹/л (n = 10 в каждой группе)

* - различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Аналогичные закономерности были обнаружены и при оценке влияния профилактического или раннего лечебного применения ИЛ-1в на динамику абсолютного количества нейтрофилов (рис. 4) и лимфоцитов у подвергшихся сочетанному облучению животных.

В ходе следующего этапа препарат рекомбинантного ИЛ-1? использовался для коррекции и восстановления гематологических показателей, развивающихся при фракционированном облучении.

Рис. 5. Количество лейкоцитов у крыс при фракционированном радиационном воздействии при применении интерлейкина-1в при рентгеновском фракционированном облучении в дозе 25 Гр (n = 10 в каждой группе), x 10⁹/л

* - различия достоверны (p <0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Как видно из данных, представленных на рисунке 5, пятикратное внутрибрюшинное введение ИЛ-1? по 1 мкг/кг в сутки в ходе продолжающегося фракционированного облучения предотвращает дальнейшее снижение количественных показателей белой крови, а также ускоряет их восстановление после окончания радиационного воздействия.

После завершения фракционированного облучения в суммарной дозе 25,0 Гр при курсовом применении ИЛ-1? (внутрибрюшинно по 1 мкг/кг в течение 5 сут) восстановление общего числа лейкоцитов, абсолютного количества нейтрофилов и лимфоцитов происходят в более ранние сроки, чем у нелеченных животных. Так, по сравнению с показателями нелеченых крыс у животных, получавших препарат, уже через 1 сут после начала терапии общее число лейкоцитов было более чем в 2 раза выше, абсолютное количество нейтрофилов - более чем в 3 раза выше, а число лимфоцитов - в 1,5 раза выше (p<0,05). Через 5 и 10 сут после первой инъекции препарата сохранялась тенденция к более высокому уровню общего количества лейкоцитов и абсолютного содержания лимфоцитов, а число нейтрофилов достоверно (p<0,05) превышало значения аналогичного показателя нелеченных животных. Результаты этого раздела работы представлены на рисунке 6.

Рис. 6. Количество лейкоцитов у крыс при применении интерлейкина-1в после окончания фракционированного рентгеновского облучения в суммарной дозе 25 Гр (n = 10 в каждой группе), x 10⁹/л

* - различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Результаты исследований, проведенных на этом этапе, показали, что в условиях внешнего острого и пролонгированного, а также и сочетанного внешнего и внутреннего облучения рекомбинантный ИЛ-1?, введенный за 24 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия, способствует предотвращению ранней постлучевой лейкопении (развивающейся за счет снижения числа и нейтрофилов, и лимфоцитов) и ускоряет восстановление количества клеток белой крови в поздние сроки после облучения. А использованные схемы применения препарата при фракционированном облучении, в высоких суммарных дозах, способствуют более быстрому и полному восстановлению гематологических показателей у крыс.

Влияние интерлейкина-1? на показатели функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови облученных крыс

Наряду с предотвращением пострадиационных изменений количества клеток белой крови ИЛ-1?, введенный за 24 ч до или через 1 ч после внешнего пролонгированного ?-облучения в дозе 10 Гр, оказывал позитивное влияние и на качественное состояние нейтрофилов, оцененное по содержанию в этих клетках лизосомальных катионных белков, активности миелопероксидазы (МПО) и щелочной фосфатазы (ЩФ).

Внешнее пролонгированное облучение в дозе 10 Гр вызывало уменьшение содержания катионных белков в нейтрофилах периферической крови крыс, особенно выраженное в промежуток с 3 по 17 сут после лучевого воздействия (табл. 8). Наибольшее падение количества этих биоцидных протеинов зарегистрировано через 5 сут после облучения.

Таблица 8. Динамика содержания катионных белков в нейтрофилах периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых внешнему пролонгированному ?-облучению в дозе 10 Гр, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1в в дозе 1 мкг/кг, усл. ед. (n = 10 в каждой группе)

В этих условиях как профилактическое, так и лечебное применение ИЛ-1? в дозе 1 мкг/кг способствовало предотвращению радиационно обусловленного снижения показателей лизосомально-катионного теста. Так, уже на ранних сроках (3-5 сут) содержание катионных белков при обеих схемах использования ИЛ-1? превышало показатели контрольной группы в среднем на 20 %. Следует также отметить, что внутрибрюшинное введение ИЛ-1? как до, так и после облучения способствовало тому, что количество катионных белков в нейтрофилах облученных крыс практически не снижалось, оставаясь на уровне 1,26-1,37 усл. ед. практически во все сроки исследования.

Активность МПО в нейтрофилах периферической крови крыс в ранние сроки после внешнего облучения в дозе 10 Гр с мощностью дозы 1 Р/мин была пониженной. Максимальное угнетение активности фермента регистрировалось через 5 сут после окончания радиационного воздействия, а восстановление данного показателя до уровня необлученных животных происходило лишь на 22-30 сут наблюдения. Профилактическое применение ИЛ-1? не отменяло раннего постлучевого ингибирования МПО, но способствовало более быстрой (уже к 7 сут опыта) нормализации активности фермента. Раннее лечебное использование препарата практически полностью предотвращало вызванное радиацией ингибирование МПО в нейтрофилах, а, начиная с 7 сут эксперимента, активность данного фермента у леченых животных достоверно превышала показатели соответствующего нелеченного контроля.

Действие внешнего пролонгированного ?-облучения приводило к увеличению в клетках активности ЩФ, особенно выраженному на 5-7 сут эксперимента. Как профилактическое, так и лечебное использование ИЛ-1? способствовало еще большей активации этого фермента в ранние сроки после окончания радиационного воздействия. Так, применение ИЛ-1? в качестве средства профилактики лучевого поражения через 3 сут после облучения приводило к увеличению активности ЩФ на 14 % по сравнению с соответствующим контролем (p>0,05) и на 18 % по сравнению с исходными данными. При применении ИЛ-1? в качестве средства раннего лечения активность ЩФ в этот же период возрастала на 11 % относительно контроля (p>0,05) и на 14 % относительно исходного уровня. В то же время, значимые отличия содержания данного фермента в нейтрофилах по сравнению с контролем регистрировались лишь через 7 и 12 сут после облучения, когда активность ЩФ у нелеченых животных уже восстанавливалась до нормы, а у крыс, получавших ИЛ-1?, все еще наблюдалась ее гиперактивация.

Оценка влияния ИЛ-1? на состояние лейкоцитов периферической крови при сочетанном внешнем и внутреннем облучении показала, что через 3 и 5 сут после сочетанного радиационного воздействия в нейтрофилах облученных крыс обнаруживалось существенное (более чем на 20 % от исходного уровня) снижение количества катионных белков, а профилактическое или лечебное использование рекомбинантного ИЛ-1в отменяло этот эффект облучения.

Таблица 9. Динамика активности миелопероксидазы в нейтрофилах периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых сочетанному внешнему и внутреннему облучению в дозе 10 Зв, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1в в дозе 1 мкг/кг, усл. ед. (n = 10 в каждой группе)

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 9, при обеих схемах применения исследуемый препарат не только предотвращал раннее постлучевое ингибирование МПО, но и значительно ускорял восстановление уровня этого фермента в нейтрофилах облученных крыс.

Уже через 12 сут после радиационного воздействия в нейтрофилах животных, получавших ИЛ-1в, происходило полное восстановление активности МПО, в то время как у животных группы сравнения (облучение без фармакологической защиты) активность этого фермента оставалась сниженной весь период наблюдения (в течение 30 сут после облучения).

Результаты изучения активности ЩФ в нейтрофилах подвергшихся сочетанному облучению животных, свидетельствуют о выраженном стимулирующем влиянии ИЛ-1в как на зрелые формы нейтрофилов, так и на их костномозговых предшественников. Закладка ЩФ в специфические гранулы клеток происходит на стадии миелоцита, а время прохождения клеток от стадии миелоцита до нейтрофила циркулирующего пула составляет 3-5 сут, то есть как раз тот срок, когда и регистрируется наибольшее увеличение содержания данного фермента у крыс, получавших до или сразу после сочетанного облучения ИЛ-1в.

Оценка влияния ИЛ-1? на показатели функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови в условиях фракционированного облучения проводили на 30 белых беспородных крысах. ИЛ-1?, растворенный в 0,2 мл физиологического раствора, вводили пятикратно внутрибрюшинно в дозе 1мкг/кг по одной инъекции в день в течение 5 сут. Животным первой опытной группы курсовую терапию ИЛ-1? начинали после набора ими дозы 20 Гр и продолжали в ходе фракционированного облучения. Крысы второй опытной группы курс интерлейкинотерапии получили после окончания фракционированного облучения и набора суммарной дозы 25 Гр. Животные контрольной группы подвергались облучению, но вместо ИЛ-1? им вводился физиологический раствор.

В результате проведенных на этом этапе исследований установлено, что применение ИЛ-1?, в ходе продолжающегося фракционированного радиационного воздействия и после его окончания оказывало позитивное влияние на активность ЩФ в нейтрофилах облучаемых крыс.

Фракционированное облучение приводило к снижению активности ЩФ, которое регистрировалось во все сроки наблюдения. В то же время, уже через 1 сут после начала курсового применения ИЛ-1? активность ЩФ в нейтрофилах облучаемых крыс восстанавливалась практически до значений ложнооблученного контроля и удерживалась на этом уровне в течение 10 сут.

В частности, уже начиная с 1 сут наблюдения, активность данного фермента в нейтрофилах крыс, получавших после окончания фракционированного облучения ИЛ-1?, восстанавливалась до значений ложнооблученного контроля и удерживалась на этом уровне не менее 10 сут. При этом через 10 сут после начала интерлейкинотерапии активность ЩФ в нейтрофилах леченых животных даже несколько превышала показатели контрольной группы (рис. 7).

Рис. 7. Динамика активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови крыс при курсовом применении интерлейкина-1? в ходе фракционированного облучения, усл. ед. (n = 10 в каждой группе)

* - различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Установлено также, что при обеих схемах применения ИЛ-1? способствовал более быстрому восстановлению активности ЩФ в нейтрофилах крыс, подвергавшихся фракционированному радиационному воздействию в большой дозе. Активность ЩФ у нелеченых облученных животных статистически значимо не отличалась от значений ложнооблученного контроля, начиная с 10 сут после окончания фракционированного облучения в суммарной дозе 25 Гр. В тоже время, при курсовом применении ИЛ-1? полное восстановление активности ЩФ происходило уже через 1 сут после завершения радиационного воздействия. Следует также отметить, что на 15 и 20 сут восстановительного периода активность ЩФ в нейтрофилах получавших ИЛ-1? крыс статистически значимо (p<0,05) превышала не только значения нелеченых животных, но и данные ложнооблученного контроля. В то же время, существенных различий в динамике этого показателя при различных схемах курсового применения ИЛ-1? (в ходе облучения или после его завершения) не наблюдалось.

Клинико-лабораторная оценка переносимости интерлейкина-1? людьми

Клинико-лабораторную оценку состояния здоровья людей, принимавших участие в исследовании, проводили непосредственно перед началом введения ИЛ-1?, в ходе его введения и в течение суток после окончания введения препарата. Препарат ИЛ-1?, предварительно разведенный физиологическим раствором, вводился внутривенно капельно в дозе 5 нг/кг в течение 3 часов.

В результате проведенных исследований установлено, что ИЛ-1? не вызывал существенных изменений состояния здоровья испытуемых людей, определяемых физикальными методами исследования. В то же время, через 2-2,5 ч после начала введения ИЛ-1? трое испытуемых предъявляли жалобы на озноб и головную боль, температура у них поднималась до субфебрильных значений, на 10-15% повышалось систолическое артериальное давление, частота сердечных сокращений увеличивалась до 78-80 ударов в минуту. В течение ближайших 10-15 мин после окончания введения ИЛ-1? самочувствие испытуемых людей улучшалось, жалоб на состояние здоровья они не предъявляли, показатели объективного статуса возвращались к нормальным. В целом, состояние здоровья добровольцев в ходе введения препарата и после его окончания оценивалось как удовлетворительное, а при их повторном обследовании через сутки после введения ИЛ-1? никаких отклонений изучаемых показателей от нормы ни у одного из испытуемых не отмечалось.

С целью более полного выявления реакций организма участвующих в исследовании людей на ИЛ-1? у них до введения, через 3, 6 и 24 ч после введения препарата проводилась оценка общеклинических гематологических, биохимических и иммунологических показателей.

В результате проведенных исследований установлено, что ИЛ-1? не оказывал существенного влияния на биохимические показатели сыворотки крови. Лишь активность АСТ через 6 ч и ЛДГ через 24 ч были повышены на 40% и 17%, соответственно, но и эти показатели были в пределах нормы.

В то же время, препарат обладал выраженным гемостимулирующим действием, которое проявлялось в виде повышения общего числа лейкоцитов (с максимумом через 6 ч после введения препарата), в основном, за счет увеличения количества нейтрофильных гранулоцитов, относительные величины которых составили 70-90%. Повышенный уровень общего числа лейкоцитов и нейтрофилов сохранялся и через сутки после введения ИЛ-1?.

Наряду с увеличением содержания нейтрофилов препарат стимулировал и их функциональную активность (рис. 9). После введения ИЛ-1? происходило увеличение адгезивной и миграционной способности нейтрофилов, возрастал их функциональный потенциал, определенный в НСТ-тесте, во все сроки наблюдения значительно повышались показатели хемилюминесценции. Об изменениях функционального статуса нейтрофилов свидетельствуют и сдвиги показателей метаболизма этих клеток: под влиянием ИЛ-1? повышалось содержание в клетках липидов и снижалась активность щелочной фосфатазы.

Рис. 9. Спонтанная хемилюминесценция нейтрофилов периферической крови людей в разные сроки после введения интерлейкина-1? (n = 6)

# - различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с данными до введения ИЛ-1?

Иммуностимулирующее действие ИЛ-1? проявлялось ранним (через 3-6 ч после начала введения препарата) снижением абсолютного количества CD3+, CD4+ и CD8+ лимфоцитов и резким увеличением числа 0-лимфоцитов. Однако уже через 24 ч после инфузии никаких изменений количества и относительного содержания различных субпопуляций лимфоцитов не наблюдалось. Кроме того, под влиянием препарата увеличивалось число клеток, синтезирующих и продуцирующих ИЛ-1 и ФНО-? (рис. 10), а пролиферативная активность лимфоцитов, оцененная в реакции бласттрансформации с субоптимальными и оптимальными дозами ФГА и PWM, напротив, несколько снижалась.

Рис. 10. Количество мононуклеаров, синтезирующих и продуцирующих цитокины, в периферической крови людей до и после введения интерлейкина-1? (n = 6)

# - различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с данными до введения ИЛ-1?

Таким образом, введение ИЛ-1 людям в дозе 5 нг/кг по субъективным (отсутствию жалоб на состояние здоровья), клиническим (показатели пульса, артериального давления, термометрии и др.) и лабораторным данным (гематологические, биохимические и иммунологические исследования) не приводило к ухудшению состояния их здоровья, но вызывало повышение общего количества лейкоцитов и стимуляцию их функционально-метаболического статуса.

Влияние интерлейкина-1 на состояние лейкоцитов людей после облучения проб их периферической крови in vitro

Задачей данного этапа исследования явилась оценка радиозащитной эффективности ИЛ-1 в отношении количественных и функционально-метаболических показателей лейкоцитов человека, регистрирующихся после облучении проб периферической крови здоровых людей in vitro.

Для решения этой задачи, у 6 здоровых добровольцев до введения и через 3, 6 и 24 ч после начала внутривенной инфузии рекомбинантного ИЛ-1 в дозе 5 нг/кг в стеклянные пробирки забирались пробы периферической крови, которые в дальнейшем подвергались облучению в дозах 0.25, 0.5, 1 и 4 Гр in vitro. В каждой пробе до и сразу после радиационного воздействия изучалось количество основных популяций лейкоцитов, параметры субпопуляционного состава лимфоцитов и их функциональная активность в ответ на митогены, относительное число мононуклеаров, синтезирующих и продуцирующих цитокины, эффекторные свойства и морфобиохимические характеристики нейтрофилов. Сравнение полученных после введения ИЛ-1 и последующего радиационного воздействия in vitro результатов проводили с исходными данными, а также со значениями, которые регистрировались после облучения проб периферической крови этих же людей без внутривенной инфузии ИЛ-1.

В результате проведенных на этом этапе исследований было установлено, что облучение проб периферической крови здоровых людей в дозах от 0.25 до 4 Гр in vitro не влияло на общее количество лейкоцитов, но вызывало изменения субпопуляционного состава лимфоцитов, активности процессов синтеза и продукции цитокинов мононуклеарами, а также показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов. Рекомбинантный ИЛ-1в в течение первых суток после его парентерального введения здоровым людям существенно изменял количественный состав и качественное состояние лейкоцитов периферической крови, разнонаправлено модифицируя реакции этих клеток, развивающиеся после облучения проб крови in vitro.

Так, при облучении проб периферической крови людей без введения им ИЛ-1 существенных изменений абсолютных количеств лейкоцитов, по отношению к исходным значениям, не наблюдалось. Если же пробы крови облучали через 6 ч после внутривенной инфузии препарата, то количество лейкоцитов в периферической крови статистически значимо (р<0,05) превышало данные, зарегистрированные при облучении проб крови у людей, обследованных до введения ИЛ-1. Эта тенденция сохранялась и через 24 ч после начала введения препарата и последующего облучения (табл. 10).

Таблица 10. Абсолютное количество лейкоцитов людей до и после введения интерлейкина-1 и последующего облучения проб периферической крови в дозах 0.25, 0.5, 1 и 4 Гр in vitro, х 10⁹ /л (n = 6)

При оценке показателей лейкоцитарной формулы было выявлено, что, на фоне отсутствия сдвигов в распределении лейкоцитов после облучения проб крови in vitro, введение ИЛ-1 сопровождалось значительным ростом относительного содержания нейтрофильных гранулоцитов, в том числе и за счет увеличения юных и палочкоядерных форм клеток. Это приводило к тому, что через 6 и 24 ч после инфузии препарата и последующего радиационного воздействия относительное содержание нейтрофилов статистически значимо (р<0,05) превышало показатели, зарегистрированные у людей как в исходном состоянии, так и после облучения проб крови in vitro без введения ИЛ-1.

Профилактическое введение испытуемым ИЛ-1 до облучения проб их периферической крови приводило также к изменению показателей, характеризующих функционально-метаболический статус нейтрофилов. Так, при радиационном воздействии in vitro в дозах 0.25, 0.5, 1 и 4 Гр, которое проводилось через 3 ч после начала внутривенной инфузии ИЛ-1, содержание липидов в нейтрофилах достоверно (р<0,05) возрастало. Если же облучение проб крови осуществлялось спустя 6 или 24 ч после введения препарата, уровень внутриклеточных жиров в гранулоцитах практически не изменялся.

Применение ИЛ-1 за 3 или 6 ч до облучения проб крови людей не отменяло постлучевого уменьшения содержания катионных белков в нейтрофилах. В то же время, эффективность ИЛ-1, введенного испытуемым за 24 ч до облучения проб их периферической крови в дозах 1 и 4 Гр, была значительной, о чем свидетельствует более высокий уровень катионных белков (115-120%) по отношению к их содержанию в нейтрофилах проб крови, облученных без предварительного введения препарата.

Профилактическое применение ИЛ-1 до облучения проб крови людей не отменяло постлучевого ингибирования щелочной фосфатазы. Однако снижение активности данного фермента после радиационного воздействия in vitro в дозах 1 и 4 Гр на фоне введенного препарата было меньшим (р<0,05), чем в пробах крови, которые подвергались облучению без введения ИЛ-1 (табл. 11).

Таблица 11. Активность щелочной фосфатазы в нейтрофилах людей до и после введения интерлейкина-1 и последующего облучения проб периферической крови в дозах 0.25, 0.5, 1 и 4 Гр in vitro, усл. ед. (n = 6)

Изменения метаболизма нейтрофилов, которые наблюдались после облучения проб крови в дозе 4 Гр на фоне парентерального введения ИЛ-1, сопровождались и модификацией эффекторных свойств данных клеток. Так, радиационное воздействие in vitro до введения ИЛ-1 вызывало статистически значимое (р<0,05) снижение показателей спонтанной и индуцированной ФМА адгезии, уменьшалась миграционная способность нейтрофилов к ИЛ-8.

Через 3 ч после начала внутривенной инфузии ИЛ-1 и последующего облучения проб крови in vitro в дозе 4 Гр достоверные (р<0,05) отличия, по отношению к исходным значениям, определялись в параметрах, характеризующих процессы адгезии и миграции, показателях спонтанного и индуцированного зимозаном НСТ-теста, а также характеристиках хемилюминесценции нейтрофилов. Следует отметить, что при облучении без введения препарата наблюдалось статистически значимое (р<0,05) уменьшение показателей НСТ-теста, а спонтанная и индуцированная ФМА или зимозаном хемилюминесценция нейтрофилов были, напротив, более высокими (р<0,05).

Анализ относительных показателей клеточного иммунитета показал, что при облучении в дозе 4 Гр проб периферической крови людей через 3 ч после начала внутривенной инфузии ИЛ-1 процентное содержание CD3+ лимфоцитов по сравнению с данными облучения до введения препарата было в 1,4 раза ниже. Снижение числа CD3+ клеток в этот период происходило в основном за счет статистически значимого (р<0,05) уменьшения относительного содержания CD4+ лимфоцитов, что отражалось и на значении индекса иммунорегуляции: 1,12 0,11 против 1,50 0,08 в контроле.

Облучение проб крови людей через 6 ч после начала введения препарата также сопровождалось уменьшением относительного содержания CD3+ и CD4+ лимфоцитов (р<0,05). Кроме того, в этот срок исследования наблюдалось и статистически значимое (р<0,05) снижение CD20+ лимфоцитов по сравнению с данными необлученных проб, а значение CD4+/CD8+ составляло 1,23 0,07.

Применение ИЛ-1 за 24 ч до облучения проб крови людей в дозе 4 Гр полностью отменяло пострадиационное снижение изученных субпопуляций лимфоцитов. Следует отметить, что относительное содержание CD95+ клеток в этот период (24,6 10,8%) было существенно ниже, чем в случае после облучения без введения препарата (37,6 14,6%) и даже по сравнению с данными необлученных проб крови (30,3 9,45%). Необходимо также подчеркнуть, что, несмотря на применение ИЛ-1, уровень 0-лимфоцитов после радиационного воздействия был существенно повышен, а относительное содержание HLA+ клеток значимо не отличалось от значений групп сравнения.

После облучения проб крови людей в дозе 4 Гр без предварительного введения ИЛ-1 статистически значимо (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем возрастало число мононуклеаров с внутриклеточной формой ИЛ-1 и ФНО- и с поверхностной формой ФНО- (рис. 11).

Рис. 11. Количество мононуклеаров, синтезирующих и секретирующих цитокины, в периферической крови людей до и через 24 ч после введения интерлейкина-1 и последующего облучения проб периферической крови в дозе 4 Гр in vitro, % (n = 6)

# - различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с данными до облучения;

_## - различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с данными после облучения без введения ИЛ-1

При профилактическом применении ИЛ-1 за 24 ч до радиационного воздействия in vitro содержание клеток, синтезирующих ИЛ-1 и ФНО-, также увеличивалось в 5,2 раза и 7,1 раза, соответственно, по отношению к данным необлученных проб. Статистически значимо (р<0,05) возрастал и уровень мононуклеаров, продуцирующих ФНО- во внеклеточное пространство (в 2,2 раза). Следует, однако, отметить, что отношение содержания клеток с внутриклеточной формой ИЛ-1 к уровню мононуклеаров с поверхностной формой ФНО- под влиянием ИЛ-1 изменялось более чем в два раза. В частности, после облучения без использования препарата этот индекс составлял 0,39, а после радиационного воздействия in vitro на фоне профилактического (за 24 ч) парентерального введения ИЛ-1 его значение возрастало до 0,98.

Радиационное воздействие in vitro в дозе 4 Гр сопровождалось тенденцией к снижению спонтанной и индуцированной митогенами пролиферативной активности лимфоцитов. При использовании ИЛ-1 до облучения проб периферической крови показатели спонтанной реакции бласттрансформации практически не отличались от исходных значений. В то же время, пролиферативная активность Т-лимфоцитов в ответ на ФГА в дозе 2,5 мкг/мл при облучении на фоне введенного ИЛ-1 уменьшалась: через 3 ч после начала внутривенной инфузии препарата - на 49%, через 6 ч - на 84% (p<0,05), через 24 ч - на 69% (p<0,05). В ответ на ФГА в дозе 15 мкг/мл показатели реакции бласттрансформации Т-лимфоцитов после введения ИЛ-1 и последующего облучения проб крови также снижались: через 3 ч - на 52%, через 6 ч - на 78% (p<0,05), через 24 ч - на 62% (p<0,05). В среднем на 40% уменьшалась и пролиферативная активность В-лимфоцитов, оцененная в реакции бласттрансформации в ответ на митоген лаконоса в дозе 5 мкг/мг.

Таким образом, результаты, представленные в настоящем разделе, свидетельствуют о том, что ИЛ-1 обладает выраженной радиозащитной активностью по отношению к лейкоцитам людей, а максимальный радиопротекторный эффект препарата, оцениваемый по количественным и функционально-метаболическим показателям лейкоцитов периферической крови, наблюдается через 24 ч после парентерального введения ИЛ-1.

В основе радиозащитного и лечебного действия ИЛ-1 лежит его способность предотвращать постлучевую депрессию кроветворения, уменьшать выраженность процесса апоптоза, а также стимулировать иммунитет и неспецифическую резистентность организма. Основные пути реализации противолучевой активности ИЛ-1, подтвержденные результатами наших исследований, представлены на схеме.

Резюмируя результаты проведенных экспериментально-клинических исследований и данные литературы, необходимо отметить, что рекомбинантные цитокины вообще, и интерлейкин-1 в частности, занимают уникальное место в системе средств профилактики и лечения радиационных поражений. В отличие от радиопротекторов ИЛ-1 обладает одновременно как профилактическим, так и лечебным действием, проявляет свой радиозащитный эффект не только при остром радиационном воздействии, но и при пролонгированном, фракционированном, сочетанном внутреннем и внешнем облучении, и, судя по данным литературы, при местных и комбинированных радиационных поражениях [Заргарова Н.И. и др., 2000; Ремизов Д.В., 2000]. Этот цитокин оказывает непосредственное воздействие на основное звено патогенеза радиационных поражений - систему гемопоэза, защищая кроветворные клетки от лучевой гибели и ускоряя их восстановление после облучения [Аксенова Н.В., 2004; Neta R., 1997]. Положительным моментом является и то, что радиозащитное действие ИЛ-1 проявляется как в условиях однократного применения, так и при курсовом введении, и сохраняется в течение достаточно длительного времени. Важно также, что фармакопейный препарат рекомбинантного ИЛ-1 «Беталейкин» относится к немногим средствам профилактики и лечения радиационных поражений, выпускаемым в Российской Федерации [Назаров В.Б., Гребенюк А.Н., 2008]. Все это позволяет рекомендовать внедрение ИЛ-1 в существующую схему профилактики и лечения радиационных поражений, так как только комплексное применение традиционных и вновь создаваемых средств и методов позволит обеспечить эффективную защиту организма при воздействии поражающих факторов радиационной природы.

Выводы

1. Рекомбинантный интерлейкин-1 при введении за 24 ч до облучения и через 1 ч после радиационного воздействия обладает выраженным радиозащитным эффектом, что позволяет рассматривать его в качестве нового лечебно-профилактического средства обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях радиационного характера.

2. В условиях острого радиационного воздействия интерлейкин-1 является эффективным медицинским средством противорадиационной защиты, позволяющим увеличивать выживаемость облученных животных: ФИД препарата при его применении в качестве радиопротектора составляет 1,18-1,20, а при использовании в качестве средства ранней патогенетической терапии радиационных поражений - 1,16-1,18. При пролонгированном радиационном воздействии, сочетанном внешнем и внутреннем облучении профилактическое и лечебное использование интерлейкина-1 позволяет увеличить выживаемость облученных животных в среднем на 40-50%.

3. Интерлейкин-1 увеличивает миграционную и пролиферативную активность ранних предшественников гемопоэза. Применение данного препарата за 24 ч до облучения или через 1 ч после радиационного воздействия способствует сохранению жизнеспособности значительного числа стволовых кроветворных клеток и ускоряет восстановление гипоплазированного после радиационного воздействия костного мозга.

4. В условиях острого, пролонгированного, фракционированного и сочетанного внешнего и внутреннего облучения профилактическое и лечебное применение интерлейкина-1 позволяет уменьшить выраженность ранней постлучевой лейкопении и ускоряет восстановление количества клеток белой крови в поздние сроки после облучения.

5. Стимулирующий эффект интерлейкина-1 в отношении показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененных в результате различных вариантов радиационного воздействия, проявляется увеличением внутриклеточного содержания катионных белков, повышением активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.

6. Введение интерлейкина-1 в дозе 5 нг/кг хорошо переносится людьми и, несмотря на кратковременное повышение температуры тела до субфебрильных цифр, не оказывает отрицательного влияния на самочувствие и объективный статус людей, а также на биохимические показатели крови. Гемо- и иммуностимулирующее действие препарата у людей проявляется развитием умеренно выраженного нейтрофильного лейкоцитоза, повышением функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, увеличением количества клеток, синтезирующих и продуцирующих провоспалительные цитокины.

7. Введение людям рекомбинантного интерлейкина-1 за 24 часа до облучения их проб их периферической крови in vitro отменяет радиационно-индуцированное снижение абсолютного числа CD4+, CD8+ и CD20+ лимфоцитов, уменьшает пострадиационное ингибирование щелочной фосфатазы в нейтрофилах, нормализует адгезивные свойства гранулоцитов и их миграционную способность, снижает выраженность пострадиационных нарушений в цитокиновой сети.

Практические рекомендации

1. Рекомбинантный интерлейкин-1 рекомендуется для применения в качестве средства профилактики и экстренной терапии лучевых поражений, формирующихся при радиационных авариях и катастрофах.

2. Разработанная экспериментальная модель исследования реакций количественного состава различных субпопуляций лейкоцитов, параметров клеточного иммунитета, характеристик цитокиновой сети и морфофункциональных показателей нейтрофилов, развивающихся после введения здоровым людям рекомбинантного интерлейкина-1 и последующего облучения проб их периферической крови in vitro, может быть использована для оценки эффективности радиомодифицирующих препаратов в отношении человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях по перечню ВАК:

1. Аксенова Н.В. Радиопротекторная активность рекомбинантного IL-1 в отношении клеток предшественников гемопоэза / Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев, Д.А. Сидоров, А.А. Тимошевский // Медицинская иммунология. 2003. Т. 5, № 5-6. С. 21-24.

2. Тимошевский А.А. Реакция лейкоцитов человека на парентеральное введение интерлейкина-1 и на последующие облучение проб периферической крови in vitro / А.А. Тимошевский, А.Н. Гребенюк, Н.М. Калинина // Мед. радиология и радиационная безопасность. 2005. Т. 50, № 2. С. 5-17.

3. Гребенюк А.Н. Противолучевые свойства интерлейкина-1 / А.Н. Гребенюк, К.Г. Саркисян, А.А. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2005. - № 1 (13). - С. 44-53.

4. Гребенюк А.Н. Препараты интерлейкина-1 в лечении поражений ионизирующими излучениями / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Конев, К.Г. Саркисян, А.А. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2005. - № 1 (14). - С. 161-162.

5. Гребенюк А.Н. Экспериментальное обоснование целесообразности использования рекомбинантного IL-1beta для коррекции эффектов
фракционированного облучения / А.Н. Гребенюк, В.В. Конев, А.А. Тимошевский // Медицинская иммунология. 2005. Т. 7, № 5-6. С. 605-611.

6. Гребенюк А.Н. Перспективные направления фармакологической коррекции пострадиационных нарушений иммунитета / А.Н. Гребенюк, Н.А. Смирнов, Ю.А. Севрук, А.А. Тимошевский // Военно-медицинский журнал. 2005. Т. 327, № 8. С. 49-53.

7. Гребенюк А.Н. Перспективы совершенствования средств и методов профилактики радиационных поражений / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Зацепин, Д.А. Сидоров, А.А. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2005. № 1 (15). Приложение. - С. 404-405.

8. Гребенюк А.Н. Принципы, средства и методы медицинской противорадиационной защиты / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, А.А. Тимошевский // Медицина катастроф. 2007. № 3 (59). С. 32-37.

9. Гребенюк А.Н. Влияние раннего терапевтического применения интерлейкина-1 на выживаемость и костномозговое кроветворение облученных мышей / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, Н.В. Аксенова, А.А. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. № 1 (21). С. 135-138.

10. Гребенюк А.Н. Влияние раннего терапевтического применения интерлейкина-1 на количество иммунокомпетентных клеток в периферической крови, тимусе, селезенке и костном мозге облученных мышей / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, А.В. Петров, Н.В. Пигарева, А.С. Симбирцев, А.А. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. № 3 (23). С. 29-35.

11. Тимошевский А.А. Медицинская противорадиационная защита специалистов аварийно-спасательных формирований / А.А. Тимошевский, Н.М. Калинина, А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2008. - № 4. - С. 13-18.

12. Алексанин С.С. Клинико-экспериментальное обоснование интерлейкина-1 как средства профилактики и ранней терапии поражений при радиационных авариях и катастрофах / С.С.Алексанин, А.А. Тимошевский // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2009. - № 2. - С. 5-11.

Статьи в журналах, сборниках трудов, тезисы докладов:

13. Гребенюк А.Н. Реакция нейтрофилов на облучение крови в малых дозах in vitro / А.Н. Гребенюк, В.В. Конев, А.А. Тимошевский, В.Г. Конусова, Н.М. Калинина, О.С. Солнцева // 3 Съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. - Т. 1. Пущино, 1997. С. 22-23.

14. Сидоров Д.А Экспериментальное изучение влияния рекомбинантного интерлейкина-1 на костномозговой и кишечный синдром при остром лучевом воздействии / Д.А. Сидоров, В.В. Конев, А.А. Тимошевский // Итоговая науч. конф. военно-научного об-ва слушателей I факультета и клин. ординаторов ВМедА: Тез. докл. СПб., 1998. С. 164.

15. Тимошевский А.А. Прямое действие малых доз ионизирующего излучения на клетки периферической крови / А.А. Тимошевский // Итоговая науч. конф. военно-научного об-ва слушателей I факультета и клин. ординаторов ВМедА: Тез. докл. СПб., 1998. С. 173.

16. Тимошевский А.А. Состояние нейтрофилов в облученных пробах крови здоровых людей и лиц, ранее подвергавшихся воздействию ионизирующих излучений / А.А. Тимошевский, А.Н. Гребенюк, В.В. Конев, Д.А. Сидоров // Юбилейная конф. молодых ученых и специалистов, посвященная 200-летию ВМедА: Тез. докл. СПб., 1998. С. 126.

17. Тимошевский А.А. Реакция лейкоцитов периферической крови на действие малых доз ионизирующих излучений / А.А.Тимошевский, В.В. Конев, О.С. Солнцева, А.Н. Гребенюк // Морской мед. журн. 1998. Т. 5, № 2 . С. 26-29.

18. Солнцева О.С. Изменение количества апоптотических клеток, синтеза и продукции цитокинов в результате воздействия малых доз ионизирующего излучения / О.С. Солнцева, Н.М. Калинина, Н.В. Бычкова, А.Н. Гребенюк, А.А. Тимошевский, А.М. Никифоров // Морской мед. журн. 1998. Т. 5, № 3. С. 31-34.

19. Куценко С.А. Использование цитохимических методов исследования нейтрофилов для оценки эффективности фармакологической коррекции радиационных поражений / С.А. Куценко, А.Н. Гребенюк, Е.В. Давыдова, Д.А.Сидоров, А.А. Тимошевский, В.В. Конев // От materia medica к современным медицинским технологиям: Матер. Всерос. науч. конф. СПб., 1998. С. 89.

20. Гребенюк А.Н. Экспериментально-теоретическое обоснование возможности применения рекомбинантного интерлейкина-1 в качестве средства ранней коррекции гематологического синдрома радиационной этиологии / А.Н. Гребенюк, Д.А. Сидоров, А.С. Симбирцев, Н.В. Аксенова, Е.В. Давыдова, В.В. Конев, А.А. Тимошевский // Современные проблемы медицинской науки и практики: Сб. науч. статей. СПб., 1998. С. 38-39.

21. Конев В.В. Оценка влияния рекомбинантного интерлейкина-1 на гематологические показатели при фракционированном радиационном воздействии / В.В. Конев, А.А. Тимошевский, Д.А. Сидоров // Итоговая науч. конф. военно-научного об-ва слушателей I факультета и клин. ординаторов ВМедА: Тез. докл. СПб., 1999. С. 62.

22. Гребенюк А.Н. Исследования радиозащитной эффективности интерлейкина-1 в Военно-медицинской академии / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Конев, Д.А. Сидоров, А.А. Тимошевский // Адаптация организма к неблагоприятным условиям среды обитания: Сб. науч. статей. - СПб.: Изд-во “АСПОР” СПбГМПА, 1999. - С. 50-54.

23. Калинина Н.М. Оценка радиозащитной эффективности препарата «Беталейкин» в исследованиях in vitro / Н.М. Калинина, О.С. Солнцева, Д.А. Сидоров, А.Н. Гребенюк, В.Г. Конусова, А.С. Симбирцев, А.А. Тимошевский // Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины: Матер. Юбилейной науч.-техн. конф. СПб., 2000. С. 30.

24. Гребенюк А.Н. Влияние «Беталейкина» на количественные и функционально-метаболические показатели лейкоцитов людей при облучении проб периферической крови in vitro / А.Н. Гребенюк, А.А. Тимошевский // Радиационные поражения, перспективы развития средств индивидуальной защиты от ионизирующих излучений: Тез. докл. науч.-практ. конф. М., 2000. С. 20.

25. Аксенова Н.В. Радиопротекторная эффективность препаратов интерлейкина-1 / Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, А.А. Тимошевский, Д.А. Сидоров // Морской мед. журн. 2001. Т. 8, № 4. С. 6-10.

26. Гребенюк А.Н. Комплексная оценка радиозащитной эффективности рекомбинантного интерлейкина-1 / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, Ф.В. Арсеньев, А.Б. Верведа, Д.А. Сидоров, В.В. Конев, А.А.Тимошевский и др. // IV съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тез. докл. - Т. II. - М., 2001. - С. 415.

27. Тимошевский А.А. Экспериментальная оценка радиозащитной активности рекомбинантного интерлейкина-1 в исследованиях in vitro / А.А. Тимошевский // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности: Тез. докл. Рос. науч. конф. СПб., 2001. С. 445-446.

28. Тимошевский А.А. Перспективы применения рекомбинантных препаратов интерлейкина-1 в качестве медицинских средств защиты / А.А. Тимошевский, Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, Д.А. Сидоров, В.В. Конев // Сб. тр. I съезда военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ. - СПб., 2002. - С.174-175.

29. Гребенюк А.Н. Влияние интерлейкина-1 на состояние нейтрофилов в условиях острого, пролонгированного, фракционированного и сочетанного (внешнего и внутреннего) облучения / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Конев, А.А. Тимошевский // III Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология): Тез. докл. Киев, 2003. С. 143.