Принципова схема ідентифікації і кількісного визначення речовин, які ізолюються екстракцією полярними розчинниками

Размещено на http://www.allbest.ru/

Тема

Принципова схема ідентифікації і кількісного визначення речовин, які ізолюються екстракцією полярними розчинниками

План лекції

1. Принципова схема аналізу «лікарських» отрут

2. ТСХ-скринінг «лікарських » отрут

3. Хімічні методи дослідження «лікарських» отрут

4. Фізико-хімічні методи ідентифікації препаратів

5. Фармакологічні дослідження «лікарських» отрут

6. Кількісне визначення «лікарських» отрут

1. Принципова схема аналізу «лікарських» отрут

Вибір схеми аналізу «лікарських» отрут залежить від ряду факторів:

· Біологічного об'єкта дослідження (органи і тканини, біологічні рідини трупа, біологічні рідини живої людини);

· Проведення спрямованого або неспрямованого азналізу препаратів;

· Оснащення судово-хімічної або хіміко-токсикологічної лабораторії (апаратура, розчинники і реактиви).

Залежно від вищевказних факторів аналіз «лікарських» отрут проводиться в двох напрямках:

· Судово-хімічне дослідження біологічного матеріалу, взятого з трупа (аналіз «лікарських» отрут в токсичних і летальних дозах -104 -106 г у пробі);

· Хіміко-токсикологічне дослідження біологічних рідин живої людини (аналіз «лікарських» отрут у терапевтичних і токсичних дозах - 106 - 1012 г у пробі);

Вибір методів дослідження «лікарських» отрут залежить від напрямку аналізу, етапу і чутливості методики:

Судово-хімічне дослідження біологічного матеріалу трупа	Етапи	Хіміко-токсикологічне дослідження біологічних рідин живої людини
	Хроматографія на папері

Размещено на http://www.allbest.ru/

Хроматографія в тонкому шарі сорбенту
Хроматографія в тонкому шарі сорбенту		Газо-рідинна хроматографія
Екстракція		Високоефективна рідинна хроматографія
	Хімічні методи

Размещено на http://www.allbest.ru/

Фізико-хімічні методи
Фізико-хімічні методи
Фармакологічні дослідження на тваринах		Імунохімічні методи
	Фізико-хімічні методи

Размещено на http://www.allbest.ru/

Фізико-хімічні методи Імунохімічні методи

Оцінка різних методів за чутливістю:

* Хімічні методи - 104-106 г у пробі.

* Фізико-хімічні методи - УФ-спектрометрія - 106-107 г у пробі, ТСХ - 106-107 г у пробі ГРХ - 108- 1010 г у пробі; ВЕРХ - 108- 1010 г у пробі;

* Імуннохімічні методи - 1010 -1012 г у пробі.

Схема ненаправленого дослідження «лікарської» отрути в біологічному об'єкті

2. ТСХ-скринінг «лікарських» отрут

лікарський ідентифікація препарат отруйний

Процес ідентифікації невідомої лікарської сполуки, що стала причиною отруєння, складається з двох етапів: попереднього і підтверджуючого.

· Попередній етап дозволяє віднести отруту до визначеної групи хімічних сполук і заснований на використанні методу тонкошарової хроматографії (ТСХ) і системи «скринінгу», тобто системи добору, просівання.

Вибір методу тонкошарової хроматографії для пошуку «лікарської» отрути при неспрямованому дослідженні зумовлений багатофункціональністю методу:

· Поділ препаратів і їхніх метаболітів.

· Очищення від домішок.

· Ідентифікація групи або препаратів індивідуальної речовини.

· Кількісна оцінка аналізованого препарату.

Попередній етап складається з двох стадій:

1 стадія - застосовуються загальні системи розчинників, що дозволяють розділити аналізовані речовини на групи, що локалізуються у визначених хроматографічних зонах. У випадку позитивного результату при використанні загальних систем розчинників приступають до другої стадії.

2 стадія - застосовуються окремі системи розчинників, що дозволяють ефективно розділити сполуки, що входять в ту чи іншу хроматографічну зону.

· Підтверджуючий етап - після проведення двох стадій попереднього етапу проводять підтверджуючі дослідження, що включають комплекс хімічних, фізико-хімічних методів, а також фармакологічні проби.

Негативний результат попереднього дослідження навіть на першій стадії свідчить про відсутність токсичних доз лікарських препаратів в екстрактах з біологічного матеріалу.

Попереднє хроматографічне дослідження ефективне за умови аналізу біологічного матеріалу, який не піддався процесам гнильного розкладання.

Умови ТСХ-скринінгу речовин кислого і слабоосновного характеру:

· Загальна система розчинників - ацетон-хлороформ (1:9).

· Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю.

· Довжина пробігу розчинників - 10 см.

· Час насичення камери парами розчинника - 15-20 хв.

Хроматографічна пластина розділяється на 5 вертикальних смуг:

S	A	Б	В	Г
*	*	*	*	*

Стандарт По 1/25 „кислого” хлороформного екстракту - 1/10

Як стандарт використовується циклобарбітал. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проялення барбітуратів, похідних саліцилової кислоти, піразолону, алкалоїдів - похідних пурину, індолу, похідних 1,4-бенздиазепіну.

Як проявники використовуються:

· Для барбітуратів - послідовно 5% розчин HgSO4 і 0,1 % розчин дифенілкарбазону в хлороформі (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями - смуги S і А ),

· Для похідних саліцилової кислоти, піразолону - 5% або 10% розчин FeCl3 (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями - смуга Б),

· Для алкалоїдів, похідних 1,4-бенздиазепіну - реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями - смуга В).

Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматографічні зони:

1. Зона з Rf - 0 -0,25 - похідні піразолону, алкалоїди.

2. Зона з Rf - 0,31- 0,41 - барбітурати, похідні 1,4-бенздиазепіну.

3. Зона з Rf - 0,41- 0,64 - похідні 1,4-бенздиазепіну.

Rs - являє собою відношення величини Rf аналізуючої речовини до величини Rf стандарту (циклобарбіталу). Вибір стандарту здійснюють так, щоб величина RS знаходилася в межах - 0,5-2. Величина Rs малочутлива до впливу випадкових відхилень в умовах експерименту і тому є більш точною оцінкою хроматографчної рухомості, ніж Rf.

Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:

* хроматографічної зони 1 - метанолом,

* хроматографічної зони 2 і 3 - ацетоном.

Елюат досліджують в окремих системах розчинників:

* Похідні піразолону, алкалоїди (I зона) - ацетон-циклогексан (5:1), сорбент - основний окис алюмінію,

* Барбітурати, похідні 1,4-бенздиаеепіну (2 зона) - хлороформ-бутанол-25% розчин аміаку (70:40:5), сорбент - силікагель КСК, забуферений розчином борної кислоти.

* Похідні 1,4-бенздиазепіну (3 зона) - етилацетат-бензол-етанол-25% розчин аміаку (90:15:5:2,5), силікагель КСК.

Умови ТСХ-скринінгу речовин основного і слабоосновного характеру:

* Загальна система розчинників - хлороформ-диоксан-ацетон-25% розчин аміаку (45:47,5:5:2,5);

* Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю,

* Довжина пробігу розчинників - 10 см,

* Час насичення камери парами розчинника - 15-20 хв.

Хроматограф пластина розділяється на 5 вертикальних смуг

S	A	Б	В	Г
*	*	*	*	*

Стандарт По 1/25 „лужного” хлороформного екстракту - 1/10

Як стандарт використовується етаперазин. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проявлення алкалоїдів; похідних фенотіазину, 1,4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти, піразолону.

Як проявники використовуються:

· Для похідних фенотіазнну - 10% розчин Н2SO4 в етанолі (з'являються червоні і фіолетові плями - смуги S і А);

· Для похідних фенотіазину, піразолону - 5% або 10% розчин FeCl3 (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями -смуга Б);

· Для алкалоїдів, похідних 1,4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти - реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями - смуга В).

Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматoграфичні зони:

1. Зона з Rf - 0,12-0,36 - алкалоїди;

2. Зона з Rf - 0,50-0,58 - пурини, похідні піразолону, фенотіазину;

3. Зона з Rf - 0,63-0,83 - похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот;

4. Зона з Rf - 0,6-0,98 - алкалоїди, похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину.

Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:

* хроматографічної зони 1 - сумішшю метанол-диетиламін (9:1);

* хроматографічної зони 2 - 4 - сумішшю метанол-25% розчин аміаку (9:1).

Елюат досліджують в окремих системах розчинників:

· Алкалоїди (1 зона) - хлороформ-диетиламін (9:1), сорбент - силікагель КСК;

· Пурини, похідні піразолону, фенотіазину (2 зона) - хлороформ-етанол (5:1), сорбент - нейтральний окис алюмінію;

· Похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот (3 зона) - хлороформ-етанол (20:1), сорбент - основний окис алюмінію;

· Алкалоїди, похідні 1,4-бенздназепіну, фенотіазину (4 зона) - циклогексан-ацетон (5:1), сорбент - основний окис алюмінію.

Результати попереднього хроматографічного дослідження підтверджуються хімічними і фізико-хімічними методами аналізу.

3. Хімічні методи дослідження «лікарських» отрут

Для виявлення «лікарських» отрут використовуються хімічні реакції - забарвлення, осадження і мікрокристалоскопічні.

Реакції забарвлення - в основі реакції забарвлення лежать наступні процеси:

· Дегідратація (за допомогою Н2SO4 концентрованої);

· Окислення препаратів (К2Сr2O7, в присутності Н2SO4 концентрованої),

· Одночасне окислення і дегідратація.

· Конденсації з альдегідами в присутності речовин, що поглинають воду.

Реакції забарвлення виконуються сухими й охолодженими осадами після видалення хлороформу. При проведенні реакцій забарвлення для лікарських отрут використовують наступні реактиви: концентровані кислоти (H2SO4, HNO3, HCl); реактиви Марки (H2SO4 конц. і формальдегід); Фреде (H2SO4 конц. і молібдат амонію); Ердмана (H2SO4 конц. і HNO3 конц.); Манделіна (H2SO4 конц. і ванадат амонію).

Оцінка результатів реакцій забарвлення:

· Можливість виключення окремих лікарських отрут і їхніх груп, що дозволяє вибрати раціональну схему аналізу хлороформної витяжки,

· Можливість знайти наявність окремих отрут і навіть груп отрут (реактив Марки орієнтує на пошук алкалоїдів похідних ізохіноліну);

· Недоліком реакцій забарвлення є неспецифічність, невисока чутливість, нестійкість отриманого забарвлення, що може змінюватися під впливом окислювачів повітря і світла або зникати;

· Головною умовою проведення реакцій забарвлення є високий ступінь чистоти хлороформних витяжок, тому що залишки білка під дією сульфатної кислоти обвуглюються, азотної - окислюються, що маскує основний результат.

Реакції осадження - в основі реакції осадження лежать наступні процеси:

· Утворення солей погано розчинних у водному середовищі (при взаємодії алкалоїдів з фосфорномолібденовою кислотою - реактив Зонненшейна, з фосфорновольфрамовою кислотою - реактив Шейдлера, пікриновою кислотою, дубильною кислотою - таніном і ін},

· Утворення комплексів з важкими металами погано розчинних у водному середовищі (при взаємодії алкалоїдів з реактивами Драгендорфа, Марме, Майєра).

Оцінка результатів реакцій осадження:

· Всі реактиви групового осадження з алкалоїдами, їхніми синтетичними аналогами й іншими органічними речовинами основного характеру дають аморфні осади,

· Перевагами реакцій осадження з загальноалкалоїдними реактивами є їхня висока чутливість (найбільшою чутливістю характеризуються фосфорномолібденова і фосфорновольфрамова кислоти і реактив Драгендорфа, найменшої - танін);

· Недоліком реакцій осадження є неспецифічність, тому що білки можуть давати аналогічні осади. Хіміко-токсикологічне значення реакцій осадження з реактивами групового осадження алкалоїдів має негативний результат.

Мікрокристалоскопічні реакції - засновані на осадженні досліджуваних речовин за допомогою відповідних реактивів і на визначенні форми кристалів, що утворюються.

Оцінка результатів реакцій осадження:

· Трудністю є те, що форма кристалів, які утворюються, залежить від багатьох факторів, до числа яких відносяться концентрація досліджуваної речовини, концентрація реактиву, співвідношення об'ємів розчинів досліджуваної речовини і реактиву, температура, рН середовища, наявність домішок, поліморфізм кристалів, що утворюються і ін. ,

· Реакції високо чутливі і специфічні при умовах лабораторії, в якій проводяться дослідження.

4. Фізико-хімічні методи ідентифікації препаратів

В хіміко-токсикологічному аналізі лікарських отрут переважно використовуються спектральні методи (спектроскопія в УФ - і ІЧ-областях) і хроматографічні методи (ТСХ, ГРХ, ВЕРХ, електрофорез).

Спектральні методи аналізу.

Спектри поглинання у видимій і ультрафіолетовій області, зв'язані з електронними переходами, одержали назву електронних спектрів.

Область електронних переходів охоплює інтервал спектру електромагнітних хвиль від 100 до 800 нм (106 - 104 см). Ця область підрозділяється на : видиму - з інтервалом довжин хвиль від 400 до 800 нм, і ультрафіолетову - з діапазоном від 100 до 400 нм. Остання також поділяється на: ближню - від 200 до 400 нм, і дальню (вакуумну) - від 100 до 200 нм.

Електрони, що входять до складу атомів і молекул, розрізняються по своєму енергетичному стану (1s-, 2s-, 2р-електрони й ін). Для їхнього збудження потрібно випромінювання з різною довжиною хвилі (енергією). Найбільша енергія необхідна для збудження електронів простого С-С-зв'язку (?-електрони). Трохи менша енергія потрібня для збудження електронів інших простих зв'язків, наприклад атома вуглецю з атомом, що містить неподілену пару електронів (?-електрони). Молекули органічних речовин, які не містять парних зв'язків, не мають характерного поглинання в робочій зоні в УФ-області (200-400 нм). Групи атомів, що містять одну або кілька кратних зв'язків, називають хромофорами, вони викликають вибіркове поглинання електромагнітного випромінювання в УФ-області. Якщо ж є зв'язок (сполучення) хромофорів один з одним або з ?-електронними системами - ауксохромами (ОН, NH3, СН4 і ін), то максимум поглинання речовини зміщується в довгохвильову область (батохромне зрушення).

Максимуми поглинання деяких хромофорів:

Хромофор	?max, нм
1	2
С = С	165
С = С = С	225
С = С	173
С = N	240-250
- NO2	271
C = O	280
- N = N -	340
= C =	620
- N = C	665
Бензол	180, 203, 254
Нафталін	275, 314

Вплив замісників на положення смуг поглинання монозаміщених похідних бензолу (в етанолі):

R	Смуга поглинання
	друга	третя
Н	203	256
СН3	206	225
Сl	210	264
OH	211	270
SH	236	271
NH2	230	280
CH = CH2	244	282
NO2	259	-
OСН3	217	269
COOH	230	279

Залежно від поводження молекул в УФ-області спектра (робоча зона - 200-400 нм) всі речовини поділяються на три групи:

* не мають характерного поглинання (відсутність хромофорів).

пахікарпін коніїн

* які мають вибіркове поглинання, що не залежить від рН-середовища;

атропін (макс. поглинання в етанолі при 252, 258, 265 нм, в розчині 0,1

промедол (макс поглинання в етанолі при 252, 258, 264 нм. в розчині 0,1 н

* які мають вибіркове поглинання, що залежить від рН-середовища.

Морфін 284 нм (Е1с? 1%= 194) 296 нм (Е1с? 1% = 274)

Молекули сполук останньої групи містять хромофори, сполучені з ауксохромами і можуть мати всі види електронних переходів. В результаті іонізації молекули при зміні рН розчинів смуги поглинання зміщуються в довгохвильову частину спектра (батохромне зрушення) або короткохвильову область (гіпсохромне зрушення). Деякі речовини (барбітурати), що не мають характерного поглинання в кислому середовищі в області робочої зони (200 - 400 нм), при підлужувані починають поглинати в зв'язку з появою хромоформного угруповання.

Речовини, що відносяться до групи сполук, що мають вибіркове поглинання в Уф-області, яке залежить від рН-середовища, представляють найбільш цікаве коло об'єктів дослідження в хіміко-токсикологічному аналізі.

Метод УФ-спектрометрії чутливий, цікавий для проведення кількісного визначення, досить точний, але вимагає ретельного очищення аналізованих речовин від супутніх домішок, що не завжди вдається при хіміко-токсикологічному дослідженні об'єктів біологічного походження.

Метод ІЧ-спектроскопії менш чутливий, ніж УФ-спектрометрії, спектри більш складні для розшифрування, тому при хіміко-токсикологічних дослідженнях використовуються недостатньо широко.

При проведенні хіміко-токсикологічних досліджень спектральний аналіз звичайно проводиться після хроматографічного скринінгу і є спрямованим. Він включає очищення виділеної сполуки і зняття спектрів, найчастіше в УФ-області при різних значеннях рН розчину й у різних розчинниках (при необхідності).

Очищення проводиться головним чином за допомогою хроматографії в тонкому шарі сорбенту, у випадках речовин кислотно-основного характеру - екстракційним методом або сполученням двох видів очищення.

Хроматографічні методи:

Умови газохроматографічного аналізу «лікарських отрут»:

Газовий хроматограф ЛХМ-80 з термоаерозольним детектором (ТАД) чи Perkin - Elmer F-22 з безполум'яним азотно-фосфорним детектором (NPD). Колонка скляна, силанізована, довжиною 1 м, внутрішній діаметр 2-3 мм. Сорбент - 3 %-ний SE-30 на хромосорбі W (НР)-80 - 100 меш. Швидкість газу-носія - 45 мл/хв азоту для ТАД і 40 мл/хв гелію для NPD. Ефективність хроматографічних колонок по додекану при 100°С для ТАД і NPD відповідно 1200 т.т і 1350 т.т. Селективність детектування оптимзована по кофеїну і гексадекану. При цьому встановлені наступні витрати допоміжних газів: для ТАД - 18 мл/хв водню, 200 мл/хв повітря, 135 мл/хв азоту через генератор аерозолю з хлоридом рубідію при температурі генератора 5100С; для NPD з кулькою силікату рубідію - 1 мл/хв водню і 60 мл/хв повітря. Температура детектора 300°С. Температура випаровувача 250°С. Температура термостату колонки змінюється по лінійній програмі від 130 до 290°С зі швидкістю 20°С в хвилину. Витримування при кінцевій температурі займає до 15 хвилин загального часу аналізу. Об'єм проби, що вводиться - 2,5 мкл.

Умови поділу «лікарських отрут» методом високоефективної рідинної хроматографії на прикладі 1,4-бензодиазепінів:

· хроматографічна колонка (62x2 мм), заповнена зворотньо-фазним сорбентом «Сепарон» С18 (5 мкм) (колонка подається з хроматографом).

· як рухливу фазу (елюент) для поділу нативних бензодиазепінів (крім медазепаму) використовують суміш 0,05 М водного розчину двухзаміщеного фосфату амонію й ацетонітрилу (65:35) - рН=7,8;

· детектування нативних 1,4-бензодиазепінів проводиться при довжині хвилі 230 нм;

· у якості елюенту для поділу продуктів гідролітичного розщеплення нативних бензодиазепінів - бензофенонів (і медазепаму) використовується система тих же розчинників, але в співвідношенні 45:55;

· детектування бензофенонів проводиться при довжині хвилі 220 нм;

· швидкість потоку елююровання - 100 мкл/хв.

Ідентифікація «лікарських» отрут методами ГРХ і ВЕРХ проводиться за параметрами утримання піків.

5. Фармакологічні дослідження «лікарських» отрут

Деякі отруйні речовини при дії на організм тварин викликають характерні фізіологічні реакції. Так, наприклад, атропін, введений в око кішки, викликає розширення зіниці. Після нанесення розчину нікотину на спинку жаби вона приймає характерну позу. Те ж стосується і стрихніну. При нанесенні його на спинку жаби з'являються титанічні судороги, а потім жаба приймає позу, характерну для дії стрихніну.

Фармакологічні іспити отруйних речовин, виділених з біологічного матеріалу і добре очищених за допомогою відповідних методів, повинні виконувати фахівці - фармакологи, що мають спеціальні пізнання в цій області і які володіють технікою експерименту.

6. Кількісне визначення «лікарських» отрут

Кількісне визначення токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу, є заключним етапом хіміко-токсикологічного аналізу. Кількісне визначення токсичних речовин виробляється після їхньої ідентифікації. При ідентифікації можуть бути виявлені токсичні речовини, що прийняті померлим перед смертю в терапевтичних дозах (з лікувальною метою) і не були причиною отруєння. Дозу отрути, що поступила в організм, можна оцінити тільки на підставі результатів кількісного визначення.

В хіміко-токсикологічному аналізі для кількісного визначення токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу й інших об'єктів, застосовуються чутливі фотоколориметричні, спектрофотометричні, газохроматографічні і деякі інші методи. Через малу чутливість гравіметричних і титриметричних методів вони практично не застосовуються в хіміко-токсикологічному аналізі. Виділені з біологічного матеріалу речовини, що піддаються кількісному визначенню, повинні бути добре очищені від білкових сполук, продуктів їхнього розкладання, які утворюються в трупному матеріалі, і від інших домішок.

Незважаючи на велике значення результатів кількісного визначення отруйних речовин, виділених з біологічного матеріалу, для розв'язку питання про отруєння в ряді випадків результати цих визначень можуть бути занижені. Це пояснюється рядом причин.

Токсичні речовини в організмі деякою мірою піддаються метаболізму. Речовини, що викликали отруєння, нерівномірно розподіляються в органах і тканинах організму. В одних органах ці речовини знаходяться в великих кількостях, ніж в інших, а в деяких органах і тканинах ці речовини можуть бути відсутні. Тому результати хіміко-токсикологічного аналізу залежать від правильного вибору органів і тканин, які направляються на дослідження. Отруйні речовини в організмі зв'язуються з білковими й іншими сполуками. Кількість речовин, які виділяються і які переходять у витяжки з біологічного матеріалу, залежить від застосовуваного методу виділення токсичних речовин з відповідних об'єктів. Кількість токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу, залежить і від ступеня гнильного розкладання досліджуваних об'єктів. Вплив зазначених вище факторів на виділення токсичних речовин необхідно враховувати при оцінці результатів кількісного визначення отрут, виділених з біологічного матеріалу в ході хіміко-токсикологічного аналізу.

Размещено на Allbest.ur