Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников

При оценке перфузии миокарда ЛЖ с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) с ^99mТс-тетрофосмином все сегменты в обеих группах пациентов были подразделены на 2 подгруппы: леченные (согласно зонам миокарда, в которые были введены аутологичные клетки-предшественники CD133+) и нелеченные. Сначала были проанализированы средние показатели накопления РФП (%) в каждой группе без разделения их по степени исходного нарушения перфузии. При этом в леченных сегментах у пациентов ИБС отмечалось достоверное увеличение накопления РФП (прирост от 10% и более) на нагрузке в поздние сроки после операции (к 1 году). В покое не наблюдалось достоверных изменений перфузии миокарда в этих зонах. У пациентов ДКМП на нагрузке также наблюдался достоверный прирост перфузии в отдаленном постоперационном периоде (прирост накопления РФП в сроки к 1 году). Изменений перфузии в покое не отмечали. Результаты исследования нелеченных сегментов показали, что для них характерно отсутствие каких-либо существенных изменений в динамике.

Чтобы оценить эффективность методики, дополнительно была проанализирована динамика количества нормально перфузируемых и с различной степенью нарушения перфузии сегментов до операции и через 1 год после вмешательства. Оказалось, что количество нормально перфузируемых сегментов увеличилось только в группе леченных сегментов у больных ИБС и ДКМП, при этом количество сегментов с различной степенью нарушения перфузии уменьшилось. В нелеченных сегментах, аналогичных изменений выявлено не было. При анализе показателей систолического утолщения, в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается достоверно положительная динамика. В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения.

На рисунках 3 и 4 представлена динамика величины дефектов перфузии (ДП) на нагрузке и в покое у больных ДКМП и ИБС. Как видно из рисунков, у пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке, так и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационными показателями. Помимо этого, отмечается незначительное уменьшение разницы площади дефекта перфузии на нагрузке и в покое.

Рисунок 3 Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на нагрузке и в покое у больных ИБС.

Рисунок 4 Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на нагрузке и в покое больных ДКМП.

Для оценки клинической эффективности клеточной кардиомиопластики в зависимости от способа введения аутологичных клеток-предшественников CD133+ проводилась оценка перфузии миокарда в динамике после операции у 6 больных с изолированным интракоронарным способом введения CD133+ (группа 1) и у 4 пациентов при изолированном интрамиокардиальном транскатетерном способе доставки клеточного материала (группа 2). Всего у данной группы пациентов было проанализировано 200 миокардиальных сегментов, из которых леченных - 104, нелеченных - 96. Для анализа эффективности способа введения клеток использовали интегральный показатель прироста накопления РФП к году после операции относительно исходного уровня. В леченных сегментах, при интрамиокардиальном способе введения накопление РФП достоверно увеличивалось на нагрузке в сегментах с умеренным, значительным и выраженным снижением перфузии в среднем на 20% относительно исходного уровня. В сегментах с выраженным нарушением перфузии накопление РФП, хотя достоверно и увеличивалось, но ни в одном сегменте в послеоперационных исследованиях уровень накопления РФП не превышал 50% от максимального. В сегментах с исходно нормальной перфузией достоверных изменений выявлено не было. При интракоронарном способе введения накопление РФП также увеличивалось, но ни в одном сегменте не было выявлено достоверной разницы изменения перфузии ни на нагрузке, ни в покое. Прирост накопления РФП не превышал в среднем 10%. В нелеченных сегментах достоверной и выраженной разницы в показателях накопления РФП, в исходно нормально перфузируемых сегментах и в сегментах с различными типами нарушения перфузии до операции и в зависимости от способа введения CD133+ выявлено не было ни на нагрузке, ни в покое. При анализе показателей систолического утолщения в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается более выраженная достоверно положительная динамика при интрамиокардиальном способе введения клеток. В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения. У пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке так и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационным. Однако при интрамиокардиальном введении клеток эта тенденция выражена более явно.

Качество жизни пациентов ИБС и ДКМП после лечения с помощью аутологичных клеток-предшественников CD133+ достоверно улучшилось по всем шкалам опросника SF - 36. Достоверное улучшение качества жизни наблюдается уже спустя 3 месяца после вмешательства и постепенно возрастает к 1 году в сравнении с исходными значениями.

Результаты терапевтического применения аутологичных клеток-предшественников CD133+ у пациентов с ревматическим анамнезом и хронической сердечной недостаточностью.

При сравнении результатов ЭхоКГ исследования пациентов до и после введения клеток CD133+ было отмечено достоверно уменьшение размеров ЛЖ (КДО, КСО, КДР и КСР), что сопровождалось улучшением сократительной функции ЛЖ.

Результаты применения терапевтического ангиогенеза при ХИНК.

При применении терапевтического ангиогенеза при ХИНК побочных эффектов после введения стимуляторов ангиогенеза отмечено не было. Уровень мочевины в сыворотке пациентов, получивших «Ангиостимулин», в динамике значимо не отклонялся от нормальных показателей (15-50 мг/%) в течение всего периода наблюдения.

Через 1 месяц после введения стимулятора клиническое улучшение состояния нижней конечности отмечалось в 80 % случаев. Заживление трофических язв через 1,5-3 месяца наблюдалось в 3 из 6 случаев, положительная динамика со стороны долго незаживающих послеоперационных ран - также в 3 случаях. Отмечалось уменьшение болевого синдрома у пациентов. При раздельном анализе эффект лечения через 1 месяц более выражен у пациентов 1-ой группы (p<0,05): клиническое улучшение появилось у 90% пациентов 1-ой группы и у 73 % больных 2-ой группы. Если во 2-ой группе клиническое улучшение ограничилось минимальным (+1 по Рутерфорду), то в 1-й в 40 % случаев возникло умеренное улучшение (+2 по Рутерфорду). Через 3 месяца клинический эффект наступил у 100 % пациентов в обеих группах. В 1-й группе умеренное улучшение отмечено у 78 % пациентов, а во 2-й - у 57 %; минимальное в 1-й группе - у 22 % больных, во 2-й - у 43 %.

К 6-му месяцу эффект сохраняется у всех пациентов 1-й группы и у 81 % - 2-й группы. Положительная динамика в обеих группах в лучшем случае не превысила «+2» по Рутерфорду (умеренное улучшение), однако, и ухудшения по причинам, связанным с исследованием, отмечено не было. Возврат состояния конечности к исходному установлен в 2 случаях во 2-й группе исследования (19 %) , что обусловлено атроэмболией из аорты.

В отдалённом периоде (больше 6 месяцев) обследовано 3 пациента. По причине стабильной положительной динамики со стороны нижних конечностей и отсутствия отрицательной со стороны других артериальных бассейнов им не проводилась дополнительная терапия. У двоих из них наступило клиническое выздоровление (полностью исчезли симптомы ишемии) через 9 месяцев после введения стимулятора ангиогенеза (клетки-предшественники); у одного - достигнутый к 6-му месяцу эффект (умеренное улучшение) сохраняется уже в течение 2 лет.

Средний прирост напряжения кислорода через 1 месяц в 1-й группе составил 7,5 мм рт. ст., во 2-й группе - 6,5 (р<0,05 в обеих группах), через 3 месяца в 1-й группе - 14,0 мм рт.ст., во 2-й - 10,4 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц), через 6 месяцев в 1-й группе - 16,0 мм рт.ст., во 2-й - 13,0 (р<0,05 в обеих группах по сравнению с исходными данными и данными через 1 месяц и через 3 месяца для 1-й группы). Средний прирост напряжения кислорода в 1-й группе выше на всех этапах наблюдения, но статистическая достоверность получена лишь через 3 месяца (p<0,05).

При анализе результатов транскутанного напряжения кислорода в 1-й группе в зависимости от способа введения стимулятора наблюдалось достоверное увеличение показателя Тк РО2. При внутриартериальном введении клеток-предшественников в течение 3 месяцев, при внутримышечном - в течение всего периода наблюдения. Средний прирост Р О2 при внутримышечном введении клеток-предшественников выше на всех этапах наблюдения, но статистической достоверности различий между группами с разными способами введения стимулятора не получено (p>0,05).

Для оценки толерантности к физической нагрузке у пациентов с перемежающейся хромотой проводился тредмил-тест. ДББХ и МДХ достоверно увеличиваются в течение всего периода наблюдения: в меньшей степени за первый месяц, в большей - за последующие месяцы. Через 1 месяц ДББХ увеличивается на 0,58 минуты, через 3 месяца ещё на 1,88 минуты, через 6 месяцев - на 3,17 минуты (суммарно за 6 месяцев на 5,63 минуты). МДХ к 6 месяцу возросла на 5,82 минуты. В 2 случаях через 3 месяца и в 4 (44 %) - через 6 месяцев тредмил-тест прекращен через 12 минут (512 метров) по причине его полного выполнения (переход во 2А степень ХИНК).

Через 3 месяца после введения стимулятора ангиогенеза появление новых видимых коллатеральных сосудов отмечено у всех ангиографически обследованных пациентов. В среднем увеличение коллатеральной сети в 1-й группе составило +2,28+/-0,75 (p>0,05, n=7), во 2-й - +2,0+/-0,45 (р<0,01, n=11). Установлена прямая достоверная связь между динамикой увеличения коллатеральной сети и изменением клинического статуса конечности (по Рутерфорду), транскутанным напряжением кислорода, средним показателем перфузии. Возраст и исходная тяжесть ишемии конечности достоверно не влияли на увеличение количества коллатеральных сосудов по данным ангиографии.

Клиническое улучшение состояния нижних конечностей оказало существенное влияние на качество жизни пациентов. Физическая активность (ФА), показатель влияния болезни на выполнение физических нагрузок, достоверно ниже принятого за норму показателя качества жизни здоровой популяции г. Санкт-Петербург исходно в обеих группах (р<0,05). В динамике наблюдается улучшение данного параметра. В 1-й группе значимо ФА возрастает к 3 месяцу, приближаясь к нормальному значению через 6 месяцев. Во 2-й группе лишь через 6 месяцев установлено значимое увеличение ФА, не достигшей нормального значения (p<0,05), что вероятно обусловлено преклонным возрастом пациентов и большим количеством сопутствующих заболеваний.

Интенсивность боли и её влияние на повседневную деятельность, достоверно снижается и, соответственно, увеличивается показатель болевого фактора (БФ) через 3 месяца в обеих группах исследования. Значимого отличия между показателями БФ на различных этапах наблюдения у пациентов 1-й группы и нормальным значением установлено не было. Во 2-й группе значение БФ значительно ниже нормального уровня в течение первых 3 месяцев и приближается к нормальному значению к 6 месяцу.

Общее здоровье (ОЗ), на момент заполнения опросника и перспектив лечения достоверно отличалась на начальном этапе в обеих группах от нормального значения. В последующем данный показатель приближается к нормальному даже во 2-ой группе, где отсутствует значимый прирост ОЗ, что подтверждает наличие положительной динамики в лечении.

В отличие от показателя ОЗ жизнеспособность (ЖС), сравнима с нормальным значением, а через 6 месяцев в 1-ой группе - превышает его (p<0,05), что объясняется значительным улучшением эмоционального настроя пациентов на фоне улучшения физического состояния. То же можно сказать и о психическом здоровье (ПЗ) пациентов. При исходно значительно сниженном ПЗ у пациентов 1-ой группы по сравнению с нормальным значением (p<0,05), уже в течении первого месяца эмоциональная картина меняется - ПЗ стремится к нормальному. Показатель РПП (влияния эмоционального состояния на жизнедеятельность) достоверно увеличивается у пациентов 2-й группы через 1 месяц, у пациентов 1-й группы - через 3 месяца. Социальная активность ожидаемо возростает, достоверно не отличаясь от нормального значения. Часть пациентов (6 человек - 24 %) изменили планы на будущее: трое снова начали, а трое продолжили работать после длительного перерыва.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Значительное число больных ИБС (от 5 до 21% по разным оценкам) имеют противопоказания к реваскуляризации хирургическими и интервенционными методами, либо у них таким способом не удается достичь полной реваскуляризации (de Feyter P., 1992; Mukherjee D. и соавт., 1999) и снять симптоматику стенокардии. В такой ситуации целесообразно рассматривать возможность применения терапевтического ангиогенеза, позволяющего обеспечить полноценный кровоток путем стимуляции формирования новых сосудов (Laham R. и соавт., 2000). Аналогичным образом, заметное количество больных хронической ишемией нижних конечностей (до 5%) страдают от остаточных симптомов после хирургии и традиционной терапии (Baumgartner I. и соавт., 2000). Несомненно, в этой группе больных терапевтический ангиогенез выглядит перспективным дополнением хирургического лечения. Более того, тяжелая сердечная недостаточность - прогрессирующий синдром, характеризующийся необратимой утратой миоцитов, теоретически может быть компенсирован за счет стимуляции регенерации миоцитов, т.е. миогенеза.

Первый этап нашего исследования был посвящен созданию генетической конструкции для терапевтической стимуляции ангиогенеза у нуждающихся в этом больных. В качестве преспективных генов-кандидатов были выбраны VEGF₁₆₅ и bFGF. Полученные на основе pBK-CMV генетические конструкции эффективно воспроизводятся в культуре E. coli, и с высокой степенью чистоты могут быть выделены из клеточного лизата на колонках фирмы Qiagen. Созданная таким образом конструкция позволяет относительно легко нарабатывать значительные (15 - 50 мг за один цикл выделения) количества плазмидной ДНК, пригодной для введения больным. Мы остановились на плазмидной конструкции в качестве стимулятора ангиогенеза основываясь, во-первых, на относительной дешевизне и простоте получения значительного количества препарата, во-вторых, на данных об эффективной экспрессии плазмидной ДНК в мышечной ткани (Tripathy и соавт., 1996), и, в-третьих, из-за опасения осложнений, связанных с применением у больных вирусного вектора (Marshall и соавт., 2003). Последующее исследование токсичности и переносимости препаратов подтвердили безопасность их применения в эксперименте на животных, и в перспективе - для лечения больных. Первично эффективность препарата VEGF₁₆₅ была проверена в стандартном тесте с матригелем. Продемонстрирована экспрессия кодируемого плазмидой белка VEGF₁₆₅ в человеческих клетках НЕК 293, а имплантация крысе помещенных в матригель трансфецированных плазмидой клеток приводила к эффективной стимуляции процессов ангиогенеза в коже.

Следующим этапом нашего исследования стала проверка эффективности сконструированных препаратов на модели хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Сравнительное изучение эффективности двух генетических конструкций показало, что через 30 дней после введения в зону ишемии даже минимальной из использованных нами в эксперименте доз (250 мкг/животное) VEGF₁₆₅ отмечается достоверное по сравнению с контролем увеличение плотности капиллярного русла, в то время как введение даже максимальной в рамках данного исследования дозы bFGF (750 мкг/животное) не оказывает существенного влияния на кровоток в ишемизированной конечности. Ангиогенная эффективность белковых препаратов FGF была продемонстрирована в ряде экспериментов на животных, как при локальном, так и при интракоронарном способах введения (Lazarous D. и соавт., 2000; Rajanayagam M. и соавт., 2000). В то же время результаты клинических испытаний белковых и генетических препаратов FGF далеко не так однозначны (Ruel M. и соавт., 2002; Simons M. и соавт., 2002). На данном этапе наших исследований, мы решили сосредоточиться на клинических испытаниях содержащей VEGF₁₆₅ плазмиды (препарат «Ангиостимулин»).

Поскольку ишемия органа приводит, в том числе к истощению регенеративных возможностей за счет уменьшения числа резидентных стволовых клеток, введения ангиогенных факторов может оказаться недостаточно для полноценного восстановления функции органа. В этой связи привлекательной альтернативой выглядит использование стволовых плюрипотентных клеток. Эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) представляют собой гетерогенную группу клеток, характеризуемую экспрессией ряда поверхностных маркеров, таких как CD34, CD133 и VEGFR-2 (KDR или Flk-1), способностью накапливать DiI-Ac-LDL и связывать считающиеся специфичными для эндотелия лектины, такие как Ulex europaeus. Маркер стволовых клеток CD34 в меньшем количестве выявляется также на зрелых клетках эндотелия, и поиск более специфичных маркеров привел к обнаружению CD133, с высокой плотностью экспрессируемого на незрелых стволовых клетках, и утрачиваемого в процессе дифференцировки (Handgretinger R. и соавт., 2003). Предполагается, что в популяции ЭПК наличествуют две субпопуляции: более примитивная CD133⁺/CD34^-/VEGFR-2⁺ и более зрелая CD133⁺/CD34⁺/VEGFR-2⁺. Нашей задачей было более подробно исследовать субпопуляционный состав ЭПК, а также фенотипически и функционально охарактеризовать эти клетки в условиях in vitro и in vivo.

Использованный в нашей работе способ выделения позволяет с высокой эффективностью получать очищенный препарат аутологичных стволовых клеток пациента. На выходе с колонки мы получали 1-3 миллиона стволовых клеток.

Анализ поверхностного фенотипа выделяемых клеток позволил продемонстрировать наличие в костном мозге обследованных пациентов CD133⁺/CD34^- субпопуляции стволовых клеток, которые в дальнейшем дифференцируются в субпопуляцию, экспрессирующую CD133⁺/CD34⁺, и в ходе последующей дифференцировки в соответствующих условиях in vitro приобретают фенотип зрелых эндотелиальных клеток. В то же время, эта субпопуляция CD133⁺/CD34^- ЭКП функционально оказалась более активной, чем теоретически более зрелая субпопуляция ЭКП CD133⁺/CD34⁺. В условиях in vitro эта субпопуляция клеток-предшественников после обработки SDF-1 более активно прилипает к обработанной фибронектином поверхности и более эффективно дифференцируется в зрелые эндотелиальные клетки по сравнению с субпопуляцией CD133⁺/CD34⁺ клеток.

Со времени первого сообщения в научной литературе (Asahara T. и соавт., 1997) было принято считать, что фенотип ЭКП определяется экспрессией на поверхности маркеров CD34 и VEGFR-2. В дальнейшем, обнаружение маркера стволовых клеток CD133 (Peichev M. et al., 2002), экспрессия которого, в отличие от CD34 утрачивается по мере дифференцировки ЭКП в клетки эндотелия, позволило подразделить популяцию ЭКП на субпопуляцию CD133⁺/CD34⁺/VEGFR-2⁺, предположительно состоящую из более ранних клеток-предшественников, и субпопуляцию CD133^-/CD34⁺/VEGFR-2⁺ клеток, предположительно далее продвинувшуюся по пути дифференцировки эндотелиального ростка (Peichev M. c соавт.). Полученные нами данные указывают на вероятность существования третьей, потенциально более примитивной субпопуляции ЭКП, определяемой экспрессией на поверхности CD133 и VEGFR-2 при отсутствии экспрессии CD34. Этот вывод подкрепляется результатами, полученными Guo Y. и соавт. В своей работе они показали, что в процессе культивирования in vitro CD34-отрицательные стволовые клетки, выделенные из костного мозга мышей, приобретают способность экспрессировать CD34, т.е. CD34^- стволовые клетки могут быть предшественниками CD34⁺ клеток. Аналогичным образом, в нашем исследовании CD133⁺/CD34^- ЭКП из костного мозга человека дифференцировались в CD133⁺/CD34⁺ клетки при культивировании in vitro в условиях, способствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки. Описанная нами субпопуляция CD133⁺/CD34^- ЭКП отличается от субпопуляции ЭКП, описанной Rehman и соавторами, поскольку последнюю характеризует высокий уровень экспрессии CD14 (95,7%) и низкий уровень экспрессии CD133 (0,16%) на поверхности клеток, в то время как исследованные нами CD133⁺/CD34^- не экспрессируют CD14. Kuci S. и соавторы (Hangretinger R. и соавт., 2003) показали, что получаемая при культивировании in vitro мононуклеаров человеческой крови в присутствии Flt3/Flk2 лиганда и интерлейкина-6 субпопуляция стволовых CD133⁺ клеток не экспрессирует CD34 и обладает способностью репопулировать костный мозг мышей с двойной мутацией: тяжелым комбинированным иммунодефицитом и диабетом I-го типа. После трансплантации эти клетки приживались на значительно более длительное время, чем свежевыделенные CD34⁺ клетки. Кроме того, на ограниченном контингенте больных (6 пациентов) было показано, что трансплантация CD133⁺ клеток ведет к улучшению функционирования миокарда в постинфарктный период (Stamm C. et al.,2003). Наблюдение за пересаженными бестимусным мышам CD133⁺ клетками-предшественниками из пуповинной крови человека показало, что они участвуют в формировании капиллярной сети в ишемизированной задней конечности, стимулируют процессы неоваскуляризации и способствуют восстановлению ишемизированых тканей задней конечности. Тем не менее, конкретные механизмы, опосредующие миграцию стволовых клеток в ишемизированные ткани, а также регуляция и механизм регенеративного действия CD133⁺ стволовых клеток требуют дальнейшего, более углубленного экспериментального исследования.

Хотелось бы подчеркнуть, что по нашему мнению, субпопуляция CD133⁺/CD34^-/VEGFR-2⁺ ЭКП костномозгового происхождения играет ключевую роль в регенерации эндотелия и восстановлении поврежденных тканей. Учитывая их высокую регенеративную способность, представляется рациональной трансплантация таких клеток в терапевтических целях. По результатам наших экспериментов, мы предполагаем, что субпопуляция CD133⁺/CD34^-/VEGFR-2⁺ клеток содержит предшественники CD133⁺/CD34⁺/VEGFR-2⁺ клеток и обладает более высоким по сравнению с последними потенциалом восстановления сосудистого русла. Полученные нами данные расширяют современные представления о гетерогенности популяций ЭКП и могут иметь значение для лечения ишемической болезни сердца и патологии магистральных сосудов.

При ИБС в основе всех патологических процессов лежит, как правило, постепенное прогрессирование артериальной недостаточности с нарушением периферической макрогемодинамики в результате развития стенотических и облитерирующих процессов в артериях. Прежде всего, это касается микроциркуляторных расстройств, которые развиваются вторично из-за низкого перфузионного давления (Савельев В.С. и соавт., 1997). Отмечается поражение капилляров, питающих мышечные волокна конечностей, дегенеративные изменения эндотелия в них и агрегация форменных элементов крови. Поэтому клиника тяжелой ишемии определяется как микроциркуляторными нарушениями, так и изменениями гемореологическими. Несостоятельность капиллярного кровообращения является одним из ведущих факторов в развитии грубых трофических нарушений у пациентов с декомпенсацией каппилярного кровотока (Казаков Ю.И. и соавт., 1997). Следует отметить, что даже при идеально выполненной операции микроциркуляция в конечности не нормализуется в течение 2-3 лет после операции и ухудшается из-за продолжающегося прогрессирования основного патологического процесса. Поэтому все пациенты после операции нуждаются в продолжении консервативной терапии, независимо от исхода хирургического лечения (в том числе по причине сопутствующего поражения других артериальных бассейнов). Больным же с неоперабельным поражением дистального артериального русла нижних конечностей, слабым развитием коллатеральных путей кровотока и, соответственно, минимальным клиническим улучшением и при отсутствии динамики после операции (по результатам нашего исследования всего в 15 % случаев) помимо принятого объёма консервативной терапии требуется более интенсивное воздействие на коллатеральное русло глубокой бедренной и подколенной артерий.

При клиническом применении генных технологий (плазмидной конструкции VEGF₁₆₅) для лечения хронической критической ишемии нижних конечностей (терапевтическая доза препарата составляет 1000 мкг (Isner J. И соавт., 1999) различной этиологии (атеросклероз и облитерирующий тромбангиит) по данным литературы уже через 1 месяц после введения препарата получен статистически достоверный положительный результат. Максимальный терапевтический эффект отмечен к третьему месяцу. Сходная динамика установлена и нами. У большей части пациентов (до 71 %) полностью прекратились или уменьшились боли покоя (до 86 % по данным литературы), у 4 из 5 пациентов зажили или значительно уменьшились трофические язвы (57-67 % по данным литературы), на 10,4-13 мм рт.ст. увеличилось транскутанное напряжение кислорода, показатели перфузии конечности по данным лазерной допплеровской флоуметрии, в среднем на 0,1 - индекс лодыжечного давления (по данным литературы на 0,15-0,19), на 1,88 минуты - длительности безболевой ходьбы (на 1,3 минуты по данным литературы); возросло количество новообразовавшихся видимых коллатеральных сосудов на уровне колена, голени и стопы по данным ангиографического исследования - средний прирост составил +2,0+/-0,45 (по разным данным литературы в среднем +1,3+/-0,04). В той или иной степени к 3 месяцу клиническое улучшение отмечается у всех пациентов (90% пациентов по данным литературы), при этом умеренное улучшение по шкале Рутерфорда - в 57 % случаев (50% по данным литературы (Baumgartner I. и соавт., 1998).

ВЫВОДЫ

Активизация восстановительных процессов в ишемизированных тканях достигается путем индукции в них процессов ангио/миогенеза, которые могут быть усилены применением ангиогенезстимулирующих факторов.

Созданная плазмидная конструкция ангиогенного препарата - ангиостимулин - биосовместима, нетоксична, позволяет эффективно экспрессировать ген VEGF₁₆₅, и может быть использована для индукции репаративного ангиогенеза в ишемизированных тканях.

Высокоочищенная популяция CD133⁺ стволовых клеток костного мозга состоит из двух субпопуляций: менее зрелых CD133⁺/CD34^-/VEGFR-2⁺ клеток и более дифференцированных CD133⁺/CD34⁺/VEGFR-2⁺ клеток, причем субпопуляция CD133⁺/CD34^-/VEGFR-2⁺ клеток обладает более высоким потенциалом дифференцировки в направлении неоангиогенеза.

Клетки CD133⁺ обладают более выраженной ангиогенной активностью по сравнению с CD34⁺, и поэтому именно эти клетки должны использоваться для стимуляции ангиогенеза при лечении ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей.

Препарат «ангиостимулин» улучшает перфузию миокарда в наиболее пораженных ишемией сегментах и этот эффект сохраняется не менее года.

При сравнительной оценке эффективности способов введения аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133⁺ для стимуляции регенеративных процессов в миокарде, показано что при интрамиокардиальном введении отмечается достоверное улучшение перфузии в леченных сегментах с исходно умеренным и значительным снижением перфузии. При интракоронарном способе введения достоверных изменений показателей перфузии получено не было.

Как при артериальном, так и при внутримышечном введении аутологичных клеток-предшественников CD133⁺ или гена VEGF₁₆₅ зарегистрировано образование новой сосудистой сети при лечении ХИНК.

После аутотрансплантации клеток-предшественников CD133⁺ достоверно улучшалось качество жизни больных ИБС и ХИНК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Исходя из результатов проведенных исследований представляется целесообразным применение внутримышечного введения генного препарата VEGF₁₆₅ (ангиостимулина) при ишемии миокарда и хронической ишемии нижних конечностей (с учетом критериев включения и исключения пациентов).

Использование аутологичных костномозговых клеток-предшественников CD133⁺ можно рекомендовать для лечения сердечной недостаточности в сочетании с хирургическими методами, при этом наиболее эффективным является метод изолированного интрамиокардиального введения.

При лечении ХИНК можно рекомендовать как внутриартериальное, так и внутримышечное введение аутологичных клеток-предшественников CD133⁺ или ангиостимулина (гена VEGF₁₆₅).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бокерия Л.А., Еремеева М.В.Современное состояние и перспективы использования ангиогенеза в лечении ишемической болезни сердца. Грудная и сердечно-сосудистая хирургия, 2000, №2, 57-61.

2. Еремеева М. В., Голухова Е.З. Факторы ангиогенеза при ишемии. Стимуляция неоангиогенеза в миокарде. Лекции по кардиологии, в 3-х томах, под ред. Бокерия Л.А. и Голуховой Е.З., изд. НЦССХ им. А.Н.Бакулева, Москва, 2001, с.161-170.

3. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М. В., Киселев С.Л. Стимуляция неоангиогенеза при ишемии миокарда. Первый этап доклинических испытаний плазмидной ДНК VEGF. Пятая ежегодная сессия Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр. 136.

4. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Э.С. Полякова. Разработка клинико-диагностических критериев отбора больных ИБС для применения терапевтического ангиогенеза. Седьмой всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2001, №3, стр.231.

5. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Полякова Э.С., Серов Р.А. Про- и антиангиогенные факторы при ишемической болезни сердца в зависимости от степени выраженности атеросклероза. VI ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2002, №3, стр.161.

6. . Eremeeva M., Golukhova E., Alshibaya M., Berishvili I., Bockeria L. Angiogenic factors production stimulated by different methods of myocardial revascularisation. 8-th International Local Drug Delivery meeting and cardiovascular course on Radiation and molecular strategies, Geneva, Switzerland, 2002, p.18.

7. Eremeeva M.V., Golukhova E.Z., Bockeria L.A. Endogenous angiogenesis activation in ischemic heart disease patients: different methods of myocardial revascularization of strategies for therapeutic angiogenesis. In book “Angiogenesis bench to bedside”, 2003, Medical and Engineering Publishers Inc., pp.275-292.

8. Л.А. Бокерия, М.В. Еремеева, Э.С. Полякова, Т.Т. Какучая, М.А. Лукашкин. Прогностическая значимость определения уровня pro-ANP и pro-BNP для оценки степени сердечной недостаточности и эффективности терапевтического ангиогенеза. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, №3, стр.161.

9. Л.А. Бокерия, Е.З. Голухова, И.П.Асланиди, М.В.Еремеева, В.Ю. Мерзляков, И.И. Беришвили, А.Ф. Клюева, Т.Т. Какучая, Э.С. Полякова, М.А. Лукашкин. Экспериментальное и клиническое исследование препаратов на основе генов ангиогенных факторов (VEGF и bFGF человека) при ишемии. VII ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференции молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, стр.161.

10. Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A. Different methods of revascularization combined with intramyocardial VEGF gene transfer administration in IHD patients. International Journal of Medical Implants and Devices, Vol. l, No l, 2003 Medical and Engineering Publishers, Inc, USA, pp 100-155.

11. Eremeeva M., Bockeria L., Golukhova E., Kiselev S.L., Polyakova E., Lukashkin M. A. Intramyocardial VEGF gene administration in IHD patients during different methods of surgical revascularisation. Angiogenesis: Novel basic science insights and human therapy. Keystone symposia 2004 abstract book, p.12.

12. Л.А. Бокерия, М.В. Еремеева, Э.С. Полякова. Диагностика сердечной недостаточности с помощью определения концентраций предшественников натрийуретических пептидов в плазме крови больных ИБС. Девятый всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». Москва. Ноябрь 2003, стр.326.

13. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Мерзляков В.Ю., Беришвили И.И., Клюева А.Ф., Какучая Т.Т., Полякова Э. С., Лукашкин М.А. Первые результаты клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGF₁₆₅ человека. Девятый всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2003, № 11, стр.326.

14. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В., Полякова Э.С. Использование предшественников натрийуретических пептидов в диагностике сердечной недостаточности ишемической этиологии до и после операции аортокоронарного шунтирования. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца» 2004, т. 5, № 3, стр.156-161.

15. Бокерия Л.А., Георгиев Г.П., Голухова Е.З., Еремеева М.В., Гнучев Н.В., Киселев С.Л., Лагарькова М.А., Ким А.И., Асланиди И.П., Вахромеева М.Н., Какучая Т.Т., Полякова Э.С., Лукашкин М.А., Волковская И.В., Демидова О.А.. Возможности использования генных и клеточных технологий для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, № 3, стр.19-38.

16. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Джитава Т.Г., Чеботарева, Еремеева М.В.. Некоторые особенности клинического течения, диагностики и реваскуляризации миокарда у больных ишемической болезнью сердца, страдающих сахарным диабетом. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, № 3, стр. 89-96.

17. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. с соавт. Первый опыт клинического применения терапевтического ангиогенеза с использованием гена VEGF₁₆₅ человека. Бюллетень НЦССХ им Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания. Креативная кардиология. Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний сердца». 2004, №4, стр. 134 -142.

18. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Новые подходы к лечению ишемической болезни сердца: терапевтический ангиогенез в сочетании с хирургической реваскуляризацией миокарда. Терапевтический архив, 2004, т. 76, №6, с.25-30.

19. Бокерия Л.А., Георгиев Г.П., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Генные и клеточные технологии при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (опыт НЦ ССХ им А. Н. Бакулева). Сердечно-сосудистые заболевания: проблемы трансплантологии. 2004, т.5, №7, стр. 70-91.

20. Bockeria L.A., Golukhova E.Z., Eremeeva M.V., I.I. Berishvili. Gene and cell therapy: alternative approach for myocardial revascularization. Proceedings of the 6th International Congress on Coronary Artery Disease 2005, Istanbul, Turkey, 29 oct.-1 nov. 2005, p.383-386.

21. Бокерия Л.А., Глянцев С.П., Серов Р.А., Еремеева М.В. и соавт.От открытия клетки к ее лечению (к 165-летию учения о клетке), часть 1 . Клиническая физиология кровообращения, 2005, №1, стр.14-23.

22. Бокерия Л.А., Глянцев С.П., Серов Р.А., Еремеева М.В. и соавт. От открытия клетки к ее лечению, ч. 2, Клиническая физиология кровообращения, 2005, №2, стр.19-29.

23. Бокерия Л.А., Глянцев С.П., Серов Р.А., Еремеева М.В. с соавт. От открытия клетки к ее лечению, ч. 3, Клиническая физиология кровообращения, 2005, №3, стр.5-12.

24. Бокерия Л.А., Муратов Р.М., Беридзе И.З., Асланиди И.П., Никитина Т.Г.,. Еремеева М.В., Волковская И.В. Новый подход к хирургическому лечению клапанной и дилатационной кардиомиопатии. Сердечно-сосудистые заболевания: клапанная патология сердца, 2005, т.6, № 6, стр.9-13.

25. M. Eremeeva, E. Golukhova, L. Bockeria, I. Volkovskaya, N. Chigogidze et al.Cell therapy by mesenchymal stem cells (CD133+) in advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: clinical experience. The J. of cardiovascular surgery, v.46, suppl. 1, №3, June 2005, p.120., 15-th Word Congress WSCTS, Vilnius, June 19-23 2005.

26. Бокерия Л.А., Голухова Е.З., Еремеева М.В. и соавт. Первые результаты терапевтического ангиогенеза у пациентов с ишемической болезнью сердца с использованием гена VEGF165 человека. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2005, №3, стр.123-131.

27. Bockeria L., Golukhova E., Eremeeva M.et al. Experimental rationale and the first experience of therapeutic angiogenesis using VEGF165 gene in patients with ischemic heart disease. The J. of cardiovascular surgery, v.46, suppl. 1, №3, june 2005, p.47, 15-th Word Congress WSCTS,Vilnius, june 19-23 2005.

28. Eremeeva M.V., Golukhova E.Z., Volkovskaya I.V., Chigogidze N.A., Aslanidi I.P., Vachromeeva M.N., Svobodov A.A., Bockeria L.A.. Stem cells (CD133+) therapy in advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: clinical experience. 12-th International Local Drug Delivary meeting and cardiovascular course on Revascularization & molecular strategies, feb. 2-4, 2006, p.102.

29. Бокерия Л.А., Спиридонов А.А., Еремеева М.В., Аракелян В.С., Демидова О.А. Первый опыт комбинированного лечения хронической ишемии нижних конечностей с использованием стимуляторов неоангиогенеза. Сердечно-сосудистые заболевания: ангиология и сосудистая хирургия, 2006, т. 7, №4, стр. 73-80.

30. Бокерия Л.А., Демидова О.А., В. Аракелян В.С., Еремеева М.В.. Опыт лечения хронической ишемии нижних конечностей с помощью генного препарата сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF₁₆₅ - ангиостимулина. Сердечно-сосудистые заболевания: ангиология и сосудистая хирургия, 2006, т. 7, №1, стр. 74-81.

31. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., Eremeeva M.V. et al.Clinical application of mesenchymal stem cells (CD 133⁺) in patients with advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy. Europace suppl., v. 8, supl.1, june 2006, 15-th World Congress in Cardiac Electrophysiology and Cardiac Techniques, june 14-17, 2006, Nice, France.

32. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., Eremeeva M.V. et al.First experience of therapeutic angiogenesis using VEGF₁₆₅ gene in patients with ischemic heart disease and its experimental rationale. Europace supplements, v. 8, supl.1, june 2006, 15-th World Congress in Cardiac Electrophysiology and Cardiac Techniques, june 14-17, 2006, Nice, France.

33. Golukhova E.Z., Bockeria L.A., M.V. Eremeeva et al.VEGF165 gene in therapy the treatment of patients with ischemic heart disease. 16-th World Congress of cardio-thoracic surgeons, 2006, Ottawa, Canada, p.82. .

34. Golukhova E.Z., Bockeria L.A.., Eremeeva М.В. et al. Mesenchymal stem cells (CD133⁺) in the treatment of patients with advanced coronary artery disease and dilative cardiomyopathy: results of the pilot study. 16-th World Congress of cardio-thoracic surgeons, 2006, Ottawa, Canada, p.83.

35. Еремеева М.В., Голухова Е.З., Чигогидзе Н.А. и соавт. Генная и клеточная терапия для стимуляции ангио/миогенеза при сердечно-сосудистых заболеваниях. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Ежегодная сессия НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», 2006, №3, стр. 215

36. Еремеева М.В., Голухова Е.З., Чигогидзе Н.А. и соавт.Лечение сердечно-сосудистых заболеваний и терапевтический ангио/миогенез. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Всероссийский XII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2006, №5, стр.266.

37. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Голухова Е.З., Ким А.И. и соавт.Клеточные и генные технологии в кардиохирургии. Поиск наиболее безопасных, но эффективных подходов. Всероссийская научно-практическая конференция и выставочная экспозиция «Высокие медицинские технологии», 25-26 сентября 2007 года, стр.114.

38. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Серов Р.А., Чудиновских Ю.А. Резидентные стволовые клетки миокарда: роль в клеточном гомеостазе миокарда и потенциально возможные направления их применения в лечении сердечной недостаточности. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 297.

39. Бокерия Л.А., Голухова Е.З, Чигогидзе Н.А., Асланиди И.П., Еремеева М.В., Никитина Т.Г., Какучая Т.Т., Шурупова И.В., Волковская И.В., Свободов А.В. Результаты клинических исследований с использованием клеточных технологий в лечении пациентов с застойной сердечной недостаточностью. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 296.

40. Бокерия Л.А., Демидова О.А., Еремеева М.В., Аракелян В.С. Использование стимуляторов ангиогенеза в лечении хронической ишемии нижних конечностей. Всероссийский XIII съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2007, №6, с. 296.

41. L. Bockeria., M. Eremeeva, T. Suchacheva, J. Chudinovskikh.Resident human cardiac stem cells: role in cardiac cellular homeostasis and in different heart diseases. Baltic Summer School 2008: Genetic and clinical aspects of arrhythmias. Abstract book.

42. Бокерия Л.А., Еремеева М.В., Серов Р.А., Чудиновских Ю.А. Резидентные стволовые клетки миокарда: роль в клеточном гомеостазе миокарда и потенциально возможные направления их применения в лечении сердечной недостаточности. Всероссийский XIV съезд кардиохирургов. Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». 2008, стр.290.

43. Еремеева М.В. Возможности применения стволовых клеток и клеток-предшественников для стимуляции реваскуляризации и регенерации органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов, октябрь 2009, принята к печати.

Размещено на Allbest.ru