Фармакологическая модуляция сигнальной функции Na+,K+-АТФазы

В концентрации 10^-6 М строфантин К практически полностью угнетал рост всех исследуемых тканей. В дозах 10^-7 М и 10^-8 М ингибирующее рост действие строфантина К было менее выражено. В концентрации 10^-11 М строфантин К на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных нейронов практически не влиял и недостоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сетчатки. Впервые обнаружено, что строфантин К в концентрации 10^-13 М вызывал достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов и почти не влиял на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных нейронов. Достоверное стимулирующее действие по отношению к эксплантатам ткани сердца препарат проявлял в концентрации 10^-14 М и ниже. Таким образом, были обнаружены трофические свойства строфантина К. Действие препарата на рост эксплантатов исследуемых тканей, также как в случае с оуабаином, было дозозависимым и тканеспецифичным.

По отношению к ткани сердца дигоксин проявлял выраженное ингибирующее действие во всех исследуемых концентрациях. Дигоксин (10^-6 М) почти полностью блокировал рост нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов сетчатки. При введении в питательную среду сердечного гликозида в концентрациях 10^-7 М и 10^-8 М наблюдали достоверное угнетающее рост исследуемых тканей действие. В концентрации 10^-9 М дигоксин незначительно угнетал рост эксплантатов ткани сетчатки. Введение в питательную среду дигоксина (10^-10 М) на рост эксплантатов не влияло. Впервые обнаружено, что дигоксин в концентрации 10^-11 М достоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сетчатки и практически не влиял на рост нейритов.

Результаты, полученные при изучении влияния строфантина К и дигоксина на рост эксплантатов ткани сердца, нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сетчатки, подтвердили предположение об участии Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции роста эксплантатов исследуемых тканей. Влияние сердечных гликозидов было тканеспецифичным и дозозависимым. Необходимо отметить, что используемые концентрации дигоксина, строфантина К и оуабаина сопоставимы с концентрациями эндогенных дигиталисоподобных факторов в плазме крови. Проведенные исследования показали, что эксплантаты ткани сердца, сенсорные нейроны и эксплантаты сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов более чувствительны к оуабаину, чем строфантину К и дигоксину.

Результаты экспериментов также свидетельствовали о том, что Na⁺,K⁺-АТФаза (по-видимому, б₃-изоформа ее б-субъединицы) оказывает тонкое регуляторное действие на рост и пролиферацию клеток исследуемых тканей в эмбриональный период онтогенеза, выполняя функцию трансдуктора сигнала.

В части экспериментов оценивали возможный механизм модуляции трансдукторной функции Nа⁺,К⁺-АТФазы молекулой оуабаина.

С помощью квантовохимических расчетов проведен полный конформационный анализ хелатных комплексов молекулы оуабаина с Са²⁺ в стехиометрии 1:1. В первом случае катион образует координационные связи с пятью атомами кислорода О¹, О³, О⁵, О¹⁹ и О^5', захватывая атомы кислорода стероидного кольца и рамнозильного остатка. Во втором случае ион Ca²⁺ связан с тремя атомами кислорода О¹, О¹¹ и О¹⁹ стероидного кольца (Рогачевский И.В. и др., 2008). Возможность модуляции сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы комплексом оуабаин-Са исследовали в экспериментальных условиях на эксплантатах ткани сердца и спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов. Влияние хелатора ионов Ca²⁺ ЭГТА на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов оценивали в диапазоне концентраций от 10^-2 М до 10^-5 М. При введении в питательную среду ЭГТА в концентрации 10^-3 М наблюдали достоверное угнетение степени роста, как эксплантатов ткани сердца, так и нейритов сенсорных ганглиев. ИП эксплантатов был ниже контрольного значения в среднем на 45,5%. При культивировании сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сердца в среде, содержащей ЭГТА (10^-3 М) и оуабаин (10^-8 М), наблюдали почти полное снятие ингибирующего действия оуабаина. ИП эксплантатов сенсорных ганглиев и ткани сердца незначительно отличался от контрольного значения. Стимулирующий эффект оуабаина (10^-10 М) при культивировании эксплантатов ткани сердца в среде, содержащей оуабаин (10^-10 М) и ЭГТА (10^-3 М) также отсутствовал. ИП экспериментальных эксплантатов практически не отличался от контроля. Для того чтобы оценить вклад рамнозильного остатка молекулы оуабаина в способность гликозида модулировать сигнальную функцию Na⁺,K⁺-АТФазы в аналогичных экспериментальных условиях был исследован оуабагенин в концентрациях от 10^-4 до 10^-9 М. Гликозид регулировал рост эксплантатов ткани сердца и спинальных ганглиев дозозависимо. В концентрации 10^-5 М оуабагенин достоверно угнетал рост нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сердца в среднем на 45% по отношению к контролю. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что чувствительность Na⁺,K⁺-АТФазы нейритов сенсорных нейронов (Пеннияйнен В.А. и др., 2003) и кардиомиоцитов к оуабагенину гораздо ниже, чем к оуабаину. Действие оуабагенина, в отличие от оуабаина, не было тканеспецифичным. Со структурно-химической точки зрения оуабагенин является агликоном оуабаина. Указанные молекулы различаются только присутствием рамнозильного остатка в положении 3в. Чувствительность аминокислотной последовательности Na⁺,K⁺-АТФазы рецептирующей сердечные гликозиды значительно повышается при наличии в атакующей молекуле рамнозильного остатка.

Отдельная часть работы была посвящена выявлению трофических и нейротрофических свойств производной гамма-пирона коменовой кислоты. Коменовую кислоту добавляли в питательную среду в диапазоне концентраций от 10^-6 М до 10^-10 М. Коменовая кислота (10^-6 М) достоверно угнетала рост эксплантатов ткани сетчатки на 24%. На рост нейритов коменовая кислота в этой концентрации действия не оказывала. Влияние коменовой кислоты в концентрации 10^-6 М на рост эксплантатов ткани сердца оказалось противоположным. В этой концентрации субстанция достоверно стимулировала рост эксплантатов ткани сердца на 40% по отношению к контролю. На фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружено, что в зоне роста присутствуют кардиомиоциты и небольшое количество фибробластов. В концентрации 10^-7 М коменовая кислота угнетала рост эксплантатов ткани сетчатки незначительно, ИП эксплантатов был ниже контрольного значения на 17,5%. В этой дозе (10^-7 М) субстанция достоверно стимулировала рост нейритов сенсорных нейронов. ИП был выше контрольного значения на 23%. Величина ИП эксплантатов ткани сердца в аналогичных условиях культивации была незначительно выше контрольного значения на 17% (p>0,05). Добавление в питательную среду коменовой кислоты в концентрации 10^-8 М приводило к достоверной стимуляции роста эксплантатов ткани сетчатки и нейритов сенсорных нейронов на 18% и 81%, соответственно. Зона роста содержала нейриты сенсорных нейронов. На рост эксплантатов ткани сердца субстанция в этой концентрации влияния не оказывала. При введении в питательную среду коменовой кислоты в концентрации 10^-10 М наблюдали достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки. ИП был выше контрольного значения на 58%. На фиксированных препаратах в зоне роста присутствовали клетки пигментного эпителия сетчатки, палочки, колбочки, ганглиозные клетки. Рост нейритов сенсорных нейронов сохранялся на прежнем уровне. На рост эксплантатов ткани сердца препарат в этой концентрации не влиял. Проведенные исследования показали, что производная гамма пирона коменовая кислота обладает нейротрофическими и трофическими свойствами. Действие субстанции является дозозависимым и тканеспецифичным. Наибольшую тропность коменовая кислота, как и оуабаин, проявила в отношении регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки.

В части экспериментов в питательную среду вместе с коменовой кислотой в эффективной для каждого вида ткани концентрации добавляли оуабаин (10^-8 М). При культивировании эксплантатов исследуемых тканей в среде, содержащей коменовую кислоту в эффективной для каждой ткани концентрации и оуабаин (10^-8 М), оказалось, что коменовая кислота устраняла ингибирующее действие оуабаина. ИП экспериментальных эксплантатов ничем не отличался от контрольного значения. Последнее свидетельствует о том, что коменовая кислота модулирует сигнальную функцию Nа⁺,К⁺-АТФазы не прямо, а опосредованно, через рецептор.

Дальнейшие исследования заключались в изучении фармакологической активности аноцептина - препарата, созданного на основе коменовой кислоты. Лекарственная форма аноцептина представляет собой 1% и 2% раствор для внутривенных инъекций, каждая ампула содержит 10 или 20 мг коменовой кислоты в 1 мл.

2.3 Оценка обезболивающего действия препарата «Аноцептин» и анальгина в условиях теста «горячая пластина»

2.5 Исследование возможности формирования физической зависимости от применения препарата «Аноцептин» с помощью метода стимуляции латерального гипоталамуса

В опытах на крысах оценивали реакцию СС структур мозга, входящих в систему положительного подкрепления гипоталамуса. Аноцептин угнетал реакцию СС латерального гипоталамуса в дозах 1, 10 30 мг/кг. Внутрибрюшинная инъекция препарата достоверно снижала вознаграждающий эффект СС. Действие аноцептина было пропорционально его дозе. В дозе 1 мг/кг препарат практически не влиял на реакцию СС. Аноцептин в дозе 10 мг/кг угнетал реакцию СС. Число нажатий на педаль было ниже контрольного значения на 12%. Максимальный эффект обнаружен при инъекции аноцептина в дозе 30 мг/кг. Препарат уменьшал число нажатий на педаль на 40% по сравнению с контролем. Ослабление реакции СС, вызванное препаратом, проявлялось сразу после его инъекции. Таким образом, обнаружено, что аноцептин не вызывает усиления реакции СС, а, наоборот, подавляет ее. Такой же подавляющий эффект исследуемого препарата на реакцию СС был получен при повторных его инъекциях. Исследование показало, что физическая зависимость от введения препарата «Аноцептин отсутствует.

2.6 Эффективность препарата «Аноцептин» при лечении экспериментальных туберкулезных хориоретинитов

Поскольку коменовая кислота, действующая субстанция препарата «Аноцептин», наибольшую тропность проявила в отношении тканей нейронального происхождения, для экспериментов по дальнейшему исследованию фармакологической активности препарата «Аноцептин» была выбрана модель туберкулезного хориоретинита (Беллиндир Э.Н., 1971). Эта модель объединяет в себе компонент воспаления и элементы деструктивных изменений в клетках ткани сетчатки.

2.6.1 Действие «Аноцептина» на M.tuberculosis in vitro.

Антимикробным действием на M. tuberculosis препарат «Аноцептин» в дозах от 200 до 1,56 мкг/мл не обладал.

Предварительные исследования показали, что аноцептин при парабульбарном введении не проявляет раздражающих свойств, не оказывает негативного влияния на структуры переднего отрезка глаза. Инъекции препарата были безболезненными.

2.6.2 Результаты эффективности лечения экспериментальных туберкулезных хориоретинитов по офтальмоскопическим признакам

Эффективность лечения экспериментальных хориоретинитов оценивали по офтальмоскопическим признакам и гистоморфологической картине. Эффективность проводимой терапии в основной серии для размера очага составила 25%, для уровня проминенции 130%, для уровня экссудации 124%. В контрольной серии значения этих параметров составили 4%, 53% и 109%, соответственно. У животных контрольной серии сохранялись помутнения и инфильтрация в стекловидном теле. Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат «Аноцептин» достоверно повышает эффективность ПТТ по всем исследуемым параметрам и сочетается с антибиотиками. Для проявления противовоспалительных свойств необходим курс препарата. Эффект, в отличие от аналгетического, развивается не сразу.

2.6.3 Результаты гистологических исследований тканей глазного дна экспериментальных животных с туберкулезными хориоретинитами

Анализ 164 гистоморфологических срезов, полученных с 40 глаз кроликов опытной и контрольной серий, показал, что во всех глазах присутствовали туберкулезные гранулемы в хориоидее, которые располагались рядом с диском зрительного нерва или миелиновым волокном. Изменения сетчатки просматривались на препаратах всех глаз; основные изменения касались вершины очага, где сетчатка была частично, либо полностью разрушена, с деструкцией пигментного эпителия. В 33 % случаев в основной серии исследования пигментный эпителий имел свою нормальную структуру даже на периферии очага, а в 90% - в перифокальной зоне, что не наблюдалось ни в одном случае контрольной серии. В гистологических срезах контрольной серии определялась деструкция пигментного эпителия с выходом пигмента из клеток.

Изучение фармакологической активности препарата «Аноцептин» in vivo позволило выявить и оценить его болеутоляющее действие и обнаружить противовоспалительные и трофотропные свойства.

Для того чтобы рекомендовать препарат для применения в клинических условиях, необходимо было оценить безопасность его действия.

2.7 Токсикометрия при изучении острой токсичности

Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления, а также данные некропсии позволили отнести лекарственную форму препарата «Аноцептин» к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (Hodge H., et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.; Сидоров K.K. 1973). Индексы летальных доз, выявленные в исследовании на мышах-самцах: ЛД₅₀ = 1064100 мг/кг, ЛД₁₆ = 65660 мг/кг; ЛД₈₄ = 1440110 мг/кг. Индексы летальных доз для мышей-самок были несколько выше: ЛД₅₀ =1190100 мг/кг; ЛД₁₆ = 90080 мг/кг; ЛД₈₄ = 1570110 мг/кг.

Дозозависимые летальные эффекты препарата «Аноцептин», выявленные в исследовании на крысах, наблюдались при значениях ЛД₅₀ = 1300150 мг/кг; ЛД₁₆ = 45050 мг/кг; ЛД₈₄ = 1850200 мг/кг. Половых различий не обнаружено.

Состояние животных, переживших острую интоксикацию, свидетельствовало о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические для человека в десятки раз.

В дальнейших экспериментах оценивали безопасность препарата при хроническом внутривенном введении.

2.8 Исследование безопасности препарата «Аноцептин» при хроническом 90-дневном внутривенном введении

2.9 Экспериментальные исследования по изучению эмбриотоксического действия препарата «Аноцептин» и его влияния на репродуктивную функцию животных

2.9.1 Результаты изучения эмбриотоксического действия препарата «Аноцептин»

На первом этапе исследования гибели или других признаков токсикоза у крыс-самок экспериментальных и контрольной групп не обнаружено. Достоверных различий в темпах прироста массы тела беременных самок опытных и контрольной групп также не было.

Инъекции препарата «Аноцептин» в дозе 50 мг/кг в течение всей беременности не вызвали достоверного увеличения пред- и постимплантационной смертности. Внешний осмотр плодов, изучение состояния внутренних органов и скелета каких-либо аномалий и отставания в росте и развитии плодов всех исследуемых групп не выявил.

На втором этапе исследования самкам экспериментальных групп вводили аноцептин в дозах 5 и 50 мг/кг с 1 по 20 дни беременности. Темпы прироста массы тела беременных крыс в изучаемых группах достоверно не отличались, гибели самок не было. Отклонения в протекании беременности, родов, заботе о потомстве в исследуемых группах отсутствовали.

Среднее количество плодов на одну самку и соотношение крысят по полу в экспериментальных и контрольной группах достоверно не отличалось. Проведенные исследования показали, что сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, опускание семенников и открытия влагалища в контрольной и 2-х экспериментальных группах достоверно не различаются. Тератогенных свойств у препарата не обнаружено. Изучение скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания не выявило различий между потомством экспериментальных и контрольной групп. Исследование эмоционально-двигательного поведения 30-дневного потомства крыс в тесте «открытое поле» показало, что длительность латентного периода, число пересеченных квадратов, количество подъемов на задние лапы и заглядываний в отверстия, число актов груминга, эмоциональный фон в контрольной и экспериментальных группах не различались.

Проведенные исследования показали, что эмбриотоксического действия у препарата «Аноцептин» нет.

2.9.2 Результаты изучения влияния препарата «Аноцептин» на репродуктивную функцию

В период введения препарата «Аноцептин» в дозе 50 мг/кг не обнаружено снижения темпов прироста массы тела, изменений в поведении, гибели животных ни в одной из изучаемых групп самцов или самок. При вскрытии самок экспериментальных групп не выявлено повышения уровней пред- и постимплантационной смертности по сравнению с соответствующими контрольными группами. Внутривенное введение аноцептина в дозе 50 мг/кг не влияло на репродуктивную функцию самцов и самок крыс их плодовитость, а также пре- и постнатальное развитие, полученного потомства. Индекс беременности в изучаемых группах достоверно не отличался. Таким образом, были получены экспериментальные доказательства того, что аноцептин при внутривенном применении не влияет на репродуктивную функцию экспериментальных животных.

Поскольку с помощью метода органотипической культуры ткани было обнаружено, что действующая субстанция препарата «Аноцептин» коменовая кислота регулирует процессы роста и пролиферации клеток разных тканей, далее исследовали влияние препарата на рост трансплантируемых опухолей.

2.10 Влияние препарата «Аноцептин» на рост трансплантируемых опухолей

Исследования на мышах и крысах показали, что препарат «Аноцептин» не влияет на рост трансплантируемых опухолей - рака Эрлиха и лимфосаркомы Плисса.

Чтобы оценить может ли внутривенное введение аноцептина вызывать повышение температуры тела, было проведено специальное исследование.

2.11 Исследование пирогенности

При внутривенном введении аноцептина здоровым людям изменение концентрации действующего вещества - коменовой кислоты - в плазме крови на основном участке описывается 2-х или 3-х частевой зависимостью (рис.1 и рис.2). Фаза распределения протекает быстро. В течение первых 10 минут концентрация снижается примерно в 4-5 раз, а в течение первого часа - в 200 раз. После 1-го часа, по-видимому, наступает фаза истинной элиминации с периодом полувыведения порядка 2.0-2.5 ч. MRT - лежит в диапазоне от 0,5 до 1,0 час. Клиренс - около 1000 мл/кг/ч. Основная часть препарата, не выводится, а матаболизируется и утилизируется в самом организме. Возможными метаболитами могут быть комплексные соединения с катионами металлов. Характер полученных кинетических кривых заставляет предположить, что фармакокинетика аноцептина определяется сочетанием кинетических и метаболических процессов. При высоких концентрациях основную роль играют распределение и выведение, а при низких - метаболизм. Следует отметить высокий уровень индивидуального разброса, особенно на участке, на котором можно предполагать доминирующую роль метаболических процессов. Возможно, именно эти процессы определяют судьбу препарата в организме в долгосрочном плане.

При изучении безопасности обнаружено, что препарат «Аноцептин» в исследуемых дозах (10, 20, 60мг/в сутки) при рекомендованном курсе лечения (10 дней) безопасен. Аноцептин не обладает раздражающим действием в местах инъекций, аллергических реакций в ходе исследования не выявлено. Препарат не оказывает негативного действия на нервную, пищеварительную, дыхательную, сердечно-сосудистую, выделительную, репродуктивную системы (Поляков Ю.И. и др., 2007; Polyakov Yu. I., et al., 2008).

Особое внимание было уделено клинической оценке возможных проявлений развития физической и психической зависимости. При структурированной беседе и клиническом обследовании ни у одного добровольца признаков психофизической зависимости, наблюдаемых при приеме наркотических аналгетиков, выявлено не было. Результаты исследования подтвердили данные доклинического исследования об отсутствии у препарата наркогенного потенциала (Поляков Ю.И. и др., 2007; Polyakov Yu. I., et al., 2008).

Рис. 1. Испытуемый № 3

Рис. 2. Испытуемый № 7

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать новое перспективное направление - создание аналгетических средств, механизм действия которых основан на фармакологической модуляции сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы нейронов ЦНС. Тест-системой для исследований в экспериментах in vitro, осуществляемых с помощью patch-clamp метода, стал ансамбль, состоящий из 3-х (Крылов Б.В. и др., 1999) или 2-х звеньев. В первом случае ноцицептивные сигналы при прохождении через систему, включающую в себя опиоидоподобный рецептор - Na⁺,K⁺-АТФазу (трансдуктор) - Na_v1.8-канал (эффекторное звено) можно регулировать рецептор-опоредованно при помощи коменовой кислоты. Во втором случае ансамбль составляют два звена - Na⁺,K⁺-АТФаза и Na_v1.8-канал. Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, регулирует ноцицептивные сигналы трансдуктор-опосредованно. Впервые на сенсорных нейронах ЦНС млекопитающих удалось получить доказательства того, что Na⁺,K⁺-АТФаза одновременно может выполнять функции рецептора к сердечным гликозидам и трансдуктора ноцицептивных сигналов, функционируя в ансамбле с Na_v1.8-каналом. Участие Na⁺,K⁺-АТФазы в модуляции ноцицептивных сигналов нашло свое подтверждение в условиях формалинового теста. Анализ полученных данных показал, что физиологическая роль эндогенного оуабаина заключается в трансдуктор-опосредованной регуляции ноцицептивной информации на разных этапах онтогенеза, при стрессе и развитии воспалительного процесса.

Исследование участия Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции роста и развития клеток разных тканей в эмбриональный период онтогенеза подтвердило, что сигнальную функцию фермента также можно модулировать двумя путями. В первом случае фармакологическими агентами были оуабаин, строфантин К, дигоксин. Сочетание теоретических квантовохимических расчетов и метода органотипической культуры ткани позволило доказать, что наличие в молекуле оуабаина рамнозильного остатка определяет тканеспецифичность сердечного гликозида, повышает аффинность Na⁺,K⁺-АТФазы к этому стероиду и увеличивает вероятность модуляции сигнальной функции фермента. Во втором случае сигнальную функцию фермента рецептор-опосредованно модулировала производная гамма-пирона коменовая кислота. Наибольшую тропность исследуемые вещества проявили в отношении регуляции роста и пролиферации клеток тканей нейронального происхождения. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что б₃-изоформа б-субъединицы Na⁺,K⁺-АТФазы оказывает тонкое регуляторное действие на рост и пролиферацию клеток возбудимых тканей в эмбриональный период онтогенеза, выполняя функцию трансдуктора сигнала.

Благодаря проведенным исследованиям разработан оригинальный лекарственный препарат с аналгетической активностью, механизм действия которого связан с рецептор-опосредованной модуляцией сигнальной функции фермента. Доказана его безопасность и эффективность. Взаимодействие лиганда (хелатного комплекса натриевой соли коменовой кислоты) с рецептором мембраны ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев служит сигналом для активации ансамбля: опиоидоподобный рецептор - Na⁺,K⁺-АТФаза (трансдуктор) - Na_v1.8-канал (эффекторное звено). Аноцептин проникает через гематоэнцефалический барьер, аналгетический эффект наступает через 4 минуты после попадания препарата в кровоток и сохраняется до 6 часов. Обнаружены противовоспалительный и трофотропный эффекты препарата. Эти эффекты отставлены во времени и развиваются постепенно после курса инъекций аноцептина. Доказано, что применение препарата «Аноцептин» не вызывает активации системы положительного подкрепления латерального гипоталамуса. При длительном парентеральном введении аноцептина не отмечается развитие лекарственной зависимости, наркогенный потенциал у препарата отсутствует. На модели экспериментального туберкулезного хориоретинита показано, что препарат «Аноцептин» достоверно повышает эффективность стандартной терапии, хорошо сочетается с антибиотиками и позволяет сохранить клетки пигментного эпителия сетчатки в зоне параспецифического воспаления.

Аналгетические свойства аноцептина реализуются за счет снижения потенциалочувствительности активационного воротного устройства Na_v1.8-канала. Проведенные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать новое перспективное направление - создание аналгетических средств, обладающих противовоспалительными свойствами, механизм действия которых основан на фармакологической модуляции сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы.

ВЫВОДЫ

1. Оуабаин в концентрациях, сопоставимых с эндогенными, модулирует сигнальную функцию Na⁺,K⁺-АТФазы. Наличие рамнозильного остатка в молекуле гликозида определяет его тканеспецифичность и повышает аффинность Na⁺,K⁺-АТФазы мембраны клеток разных типов к оуабаину.

2. При трансдуктор-опосредованной модуляции оубаином Na⁺,K⁺-АТФазы происходит снижение потенциалочувствительности активационного воротного устройства Na_v1.8 каналов мембраны ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев, что свидетельствует о способности гликозида регулировать ноцицептивные сигналы.

3. Сигнальная функция Na⁺,K⁺-АТФазы заключается в обеспечении модуляции процесса кодирования ноцицептивных сигналов ансамблем: опиоидоподобный рецептор - Na⁺,K⁺-АТФаза - Na_v1.8-канал (либо Na⁺,K⁺-АТФаза - Na_v1.8-канал) мембраны ноцицептивных нейронов спинальных ганглиев и регуляции тканевого моделирования на различных этапах онтогенеза.

4. При регуляции процессов роста и пролиферации кардиомиоцитов и клеток ткани сетчатки и роста нейритов сенсорных нейронов в эмбриональный период онтогенеза оуабаин в эндогенных концентрациях по эффективности превосходит строфантин К, дигоксин, оуабагенин и сопоставим с коменовой кислотой.

5. По своему действию на потенциалочувствительность активационного воротного устройства медленных натриевых каналов мембраны ноцицептивных нейронов коменовая кислота близка к влиянию сердечного гликозида оуабаина.

6. На основе производной гамма-пирона коменовой кислоты создан препарат «Аноцептин». Инъекция аноцептина мышам в тесте «горячая пластина» и крысам в формалиновом тесте оказывает выраженное болеутоляющее действие. Аналгетический эффект препарата проявляется через 4-6 минут после парентерального введения и сохраняется до 6 часов. В дозах, оказывающих аналгетическое действие, аноцептин угнетает реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса крысы, что свидетельствует об отсутствии у животных лекарственной зависимости от препарата. Терапевтический индекс аноцептина в экспериментах на крысах соответствует 64. У препарата отсутствуют канцерогенные и тератогенные свойства. Аноцептин апирогенен.

7. После парабульбарного введения аноцептина в течение 10 дней проявляется противовоспалительный эффект препарата. В опытах in vitro аноцептин не обнаружил антимикробной активности в отношении микобактерий туберкулеза. Использование аноцептина при комплексной химиотерапии экспериментального туберкулезного хориоретинита сопровождается повышением эффективности лечения за счет уменьшения воспалительных явлений в очаге поражения. Аноцептин, оказывая активирующее влияние на трофические процессы в сетчатке, на фоне комплексной противотуберкулезной терапии экспериментальных туберкулезных хориоретинитов способствует сохранению клеток пигментного эпителия как в зоне параспецифического воспаления (в 90%), так и в области очага (в 33%).

8. Безопасность действия аноцептина в терапевтических дозах подтверждена в клиническом исследовании. Препарат в дозах, вызывающих аналгетическое действие, у здоровых людей не оказывает побочного влияния на нервную, пищеварительную, дыхательную, сердечно-сосудистую, выделительную системы, не обладает раздражающим действием в местах инъекций. Отсутствует психофизическая зависимость при длительном приема препарата.

9. Распределение препарата при внутривенном введении у здоровых добровольцев описывается 2-х или 3-х компартментной зависимостью. Аноцептин быстро исчезает из системного кровотока, в течение первых 10 минут концентрация препарата снижается в 4-5 раз. Среднее время присутствия препарата в организме лежит в диапазоне от 0,5 до 1,0 час. Клиренс - около 1000 мл/кг/ч. Основная часть препарата, не выводится, а матаболизируется и утилизируется в самом организме.

10. На основе изучения влияния соединений, изменяющих активность Na⁺,K⁺-АТФазы, разработана новая методология поиска и изучения обезболивающих препаратов, механизм действия которых основан на модуляции сигнальной функции этого фермента.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ПАТЕНТЫ

1. Крылов Б.В., Лопатина Е.В. «Синтетическое анальгетическое средство и способ лечения на основе этого средства» патент РФ № 2322977 приоритет от 01.08. 2006 МПК А61К031/351А61Р029/02 дата публикации 27.04.2008. Бюллетень изобретений. № 12- 2008. - С. 1-30.

2. Крылов Б.В., Лопатина Е.В «Анальгетическое средство и способ лечения болевого синдрома различной этиологии с помощью этого средства» патент РФ № 2367432 приоритет от 27.09.2007 МПК А61КА61Р дата публикации 20.09.2009. Бюллетень изобретений. - 2009. № 26 - С.1-25.

3. Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Крылов Б.В. «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства» патент РФ № 2362554 приоритет от 27.09.2007 МПК А61КА61Р дата публикации 27.07.2009. Бюллетень изобретений. № 21 - 2009. - С. 1-27.

СТАТЬИ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка А.А. Исследования участия Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани сердца в органотипической культуре. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. Т. 140. № 8. С. 150-153.

Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование роли Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. Т. 139, № 2. С. 147-160.

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Цырлин В.А. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов на роста эксплантатов ткани сердца. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2005. Т. 91. № 11. С.1299-1304.

Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Цырлин В.А., Крылов Б.В. Влияние ингибиторов натриевого насоса на рост нейритов сенсорных ганглиев. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2008. Т.94. №3. С. 326-330.

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Рогачевский И.В., Крылов Б.В. Фармакологическая модуляция трансдукторной функции Na⁺,K⁺-АТФазы Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т.146. №10. С. 416-418.

Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Пеннияйнен В.А., Виноградова Т.В. Участие сердечных гликозидов в регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. Т.146. №12. С. 651-653.

Рогачевский И.В., Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Крылов Б.В. Неэмпирический конформационный анализ хелатных комплексов молекулы оуабаина с Са²⁺ и возможный механизм модуляции трансдукторной функции Na⁺, K⁺-АТФазы. Журнал общей химии. 2008. Т.78. Вып. 10. С. 1673-1683.

Penniyainen V. A., Lopatina E. V.,. Tsyrlin V. A, Krylov B. V.The effects of sodium pump inhibitors on sensory ganglion neurite growth //Neurosci. and Behav. Physiol. 2009. Vol.39. N. 3. - P. 301-304.

Кипенко А.В., Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Рогачевский И.В., Цырлин В.А., Крылов Б.В. Роль оуабаина в регуляции роста тканей разных типов. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2009. Т.95. №2. С. 137-142.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Шевцова Е.С. Роль Na⁺,K⁺-АТФазы, как регулятора процессов роста в клетках разных типов. Конгресс ассоциации кардиологов стран СНГ «Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии», СПб. 2003 г. Научно-практический ж. Кардиология СНГ Т.1. С. 173.

Крылов Б.В., Щеголев Б.Ф., Лопатина Е.В., Буткевич И.П., Отеллин В.А. Новый метод купирования опиатного абстинентного синдрома. Роль медленных натриевых каналов. Фундаментальные науки - медицине. Москва (10-11 декабря) 2003. С.39-40.

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Зайка А.А. Исследование роли сердечных гликозидов в регуляции роста кардиомиоцитов. III Всероссийская с международным участием Школа-конференция по физиологии кровообращения, Москва. 2004. С.55-56.

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А. Участие сердечных гликозидов в регуляции роста кардиомиоцитов. XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 442-443.

Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В. Исследование участия Na⁺, K⁺-АТФазы в регуляции роста клеток разных типов в органотипической культуре ткани. Сборник статей Международная конференция, посвященная юбилею И.П. Павлова, Минск. 2004. С. 298-299.

Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Хокканен В.М., Крылов Б.В. Влияние оуабаина и норадреналина на рост клеток сетчатки в органотипической культуре ткани. Сборник статей конференции, посвященной 60-летию Института глазных болезней им. Гельмгольца, Москва. 2004. С.25-26.

Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Хокканен В.М., Крылов Б.В. 3 изоформа Na/K-АТФазы модулирует процессы роста клеток сетчатки. XIX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 90. № 8. С. 331-332.

Карецкий А.В., Пеннияйнен В.А., Лопатина Е.В., Хокканен В.М., Крылов Б.В. Перспективы лечения осложнений хориоретинитов, в том числе туберкулезного характера. “Современные возможности диагностики и лечения витреоретинальной патологии”, Москва 27 мая 2004 года. Сб. науч. Статей по материалам науч.-пр. конф. - М.: "Экономика", 2004. С. 49-50.

Карецкий А.В., Лопатина Е.В., Крылов Б.В., Пеннияйнен В.А., Хокканен В.М. Влияние Q-134 на рост клеток сетчатки в органотипической культуре ткани // Клеточные технологии в офтальмологии: регенеративная медицина и трансплантация тканей в офтальмологии: материалы международ. конф. - М., 2005. - С. 26-27.

Karetsky A.V., Lopatina E.V., Penniyaynen V.A. б3-izoform of Na⁺, K⁺-ATPase modulates process of cells growth in the chicken retina. Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects", Saint-Petersburg. 2005. P.30.

Lopatina E.V., Tsyrlin A.V. The influence of cardiac glycoside on the growth of explantat of cardiac tissue Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects" Saint-Petersburg. 2005. P.54-55.

Рогачевский И.В., Плахова В.Б., Лопатина Е.В., Буткевич И.П., Крылов Б.В. Принципы создания новых лекарственных препаратов: от молекулряной физиологии до клинического эффекта // Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности: Сб. трудов 2-й междунар. науч.-практ. конф. /Под ред. А.П.Кудинова и др.- Т.6. Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование. СПб.: Изд-во Политехн . Ун-та, 2006. С. 169-183.

Лопатина Е.В., Карецкий А.В., Пенниянен В.А., Хокканен В.М., Крылов Б.В. Моделирование процесса пролиферации клеток сетчатки теплокровных. Морфология. 2006. Т .129. №2. С .55.

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Крылов Б.В., Цырлин В.А. Na/Ka - АТФаза модулирует синтетические процессы в тканях разных типов. Физиологическое общество им И.П.Павлова. Съезд XX, Москва. 4-8 июня, 2007.- М.: Издат. дом «Русский врач», 2007. С.311-312.

Лопатина Е.В., Пеннияйнен В.А., Виноградова Т.В. Участие Na⁺, K⁺-АТФазы в регуляции роста ткани сетчатки в органотипической культуре. Всероссийская конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университета», Санкт-Петербург. 10-12 октября, 2007. С. 189.