Роль алельного поліморфізму генів ендотеліальної NO-синтази та протеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань: молекулярно-генетичні аспекти

Таким чином, отримані дані певною мірою пояснюють патогенетичне значення поліморфізму промотору гену еNOS. При порушенні коронарного кровообігу в індивідуумів з С/С варіантом промотору значно меншою мірою активується транскрипція гену eNOS, утворюється недостатня кількість молекул eNOS, яких не вистачає для синтезу додаткової кількості NO. Внаслідок цього судини розширюються меншою мірою, адгезія та агрегація тромбоцитів не попереджується і виявляються недостатніми інші механізми ангіо- та кардіопротекторної дії монооксиду азоту. Питання про функціональну реалізацію поліморфізму 7-го екзону та 4-го інтрону залишається відкритим та потребує проведення подальших досліджень.

Алельний поліморфізм генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми. Робіт, присвячених ролі імунопротеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань нам знайти не вдалося, однак принципове значення цих мультикаталітичних комплексів у презентації внутрішьоклітинних антигенів та можливість експресії субодиниць імунопротеасоми в неімунних тканинах дали нам підстави сподіватися, що алельний поліморфізм генів LMP2 та LMP7 може мати значення в патогенезі ГКС чи артеріальної гіпертензії.

Напротивагу до поліморфізму гену eNOS, генетична варіабельність генів LMP2 та LMP7 при захворюваннях людини вивчена надзвичайно мало, а при серцево-судинних захворюваннях не вивчалася зовсім. За даними генотипування розподіл частот різних алельних варіантів генів LMP2 і LMP7 був майже однаковим в контрольній групі та у хворих із ГКС.

Співвідношення Arg/Arg, Arg/His і His/His варіантів при аналізі поліморфізму гена LMP2 становило 52%, 40.5% і 7.5% відповідно (в контролі - 53.8%, 38.7%, 7.5%; Р>0.05 за ²-критерієм). Алельні варіанти гена LMP7 розподілилися наступним чином: Lys/Lys - 89.5%, Lys/Gln - 10.5%, Gln/Gln - 0% (в контролі - 93.8%, 6.2%, 0% відповідно; Р>0.05). Отже, серед 360 генотипованих осіб не було жодної гомозиготи (Gln/Gln). Це свідчить про те, що в українській популяції цей поліморфізм гена LMP7 зустрічається надзвичайно рідко. Отримані дані свідчать про те, що розподіл частот алельних варіантів генів LMP2 і LMP7 не відрізняється в контрольній групі та в групі хворих із ГКС. Перед усім результати дослідження дозволяють зробити висновок про еволюційну консервативність генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми. Попри те, що гени LMP2 і LMP7 розташовані в надзвичайно варіабельній ділянці 6-ої хромосоми в комплексі з генами, які кодують білки головного комплексу гістосумісності, на сьогодні описано тільки по одному SNP. Ідентичність розподілу алельних варіантів цих генів у хворих із ГКС та у практично здорових осіб опосередковано свідчить про те, що імунні механізми не грають провідної ролі в ініціації атеросклеротичного ураження коронарних судин. Вочевидь, алельний поліморфізм інших генів, зокрема ендотеліальної NO-синтази, значно більшою мірою впливає на ймовірність розвитку серцево-судинних захворювань.

Експресія генів LMP2 та LMP7 та пептидазна активність протеасоми при різних варіантах алельного поліморфізму LMP2 та LMP7. В результаті проведених функціонально-генетичних досліджень нам вдалося встановити значення алельного поліморфізму гена LMP2 у змінах пептидазної (трипсиноподібної та хімотрипсиноподібної) активності протеасоми.

Так, трипсиноподібна активність протеасоми при генотипі Arg/Arg була вище, ніж при генотипі His/His та нижче порівняно з гетерозиготами. Хімотрипсиноподібна активність протеасоми відрізнялася у носіїв різних алельних варіантів аналогічним чином. Найбільша активність спостерігалася у гетерозигот, а найменша - у гомозигот His/His. Найбільш цікавим, на нашу думку, є те, що заміна амінокислоти в субодиниці протеасоми, що забезпечує пептидиглютаміл пептид-гідролазну активність, суттєво впливає на пептидазну (трипсино- та хімотрипсиноподібну) активність інших субодиниць. Це може свідчити про те, що ця заміна впливає на конформацію внутрішнього кільця протеасоми і здатність інших субодиниць імунопротеасоми розщеплювати відповідні субстрати змінюється. Також не виключено, що встановлені зміни активності залежать від процесів зборки чи деградації імунопротеасоми, спричинені заміною аргініну на гістидин. За даними Kisselev A.F. et al. (2003) специфічні інгібітори пептидилглютаміл пептид-гідролазного сайту ізольованої 20S-протеасоми втричі збільшують трипсиноподібну активність, однак не впливають на хімотрипсиноподібну. Одночасно субстрати ₁-субодиниці (містять залишки кислих амінокислот) за алостеричним механізмом зменшують хімотрипсиноподібну активність, а гідрофобні субстрати ₅-субодиниці за рахунок взаємодії з некаталітичними субодиницями протеасоми збільшують активність усіх пептидазних сайтів. Таким чином, є підстави вважати, що пептидилглютаміл пептидгідролазний сайт як конформаційно, так і функціонально впливає на активність інших субодиниць. Зважаючи на те, що пептидилглютаміл пептидгідролазна активність зменшується при формуванні імунопротеасоми, можна припустити, що заміна аргініну на гістидин в LMP2 при алельному поліморфізмі збільшує вказану активність, за рахунок чого зменшується трипсиноподібна активність мультикаталітичного протеїназного комплексу.

Вплив протеасоми та її інгібіторів на активність ендотеліальної NO-синтази. Вивчення функціонального звґязку між протеасомним протеолізом та активністю продукції монооксиду азоту ендотеліальною NO-синтазою дозволило отримати нові дані з цієї проблеми. Зокрема, нам вдалося встановити, що протеасомний протеоліз може суттєво впливати на активність продукції NO ізольованими тромбоцитами, а саме збільшувати активність eNOS. При інкубації тромбоцитів із протеасомною фракцією ІІ із ретикулоцитів кроля (PF II) активність еNOS збільшувалася на 24,6% (Р=0,02). Метильований убіквітин і класто-лактацистин -лактон значною мірою нівелювали цей ефект.

Таким чином, протеасомній деградації за вказаних умов, вочевидь, зазнає не власно еNOS, а якийсь негативний регулятор її активності. Ми припустили, що для запуску убіквітинізації і розщеплення протеасомою еNOS необхідна певна модифікация протеїну. В з'язку з цим ми попередньо інкубували тромбоцити з 1 мМ Н₂О₂, маючи на думці те, що окиснення білка еNOS ініціює процес убіквітинізації. Проте, активність еNOS в тромбоцитах, оброблених Н₂О₂, після інкубації із PF II зростала ще більшою мірою, перевищуючи контрольні значення на 51.3%. Результати наших дослідів добре узгоджуються з даними Govers R. et al. (2003), згідно до яких інгібітори протеасоми (класто-лактацистин бета-лактон та MG132) за 1 годину інкубації попереджують агоніст-індуковане підвищення активності еNOS в ендотеліальних клітинах. При цьому кількість білка еNOS та регулятора активності цього ферменту - кавеоліна-1 - не змінювалася. Результати дослідження дозволили припустити наявність інгібітору еNOS, відмінного від кавеоліна-1 в ендотеліальних клітинах. Отримані нами дані також підтверджують наявність в тромбоцитах інгібітору, що зазнає протеасомного протеолізу протягом однієї години інкубації. Серед можливих кандидатів на роль цього інгібітору, слід перед усім вказати на інші види кавеолінів (кавеолін-2 та 3). Ці гомологічні кавеоліну-1 білки також коекспресуються в плазматичній мембрані разом із еNOS та пригнічують її активність. Відносно кавеоліна-3 отримано дані про можливість його протеасомної деградації, бо інгібітори протеасоми сприяли накопиченню кавеоліна-3 в плазматичній мембрані Galbiati F. et al., 2000. У якості іншого негативного регулятора активності еNOS можна розглядати білок CHIP (carboxyl terminus of Hsp70-interacting protein), який за рахунок ремоделювання молекулярного шаперона еNOS білка HSP90 переводить еNOS з розчинної форми у нерозчинну неактивну форму. Важливо, що CHIP виконує роль убіквітин-лігази для деяких “клієнтів” HSP90, однак, даних про убіквітинізацію еNOS під впливом CHIP досі не отримано. Таким чином, можна говорити, що CHIP також може підлягати протеасомній деградації і саме за рахунок цього підвищується активність еNOS за дії протеасомної фракції. У 2001-2002 роках було відкрито ще два білкових регулятора еNOS - NOSTRIN (eNOS traffic inducer) и NOSIP (eNOS interacting protein) Zimmermann K. et al., 2002. Обидва білки здатні пригнічувати активність еNOS за рахунок передислокації ферменту до субмембранних вакуолярних структур або за рахунок інших механізмів. Ці білки також можна внести до переліку претендентів на роль інгібітору, який зазнає протеасомної деградації.

Протеасомна деградація рекомбінантної ендотеліальної NO-синтази. В результаті експериментів із рекомбінантною eNOS бика встановлено, що після інкубації із протеасомною фракцією ІІ, що містить усі компоненти для убіквітинізації та протеасомної деградації в принципі усіх внутрішньоклітинних білків ссавців, активність рекомбінантної eNOS вірогідно знижується на 9.4 % (Р<0.0001), а інгібітор протеасоми (MG132) попереджує падіння активності ферменту. Останній факт підтверджує, що саме протеолітична активність протеасоми забезпечує зменшення активності eNOS.

Застосування метильованого убіквітину, що запобігає елонгації поліубіквітинового ланцюга, також зменшувало ступінь пригнічення активності рекомбінантної eNOS після інкубації із протеасомною фракцією. Таким чином, пригнічення активності рекомбінантної eNOS мало убіквітин-залежний характер, тобто під час інкубації із протеасомною фракцією відбувалася убіквітинізація та поліубіквітинізація рекомбінантного ферменту, а метильований убіквітин перешкоджав цьому процесу. Отримані дані дають підстави для висновку про можливість убіквітин-залежної протеасомної деградації ендотеліальної NO-синтази, принаймні за умов in vitro. Звичайно, безпосередньо екстраполювати цей факт на умови цілої клітини або організму не можна. Ступінь пригнічення протеасомною фракцією рекомбінантної eNOS була не такою вже значною - до 10% в різних серіях експерименту, що дозволяє припускати наявність більш ефективних, порівняно із протеасомним протеолізом, протеолітичних систем, які мають здатність більш еффективно розщеплювати цей фермент як за штучних умов, та і in vivo.

Протеасомна деградація матричної РНК різних ізоформ NO-синтази. Важливим показником експресії будь-якого гена є стабільність інформаційних РНК (іРНК), що утворюється внаслідок транскрипції та сплайсингу. У роботах французьких дослідників було доведено, що протеасома має окрім трьох пептидазних ще й РНК-азну активність Petit F. et al., 1997. Застосувавши молекулу РНК вірусу табачної мозаїки, вони показали, що як ціла протеасома, так і окремі її субодиниці (zeta та iota) проявляють рибонуклеазну активність. В сучасних роботах припускається, що від активності протеасомного протеолізу залежить строк напівжиття молекул РНК, а врешті-решт рівень експресії певних білків у клітинах. Виходячи з вищенаведеного, та зважаючи на практично повну відсутність даних про можливість руйнування специфічних еукаріотичних РНК ми дослідили можливість протеасомної деградації РНК різних ізоформ NO-синтази. Застосування розробленого нами методу визначення РНК-азної активності протеасоми із використанням зворотної транскрипції з наступною полімеразною ланцюговою реакцією дозволило встановити, що 26S протеасома з PF II ефективно розщеплює РНК.

Інтенсивність протеасомної та РНКазної деградації РНК не відрізняються, тобто ефективність руйнування молекул РНК під дією протеасоми відповідає такій у РНКаз. Також результати дослідів вказали, що класто-лактацистин -лактон пригнічує РНК-азну активність протеасоми тільки в разі достатньо довгої інкубації із PF II (протягом 2 годин), практично повністю попереджуючи деградацію РНК актину и міозину (Р=0.01). Важливо, що класто-лактацистин -лактон не впливав на перебіг зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції, бо інкубація цього інгібітору з РНК не впливала на кінцевий результат (яскравість ампліфікату).

Також було встановлено, що компоненти PF II не впливають на процес зворотної транскрипції та ампліфікації, тому що додавання PF II безпосередньо перед початком зворотної транскрипції не змінювало кількість продукту полімеразної ланцюгової реакції.

В експериментах з оцінкою впливу PF II на результати ампліфікації генів різних ізоформ NO-синтаз було отримано аналогічні результати - інкубація РНК з PF II призводила до руйнування РНК і як наслідок не утворювалися ампліфікати відповідних генів (Р=0.01). Таким чином, за нашими результатами якоїсь специфічності або вибірковості у деградації РНК протеасомою не спостерігається.

Наша спроба попередити руйнування певних РНК із застосуванням олігонуклеотиду, що відповідає послідовності нуклеотидів у РНК iNOS, виявилася невдалою - деградація РНК відбувалася так само інтенсивно. Слід визнати, що вивчення РНКазної активності протеасоми знаходиться на початковому рівні. Досі остаточно не з'ясовано, які саме субодиниці протеасоми забезпечують здатність цього макромолекулярного комплексу до руйнування РНК. В роботі Petit F. та співав. (1997) наводяться докази того, що некаталітичні (по відношенню до білків) -субодиниці протеасоми (zeta та iota) відповідають за РНКазну активність, а перша з них виявляється в клітинах переважно (60-70 %) у мономерному стані як в ядрі, так і в цитоплазмі. В наших експериментах вперше показано, що специфічний інгібітор протеасоми, який взаємодіє саме з пептидазними каталітичними -субодиницями, пригнічує РНКазну активність протеасоми. Не виключено, що під впливом цього інгібітору змінюється конформація усього комплексу і це призводить до порушення здатності протеасоми руйнувати РНК чи зв'язуватися з відповідними послідовностями в молекулах РНК. Пошук ендогенних та синтетичних регуляторів саме РНКазної активності в цьому аспекті відкриває великі перспективи як в розумінні фундаментальних механізмів регуляції стабільності молекул РНК та синтезу білків, так і в можливостях цілеспрямованого впливу на ці процеси опосередковано через протеасомний протеоліз.

Вплив кверцетину на пептидазні активності протеасоми. Отримавши докази залучення протеасоми в регуляцію активності eNOS як на етапі матричної РНК, так і білка, ми замислилися над можливим практичним застосуванням речовин, що впливають на активність протеасоми, як модуляторів продукції монооксиду азоту. Використання інгібіторів протеасоми з цією метою ускладнюється їх надзвичайною високою вартістю та можливими побічними реакціями організму на введення синтетичних речовин.

Поштовх у вирішенні цього питання ми отримали після ознайомлення з роботою, виконаною під керівництвом доктора Ping Dou, що була опублікована у 1998 році. У цій роботі автори навели незаперечні докази того, що поліфеноли із зеленого чаю здатні пригнічувати активність протеасоми, причому ефективність інгібіції відповідає такій у специфічних інгібіторів протеасоми. Структурна аналогія між епігалокатехін-3-галатом, що виявляв найбільшу активність, та біофлавоноїдом кверцетином, властивості якого як кардіопротектору тривалий час вивчалися у відділі експериментальної кардіології під керівництвом академіка О.О. Мойбенка, була настільки очевидною, що ми припустили можливість впливу кверцетину на активність протеасоми.

В експериментах з пурифікованою 20S протеасомою нами вперше показано, що кверцетин дозозалежно пригнічує усі три пептидазні активності протеасоми, причому ступінь пригнічення співставляється з такою при застосуванні специфичного інгібітору протеасоми.

Найбільшою мірою кверцетин, як і специфічний інгібітор, пригнічує хімотрипсиноподібну активність 20S протеасоми - від 80 % до 65 % залежно від концентрації. Трипсиноподібна активність знижувалася на 30 - 10 %, а пептидилглютаміл пептид-гідролазна - на 61 - 50 %. Класто-лактацистин в-лактон виявляє, звичайно, більшу здатність пригнічувати гідроліз специфічних пептидних субстратів. Аналогічним чином кверцетин пригнічує активність 26S протеасоми з PF II, однак ефективність інгібування гідролізу специфічних пептидних субстратів була меншою, ніж у класто-лактацистин -лактона.

При визначенні активності протеасоми в ізольованих кардіоміоцитах було отримано наступні результати: кверцетин на 63.7 % (Р = 0.04) пригнічував хімотрипсиноподібну активність протеасоми, на 26 % (Р = 0.03) - трипсиноподібну і на 34.2 % (Р = 0.16) - пептдилглютаміл пептидгідролазну. Ефект класто-лактоцистин -лактону був, звичайно, більш вираженим і вірогідно знижувалася активність гідролізу усіх трьох флуорогенних субстратів. Таким чином, проведені нами експерименти повністю підтвердили гіпотезу про здатність біофлавоноїдів пригнічувати акивність протеасоми.

Таблиця 3. Кількість (%) живих, некротичних та апоптотичних кардіоміоцитів в контролі, при моделюванні аноксії-реоксигенації та за впливу класто-лактацистин -лактона (2.5 мкМ), кверцетину (2.5 мкМ) і “Корвітину” (2.5 мкМ).

Кверцетин дозозалежно пригнічував і активність пурифікованої протеасоми і протеасомну активність в культурі неонатальних кардіоміоцитів. Порівняння його властивостей із відомими інгібіторами протеасоми (класто-лактацистин в-лактон, MG 132) показало, що він незначно поступається цим речовинам у здатності інгібувати пептидазні активності макромолекулярного протеїназного комплексу. Підтвердженням отриманих нами даних стала робота тієї самої дослідницької групи Ping Dou. У травні 2005 року вони оприлюднили свої дані про антипротеасомні властивості кверцетину та ряду інших біофлавоноїдів Chen D. et al., 2005. У цій роботі також наводяться дані про здатність кверцетину спричинювати загибель пухлинних клітин за рахунок пригнічення активності протеасоми і робиться висновок про перспективність застосування біофлавоноїдів при лікуванні чи профілактиці пухлинних захворювань. Однак, кверцетин, а більшою мірою його водорозчинний аналог “Корвітин”, вже знайшли застосування в лікуванні серцево-судинних захворювань Пархоменко О.М. та ін., 2005 і, можливо, певною мірою кардіопротекторні властивості біофлавоноїдів реалізуються за рахунок впливу на активність протеасоми. Ми перевірили це припущення у дослідах на культивованих кардіоміоцитах і встановили, що в низьких концентраціях (5 мкМ) кверцетин, так само як і “Корвітин”, здатний попереджувати розвиток некротичної та апоптотичної загибелі клітин при відтворенні аноксії-реоксигенації (таблиця 3).

Збільшення концентрації препарату спричинювало загибель клітин як запрограмованим (апоптоз та аутофагія), так і незапрограмованим шляхом. Традиційні інгібітори протеасоми (класто-лактацистин в-лактон, MG 132) виявляли аналогічні властивості, що дозволило нам зробити висновок про те, що пригнічення активності протеасоми під час аноксії-реоксигенації є одним з найбільш важливих механізмів дії кверцетину як кардіопротектору. Ми добре усвідомлювали, що за введення препарату внутрішньовенно, коли неминучою стає взаємодія кверцетину із різноманітними факторами крові, які можуть зв'язувати та інактивувати біофлавоноїд може суттєво знизити здатність цієї речовини впливати на активність внутрішньоклітинної протеїнази. Чи буде кверцетин за умов цілісного організму впливати на активність протеасоми так само, як на ізольовані клітини (кардіоміоцити чи тромбоцити)?

Саме для з'ясування цього питання ми провели експерименти із визначення активності протеасоми в лейкоцитах крові, які виділялися з крові кролів до введення водорозчинного аналогу кверцетину “Корвітину” та через 90 хвилин після інґєкції. Концентрація препарату відповідала лікувальній дозі (5 мг/кг), яку було встановлено в експериментах на собаках та підтверджено в кардіологічній клініці. Результати експериментів показали, що через 90 хвилин після внутрішньовенного введення “Корвітину” протеасомна активність в ізольованих лейкоцитах змінюється по-різному в залежності від виду клітин, в яких вимірювалася хімотрипсиноподібна, трипсиноподібна та пептидилглютаміл пептидгідролазна активність мультикаталітичного протеїназного комплексу. Усі три пептидазні активності протеасоми значно пригнічувалися у нейтрофільних гранулоцитах. Хімотрипсиноподабна активність знижувалася у 2.3 раза (Р=0.038), трипсиноподібна - в 2.1 раза (Р=0.09), а пептидилглютаміл пептидгідролазна - в 2.6 раза (Р=0.047). У моноцитах та лімфоцитах ці зміни були менш суттєвими. Значне зменшення активності протеасоми саме у нейтрофільних гранулоцитах - це факт, що має велике практичне значення, бо саме нейтрофільні гранулоцити становлять переважну більшість клітин в інфільтраті ішемізованого органу. Саме ці клітини несуть відповідальність за вторинну альтерацію та поширення зони інфаркту як серця, так і будь якого іншого органу, навіть після відновлення кровотоку. Отже, є усі підстави вважати, що кардіопротекторні властивості “Корвітину” реалізуються, зокрема, за рахунок впливу на протеасомний протеоліз як у кардіоміоцитах, так і в нейтрофільних гранулоцитах.

ВИСНОВКИ

Сучасними роботами в галузі патологічної фізіології та медичної генетики доведено, що індивідуальні особливості генетичної інформації людини можуть обумовлювати розвиток не тільки відомих моногенних спадкових захворювань, але й полігенних патологій, в тому числі і найбільш поширених серцево-судинних захворювань. Важливим підходом до ідентифікації генотипу людини є визначення алельного поліморфізму генів, зокрема тих, що пов'язані із хворобами серця та судин, серед яких ген ендотеліальної NO-синтази має виняткове значення.

1. При дослідженні частоти алельного поліморфізму промотору (Т^-786>С), 7-го екзону (G⁸⁹⁴>T) та 4-го інтрону (4а/4b) гена ендотеліальної NO-синтази показано, що С/С варіант промотору в 2.7 рази частіше зустрічається у хворих на гострий коронарний синдром, ніж у практично здорових осіб.

2. У виникненні есенціальної артеріальної гіпертензії у дітей та підлітків має значення алельний поліморфізм 7-го екзону (G⁸⁹⁴>T) гена ендотеліальної NO-синтази - Т/Т варіант виявлявся у хворих втричі частіше, ніж у практично здорових осіб.

3. Інтенсивність експресії гена ендотеліальної NO-синтази на 35% менша при С/С генотипі промотору, ніж за Т/Т варіанту промотору, а активність продукції NO тромбоцитами людей з С/С варіантом промотору у 2.1 рази менша, ніж при Т/Т генотипі, що вказує на функціональне значення цього алельного поліморфізму як одного із патогенетичних механізмів серцево-судинних захворювань.

5. Поліморфізм генів, що кодують субодиниці протеасоми (LMP2 та LMP7), дуже рідко зустрічається в українській популяції, а розподіл різних алельних варіантів цих генів не відрізняється у хворих на серцево-судинні захворювання та у практично здорових індивідуумів.

6. Експресія генів LMP2 та LMP7 не залежить від алельного поліморфізму зазначених генів, проте хімотрипсиноподібна та трипсиноподібна активність протеасоми в ізольованих моноцитах залежить від поліморфізму гена LMP2: за алельного варіанту Arg/Arg спостерігається зменшення пептидазних активностей протеасоми, а гетерозиготи (Arg/His) відрізняються найбільшою активністю макромолекулярного протеїназного комплексу.

8. Доведено, що протеасома приймає участь в регуляції активності ендотеліальної NO-синтази в ізольованих тромбоцитах кроля - активація протеасомного протеолізу спричинює вірогідне підвищення активності ферменту на 25 %, а інгібітори протеасоми та метильований убіквітин запобігають цьому ефекту. За умов in vitro рекомбінантна ендотеліальна NO-синтаза також зазнає убіквітин-залежної протеасомної деградації.

9. За допомогою розробленого нами методу доведено, що матричні РНК різних ізоформ NO-синтази розщеплюються 26S протеасомою, а інгібітор протеасоми класто-лактацистин -лактон пригнічує РНКазну активність протеасоми. Цей факт свідчить про участь протеасомного протеолізу в регуляції активності NO-синтази як на посттранскрипційному, так і посттрансляційному рівні.

10. Кардіопротекторні механізми дії біофлавоноїду кверцетину пов'язані із впливом на протеасомний протеоліз, бо зазначений препарат дозозалежно пригнічує усі три пептидазні активності пурифікованої протеасоми та активність цього протеїназного комплексу в культивованих неонатальних кардіоміоцитах. При цьому кверцетин запобігає некротичній та апоптотичній загибелі культивованих кардіоміоцитів при моделюванні аноксії-реоксигенації, однак не зменшує кількість клітин, що гинуть шляхом аутофагії.

13. Внутрішньовенне введення водорозчинного аналогу кверцетину “Корвітину” призводить до значного пригнічення активності протеасоми в нейтрофільних гранулоцитах, що дозволяє використовувати цей лікувальний препарат з метою регуляції активності протеасомного протеолізу при серцево-судинних захворюваннях.

14. Проведені генетичні та патофізіологічні дослідження підтримують сучасний напрямок у медичній генетиці, що відкриває нові можливості ранньої діагностики та індивідуалізації лікування серцево-судинних захворювань за принципами фармакогенетики.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Биць Ю.В., Досенко В.Є., Медведєв В.В. Роль апоптозу в патогенезі атеросклерозу // Фізіологічний журнал.- 2000.-Т. 46.- №5.-С.83-93.

2. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Мойбенко О.О., Пархоменко О.М. Патофізіологічні аспекти генетичного поліморфізму ендотеліальної NO-синтази // Фізіологічний журнал.-2003.-Т.48.-№6.-С.86-102.

3. Веремеенко К.Н., Досенко В.Е., Нагибин В.С., Кизим А.И., Мойбенко А.А. Протеолитические ферменты и апоптоз // Укр. биохимический журнал.-2003.-Т., №4.-С.20-34.

4. Нагібін В.С., Досенко В.Є., Пивовар С.М., Мойбенко О.О., Ягупольский Л.М. Фторований аналог діазоксиду попереджує апоптоз неонатальних кардіоміоцитів під час аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал.-2004.-Т.50, № 3.-С.3-9.

5. Досенко В.Е., Прудников И.М., Цывкин В.Н., Мойбенко А.А. Протеасомальная активность в синаптосомах структур головного мозга при пролонгированном иммобилизационном стрессе // Нейрофизиология.- 2004.-Т.36, №2.-С.121-127.

6. Тумановська Л.В., Досенко В.Є., Нагібін В.С., Макогон Н.В., Мойбенко О.О. Апоптотична, аутофагічна та онкотична загибель кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал.-2004.-Т.50, №5.-С.11-18.

7. Мойбенко О.О., Досенко В.Є., Нагибін В.С., Тумановська Л.В. Особливості клітинної смерті кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Клінічна та експериментальна патологія.-2004.-Т.ІІІ, №2.-С.30-32.

8. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Лутай Я.М., Пархоменко О.М., Мойбенко О.О. Алельний поліморфізм промотору гену ендотеліальної NO-синтази (Т^-786>С) як генетичний предиктор гострого коронарного синдрому // Фізіологічний журнал.-2005.-Т.51, №1.-С.72-76.

9. Досенко В.Є., Лутай Я.М., Загорий В.Ю., Пархоменко А.Н., Мойбенко А.А. Частота аллельного полиморфизма гена эндотелиальной NO-синтазы у больных с острым коронарным синдромом в украинской популяции // Цитология и генетика.-2005.-Т.39.-№2.-С.49-54.

10. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Влияние протеасомного протеолиза на активность NO-синтазы в изолированных тромбоцитах // Укр. биохимический журнал.-2005.-T.77.-С.39-42.

11. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Хайтович Н.В., Гордок О.А., Мойбенко О.О. Алельний поліморфізм гену ендотеліальної NO-синтази та його функціональні прояви // Фізіологічний журнал.-2005.-Т.51, №2.-С.39-45.

12. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Postconditioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death in culture // Фізіологічний журнал.-2005.Т.51.- №3.-С.12-17.

13. Досенко В.E., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Изменения протеасомальной активности и активности нейтральных протеиназ в тканях головного мозга крыс при старении // Нейрофизиология.-2005.-Т.37.-№1.-С.11-14.

14. Пархоменко А.Н., Лутай Я.М., Досенко В.E., Довгань Н.В., Мойбенко А.А. Распространенность, патогенетическое и прогностическое значение полиморфизма промотора гена эндотелиальной NO-синтетазы у больных с острым коронарным синдромом // Укр. кардіол. журнал.- 2005.-№4.-С.20-27.

15. Мойбенко А.А., Досенко В.E., Нагибин В.С. Ферментативные механизмы апоптоза // Пат. физиология и экспериментальная терапия.-2005.-№3.-С.17-26

16. Досенко В.Є. Метод оцінки функціонального значення алельних варіантів гена ендотеліальної NO-синтази // Лабораторна діагностика.-2005.-№2.-С.47-52.

17. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Изменения протеасомальной активности и активности нейтральных протеиназ в лейкоцитах крови и в головном мозге при старении // Успехи геронтологии.-2005.-Вып.17.-С.102-107.

18. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Нагибин В.С., Мойбенко А.А. Влияние N-3-метиладенина на пептидазную и рибонуклеазную активность протеасомы // Укр. биохимический журнал.-2005.-Т.77, №5.-С.52-56.

19. Досенко В.Є., Михальчук Д.В., Загорий В.Ю., Пархоменко А.Н., Мойбенко А.А. Частота аллельного полиморфизма генов, кодирующих каталитические субъединицы иммунопротеасомы, у больных с острым коронарным синдромом // Цитология и генетика.-2005.-Т.39, №6.-С.50-54.

20. Досенко В.Є., Михальчук Д.В., Загорий В.Ю., Хайтович М.В., Мойбенко А.А. Функціональне значення алельного поліморфізму генів, що кодують каталітичні субодиниці імунопротеасоми // Фізіологічний журнал.-2005.-Т.51, №6.-С.3-10..

21. Досенко В.Є., Пашевін Д.О., Биць Ю.В., Мойбенко О.О. Зміни активності протеасоми в тканинах аорти при пролонгованому імобілізаційному стресі // Клін. та експерим. патологія.-2005.-Т.4, №2.-С.32-36.

22. Досенко В.Є., Нагибин В.С., Тумановская Л.В., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Влияние кверцетина на активность 20S, 26S протеасомы и протеасомную активность в изолированных кардиомиоцитах // Биомедицинская химия.- 2006.-Т.52, №2.-С.138-145.

23. Мойбенко О.О., Досенко В.Є., Лутай Я.М., Хайтович М.В., Пархоменко О.М. Алельний поліморфізм гену ендотеліальної NO-синтази у хворих на серцево-судинні захворювання // Доповіді НАН України.-2005.-№12.-С.173-176.

24. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Мойбенко А.А. Протеасомна деградація РНК різних ізоформ NO-синтази // Фізіологічний журнал.-2006.-Т.52, №1.-С.3-7.

25. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Proteasomal proteolysis in anoxia-reoxygenation, preconditioning and postconditioning of isolated cardiomyocytes // Pathophysiology.-2006.-Vol. 13, N2.-P.119-125.

26. Dosenko V.E., Zagoriy V.Yu., Lutay Y., Parkhomenko A., Moibenko A.A. Allelic polymorphism of promoter (T^-786>C), but not that of exon 7 (G⁸⁹⁴>T) or VNTR in intron 4 of the endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with acute coronary syndrome in the Ukrainian population // Clin. Exp. Cardiol.-2006.-Vol.11, N1.-P.11-13.

27. Dosenko V.E., Zagoriy V.Yu., Haytovich N.V., Gordok O.A., Moibenko A.A. Allelic polymorphism of endothelial NO-synthase gene and its functional manifestations // Acta Biochem. Pol.-2006.-Vol. 53, N2.-P.299-302.

28. Хайтович М.В., Досенко В.Є. Вплив генетичних поліморфізмів генів ангіотензин-перетворюючого ферменту та ендотеліальної синтази оксиду азоту на ефективність антигіпертензивної терапії у дітей з артеріальною гіпертензією // Педіатрія, акушерство та гінекологія.-2005.-№3.-С.42.

29. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Moibenko A.A. Phosphocreatine (neoton) prevents necrotic and apoptotic death of cardiomyocytes in modelling of anoxia-reoxygenation // J. Mol. Cell. Cardiol.-2004.-Vol.36.-Issue 5.-P.746.

30. Dosenko V.E., Prudnikov I.M., Cyvkin V.N., Moibenko A.A.Increase of proteasomal activity in cortex and hippocampus synaptosomes in prolonged immobilization stress // Abstracts of Joint 59^th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.24.

31. Dosenko V.E., Mikhalchyuk D.V., Moibenko A.A. Association between allelic variant of immunoproteasome subunits (LMP2, LMP7) and acute coronary syndrome // Abstracts of Joint 59^th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.15.

32. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Moibenko A.A. Proteasomal activity in isolated neonatal cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.13.

33. Zagoriy V.Yu., Dosenko V.E., Moibenko A.A. Age-related changes of proteasomal activity in blood leukocytes and in brain // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. “The ubiquitin proteasome system in health and disease”, (Cirencester, 6-10 Sept., 2004).-P.23.

34. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovskaya L.V., Moibenko O.O. Apoptotic and autophagic death of cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation and at inhibition of proteasome activity // Abstracts of 12^th Euroconference on apoptosis, (Chania, 17-20 Sept. 2004).-P.117.

35. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Autophagic cell death of cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation is prevented by postconditioning. K_ATP-channels dependent effect // Abstracts of 13^th Euroconference on apoptosis “Survival on the Danube”, (Budapest, 1-4 Oct., 2005).-P.58.

36. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A. Proteasome inhibitors as agents of pharmacological preconditioning // Abstracts of 13^th Euroconference on apoptosis “Survival on the Danube”, (Budapest, 1-4 Oct., 2005).-P.161.

37. Dosenko V., Nagibin V., Tumanovskaya L., Yuzkiv M., Moybenko A., Vaage J. Postconditioning in cultured cardiomyocytes: role of proteasomal proteolysis and ATP-sensing K+ channels // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 38, Abstracts 25th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Tromsш, June 21-25, 2005).-Р.1017.

38. Dosenko V., Zagoriy V., Parkhomenko A., Moybenko A. Allelic polymorphism of endothelial NO-synthase gene and its functional manifestations // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 38, Abstracts 25th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Tromsш, June 21-25, 2005).-Р.1083.

39. Lutay Y., Parkhomenko A., Dosenko V., Dovgan N., Moibenko A. Endothelial NOS gene promoter polymorphism has negative prognostic impact after ACS that can be facilitated by smoking // Eur. Heart J.-2005.-Vol.26.-P.156.

40. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovska L.V., Moybenko A.A., Vaage J. Proteasome inhibitors reproduce preconditioning and postconditioning in cardiomyocyte culture // J. Mol. Cell. Cardiology.-2005.-Vol. 40, Abstracts 26th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Manchester, June 14-17, 2006).-Р.936.

АНОТАЦІЇ

Досенко В.Є. Роль алельного поліморфізму генів ендотеліальної NO-синтази та протеасоми в патогенезі серцево-судинних захворювань: молекулярно-генетичні аспекти. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено вивченню ролі алельного поліморфізму гена ендотеліальної NO-синтази та генів, що кодують субодиниці імунопротеасоми, в патогенезі серцево-судинних захворювань. При дослідженні частоти алельного поліморфізму промотору (Т^-786>С), 7-го екзону (G⁸⁹⁴>T) та 4-го інтрону (4а/4b) гена ендотеліальної NO-синтази показано, що С/С варіант промотору в 2.7 рази частіше зустрічається у хворих на гострий коронарний синдром, ніж у практично здорових осіб. Інтенсивність експресії гена ендотеліальної NO-синтази на 35% менша при С/С генотипі промотору, ніж за Т/Т варіанту промотору, а активність продукції NO тромбоцитами людей з С/С варіантом промотору у 2.1 рази менша, ніж при Т/Т генотипі, що вказує на функціональне значення цього алельного поліморфізму. Розподіл різних алельних варіантів генів, що кодують субодиниці протеасоми (LMP2 та LMP7) не відрізняється у хворих на серцево-судинні захворювання та у практично здорових індивідуумів. За допомогою розробленого нами методу доведено, що матричні РНК різних ізоформ NO-синтази розщеплюються 26S протеасомою, а це свідчить про участь протеасомного протеолізу в регуляції активності NO-синтази як на посттранскрипційному, так і посттрансляційному рівні. В експериментах in vitro та на культурі кардіомоцитів показано, що кардіопротекторні механізми дії біофлавоноїду кверцетину пов'язані із впливом на протеасомний протеоліз.

Ключові слова: ендотеліальна NO-синтаза, протеасома, алельний поліморфізм, серцево-судинні захворювання.

Досенко В.Е. Роль аллельного полиморфизма генов эндотелиальной NO-синтазы и протеасомы в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний: молекулярно-генетические аспекты. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2006.

Представлены результаты определения аллельного полиморфизма промотора (Т^-786>С), 7-го экзона (G⁸⁹⁴>T) и 4-го интрона (4b/4a) гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) у больных с острым коронарным синдромом. Установлено, что соотношение аллельных вариантов при анализе Т^-786С полиморфизма промотора составляет 48%, 36% и 16% (в контроле - 48%, 46%, 6%; Р<0.05 по ²-критерию); при анализе G⁸⁹⁴T полиморфизма 7-го экзона - 34%, 58%, 8% (в контроле - 29%, 67%, 4%; Р>0.05), а при определении 4b/4a полиморфизма 4-го интрона - 64,5%, 31% и 4,5% (в контроле - 62,5%, 32,5%, 5%; Р>0.05). Полученные даные свидетельствуют о том, что С/С вариант промотора гена eNOS имеет отношение к увеличению вероятности развития острого коронарного синдрома в украинской популяции. При этом в развитии эссенциальной артериальной гипертензии у детей и подростков имеет значение аллельный полиморфизм 7-го экзона (G⁸⁹⁴>T) гена eNOS - Т/Т вариант встречался у больных в три раза чаще, чем у практически здоровых индивидуумов. Интенсивность экспресии гена eNOS на 35% меньше при С/С генотипе промотора, чем при Т/Т варианте, а активность продукции NO тромбоцитами людей с С/С вариантом промотора в 2.1 раза менше, чем при Т/Т генотипе, что указывает на функциональное значение этого аллельного полиморфизма. Также представлены результаты определения аллельного полиморфизма генов, кодирующих большие мульфункциональные протеазы LMP2 (Arg₆₀His) и LMP7 (Lys₁₄₅Gln). Установлено, что соотношение аллельных вариантов Arg/Arg, Arg/His и His/His при анализе полиморфизма гена LMP2 составило 52%, 40.5% и 7.5% соответственно (в контроле - 53.8%, 38.7%, 7.5%; Р>0.05 по ²-критерию). Распределение аллельных вариантов гена LMP7 было следующим: Lys/Lys - 89.5%, Lys/Gln - 10.5%, Gln/Gln - 0% (в контроле - 93.8%, 6.2%, 0% соответственно; Р>0.05). Полученные даные свидетельствуют о том, что полиморфизм генов, кодирующих каталитические субъединицы протеасомы, не влияет на вероятность развития острого коронарного синдрома в украинской популяции. В экспериментах на изолированных тромбоцитах показано, что при воздействии протеасомной фракции ІІ (PF II) из ретикулоцитов кролика изменяется активность эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). При инкубации соницированных тромбоцитов с PF II активность еNOS увеличивалась на 24.6% (Р=0.02). Метилированный убиквитин и класто-лактоцистин -лактон в значительной степени нивелировали этот эффект. С помощью разработанного метода показано, что матричные РНК различных изоформ NO-синтазы расщепляются 26S протеасомой, а ингибитор протеасомы класто-лактацистин -лактон подавляет РНКазну активность протеасомы, а это свидетельствуют об участии убиквитин-зависимого протеасомного протеолиза в регуляции активности eNOS в регуляции активности NO-синтазы как на посттранскрипционном, так и посттрансляционном уровне. Установлено, что кардиопротекторные механизмы действия биофлавоноида кверцетина связаны с влиянием на протеасомный протеолиз, т.к. указанный препарат дозозависимо угентает пептидазные активности пурифицированной протеасомы и активность этого протеиназного комплекса в культивированных кардиомиоцитах. При этом кверцетин предупреждает некротическую и апоптотическую гибель кардиомиоцитов при моделировании аноксии-реоксигенации.

Ключевые слова: эндотелиальная NO-синтаза, протеасома, аллельный полиморфизм, сердечно-сосудистые заболевания.

Dosenko V.E. The role of endothelial NO-synthase and proteasome allelic polymorphism in pathogenesis of cardio-vascular disease: molecular and genetic aspects. - Manuscript.

Thesis for a doctor of science degree by speciality 14.03.04 - pathological physiology. - O.O. Bogomolets Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kyiv, 2006.

The work is devoted to investigation of the role of promoter (Т^-786>С), exon 7 (G⁸⁹⁴>T) and intron 4 (4b/4a) of endothelial NO-synthase (eNOS) and LMP2 (Arg₆₀His) and LMP7 (Lys₁₄₅Gln) allelic polymorphism in pathogenesis of cardio-vascular disease. Obtained data show that С/С promoter variant of eNOS is in 2.7-fold more frequent at patients with acute coronary syndrome, than in practically healthy subjects. Level of eNOS gene expression is on 35% less at the C/C genotype, than at the T/T variant of promoter. Activity of NO production in platelets of people with the C/C variant of promoter is in 2.1 times less than it is at the T/T genotype. It specifies to the functional value of this allelic polymorphism. Distribution of different allelic variants of LMP2 and LMP7 genes does not differ in patients with cardio-vascular disease and in practically healthy subjects. With the use of developed method it was shown that mRNA of different NOS іsoform hydrolyzed by 26S proteasome, which indicates the participation of proteasomal proteolysis in regulation of the eNOS activity both on posttranscriptional and posttranslational levels. In vitro and cardiomyocyte culture experiments was shown that the cardioprotective mechanisms of quercetin are related to influence on proteasomal proteolysis.

Key words: endothelial NO-synthase, proteasome, allelic polymorphism, cardio-vascular disease.

Размещено на Allbest.ru