Микробиологическая диагностика
Анализ организации лабораторной микробиологической службы. Характеристика основных методов выделения и идентификации бактерий, обнаружения вирусов, грибов и простейших. Консистенция колоний и особенности роста на среде, системы их идентификации.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 05.12.2017 |
| Размер файла | 2,2 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Индикаторные бумажки
Для изучения биохимической активности бактерий широко применяют системы индикаторных бумажек или наборы мультимикротестов.
Система индикаторных бумажек (СИБ) - набор дисков, пропитанных различными субстратами. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии. Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceaelll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37 0С.
Наборы мультимикротестов - пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и инкубируют при 37°С. На практике используют тесты RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.
Автоматические системы идентификации бактерий
Автоматические системы идентификации бактерий позволяют быстро (на 24-48 ч быстрее обычных методов) получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время наибольшее распространение получили системы типа Microscan и Vitek.
Системы Microscan. Используют турбидиметрические, колориметрические и флюоресцентные методы идентификации бактерий. Системы состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты. Грамположительные и грамотрицательные бактерии дифференцируют с помощью флюоресцирующих субстратов (время анализа - 2 ч). Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа - 4-6 ч). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков определяют по изменению оптической плотности. Система компьютеризирована и автоматически проводит все необходимые расчёты.
Системы Vitek. В этой системе применяют один тип планшетов с тридцатью лунками. В каждую лунку автоматически вносится суспензия бактерий с известной концентрацией микробных тел. Идентификация микроорганизмов (гемофилы, нейссерии, дрожжи и анаэробы) основана на турбидометрии реакционной среды в лунке. В зависимости от свойств микроорганизма время, необходимое для его идентификации, варьирует от 4-8 до 18 ч. Система полностью компьютеризирована и работает автоматически.
4. Методы идентификации нуклеиновых кислот
Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот (рис. 1-17). Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).
Метод гибридизации в растворах даёт наиболее быстрые результаты (рис. 1-18, А). Широкому внедрению метода препятствует проблема удаления не связавшихся нитей нуклеиновых кислот.
Метод гибридизации на твёрдой основе (рис. 1-18, Б) и его сэндвич - модификация (рис. 1-18, В) распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Основу метода ПЦР составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. Первоначально проводят отжиг - термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Затем среду охлаждают и вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции применяют синтетические праймеры - олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеоти-дов (например, дезоксинуклеотидтрифосфат), взаимодействующие с окончаниями последовательностей и образующие последовательности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную taq-полимеразу (по названию бактерии Thermus aquaticus), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; поскольку tag-полимераза термостабильна, то необходимость в её повторном внесении отсутствует (рис. 1-19). ПЦР позволяет получить большие количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза. Метод ПЦР лежит также в основе ДНК-идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и пр.
Серологические методы
Классические серологические реакции применяют для выявления бактериальных AT, а также для выявления Аг, особенно для идентификации бактериальных Аг. Среди современных методов наибольшее распространение нашли методы твердофазного ИФА и латекс-агглютинации.
Аллергологические методы
Сенсибилизирующей активностью обладает ограниченное количество бактериальных Аг. Поэтому метод кожных проб применяют лишь при диагностике туберкулёза, сапа, мелиоидоза, бруцеллёза и туляремии.
Биологические методы
Выделение патогенных бактерий от заражённых животных имеет большую диагностическую ценность, особенно при контрольном применении иммунных сывороток. Цель подобных манипуляций - уменьшение времени проведения бактериологических исследований.
При диагностике инфекций, вызванных эффектами токсина (например, ботулизма или сибирской язвы), материал, предположительно содержащий возбудитель и токсин, помещают в физиологический раствор, а затем фильтруют через бумажные фильтры, натёртые тальком (последний хорошо адсорбирует токсин). Смывами с фильтров заражают чувствительных животных.
При диагностике инфекций, обусловленных различными патогенными свойствами самого возбудителя, лабораторных животных заражают микробной взвесью.
Для диагностики бактериальных инфекций используют различных животных, так как проявляют видовую восприимчивость к различным этиологическим агентам.
Мыши чувствительны к пневмококкам, нейссериям, пастереллам, клостридиям, листериям, возбудителям сибирской язвы, туляремии, чумы, ботулизма, столбняка, коклюша и мелиоидоза
Крысы чувствительны к возбудителям туберкулёза (бычьего типа), мелиоидоза и др.
Морские свинки чувствительны к возбудителям туберкулёза (человеческого типа), дифтерии, сапа, чумы, бруцеллёза, туляремии, холеры, газовой гангрены, ботулизма, псевдотуберкулёза и др.
Кролики чувствительны к стафилококкам, стрептококкам, нейссериям, Mycobacterium bovis, возбудителям газовой гангрены, сибирской язвы, ботулизма, столбняка и др.
Кошки. Животных заражают стафилококками, возбудителями сапа, коклюша и др.
Обезьяны. Их заражают шигеллами, листериями, сальмонеллами, возбудителями мелиоидоза, коклюша и др.
Птицы. Кур и голубей используют для диагностики туберкулёза (птичьего типа), пастереллёза, риносклеромы и др.
5. Методы обнаружения вирусов
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
выделение и идентификацию возбудителя;
обнаружение и определение титров противовирусных AT;
обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала. При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия: образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя; материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований; образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной - при температуре - 50°С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя - "золотой стандарт" в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток - один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.
Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
Культуры органов
Не все виды клеток способны расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживающей ткани.
Куриные эмбрионы
Куриные эмбрионы (рис. 1-20) - практически идеальные модели для культивирования некоторых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирования и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбудители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распознавать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.
Заражение на хорион-аллантоисную мембрану. Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобождают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают отверстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, свободный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обработанный бактерицидами).
Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.
Заражение в аллантоисную полость. 10-суточные эмбрионы заражают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).
Заражение в желточный мешок. Используют 3~8-суточные эмбрионы, у которых в этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воздушном мешке
Наблюдение и учёт результатов. В качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими тканями на кусочки. Для выявления Рис. 1-20. Схематическое изображение характерных поражений на хорион - развивающегося куриного эмбриона.
Аллантоисной мембране удаляют скорлупу и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.
Животные модели
При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили клеточные культуры. Тем не менее, животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.
Идентификация вирусов
Качественное определение. Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических признаков, гибель и т.д.), куриных эмбрионах и на клетках (в культурах). Под воздействием конкретных вирусов возможно изменение морфологии, роста, репродукции клеток либо их разрушение. Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по цитопатическим эффектам (в том числе бляшкообразованию, тельцам включений), феномену гемадсорбции, "цветной реакции".
Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.
Бляшкообразование. "Бляшками" называют негативные колонии - участки разрушенных клеток, выглядящие как зоны просветления на монослоях клеток, покрытых слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).
Тельца включений. Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований - скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).
Отсутствие цитопатического эффекта. Некоторые вирусы (например, вирус краснухи) не проявляют цитопатического эффекта. Их можно выявлять по интерференции другого вируса, способного вызывать дегенерацию заражённых клеток.
Феномен гемадсорбции. Многие заражённые вирусами клетки приобретают способность сорбировать на своей поверхности различные эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатического эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности.
"Цветная реакция". В культуральную среду, используемую для поддержания клеток, вносят индикатор. Рост клеток сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом рН среды и изменением окраски индикатора. Заражение культур вирусом резко ингибирует клеточный метаболизм, и среда сохраняет первоначальный цвет.
Экспресс-диагностика. Для быстрой идентификации вирусной инфекции разработаны многочисленные методы экспресс-диагностики, основанные на обнаружении вирусных Аг. Например, для ранней диагностики ВИЧ-инфекции широко используют ИФА, выявляющий поверхностные Ar вируса.
Количественное определение
Количественное определение вирусов проводят двумя путями - изучением инфекционности и количественным определением вирусных Аг. Определение титра инфекционности вирусов в значительной степени зависит от метода количественного исследования; у бактериофагов отношение инфекционность-частица составляет приблизительно 1 (то есть каждая вирусная частица способна вызвать инфекцию), для вирусов животных данное отношение составляет 1: 10 (иногда выше из-за вирусингибирующего действия факторов резистентности).
Определение инфекционности вирусов. Наиболее доступная форма количественного определения - подсчёт числа вирусных "бляшек". Прямые тесты на инфекционность применяют для установления инфекционной дозы (ID) или летальной дозы (LD) изучаемого вируса (обычно выражают в lg). ID50 - разведение, инфицирующее 50% клеток; LD50 - разведение, убивающее 50% поражённых клеток или животных.
Выявление вирусных Аг и вирусных частиц. Наиболее распространённый метод - реакция количественной гемагглютинации. Метод основан на способности вирусов сорбироваться на поверхности эритроцитов животных и человека. Количественную электронную микроскопию применяют для подсчёта общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом объекте (например, культуральной жидкости).
Морфология вирусов
Изучение морфологии вирусов возможно лишь при помощи электронной микроскопии, однако чаще всего этот метод недоступен из-за отсутствия столь дорогого и сложного прибора. Более того, многие возбудители морфологически сходны, что снижает ценность этого метода. Наиболее распространён метод микроскопии содержимого везикул и тканевых экстрактов, обработанных красителями (негативное контрастирование), с последующим подсчётом ДНК - или РHK-содержащих вирусов. Электронная микроскопия позволяет быстро обнаружить орто- и парамиксовирусы в отделяемом дыхательных путей, герпесвирусы в жидкости везикул и ротавирусы в фекалиях.
Серологические методы идентификации
При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.
РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.
Торможение гемагглютинации. РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.
Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.
Прямая иммунофлюоресценция. Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклональных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать не связавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).
Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.
Выявление противовирусных AT в сыворотке
Более простой и доступный подход - выявление противовирусных AT в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.
Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать AT, образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую - в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.
РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные AT в сыворотке больного.
РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.
РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.
Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации не связавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к lg человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшее распространение нашёл метод иммуноблотинга.
Выявление вирусных Аг
ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.
Гибридизация ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине I комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.
ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.
6. Методы диагностики грибковых инфекций
Микроскопия. Микроскопия - один из основных методов выявления возбудителей микозов. Позволяет проводить экспресс-диагностику микозов и получать результат в течение 1-2 ч, тогда как для выделения культуры возбудителя необходимы недели. Для экспресс-диагностики препараты часто необходимо окрашивать специальными красителями, так как простая окраска гематоксилином и эозином часто не позволяет выявить клетки грибов.
Неокрашенные препараты
Микроскопия методом висячей или раздавленной капли. Метод позволяет выявить структуры грибов в клинических образцах без предварительного окрашивания.
Обработка 10% едким кали (КОН). Метод используют в первую очередь для визуализации структур возбудителей в фрагментах кожи и её придатках (ногти, волосы), отделяемом очагов поражения и влагалища. В указанных образцах содержится большое количество клеток, в которых КОН разрушает кератин, оставляя неизменёнными клетки грибов.
Окрашенные препараты
Окраска по Граму. В мазках из клинического материала грибы представлены грамположительными клетками. Клетки Cryplococcus neoformans плохо воспринимают красители, что можно использовать как дифференциально-диагностический признак при микроскопии окрашенных мазков СМЖ.
Окраска нигрозином или тушью по Бурри мазков СМЖ позволяет выявить капсулированные клетки Cryptococcus neoformans. Для идентификации этого микроорганизма можно использовать муцикармин или конго красный.
Окраска по Романовскому - Гимзе или Райту мазков крови и костного мозга позволяет выявить дрожжевую форму Histoplasma capsulatum в цитоплазме фагоцитов.
Окраска метенаминовым серебряным по Гомори. Метод включает предварительную обработку гистологических препаратов хромовой кислотой с последующим нанесением красителя (клетки грибов тёмно-серые или чёрные).
Окраска по Гридли. Метод включает предварительную обработку препаратов хроматом лейкофуксина с последующим нанесением фуксинового альдегида и метанилового жёлтого (клетки грибов розово-пурпурные на жёлтом фоне).
Окрашивание перйодной кислотой и реактивом Шиффа (по Мак-Манусу). 1,2-Гликольные группировки полисахаридов клеточных стенок грибов сначала окисляются перйодной кислотой до альдегидов, реагирующих с сульфитом лейкофуксина реактива Шиффа; клетки окрашиваются в насыщенно розовый или красный цвет.
Иммунофлюоресцентная микроскопия
Наибольшее распространение нашла РИФ. Применяют AT, меченные флюоресцеинами; для выявления грибковых Аг реагент наносят на гистологический препарат, инкубируют и проводят люминесцентную микроскопию.
Выделение грибов
Культуральные условия и потребности роста у патогенных грибов отличаются от таковых у возбудителей бактериальных инфекций. Большинство патогенных грибов не требовательно к питательным средам и хорошо растёт в аэробных условиях. Для роста грибов среды могут включать какой-либо органический источник углерода, неорганического азота в виде нитратов или аммонийных солей. рН питательных сред кислый (около 4,0-6,5), большинство бактерий не способно расти в подобных условиях. Среди витаминов большинство грибов нуждается в водорастворимых (например, биотине, рибофлавине, тиамине и др.). Большинство патогенных видов мезофилы и растёт в интервале температур 20-45 "С. При выделении обычно делают парные посевы, один из которых инкубируют при 25 0С, а второй - при 37°С; подобная манипуляция позволяет выявить возможный диморфизм. Идентификацию возбудителя проводят по морфологическим и биохимическим признакам. В практической работе обычно используют два типа сред - неселективные и селективные.
Неселективные среды
Наиболее распространён агар Сабуро - пептонный агар с мальтозой (или глюкозой). Его отличает высокое содержание углеводов, ингибирующее размножение бактерий. Также используют МПА, картофельно-декстрозный агар, агар Чапека-Докса, дрожжевой агар, сусло-агар и др. Нередко среды модифицируют добавлением антибиотиков, циклогексимида или хлоргексидина. Для выделения прихотливых патогенов (например, Blastomyces dermatitidis и Histoplasma capsulatum) в качестве обогащенных сред применяют 5-10% КА, дополненный сердечным и мозговым экстрактом, либо асцитический агар. После образования колоний следует делать пересев на более простые среды, например картофельно-декстрозный агар или среду Сабуро, на которых можно быстрее выявить споруляцию возбудителей.
Селективные среды
Селективные среды обычно получают на основе неселективных, с добавлением пенициллина (20 ЕД/мл), стрептомицина (40 ЕД/мл) или гентамицина (0,5 мкг/мл), левомицетина (16 мкг/мл). Для ингибирования бурного роста плесеней, подавляющих медленно растущие диморфные грибы, в среды вносят циклогексимид (0,5 мкг/мл). Следует помнить, что препарат подавляет рост некоторых патогенных грибов (например, Cryptococcus neoformans и Aspergillus fumigatus).
Выявление противогрибковых AT и грибковых Аг
Наиболее часто применяют реакцию латекс-агглютинации (выявляет IgM), PCK (выявляет IgG) и ИФА. Результаты реакций часто могут быть сомнительными вследствие перекрёстного реагирования с Аг различных грибов. Тем не менее идентификация AT или циркулирующих Аг в крови, СМЖ и моче позволяет установить диагноз до получения результатов посевов.
Кожные пробы ранее были одним из популярных методов диагностики микозов, однако их неспецифичность ограничивает диагностическую ценность. В настоящее время их чаще используют для изучения иммунной прослойки в популяции при эпидемиологических исследованиях.
Гибридизация нуклеиновых кислот - новый метод идентификации патогенных грибов, разработанный для определения основных возбудителей системных микозов - бласто-, крипто- и кокцидиоидомикозов, а также гистоплазмоза. Для постановки реакции проводят экстракцию РНК из культуры и вносят одноцепочечные молекулы ДНК, меченные флюоресцеином. При наличии в культуре одного из четырёх указанных возбудителей происходит гибридизация соответствующей ДНК с РНК патогена с образованием легко обнаруживаемого комплекса. Основное достоинство метода - возможность применения на ранних сроках (5 сут) в культурах, содержащих мицелиальные и дрожжевые формы.
7. Методы обнаружения простейших
Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенностей возбудителя и в значительной степени зависит от правильного взятия клинического материала и адекватной фиксации. Ошибки при проведении этих мероприятий могут привести к получению ошибочных результатов.
Микроскопия. Поиск патогенных простейших обычно проводят в субстратах, являющихся средой их обитания - испражнениях, крови.
Испражнения. Дли адекватного выявлении паразитов в ЖКТ необходимо исследовать не менее трёх проб, полученных в течение 10 сут. Для диагностики амебиаза этого может оказаться недостаточно, и при подозрении на это заболевание необходимо исследовать шесть проб, полученных в течение 14 сут. Следует избегать попадания в материал воды или мочи, губительно действующих на простейших. Если больному в диагностических целях вводили внутрь сульфат бария, минеральное масло, препараты висмута или проводили специфическую терапию, то забор испражнений следует проводить не ранее 8-х суток после последнего введения. Для выявления трофозоитов (подвижных форм) жидкие испражнения необходимо исследовать в течение 30 мин после получения; при более оформленном стуле эти исследования можно провести в течение часа; на более поздних сроках трофозоиты обычно разрушаются. При невозможности своевременного обследования в образцы вносят фиксирующие растворы, сохраняющие морфологию взрослых особей.
Макроскопическое исследование может выявить примесь крови и слизи (частый диагностический признак амебиаза). Выявление же самих паразитов проводят при светооптической микроскопии влажных нативных препаратов либо в окрашенных мазках.
Микроскопия нативных препаратов. Небольшое количество испражнений наносят на предметное стекло, диспергируют в капле физиологического раствора, накладывают покровное стекло и исследуют под микроскопом на наличие трофозоитов (в жидкие испражнения физиологический раствор не вносят). Нативные препараты можно слегка докрашивать раствором Люголя, что облегчает выявление цист. Особенно внимательно необходимо исследовать кровь и слизь; желательно готовить отдельные препараты, не контаминированные (по возможности) фекальными массами.
Методы накопления. Для выявления паразитов, присутствующих в незначительных количествах, применяют различные методы накопления. При исследовании кала наиболее часто используют седиментационный метод. Для исследования забирают каплю надосадочной жидкости, наносят на предметное стекло, где смешивают с равным объёмом физиологического раствора, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Смесь на предметном стекле можно подкрашивать раствором Люголя, раствор разрушает трофозоиты, но позволяет хорошо визуализировать ядра и включения гликогена в цистах.
Микроскопия окрашеных мазков позволяет не только выявлять, но и дифференцировать простейших; окраску наиболее часто проводят гематоксилином и эозином по Хайденхайну.
Кровь. Капиллярную или венозную кровь помещают в пробирку с антикоагулянтом (например, с этилендиаминтетрауксусной кислотой); исследования необходимо проводить по возможности быстро. Обнаружение простейших проводят микроскопией толстых и тонких мазков. Толстые мазки готовят из больших объёмов крови, нанесённых на предметное стекло; их обычно окрашивают по Романовскому-Гимзе, чего обычно бывает вполне достаточно для выявления паразитов. Тонкие мазки готовят для облегчения морфологической дифференцировки паразитов крови, мазки обычно окрашивают по Романовскому-Гимзе или Райту.
Образцы различных тканей
Образцы различных тканей отбирают, учитывая биологию паразита и его типичную локализацию. Образцы кожных покровов окрашивают обычными гистологическими красителями и микроскопируют. Биоптаты лимфатических узлов, селезёнки, печени, аспираты костного мозга и СМЖ забирают при подозрении на трипаносомозы или лейшманиозы. Часть образцов микроскопируют в виде нативных мазков, часть окрашивают по Романовскому-Гимзе или Райту. Также возможно окрашивание образцов различными гистологическими красителями, наиболее употребляемыми для изготовления препаратов из исследуемых тканей.
Выделение возбудителей
Выделение возбудителей проводят только в специализированных лабораториях, институтах и центрах; проводить эти мероприятия в обычных бактериологических лабораториях недопустимо. На специальных средах и культурах тканей можно выделять и культивировать практически все патогенные простейшие.
Серологические исследования
Серологические исследования - наиболее распространённые и доступные диагностические методы. Их часто проводят при подозрении на токсоплазмоз, амебиаз (РИГА, латекс-агглютинация), лейшманиозы (РИГА), трипаносомозы (РИГА, РСК) и т.д.
Заключение
Подробно рассмотрев известные способы идентификации различных микроорганизмов, можно сделать вывод, что в основном это длительный и трудоемкий процесс, требующий достаточного набора знаний, оборудования и специальных условий. Но не сотря на все трудности, диагностика необходима в целях идентификации микроорганизмов при установлении диагноза инфекционных заболеваний или иных вызванных микробами процессов и определения физиологических свойств культуры с другими целями, например при выборе химиотерапевтического препарата. Но жаль, что пока не существует универсального метода для быстрого и качественного определения микроорганизма. Каждый метод подходит для определённого ряда инфекций и не годиться для определения возбудителей других заболеваний. Также мало пока способов внелабораторной диагностики, потому что, например, часто необходимо наличие чистой культуры, что практически невозможно создать в полевых условиях. В мире постоянно появляются или обнаруживаются новые неизвестные микроорганизмы и, возможно, от скорости их идентификации будет зависеть жизнь многих людей. Из всего этого можно сделать вывод, что человечеству необходимо уделять больше внимания развитию микробиологии.
Литература
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., "Медицинская микробиология, вирусология, иммунология", Москва, 1994 г.
2. Гурина С.В., Соколова И.П., "Микробиология", СПб, 2000 г.
3. Красильников А.П., Романовская Т.Р., "Микробиологический словарь-справочник", Минск, 1999 г.
4. Поздеев О.К. под ред. Покровского В.И., "Медицинская микробиология", Москва, 2002 г.
5. Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., "Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии", Ростов-на-Дону, 2002 г.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Выделение возбудителя в начальном периоде болезни при микробиологической диагностике, исследование крови, изучение колоний на дифференциальной среде. Исследование дуоденального содержимого с диагностической целью, при обследовании на бациллоносительство.
реферат [22,0 K], добавлен 15.06.2010Главные задачи микробиологических исследований клинической лабораторной диагностики. Оснащение бактериологической лаборатории, высокопроизводительная автоматизированная техника идентификации микроорганизмов, стандартизация микробиологической диагностики.
реферат [47,1 K], добавлен 09.10.2010Микробиология как наука, история ее развития. Характеристика задач медицинской микробиологии. Классификация микроорганизмов по степени их биологической опасности. Организация микробиологической лабораторной службы, правила поведения и работы в ней.
презентация [1,2 M], добавлен 30.11.2015Понятие лептоспироза - инфекционного заболевания, вызывающего поражение кровеносных капилляров, печени, почек, мышц. Морфология и тинкториальные свойства лептоспироза, эпидемиология, патогенез и клиническая картина. Методы микробиологической диагностики.
презентация [1,5 M], добавлен 03.05.2015Свойства вирусов и плазмид, по которым они отличаются от остального живого мира. Морфология вирусов. Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина. Методы культивирования вирусов. Вирусы бактерий (бактериофаги). Этапы взаимодействия фагов и бактерий.
реферат [25,6 K], добавлен 21.01.2010Общая характеристика, физико-химические свойства, химическое строение фенолгликозидов. Методы выделения и идентификации. Методики обнаружения фенолгликозидов. Качественное и количественное определение. Лекарственные растения содержащие феногликозиды.
курсовая работа [459,2 K], добавлен 11.06.2010Описание механизмов защиты организма человека от различных возбудителей: вирусов, бактерий, грибов, простейших, гельминтов. Общие свойства клеточных факторов неспецифической защиты. Функции гранулоцитов и нейтрофилов. Свойства антител-иммуноглобулинов.
презентация [176,1 K], добавлен 15.02.2014Характеристика хроматографических методов идентификации антибиотиков и их отнесения к той или иной группе антибактериальных препаратов. Анализ исследований ученых мира в сфере выявления и классификации антибиотиков в различных медицинских препаратов.
курсовая работа [29,6 K], добавлен 20.03.2010Текущее состояние клинической лабораторной диагностики РФ и тенденции ее развития. Современная структура лабораторной службы. Представление об основных нормативных документах, регулирующих деятельность КДЛ. Принципы и формы централизации исследований.
реферат [58,7 K], добавлен 10.12.2014Сущность, цели и задачи клинической лабораторной диагностики. Лабораторное обеспечение медицинской помощи и его организация. Основополагающие принципы и тенденции развития лабораторной службы. Основы взаимоотношений между клиникой и лабораторией.
презентация [2,4 M], добавлен 06.04.2015
