Диагностика коклюшной и паракоклюшной инфекций

Латекс-микроагглютинация

Одна из модификаций реакции агглютинации является реакция пластинчатой окрашенной латекс-микроагглютинации.

Принцип метода состоит в следующем: полистироловый латекс сенсибилизируют компонентами клеток коклюшной палочки и на стеклянной пластине смешивают с двукратным разведением исследуемого субстрата. Учет результатов производят после окрашивания. Эта реакция позволяет выявить противококлюшные антитела в ранние сроки заболевания и отличается простотой интерпретации результатов. Однако в связи с использованием в качестве антигена продуктов распада клеток возбудителя, данный метод может давать ложноположительные результаты[5].

Реакция нейтрализации

Реакция нейтрализации цитопатогенного действия коклюшного токсина на культуре клеток яичников китайских хомяков основана на регистрации морфологических изменениях клеточного монослоя, индуцируемых токсином и блокируемых токсин-нейтрализующими антителами. Стандартизация условий реакции позволила сделать ее высокоспецифичной и добиться высокой воспроизводимости результатов. Стало возможным количественное определение коклюшного токсина и токсин-нейтрализующих антител.

Сущность метода заключается в том, что последовательно разведенные сыворотки крови человека добавляют в лунки микропланшета, в которые затем вносят коклюшный токсин в рабочей дозе и культуру клеток СНО. Сыворотки в планшетах инкубируют при +37 °С в течение 5-6 суток. По окончании инкубации в каждую лунку добавляют окрашивающий раствор. Окрашивание дна лунки показывает, что клетки жизнеспособны - следовательно, токсин был нейтрализован токсин-нейтрализующими антителами, содержащимися в сыворотке крови. Отсутствие окрашивания указывает на обратное: не связанный антителами токсин нарушил метаболизм и рост культуры клеток, что привело к их гибели.

Обнаружение по окончании инкубации живых клеток культуры СНО в лунках, содержащих определенные разведения сывороток, будет указывать на соответствующий титр антител к коклюшному токсину в тестируемых сыворотках. При этом титр антител исследуемых сывороток сравнивается с титром контрольных токсиннейтрализующих антител. Однако это трудоемкая реакция, поэтому в основном она используется при проведении научных исследований, а не в практическом здравоохранении[5].

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ для выявления антител к коклюшному микробу получил широкое распространение в 80-е годы. Полученные результаты свидетельствовали о несомненных преимуществах этого метода по сравнению с реакцией агглютинации. Использовали как цельные бактериальные клетки, так и комплексы антигенов или частично очищенные антигены возбудителя. Однако ряд антигенов коклюшного микроба перекрестно реагирует с другими грамотрицательными бактериями, а при высокой чувствительности метода возможность перекрестных реакций значительно возрастает. Кроме того, сорбция антигенов из комплекса антигенов на поверхность планшет зависит от свойств самих антигенов и материала, из которого изготовлены планшеты [9].

Принципиально новым этапом стало использование в качестве антигенного субстрата очищенных антигенов микроорганизма. Необходимо было решить вопрос о диагностической ценности применения различных антигенов [11]. Сравнивали иммунный ответ на цельные микробные клетки, очищенные коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, пертакгин, смесь этих антигенов. Чувствительность метода при использовании разных антигенов составила: 54% для цельных клеток, 85 % для филаментозного гемагглютинина, 92% для коклюшного токсина, 62 % для пертакгина, 85% для пула этих 3-х антигенов (эти данные получены по совокупности исследований с IgG, А и М)[6]. При сравнении иммунного ответа в парных сыворотках у пациентов разных возрастных групп с бактериологически подтвержденным диагнозом было выявлено максимальное число сероконверсий и положительных результатов в первой сыворотке в реакции с коклюшным токсином, причем самая выраженная сероконверсия получена в возрастных группах младше 3 месяцев и старше 15 лет.

При этом необходимо учитывать, что на фоне массовой иммунизации у детей может быть повышен уровень иммуноглобулинов G к коклюшному токсину (поствакцинальный). В связи с этим за положительный результат может быть принят либо высокий уровень иммуноглобулинов G (на фоне контрольных сывороток здоровых детей данного возраста), либо выраженная сероинверсия (повышение уровня иммуноглобулинов при повторном исследовании не менее чем на 20 единиц или не менее чем в 8 раз). Определение сывороточных IgМ и А (в качестве антигена использовались цельные клетки) может применяться для быстрой серологической диагностики коклюша без исследования парных сывороток.

При использовании очищенных антигенов наиболее полным серологическим исследованием является определение IgG к филамеиозному гемаглютинину и коклюшному токсину и определение IGА к филаментозному агглютинину. Исходя из того, что формирование противококлюшного иммунитета происходит на локальном и системном уровнях, было высказано предположение о существенной роли секреторных иммуноглобулинов в этом процессе. При иммунизации не происходит повышение уровня секреторных иммуноглобулиновА, поэтому выявление их в носоглоточной слизи может служить свидетельством заболевания, в том числе и при отрицательном результате бактериологического исследования [12].

1.5 Особенности серодиагностики у привитых

Вакцинацию проводят с 3-х месяцев трехкратно с интервалом между прививками 1,5 месяца вакциной АКДС.

Вакцинация приводит к увеличению титров антител (в ИФА) ко всем известным антигенам В.реrtussis. У детей, привитых клеточной коклюшной вакциной, возрастают титры антител к ГА, КТ, АГГ, ЛПС и поверхностным белкам. Выраженность иммунного ответа пропорциональна числу полученных доз вакцины [13].

При вакцинации не наблюдается индукции секреторных IgA-антител, а резкое повышение содержания сывороточных противококлюшных IgА-антител может служить свидетельством заболевания [5].

Определение IgG- антител более целесообразно, чем выявление IgA-антител. При заболевании коклюшем нарастание IgG-антител происходит в значительно ранние сроки и на 4-й неделе болезни высокие титры антител выявляются практически у всех детей. Интересные данные были получены при изучении изотипов антител в сыворотке вакцинированных, но заболевших детей. Иммунный oтвет непривитых детей характеризовался накоплением IgМ-антител, содержание которых в сыворотке вакциниpованных было значительно более низким, чем содержание IgG-антител. Эти данные свидетельствуют, что вакцинация, индуцирующая незначительное количество антитоксических антител, обеспечивает при инфицировании анамнестический ответ[12].

После вакцинации увеличиваются также титры нейтрализующих антител. Три дозы клеточной вакцины вызывают умеренный (по титрам нейтрализующих антител) иммунный ответ у 59% привитых [14]. Средний титр нейтрализующих антител к ЛПС (по данным реакции нейтрализации на СНО) увеличивался с 45 ЕД/мл до иммунизации в двухмесячном возрасте до 407 ЕД/мл через один месяц после третьей дозы АКДС -вакцины [13].

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1 Методика проведения бактериологического исследования

Забор материала может проводиться 2 способами - тампоном и кашлевыми пластинками:

1) тампоном материал забирают как с диагностической целью, так и с эпидемическими показаниями. У младенцев материал забирают только тампоном;

2) забор материала тампоном проводит специально обученный и инструктированный персонал;

3) для повышения вероятности находки возбудителя материал

отбирают 2 тампонами, предварительно выгнутыми под тупым углом: сухим и влажным. Сухой тампон служит для провокации кашля, а влажный - для непосредственного взятия материала. Материал с сухого тампона засевают на чашки со средой КУА обязательно на месте его взятия, а влажный - сеют в лаборатории. Материал доставляют в лабораторию не позже 2-4 часов после взятия.

Методика забора материала сухим и увлажненным тампонами

одинакова и сводится к следующему: медицинский работник левой рукой фиксирует с помощью шпателя корень языка, а правой - вводит

тампон в полость рта, продвигая его за корень языка. Тампон не должен касаться слизистой оболочки щек, языка и миндалин. Кончиком тампона и выпуклой его частью касаются задней стенки глотки, проводя по ней справа налево 2-3 раза, потом также осторожно над шпателем вынимают тампон из полости рта.

Метод "кашлевых пластинок" используют только с диагностической целью при наличии кашля. Взятие материала проводит медицинский персонал.

Сбор материала проводят на 2 чашки с питательной средой. Для этого во время кашля снимают крышку с чашки Петри, подносят чашку со средой ко рту человека, который кашляет, на расстоянии 10-12 см. и держат в течение 5-6 кашлевых толчков так, чтобы капельки слизи из дыхательных путей попали на поверхность среды. При непродолжительном покашливании можно эту же чашку поднести повторно. Необходимо следить, чтобы на питательную среду не попала слюна, рвотные массы. Чашку с питательным средой закрывают крышкой и доставляют в лабораторию.

Инкубацию осуществляют при температуре 35⁰C в условиях повышенной концентрации CO и повышенной влажности.

Доставка материала и оформление направления

Материал на увлажненных тампонах и посевы материала

немедленно доставляют в лабораторию (не позже 2-4 часов после взятие).

При транспортировке стоит оберегать материал от прямых

солнечных лучей, сохраняя его в температурных пределах от +4 до +37⁰С, для чего рекомендуется помещать его в специальные термоконтейнеры или биксы. На материал, который посылают в лабораторию, оформляют направление, где дополнительно указывают: 1) количество обследований; 2) метод взятия материала.

Бактериологический метод исследования

Бактериологический метод исследования предусматривает выделение возбудителя путем посева на плотные питательные среды, выделения чистой культуры и идентификацию возбудителей рода Bordetella.

Исследование продолжается в течение 5-7 дней.

Первый день исследование:

1) посев материала, взятого тампоном, проводят на 1-2 чашки с питательной средой, которая предварительно обработана пенициллином, цефалексином или амфотерицином для подавления сопутствующей микрофлоры (при взятии материала "кашлевыми пластинками" среду антибиотиками не обрабатывают). Обработку антибиотиками можно проводить двумя способами: путем нанесения их на поверхность питательной среды или путем добавления в среду. Для получения изолированных колоний, посев материала делают тщательным образом втирая его тампоном сначала на периферии среды в виде 4-5 бляшек, а потом Z -образным штрихом в центре чашки. Та же методика посева применяется на второй чашке. Стерильным шпателем растирают центральные части посева, не касаясь бляшек.

Посев материала также можно делать таким способом: на половину чашки Петри материал засевается площадью, потом рассевается на третий и четвертый секторы;

2) засеянные чашки (тампоном или "кашлевые пластинки") помещают в термостат при температуре 35-37⁰C на 3 сутки (72 часа). Для увлажнения воздуха в термостат ставят сосуд с водой;

3) как питательная среда для посева исследуемого материала применяют среды, которые содержат кровь: картофельно-глицериновый агар (среда Борде-Жангу) или среды без крови: КУА. Среды могут быть приготовлены непосредственно в лабораториях или приобретены.

Четвертый день исследование (3 сутки, 72 часа) :

1) просматривают посевы на чашках с питательной средой с целью отбора подозрительных колоний рода Bordetella. Просмотр колоний делают с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа или бинокулярной лупы с большим фокусным расстоянием;

2) колонии микроорганизмов рода Bordetella при росте на питательных средах выпуклые, влажные, гладкие, блестящие с ровными краями, серого цвета с голубым, серебристым, а иногда желтоватым или беловатым оттенком. Колонии видов Bordetella имеют мягкую (маслянистую) консистенцию и легко снимаются. При просмотре колоний в стереоскопическом микроскопе можно наблюдать узкий луч света ("хвостик"), который отходит от ее центра.

Сроки появления колоний разные: колонии B.parapertussis - через 24-48 часов и В. pertussis - через 48-72 часа. Разная скорость роста отражается на величине колоний при пересмотре их через 72 часа. На средах с кровью вокруг колоний почти всегда образуется зона слабого гемолиза;

3) B. parapertussis при росте на среде КУА вызывают диффузное окрашивание среды в буровато - коричневый цвет, который оказывается при просмотре в проходяшем свете, а также вызывают потемнение среды с кровью. Рост B.pertussis на питательной среде не сопровождается изменением цвета;

4) при появлении на среде подозрительных колоний выделяют чистую культуру, путем отсева их на скошенный КУА или в чашки Петри с одной из питательных сред. При этом поверхность среды делят на несколько секторов и отсеивают каждую колонию на отдельный сектор, тщательным образом втирая ее в среду круговыми движениями;

5) при наличии значительного количества однотипных подозрительных колоний, кроме выделения чистой культуры, из колоний, которые остались, делают мазки, определяют морфологические и тинкториальные свойства культуры при окрашивании по Граму. Одновременно выявляют и отсутствие спонтанной агглютинации. Микробы рода Bordetella имеют вид мономорфных мелких овоидных палочек (коккобактерий), равномерно расположенных в мазке, грамотрицательные. Иногда B. parapertussis, особенно со среды Борде-Жангу, могут иметь вид продолговатых полиморфных палочек. Культуру из колоний, которые остались, проверяют в реакции агглютинации на стекле со специфическими видовыми сыворотками, разведенными 1:10 и, по возможности, с адсорбируемыми монорецепторными сыворотками к аглютиногенам (факторам) 1 и 14.

Если количество подозрительных колоний значительно, то можно поставить пробу Закса для определения наличия фермента уреазы;

6) на основании изучения характера колоний и морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму, позитивной реакции агглютинации с видовыми неадсорбируемыми сыворотками к факторам 1 и 14, на третьи сутки можно выдать предварительный ответ;

7) при отсутствии роста подозрительных колоний на среде, чашки Петри опять помещают в термостат на 24-48 часов и просматривают повторно в соответствующий срок.

Пятый - шестой день исследование (4-5 сутки, 96-120 часов):

1) просматривают посевы, сделанные для выделения чистой культуры, и отмечают изменение цвета среды: B.parapertussis диффузно окрашивают среду (КУА) в буровато - коричневый цвет;

2) на предметном стекле в капле физиологического раствора готовят мазок и окрашивают его по Граму, определяя морфологию выделенной культуры, ее чистоту, а также отсутствие спонтанной агглютинации;

3) серологические свойства проверяют в РА на стекле со специфическими сыворотками к B. pertussis и B. parapertussis, разведенными 1:10, а также с адсорбируемыми монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14. Серовар B.pertussis определяют агглютинацией с монорецепторными сыворотками к факторам 1, 2, 3;

4) для проверки биохимических свойств делают посевы чистой культуры на агаровую среду с тирозином (определения наличию тирозиназы), выявляют наличие уреазы по методу Закса. При подозрении на выделение чистой культуры B.bronchiseptica, определяют утилизацию цитрата на среде Симонса и подвижность путем посева в полужидкий агар (0,3% агар-агара). B.pertussis биохимически инертная: не растет на МПА, не изменяет цвет агаровой среды с тирозином, не имеют фермента уреазы (проба Закса - негативна), не будет утилизировать цитрат.

B. parapertussis дает рост на простых питательных средах изменяет цвет среды с тирозином на коричневый, имеет фермент уреазу (проба Закса позитивна). B.bronchiseptica отличается быстрым ростом на простых питательных средах, подвижностью, не изменяет цвета среды с тирозином, способна утилизировать цитрат на среде Симонса;

5) на основании изучения чистой культуры: морфология колоний и

клеток, реакции агглютинации с видовыми сыворотками и монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14, результатов пробы на уреазу, изменения цвета среды с тирозином, утилизации цитратов может быть выдан окончательный положительный ответ;

6) если в течение пяти суток (6 день исследование) на среде не выявлены колонии, подозрительные на бактерии рода Bordetella, исследования прекращают и выдают окончательную негативную ответ.

Изучение ферментативной активности

· Выявление уреазной активности.

Метод базируется на способности микроорганизмов, которые имеют фермент уреазу, расщеплять мочевину до аммиака, за счет которого происходят изменение pH среды, который влияет на изменение цвета индикатора.

Смесь реактивов Но и Б (19 частей) разливают по 0,0,1-0,2 куб. см в стерильные пробирки (с пробками) и вносят 1-2 петли исследуемой культуры. Одновременно ставят контроль реактива без внесения культуры. Пробирки помещают в термостат при 35-37⁰C на 30мин. Учет результатов проводят после инкубации, а при отсутствии изменения цвета смеси - пробирки оставляют при комнатной температуре и результат учитывают на следующий день. При наличии у микроорганизма фермента уреазы происходит расщепление мочевины до аммиака, который приводит к изменению цвета среды с желтого на малиновый.

· Определение способности утилизировать цитрат как единственный источник углерода.

Исследуемую культуру засевают на скошенную среду Симонса и инкубируют при (37±1)⁰C одни сутки. Цитратутилизирующие бактерии хорошо растут и вызывают изменение цвета среды в синий цвет. Микроорганизмы, которые не утилизируют цитрат на этой среде не растут и не изменяют ее цвет.

· Определение пигментообразования.

Засевают культуру, которая выделена, на простой питательный агар с 0,01% тирозином и инкубируют в течение суток при (37±1)⁰C. При расщеплении тирозина среда окрашивается в желто-коричневый цвет.

Сроки выдачи и формулировка ответов

Ответ при исследовании на коклюш и паракоклюш выдается, как правило, на 3-5 сутки.

Предварительный положительный ответ может быть выдан на третьи сутки с формулировкой: "Выявленные микроорганизмы, подозрительны на бактерии рода Bordetella, исследование продолжается".

Окончательный позитивный ответ может быть выдан на 5-6 сутки и формулируется так: "Выявлены B.pertussis (B. Parapertussis, B. bronchiseptica)".

Негативный ответ выдается на 5 сутки при отсутствии подозрительных колоний на бактерии рода Bordetella и формулируется так: "Бактерии рода Bordetella не выявлены".

В случае замедленного роста микробов или выделения нетипичной культуры предварительный и окончательный ответы могут быть выданы позже (6-7 сутки).

2.2 Методика проведения РА

Кровь для исследования можно взять из пальца (0,8-1,0 мл.) с соблюдением обычных правил асептики. Кровь собирают, приложив к месту укола конец короткой пастеровской пипетки. Кровь из пипетки выдувают в центрифужную пробирку, которую потом помещают на 10-15 мин. в термостат. Сгусток, который образовался, отделяют от стенки пробирки и помещают в холодильник до отделения сыворотки. Сыворотку отсасывают пастеровской пипеткой, разводят физиологическим раствором 1:5 или 1:10, плотно закрывают пробкой и хранят в холодильнике.

Когда удается взять кровь в небольшом количестве, ее набирают в количестве 0,2 или 0,5 мл. и вносят в пробирку, куда предварительно наливают 1,8 мл. стерильного физиологичного раствора. После центрифугирования смесь сыворотки с физиологичным раствором (разведение сыворотки соответственно 1:20 или 1:10) переносят в стерильную пробирку и из нее делают следующие 2-кратные разведение (1:20, 1:40 и т.д.).

Из исследуемой сыворотки готовят 9-10 последовательных разведений:1:5, 1:10 и т. п. до 1:1280 или 1:2560. Обязательно ставят контроль диагностикума, сыворотки и физиологического раствора. Реакцию агглютинации ставят таким способом: до 0,25 мл. соответствующего разведения сыворотки добавляют 0,25мл. диагностикума. Пробирки помещают в термостат при (37± 1)⁰C на 2 часа, а потом оставляют при комнатной температуре (20 ± 2)⁰C.

Результаты учитывают на следующий день с помощью агглютиноскопа. В первую очередь проводят оценку контроля. Диагностикум с раствором натрия хлорида (КД) должен иметь равномерную муть без хлопьев. Сыворотка с раствором натрия хлорида (КС) и раствор натрия

хлорида (КФР) должны быть прозрачными. Если контроль отвечает требованиям, учитывают результаты реакции агглютинации.

Конечным титром считают разведение, при котором отмечается четкая агглютинация на два плюса (++), однако реакция учитывается как положительная лишь при наличии в предыдущих пробирках четкой агглютинации на четыре или три плюса (++++ или +++).

Диагностическим титром реакции агглютинации у не привитых и детей, которые не болели считают разведения 1:80.

У иммунизированных детей и взрослых положительные результаты реакции учитывают только при исследовании парных сывороток крови, взятых с интервалом 1-2 недели при нарастании титра не меньше, чем в 4 раза.

2.3 Методы статистического анализа

Полученные данные заносились в таблицу MS Excel 2007, где рассчитывались показатели описательной статистики. Рассчитывалась медиана для определения среднего уровня признака в числовых рядах с неравными интервалами в группах. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программы STATISTICA v.6.0, были применены критерий Стьюдента, непараметрический критерий Манна-Уитни для сравнения данных в двух независимых группах. Для сравнения данных в трех независимых группах применялся критерий Краскелла-Уоллиса, а также критерий ч2 для сравнения долей. Статистически значимой считалась 95% вероятность различий (р<0,05).

2.4 Характеристика обследованных больных

В качестве объекта исследования были выбраны 64 пациента, находившихся на лечении в Гомельской областной инфекционной клинической больнице с 2005 года по 2009 год с диагнозом «Коклюш».

Возраст пациентов от 1 месяца до 16 лет. В зависимости от возраста, учитывая эпидемиологическую ситуацию, пациенты были разбиты на 5 групп: первая - до 1 года (37 человек, 58%), вторая - от 1 до 3 лет (11 человек, 17%), третья - от 3 до 6 лет (5 человек, 8%), четвертая - от 6 до 9 лет (6 человек, 9%), пятая - старше 9 лет (5 человек, 8%). Средний возраст составляет 2,6 ± 0,5 года.

Среди обследованных больных преобладали дети в возрасте до 1 года (37 человек), притом из них 27 человек в возрасте до 6 месяцев включительно, старше 6 месяцев- 10 человек.

Среди больных было девочек 31(48%), мальчиков - 33 (52%). В возрастных группах следующее соотношение полов, представленное на рисунке 2.

Рисунок1- Распределение больных по возрасту

Рисунок 2 - Соотношение полов в возрастных группах

Соотношение девочек и мальчиков примерно одинаково в возрастных группах (р>0.05).

В зависимости от прививочного анамнеза полноты курса АКДС - вакциной пациенты были разбиты на 3 группы. Первая группа - привитые - 32 человека (50%). Вторая группа - не привитые - 22 человека (34%). Третья группа - не полный курс (V1, V1-V2)-10 человек (16%).

Рисунок 3- Распределение больных в зависимости от полноты курса АКДС-вакцины

У привитых преобладают дети в возрасте до 3-х лет(56%), у не привитых 86% детей до 1 года. Все дети не окончившие курс прививок АКДС - вакциной в возрасте до 1 года.

У больных преобладали среднетяжелые формы заболевание (88%), тяжелые и легкие формы встречаются редко (10% и 2% соответственно).

Источник инфекции удалось установить у 37 (58%) госпитализированных пациентов.

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1 Характеристика больных в группе привитых

Из 32 человек (привитых) РА проведена 22(69%).Эти больные были поделены на 2 группы: дети до 3-х лет и старше 3-х лет (по 11 человек каждая). Данное деление произведено из расчета того, что максимальная напряженность поствакцинального иммунитета наблюдается в возрасте до 3-х лет, а потом - снижается.

Проанализировав в двух группах особенности клинической картины и ОАК, характерные для данного заболевания, получили данные, представленные в таблице 2 (сравнение проводилось с помощью метода Манна- Уитни).

Таблица 2 - Сравнительная характеристика по возрастным группам

Возрастные группы Характерные особенности	До 3-х лет n= 11	Старше 3-х лет n= 11	р
Клинической картины	Среднее количество приступов кашля с репризами, в сутки	13,4 ±4,7	11 ±5,3	0.21
	Наличие апноэ, кол-во чел.(%)	3 (27%)	1 (9%)	0.47
	Среднее значение t тела, С	37.4 ±0,8	37.3 ±0,3	0.89
Общего анализа крови	Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	22,7 ±11,6	10,7 ±4,9	0.01
	Среднее содержание лимфоцитов, %	75,4 ±11,6	52 ±11,5	0.0006

Статистических различий в клинической картине не обнаружено (р> 0.05). В общем анализе крови содержание лейкоцитов и лимфоцитов достоверно выше у детей в группе до 3-х лет, но в данной группе нормы по этим показателям выше. Поэтому в таблице 3 сравнили степень тяжести заболевания в этих группах.

У детей до 3-х лет встречаются тяжелые формы, чего нет у детей старше 3-х лет. Пациентов со средней степенью тяжести практически одинаковое количество( 9 и 10 соответственно). Легкая степень тяжести встречается только у детей старше 3-х лет.

Таблица 3 - Сравнение степени тяжести в возрастных группах привитых детей

Степень тяжести	До 3-х лет n= 11	Старше 3-х лет n= 11
Легкая, абс.(%)	0	1(9%)
Средняя, абс.(%)	9(82%)	10(91%)
Тяжелая, абс.(%)	2 (18%)	0

Далее были проанализированы особенности клинической картины и ОАК в данных возрастных группах в зависимости от результатов РА.

У детей в возрасте до 3-х лет (11 человек) взятие материала проводилось на 2-5 неделе заболевания. Повышение титра до диагностического и прирост в 4 раза наблюдалось у 7 больных (64%), что подтверждает диагноз. У 4 больных результат отрицательный.

Сравнение клиническую картину и данные ОАК в таблице 4 (для сравнения применялся тест Манна- Уитни).

Таблица 4 - Сравнительная характеристика привитых больных в возрасте до 3-х лет, в зависимости от результата РА

Результат РА Характерные особенности	Диагностический титр и/или прирост в 4 раза n= 7	Отрицательный n= 4	р
Клинической картины	Среднее количество приступов кашля с репризами, в сутки	11,4±4,1	12±5,9	0.92
	Наличие апноэ, кол-во чел.	3 (43%)	0	0.26
	Среднее значение t тела,С	37.0±0,3	38.1±1,05	0.09
Общего анализа крови	Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	23±13,8	21±8	1
	Среднее содержание лимфоцитов,%	72,9±13,6	75,3±6,6	1

Статистических различий по всем признакам не выявлено (р> 0,05) .

У детей старше 3-х лет (11 человек) взятие материала для РА проводилось нам 2-4 неделе заболевания. Повышение титра до диагностического и прирост в 4 раза наблюдалось у 9 больных (82%), что подтверждает диагноз. У 2 больных результат отрицательный.

Всем производился посев на B. pertussis : получена культура у 2 больных (данные РА, клиническая картина и данные общего анализа крови не отличаются от больных , у которых наблюдалось повышение титра антител до диагностического) . У 9 больных культура при посеве не обнаружена.

Сравнения клинической картину и ОАК представленные в таблице 5 (для сравнения применялся тест Манна- Уитни).

Таблица 5 - Сравнительная характеристика привитых больных старше 3-х лет, в зависимости от результата РА

Результат РА Характерные особенности	Диагностический титр и прирост в 4 раза n= 9	Отрицательный n= 2	р
Клинической картины	Среднее количество приступов кашля с репризами, в сутки	10±4,9	10±2,8	0.72
	Наличие апноэ, кол-во чел.	1 (11%)	0	0.81
	Среднее значение t тела,С	37.2±0,4	37.4±0,1	0.91
Общего анализа крови	Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	10,5±5,4	12±4,2	1
	Среднее содержание лимфоцитов, %	50,8±12,4	57,5±3,5	0.24

Статистических различий по всем признакам не выявлено (р>0,05).

3.2 Характеристика больных в группе не привитых

Данная группа состояла из 22 детей в возрасте от 1 месяца до 8лет.

Для подтверждения диагноза применялся посев и РА.

РА не проводилась 6 больным из-за отсутствия диагностикума. Из 16 больных у 5 (31%) положительный результат (увеличение титра антител до диагностического), у 11 (69%) - отрицательный. Материал для РА был взят на 2-5 неделе болезни.

Проанализировав характерные особенности клинической картины и ОАК получены данные, представленные в таблице 6 (для сравнения применялся тест Манна - Уитни).

Таблица 6 - Характеристика не привитых больных в зависимости от результатов РА

Результат РА Характерные особенности	Положительный n=5	Отрицательный n=11	p
Клиническая картина	Среднее кол-во приступов кашля с репризами, в сутки	12,6±4,9	10,3±2,9	0,34
	Наличие апноэ, кол-во чел.	1(20%)	5(45%)	0,43
	Среднее значение t тела, C	36,9±0,3	37,1±0,5	0,91
ОАК	Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	18,1±12,8	19,1±10,6	0,69
	Среднее содержание лимфоцитов, %.	73,8±5,9	79,9±4,86	0,054

Статистических различий по всем признакам не обнаружено (р>0.05).

3.3 Сравнительная характеристика привитых и не привитых

Сравнивая группу привитых и не привитых, выясняли различия в клинической картине. Данные представлены в таблице 7 и 8 . Сравнение производилось с помощью теста Манна- Уитни.

Таблица 7 - Характеристика привитых и не привитых, больных коклюшем с серологически подтвержденным диагнозом

Результат РА Характерные особенности	Привитые n=16	Непривитые n=5	p
Клиническая картина	Среднее кол-во приступов кашля с репризами, в сутки	10,6±4,5	12,6±4,9	0,34
	Наличие апноэ, кол-во чел.	4(25%)	1(20%)	0,71
	Среднее значение t тела, C	37,1±0,4	36,9±0,3	0,43
ОАК	Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	15,5±12	18,1±12,8	0,62
	Среднее содержание лимфоцитов, %.	60,4±16,8	73,8±5,9	0,15

По всем признакам нет различий у привитых и не привитых (р>0.05).

Таблица 8 -Характеристика привитых с серологически подтвержденным диагнозом и не привитых с серологически неподтвержденным

Результат РА Характерные особенности	Привитые положительные n=16	Не привитые отрицательные n=11	р
Клиническая картина	Среднее кол-во приступов кашля с репризами, в сутки	10,6±4,5	10,3±2,9	0,91
	Наличие апноэ, кол-во чел.	4(25%)	5(45%)	0,29
	Среднее значение t тела, C	37,1±0,4	37,1±0,5	0,86
ОАК	Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	15,5±12	19,1±10,6	0,21
	Среднее содержание лимфоцитов,%.	60,4±16,8	79,9±4,86	0,007

У привитых больных с серологически подтвержденным диагнозом достоверно ниже уровень лимфоцитов, чем у не привитх с серологически неподтвержденным диагнозом (р<0.05). По остальным критериям существенных различий не выявлено(p>0.05).

Была проанализирована степень тяжести болезни у привитых и не привитых. Данные представлены в таблице 9. Для сравнения применялся критерий Стьюдента.

Таблица 9 - Распределение больных коклюшем в зависимости от тяжести заболевания и привитости(%)

Степень тяжести	Привитые n= 32	Не привитые n= 22	Р
Легкая	3%	0	0,41
Средняя	91%	82%	0,33
Тяжелая	6%	18%	0,035

У привитых наблюдалась легкая степень тяжести, чего не было у не привитых. Средняя степень наблюдалась с относительно одинаковой частотой у привитых и не привитых детей. Тяжелая степень достоверно чаще встречалась у не привитых, чем у привитых ( р< 0.05).

Были проанализированы титры антител привитых и непривитых. Данные представлены в таблице 10 (для сравнения применялся критерий Стьюдента).

Таблица 10 - Распространенность титров противококлюшных антител у привитых и не привитых

Титр антител	Привитые n=22	Не привитые n=16	р
1:40	2 (9%)	0	00,23
1:80	3 (14%)	2 (12%)	0,89
1:160	8 (36%)	3 (19%)	00,26
1:320	2 (9%)	0	00,23
>1:320	1(5%)	0	00,37
Отрицательный	6 (27%)	110 (69%)	00,01

У привитых больных отмечается увеличение титра антител до 1:320 и выше, чего не встречается у непривитых Отрицательных результатов достоверно больше у непривитых, чем у привитых( р<0.05).

Так же были проанализированы сроки наибольшего нарастание титра антител у привитых и непривитых (4,2±1,2 и 4±1,9 недели, соответственно). Сроки нарастания титра антител не различаются (р>0.05).

3.4 Значение бактериологического и серологических методов исследования

Клиника у всех больных(64 человека) была типичной и проявлялась в периодических приступах кашля с покраснением и цианозом лица, слезоточивостью, отечностью век, выделением тягучей мокроты или рвотой в конце приступа кашля. Из них 39-м (60%) диагноз выставлен на основании только клинической картины.

Посев для выделения культуры произведен всем 64 больным. На 2-4-й неделе от начала кашля посев произведен 54 больным (84%), так как в этот период наибольшая вероятность получения культуры. Выделена культура B.pertussis была у 3(5%). Из них у двоих диагноз подтвержден серологически (прирост антител в 4 раза). У оного больного титр антител был отрицательный (РА поставлена однократно на 2-й неделе, пациент не привит). На более поздних сроках посев произведен 10 больным (у всех B.pertussis не обнаружена).

Таблица 11 - Характеристика больных коклюшем в зависимости от результатов бактериологического исследования

Результат посева на В. pertussis Характерные особенности	Обнаружена B.pertussis n=3	Не обнаружена n=61	p
Клиническая картина	Среднее кол-во приступов кашля с репризами,в сутки	12±3	11,4±6,15	0,43
	Наличие апноэ, кол-во чел.	1(33%)	16(26%)	0,79
	Среднее значение t тела, C	37,2±0,2	37,3±0,6	0,84
ОАК	Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	13,9±3	17,8±9,8	0,66
	Среднее содержание лимфоцитов, %.	69,3±19	69,5±15,8	0,99

Статистических различий не выявлено между больными с бактериологически подтвержденным диагнозом и больными, у которых культура B.pertussis не обнаружена. Вероятно, это связано с малым количеством случаев выявления возбудителя.

РА была поставлена 45 больным. Серологически подтвержден диагноз был у 24 человек (53%), отрицательный результат у 21.

Парные сыворотки поставлены 32 больным (71%). Из них у 12 отрицательный результат. Из тех у кого положительный результат ( 20 человек) титр антител увеличился у 15 больных, у 5 - снизился в течение заболевания.

Были проанализированы клиническая картина и данные общего анализа крови больных, у которых титр противококлюшных антител нарастал и тех, у кого снизился на протяжении заболевания. Сравнение получены данных производилась с больными у которых диагноз подтвержден бактериологически и серологически ( таблица 12 ).

Таблица 12 - Характеристика больных, у которых снижался и увеличивался титр антител в течении заболевания

Характерные особенности	Увеличился титр (1) n= 13	Снизился титр (2) n= 5	Бактериологически подтвержденный диагноз (3) n= 3	Р (1-3)	Р (2-3)
Среднее кол-во приступов кашля с репризами, в сутки	13,5±4,9	8,2±3	12±3	0,84	0,42
Наличие апноэ, кол-во чел.	3 (23%)	2 (33%)	1(33%)	0,79	0,88
Среднее значение t тела,0C	37,1±0,5	37,3±0,3	37,2±0,2	0,36	0,89
Среднее содержание лейкоцитов, 109/л.	17,9±13,1	14,9±11,5	13,9±3	0,84	0,65
Среднее содержание лимфоцитов, %.	69,2±16,5	55,8±14,1	69,3±19	1,0	0,18

Статистических различий не выявлено(р>0.05).

Однократно поставлена РА 13 больным (29%): у 3-х титр антител достигал уровня защитного(1:160- 1:320). У остальных был отрицательным.

Заключение

В результате проделанной работы изучено значение клинической картины и лабораторной диагностики при постановке диагноза: Коклюш. Проведен обзор литературных источников, изучены методики бактериологического исследования и постановки РА в лаборатории ГОИКБ.

Обследовано 64 пациента, находившихся на лечении в ГОИКБ с 2005 года по 2009 год.

У больных преобладали среднетяжелые формы заболевание (88%), тяжелые и легкие формы встречаются редко (10% и 2% соответственно).

Источник инфекции удалось установить у 37 (58%) госпитализированных пациентов.

Анализ возрастной структуры больных показал, что преобладают дети в возрасте до 1 года, а из них 72% детей первого полугодия. Это связано с отсутствием врожденного и поздней выработкой (после трех введений вакцины) поствакцинального иммунитета. Заболевание у взрослых не было зарегистрировано, возможно, это связано с необращаемостью взрослых в лечебные учреждения при наличие длительного кашля.

При анализе половой структуры заболевших выяснилось, что соотношение девочек и мальчиков практически одинаково.

В зависимости от прививочного анамнеза полноты курса АКДС - вакциной пациенты были разбиты на 3 группы. Первая группа - привитые-32 человека (50%). Вторая группа-не привитые-22 человека (34%). Третья группа- не полный курс (V1, V1-V2)-10 человек (16%).

Для определения особенностей серологической диагностики у привитых, они сравнивались с не привитыми детьми. У привитых больных отмечается увеличение титра антител до 1:320 и выше, чего не встречается у непривитых. Отрицательных результатов РА достоверно больше у непривитых, чем у привитых ( р<0.05).Так же наибольшее нарастание титров противококлюшных антител у привитых и не привитых происходил в одинаковые сроки заболевания (на 4 неделе, р>0,05).

Так же были проанализированы клиническая картина и данные ОАК у привитых и не привитых в зависимости от результатов РА. Выяснилось, что по клиническим данным лица с положительным и отрицательным результатом РА не различаются. Это наблюдается как внутри групп привитых и не привитых детей, так и между группами. Т.е. проявления клиники не зависит от присутствия противококлюшных антител у больного.

В ОАК наблюдались различия по содержанию лейкоцитов и лимфоцитов у привитых: эти показатели достоверно выше в группе детей до 3-х лет, чем у детей старше 3-х лет. Возможно, это связано с тем, что в младшей группе у детей нормы по этим показателям выше.

У привитых больных с серологически подтвержденным диагнозом достоверно ниже уровень лимфоцитов, чем у не привитых с серологически неподтвержденным диагнозом (р<0.05).

При сравнении степени тяжести заболевания у привитых и не привитых, выяснилось, что у привитых наблюдалась легкая степень тяжести, чего не было у не привитых. Средняя степень наблюдалась с относительно одинаковой частотой у привитых и не привитых детей. Тяжелая степень достоверно чаще встречалась у не привитых ( р< 0.05).

При выставлении диагноза у 60% больных учитывались только клинико-эпидемиологические данные. Серологически подтвержден диагноз был у 24 человек, бактериологически только у 3.Статистических различий между больными с бактериологически подтвержденным диагнозом и больными, у которых культура B.pertussis не обнаружена нет. Вероятно, это связано с малым количеством случаев выявления возбудителя.

Так же проанализированы данные пациентов, у которых повысился и снизился титр противококлюшных антител на протяжении заболевания, в сравнении с пациентами, у которых получена культура B.pertussis. В результате -различий не выявлено.

Т.о. в настоящее время для постановки диагноза учитывают характерные клинические и гематологические данные. Для достоверного подтверждения коклюша по-прежнему остается выделение чистой культуры возбудителя. Но это затруднительно, т.к. чаще госпитализация больных происходит в поздние сроки, применяются антибактериальные средства в догоспитальный период, играет роль и сложность выделения культуры. Определение титра антител в РА не всегда подтверждает диагноз, что, возможно, связано с низкой чувствительностью РА или со сниженным иммунитетом у заболевших детей. У привитых так же для подтверждения диагноза необходимо выявлять классы иммуноглобулинов (например, с помощью ИФА). Но данных исследований не проводят в ГОИКБ. Учитывая, что коклюшеподобный синдром наблюдается при некоторых респираторных заболеваниях, при обследовании больных для дифференциальной диагностике, при необходимости, стоит применять дополнительные методы исследования.

Список литературы

1. Современные аспекты коклюша у детей //Педиатрия. - 1994. -№ 3. - С. 66-70.

2. Иоффе В.И., Остова П.В., Склярова Н.Н., Козлова Н.А. Коклюш / Микро -биология, иммунология, специфическая профилактика. М: Медицина, 1964.

3. Захарова М.С., Талин О.М., Воробьева А.И., Мяртин Я.К. Коклюш и паракоклюш в Эстонской ССР. - Таллин: Валгус, 1983.- 148с.

4. Маянский А.Н. Микробиология для врачей (очерки патогенетической микробиологии). Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 1999.-400с.

5. Ценева Г.Я., Курова Н.Н. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша и лабораторная диагностика// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2003.- Т. 5. - № 2.- с.329-340.

6. Тимченко В.Н., Бабаченко И.В., Ценева Г.Я. Эволюция коклюшной инфекции у детей. Издание СПбГПМА. Изд-во « ЭЛБИ- СПб », 2005.- 192с.

7. Носов С.Д., Соболева В.Д. Учение о коклюше. М.: Изд-во медицинской литературы Медгиз, 1962.- 279с.

8. Коклюш и паракоклюш - 2009

9. Ларшутин С.А., Смирнов В.Д., Сюндюкова Р.А., Просвиркина Т.Д. Лабораторная диагностика коклюша// Эпидемиология и инфекционные болезни - М., 1998. - № 4.- с.50-52.

10. Синая Г.Я., Биргер О.Г. Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях. М.: Изд-во медицинской литературы Медгиз, 1949.- 456с.

11. Феклисова Л.В., Спирина Г.В., Шобухова Т.С.и другие. Применение новой тест-системы для диагностики коклюшной инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни - М., 2000. - № 2.- с.64.

12. Хордина А.А., Лапаева И.А., Русакова Е.В. Оценка поствакцинального противококлюшного иммунитета с помощью ИФА//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1989.- №1.- с. 50- 54.

13. Галазка А. Иммунологические основы иммунизации/ Модуль 4. Коклюш// ВОЗ, Женева, 1993.

14. Селезнева Т.С. Мониторинг иммуноструктуры детского населения к коклюшу в современных условиях. - 2009

Размещено на Allbest.ru