Біохімічні, структурно-функціональні та метаболічні зміни консервованої крові людини в процесі зберігання при позитивній температурі

Визначили кореляційну відповідність рО₂ у консервованій крові питомій вазі карбоксигемоглобіну на етапах зберігання, а також концентрацію Hb (НGB). Виявили зниження показника НGB щодо його базового рівня до кінця строку спостерігання в “ГГЦ”- крові на 44,7%, в “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові - на 36,6%. Очевидно, дезінтеграція Нb також сприяла вивільненню О₂ з хімічних зв'язків і його накопиченню в консервованій крові.

Парціальна напруга вуглекислого газу. У першу добу з моменту вилучення крові в донора рСО₂ перевищувала рО₂ у крові, стабілізованій “ГГЦ”, в 2,7 рази; в “ЦФДА-1”-крові - в 2,6 рази, і в “АГЦ”- крові - в 3,2 рази, у той час як у нормі для венозної крові людини рСО₂ перевищує рО₂ тільки в 1,15 разів. Високий показник рСО₂ можна вважати результатом взаємодії цитрату натрію/лимонної кислоти, що входять до складу гемоконсервантів, з бікарбонатом плазми. Оскільки висока концентрація СО₂ збільшує локальну концентрацію протонів (Н⁺), чому сприяє активність цитозольного ферменту карбоангідрази, то, як наслідок, відбувається зниження спорідненості гема до кисню й посилене звільнення О₂. Це дає можливість стверджувати, що підвищене утворення СО₂ у момент “зустрічі” крові з гемоконсервантом може служити пусковим моментом витиснення О₂ зі зв'язку з Нb і подальших оксидативних змін структур еритроцитів. У крові, консервованій “ГГЦ”, у період з 7-ї по 21-шу добу намітилася тенденція рСО₂ до зниження; у період з 28-ї по 42-гу добу зниження рСО₂ стало достовірним. У крові, заготовленій на “ЦФДА-1” та “АГЦ”, у період з 7-ї по 42-гу добу мала місце лише тенденція до зниження рСО₂.

Відзначили пряму достовірну кореляцію між зниженням рН і рівнем рСО₂. Очевидно, на етапах зберігання крові дисоціація оксигема підсилювалася, О₂ поступово дифундував у плазму, і його місце займав СО_2, утворюючи карбогемоглобін. Іншими причинами зниження рСО₂, що досягло достовірного рівня на 28-му добу, можна вважати зв'язування СО₂ у гідрокарбонати й протеїнати. У результаті зазначених хімічних взаємодій надлишок СО₂, що утворився спочатку, на 35-ту добу зберігання консервованої крові вже не спостерігався.

Проведена робота по визначенню динаміки газів консервованої крові призвела до висновку: слід рекомендувати заміну цитрату натрію та лимонної кислоти у складі гемоконсерванта на стабілізатор, який не вступає в хімічні взаємодію з буферними системами консервованої крові.

Таким чином, еритроцити людини з моменту вилучення із кровоносного русла донора й переміщення в штучне середовище гемоконсерванту зазнають осмотичних, механічних, хімічних і температурних впливів, нефізіологічних для живої клітини. Схематичне зображення виявлених у роботі альтерацій структур консервованого еритроцита показано рисунком 5.

Природний захист еритроцитів консервованої крові. Одним з головних компонентів ферментативної ланки системи антирадикального захисту клітин є СОД, що перетворює токсичний супероксиданіон-радикал (*О₂-) у менш токсичний пероксид водню (Н₂О₂) [Чумаков В. Н., Осинская Л. Ф., 1977; Boveris A., 1977; Hassan H.M., Fridovich I., 1983; Agostoni A, Gerli GC, Beretta L. et al., 1980; Барабой В. А., Брехман И. И., Голотин В. Г. і соавт., 1992]. Встановили підвищення активності СОД в еритроцитах крові, заготовленої на всіх узятих для порівняння гемоконсервантах, з 7-ї доби зберігання. Виявили, що даний показник вірогідно зростав: в “ГГЦ”- крові - у період 1 - 14-та доба (на 56,6%), в “ЦФДА-1” крові - 1 - 21-ша доба (на 40,9%), в “АГЦ”- крові - 1 - 28-ма доба (на 41,4%), після чого в “АГЦ”- крові мав тенденцію до зниження, а в “ГГЦ”- і “ЦФДА-1”- крові знижувався. Останнє можна пояснити тим, що білкова природа ферменту в умовах генерації АФК робить його об'єктом неконтрольованоі модифікації, денатурації та фрагментації при прогресуванні явищ оксидативного стресу [Денисенко О.І., 2004]. Отже, адекватне функціонування СОД як антиоксиданту найдовше зберігалося в еритроцитах крові, консервованої “АГЦ”.

Оскільки СОД утилізує *О₂- з утворенням Н₂О₂, очікуваним було підвищення активності каталази [Мазо В. К., 1998; Васильєва И. Ф., 2003]. В 1-шу добу спостерігання в еритроцитах крові, консервованої “ГГЦ”, виявили максимальну напругу активності каталази, що перевищує таку в еритроцитах крові, консервованої “ЦФДА-1” і “АГЦ”, в 3,1 і 3,5 рази відповідно. Це свідчило про більший ступінь накопичення H₂O₂ і необхідність каталазного антипероксидного захисту. Виявили зростання активності ферменту на 240% у період з 1-ї по 14-ту добу в крові, консервованій “ГГЦ”, та на 160% і 178% у період з 1-ї по 21-шу добу в крові, заготовленій на “ЦФДА-1” і “АГЦ”, відповідно. В “ГГЦ”- крові в період 14 - 42-га доба, а в “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові - 21 - 42-га доба активність каталази знизилася (у крові, консервованій “ГГЦ”, на 32,5% відносно 14-ї; у крові, консервованій “ЦФДА-1”, на 50,7%, в “АГЦ”- крові - на 32,0% відносно 21-ї доби). Це могло бути обумовлено: а) гіперпродукцією H₂O₂ (субстратна інгібіція); б) розривом іонних взаємодій ферменту з мембраною й виходом у плазму при наростанні в мембрані явищ ПОЛ [Верболович В.П., Підгірський Ю.К., Підгірська Л.М., 1989; Терьохіна Н.А., Короваїв В.Г., 2003];

Размещено на http://www.allbest.ru/

в) дестабілізацією молекули ферменту.

Виявили високий ступінь кореляційного зв'язку активності каталази й СОД (“ГГЦ”- еритроцити: r=0,82, р<0,05; “ЦФДА-1”- еритроцити: r=0,89, р<0,05; “АГЦ”- еритроцити: r=0,93, р<0,01), що відповідає даним літератури, яка свідчить про синергізм роботи СОД і каталази в першій лінії антиоксидантного захисту клітини [Мазо В.К., 1998; Кулинский В.И., 1999].

Вивчили зміни активності глутатіонпероксидази в консервованій крові. Установили, що в 1-шу добу після заготівлі крові в донора активність ГП в “ГГЦ”-еритроцитах вірогідно перевищувала таку в “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- еритроцитах. Далі в еритроцитах крові, заготовленої на всіх узятих для порівняння гемоконсервантах, активність ГП підвищувалась, що свідчить про зростання концентрації гідроперекісних сполук, досягаючи вірогідно високого рівня на 7-му добу. На 42-гу добу спостерігання показник активності ГП перевищив первісний в еритроцитах крові, консервованої “ГГЦ”, в 2,1 рази; у “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові - в 1,9 рази. Це свідчить про функціонування ГП еритроцитів на всьому протязі строку зберігання гемотрансфузійного середовища і про найвищу напруженість роботи даної системи в еритроцитах крові, консервованої “ГГЦ”, мабуть, обумовлену найбільшим ступенем накопичення гідроперекісних сполук.

Активність глутатіонредуктази на етапах зберігання консервованої крові. На 7-му добу спостерігання встановлене підвищення активності ГР щодо вихідного. В еритроцитах крові, консервованої “ГГЦ”, найбільш висока активність ГР була виявлена в 1-14-ту добу, зростання щодо базового рівня склало 104,9%, що свідчило про накопичення окисленого глутатіону - субстрату для ГР - до зазначеного етапу спостерігання. У період 21-ша - 42-га доба активність ферменту знизилася, можливо, через: а) субстратну інгібіцію, б) альтерації молекули. У крові, консервованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”, до 21-ї доби розходження в активності ГР встановлені не були, відзначене підвищення на 168,9 і 171,6% відповідно. Далі в еритроцитах крові, консервованої “ЦФДА-1”, активність ГР знизилася, у той час як в еритроцитах “АГЦ”- крові продовжувала підвищуватися до 28-ї доби з наступною тенденцією до зниження. У період 28-ма - 42-га доба рівень активності ГР в “АГЦ”- еритроцитах вірогідно перевищував такий в “ГГЦ”- і “ЦФДА-1”- еритроцитах, що свідчило про ефективніше функціонування ферменту.

Визначили високі коефіцієнти кореляції при зіставленні рівня активності ГР і концентрації NO₃^- у крові, консервованій “АГЦ” і “ЦФДА-1”, у зв'язку із чим припустили, що ГР, здійснюючи антиоксидантну дію, сприяла нейтралізації активних форм азоту.

Зміни концентрації відновленого глутатіону на етапах зберігання консервованої крові. Відомо, що концентрація ВГ в еритроцитах in vivo, in vitro і в консервованій крові з часом знижується [Baur G., Iung A., Wendel A., 1982; Suzuki T., Agar N.S., Suzuki M., 1984]. Ми встановили, що в 1-шу добу в зразках еритроцитів крові, заготовленої на альтернативних гемоконсервантах, рівень ВГ не розрізнявся. Далі концентрація ВГ поетапно знижувалася, досягаючи вірогідних значень щодо вихідних на 7-му добу спостерігання. У період 7-ма - 14-та доба рівень ВГ в еритроцитах “ГГЦ”- крові був нижчим, ніж в “АГЦ”- і “ЦФДА-1”- крові. З 21-ї по 35-ту добу даний показник істотно не відрізнявся від такого в “ЦФДА-1”- крові, але був нижчим, ніж в “АГЦ”- крові. З 35-ї по 42-гу добу рівень ВГ у крові, консервованій “АГЦ”, перевищував такий у крові, консервованій “ГГЦ”, але не відрізнявся від показника “ЦФДА-1”- крові. До 42-ї доби втрата еритроцитами ВГ до кінця строку спостерігання склала: у крові, консервованій “ГГЦ”, 67,1%; у крові, консервованій “ЦФДА-1” і “АГЦ”, 66,5 і 66,3% відповідно. Зменшення вмісту ВГ в консервованих еритроцитах було обумовлене наступним:

1. Зниження енергетичного метаболізму. Установлено відповідність поетапних змін кількості ВГ в консервованому еритроциті кількості АТФ, 2,3-ДФГ і аденіну. Високі коефіцієнти прямої кореляції свідчили про те, що зниження енергоутворення негативно позначається на ефективності здійснення антиоксидантного захисту.

2. Витрата ВГ на підтримку нативної структури біологічно значимих макромолекул (так званий “дефіцит споживання”). Значимість ВГ як природного антиоксиданту для збереження структур консервованих еритроцитів підтверджується високими коефіцієнтами кореляції між його витратою й показниками деструкції фосфоліпідного бішару мембрани (поетапне зростання елюації ФС, ФЕ в плазму).

3. Підвищена продукція АФК при зниженні активності ферментів відновлення ВГ (ГР й Г-6-ФДГ) і інших ферментів. Установлено високі коефіцієнти прямої корелятивної відповідності концентрації ВГ активності ЛДГ в еритроцитах і відсутність такої при зіставленні з активністю Г-6-ФДГ. Останнє, можливо, мало місце через нелінійність змін активності ферменту на етапах зберігання консервованих еритроцитів (установлене прогресуюче зниження концентрації ВГ й параболічний характер зміни активності Г-6-ФДГ). Виявлено негативну кореляцію показників концентрації ВГ й активності цитозольних ферментів ЛДГ і Г-6-ФДГ у плазмі, що свідчить про залежну від часу дезінтеграцію еритроцитів.

Використання консервованим еритроцитом білірубіну як антиоксиданту. Відомо, що стресові умови, що розвиваються в гемотрансфузійному середовищі в ході його “старіння”, викликають лізис еритроцитів з накопиченням гема в плазмі [Жибурт Е. Б., 2000]. Незв'язаний гем, будучи потужним прооксидантом, стимулює утворення вільних радикалів і активує ПОЛ з наступним ушкодженням біомолекул мембран еритроцитів [Wagener F.A.D.T.G.A., Eggert А., Boerman O.C., 2001]. Захист від прооксидантної дії гема здійснює ГО-1 [Maines M.D., 1997; Otterbein L.E., Choi A.M.K., 2000]. Bi, що утворюється при впливі ГО-1 і білівердінредуктази, є одним із найпотужніших природних антиоксидантів [Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И., 2003].

Виявили, що у всіх зразках крові, стабілізованої альтернативними гемоконсервантами, у першу добу спостерігання рівні загального, вільного й зв'язаного Ві перебувають у референтних межах, однак у крові, заготовленій на гемоконсервантах, які містять аденін і фосфат натрію, вміст загального Ві істотно нижче, ніж у крові, консервованій “ГГЦ”. Це можна пояснити більшим ступенем травматизації еритроцитів у момент їхнього потрапляння в середовище “ГГЦ”, виходом гемоглобіну із клітини й перетворенням його на Bi внаслідок дії ГО-1 і білівердінредуктази лейкоцитів. У крові, консервованій “ГГЦ”, найбільш високий рівень загального Bi спостерігався протягом 1-ї - 7-ї доби консервації. Концентрація вільного Bi на даному етапі перевищувала показник “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові в 1,5 - 1,8 і 1,8 - 1,6 разів відповідно. Є логічним, що “ГГЦ”- клітини в момент їхнього переміщення в середовище гемоконсерванту і в наступні 7 діб перебували в стресових умовах, що вимагають максимальної напруги функціонування ГО-1. На пізніших строках спостерігання (14-42 доба) статистично достовірних відмінностей даного показника в порівнянні між зразками крові, заготовленої на альтернативних гемоконсервантах, не виявили. Установили можливість впливу Bi як антиоксиданту на ступінь дезінтеграції структур консервованих еритроцитів, визначивши достовірну пряму кореляцію рівня Bi з поетапними змінами гематокриту, зворотну - з рівнем позаеритроцитарного Hb, активністю Г-6ФДГ і ЛДГ у плазмі. На пізніх етапах зберігання крові, консервованої всіма досліджуваними гемоконсервантами (28-ма - 42-га доба), низькі концентрації Bi не забезпечували достатній рівень антиоксидантного захисту.

Антиоксидантна дія монооксиду карбону. Відомо, що СО, який є регулятором гуанілатциклази, забезпечує антиапоптозний і антиоксидантний ефект [Otterbein L.E., Choi A.M.K., 2000]. У нашому дослідженні в першу добу після переміщення донорських еритроцитів у середовище гемоконсерванта визначалася максимальна концентрація СО в еритроцитах (13,98; 8,55 і 11,51 ммоль/л відповідно), що могло бути обумовлене його інтенсивним утворенням внаслідок високої активності ГО-1. Висока концентрація СО у перші 14 діб вказувала на наявність у консервованих еритроцитах ефективного антиоксидантного захисту за рахунок роботи системи ГО-1-СО, причому в “АГЦ” - консервованих еритроцитах у період 1-ша - 14-та доба відзначено найвищий рівень СО у порівнянні з “ГГЦ”- і “ЦФДА-1”- консервованими еритроцитами (р<0,05). В цей період в еритроцитах “ГГЦ”-, “ЦФДА-1”- і “АГЦ”- крові відзначене зниження рівня СО, можливо, обумовлене оксидативною дестабілізацією молекули ГО-1, а також його споживанням як антиоксиданту, що, відповідно до даних літератури, могло сприяти зниженню концентрації Н₂О₂ у клітині й, відповідно, зменшенню ступеня ПОЛ [Sa, Zhi-Sheng; Huang, Li-Qin; Wu, Guo-Lin et al., 2007]. Щоб підтвердити або відкинути даний постулат, вивчили кореляційний зв'язок між концентрацією СО на етапах спостереження й активністю СОД і каталази в еритроцитах (табл. 3).

Таблиця 3

Матриця корелятивного зв'язку кількості СО і активності ферментів-антиоксидантів

Відсутність достовірної корелятивної відповідності зазначених показників не дала можливості точно визначити “точку дії” СО як антиоксиданту (за винятком статистично достовірної відповідності СО - активність каталази в “ГГЦ”- еритроцитах, що, можливо, мала місце через більше накопичення пероксидів). Підвищений рівень СО в еритроцитах, консервованих розчинами, що містять аденін і фосфат натрію, свідчив про більш виражений СО-гемоксигеназний антиоксидантний захист. Починаючи з 21-ї доби, утворення/витрата СО перебували на практично постійному рівні. Очевидно, СО активно реалізував свою антиоксидантну функцію в “ГГЦ”- стабілізованих еритроцитах протягом 2/3 строку їхнього зберігання, в “ЦФДА-1”- еритроцитах - менше половини строку зберігання, в “АГЦ”- еритроцитах - до 2/3 строку зберігання. Можливо, потреба у витраті СО еритроцитами “АГЦ”- крові була нижче, ніж “ЦФДА-1”- і “ГГЦ”-еритроцитами. Роль СО як антиоксиданту для консервованих еритроцитів показана нами вперше.

Сечовина консервованої крові як антиоксидант. Відомо, що сечовина втримується в крові в частково зв'язаному з гемоглобіном і сироватковим альбуміном вигляді. Завдяки тропності до металів змінної валентності, сечовина перешкоджає утворенню metHb [Коровина Н. А., Захарова И. Н., Обыночная Е. Г., 2003], а також проявляє антиоксидантні властивості, скорочуючи число залізовмісних центрів ПОЛ [Гершенович З.С., Кричевская А.А., Лукаш А.И., 1970].

Ми встановили, що в першу добу після вилучення крові в донора рівень сечовини в плазмі відповідав нормі; з 7-ї (“ГГЦ”) - 14-ї доби (“ЦФДА-1” і “АГЦ”) він почав знижуватися. Оскільки в штучних умовах, створених консервуванням, у донорській крові синтез сечовини неможливий, так само як і подальший її катаболізм, можна припустити витрату даної речовини як антиоксиданту, що підтверджується й витратою білірубіну, яка відбувалася в тісному достовірному кореляційному зв'язку з витратою сечовини: r=0,96, p<0,01 для всіх досліджуваних зразків.

Вірогідно нижчий вміст сечовини в крові, консервованій “ГГЦ”, у період 14-21 доба, свідчить про інтенсивнішу її витрату, отже, про більшу потребу еритроцитів в антиоксидантному захисті і про його здійснення. Роль сечовини як антиоксиданту при зберіганні консервованої крові показана нами вперше.

Клінічне застосування еритроцитвмістних гемотрансфузійних середовищ, заготовлених з використанням альтернативних гемоконсервантів, для корекції анемічного синдрому. Після переливання еритроцитної маси з крові, заготовленої на “ГГЦ” і “ЦФДА-1”, ми відзначили зменшення ступеня важкості анемії у хворих дифузно-осередковою формою множинної мієломи в 100% випадків. На всіх етапах спостерігання мали місце статистично достовірні розходження RBC, МСН, МСНС, HGb і КП: дані показники в реципієнтів “ЦФДА-1”- консервованих еритроцитів вірогідно перевищували відповідні показники в реципієнтів еритроцитної маси із крові, консервованої “ГГЦ”. Застосування “ЦФДА-1”- еритроцитної маси ефективніше, ніж застосування еритроцитів, консервованих “ГГЦ”, усувало тканинну гіпоксію. Очевидно, порівняно високий середній рівень насичення О₂ популяції молекул Hb у реципієнтів “ЦФДА-1”- ЕМ був обумовлений циркуляцією в кровоносному руслі донорських еритроцитів з вищим вмістом органічних фосфатів у порівнянні із еритроцитами “ГГЦ”- крові. Беручи до уваги встановлений нами факт більш високої концентрації в “ЦФДА-1”- еритроцитах 2,3-ДФГ, який грає основну й провідну роль у виконанні донорським еритроцитом кисневотранспортної функції, можна вважати ступінь порушення транспорту О₂ до тканин у хворих після переливання “ЦФДА-1”- ЕМ меншою. Крім того, ЕМ стимулювала в реципієнтів еритропоез, про що свідчило підвищення кількості еритроцитів у периферичній крові щодо вихідного рівня на 15-ту добу: у реципієнтів “ГГЦ”- консервованих клітин - на 21,6%, у реципієнтів “ЦФДА-1”- еритроцитів - на 31,8% при трансфузії однакової дози цього компоненту крові.

Висновки

Отримано важливі результати, що формують рішення поставленої проблеми визначення тригерів і ланок ланцюга альтерацій консервованих еритроцитів, на які можливо впливати підбором моделюючих добавок у рецептуру гемоконсервантів. Оцінка вихідного стану проблеми - додавання неорганічного фосфату й аденіну в рецептуру гемоконсервантів “ЦФДА-1” і “Адглюфоцит” - показала їхню перевагу перед консервантом “Глюгіцир”, який не має в складі зазначених метаболітів, у строках збереження морфології й функцій донорських еритроцитів. Однак і ці гемоконсерванти не можуть забезпечити морфофункціональну повноцінність еритроцитів в пізні строки їх зберігання, хоча найкращі консервуючі властивості були визначені в розчині “Адглюфоцит”. Отже, оцінка проявів альтерацій консервованого еритроцита й виявлені “слабкі ланки” у його захисті надали можливості вказати на необхідність: а) розробки рецептур гемоконсервантів з інгредієнтами, що справляють на еритроцит модулюючу дію; б) заміни стабілізатора системи згортання крові на такий, що не вступає в реакцію з бікарбонатами плазми.

1. Проведені з використанням автоматичного гематологічного аналізатора й люмінесцентної мікроскопії дослідження показали, що еритроцити в процесі зберігання консервованої крові піддаються морфометричним змінам. Їх кількість поетапно убуває, досягаючи вірогідно низького значення в порівнянні з вихідним: у крові, заготовленій на консервантах “Глюгіцир” і “ЦФДА-1”, - після закінчення 2/3 встановленого нормативно-технічною документацією строку придатності, а в крові, консервованій розчином “Адглюфоцит”, - до кінця зазначеного строку. Змінюється форма еритроцитів від дискоцитів через оборотні (ехіноцити, стоматоцити) варіанти в необоротні (акантоцити, сфероцити) з наступною дезінтеграцією. Кількість сферульованих еритроцитів зі зниженим показником об'єму вище в більш ранній строк у крові, заготовленій з застосуванням “Глюгіцир”. Дисксферотрансформація еритроцитів в “Глюгіцир”- крові протікає з поетапним зменшенням об'єму клітин. У крові, консервованій розчинами “ЦФДА-1” і “Адглюфоцит”, накопиченню сфероцитів передує етап збільшення діаметра еритроцитів (з чотирнадцятої по двадцять першу добу). Гемоконсервант “ЦФДА-1” так само, як і “Глюгіцир”, в останню третину установленого строку придатності гемотрансфузійних середовищ не зберігає нормальний морфологічний статус основної маси клітин. Гемоконсервант “Адглюфоцит” проявляє порівняно вищу здатність віддаляти в часі настання необоротних змін у популяції еритроцитів.

2. Ключова роль у формуванні реологічного стану консервованої крові належить еритроцитам, перехід асоціації яких в “монетні стовпчики” до структур більш високого порядку вірогідно збільшує в'язкість консервованої крові. На пізніх строках її зберігання зниження в'язкості обумовлене накопиченням еритроцитів зі зменшеним діаметром, а також зниженням гематокриту.

3. Із трьох узятих для порівняльних досліджень гемоконсервантів тільки “Глюгіцир” створює середовище, у якому еритроцити поетапно накопичують глюкозу. Гемоконсерванти “ЦФДА-1” та “Адглюфоцит” забезпечують стабільніше протікання її катаболізму. Висока концентрація глюкози в складі гемоконсерванту поряд з позитивними сторонами (резерв субстратів для гліколізу, пентозофосфатного й 2,3-діфосфогліцератного шунтів) має й негативну - глікозилювання гемоглобіну, що погіршує транспорт газів крові. Існує достовірна зворотна кореляція показників рівня глікозильованого гемоглобіну й концентрації глюкози в плазмі крові, заготовленої на гемоконсервантах “Глюгіцир” і “Адглюфоцит”, які містять підвищену кількість глюкози на 1мл цільної крові.

4. Гемоконсерванти “ЦФДА-1” і “Адлгюфоцит” підтримують вищу концентрацію макроергічних сполук відносно консерванту “Глюгіцир”, отже, віддаляють в часі дисксферотрансформацію еритроцитів. Енергетична забезпеченість консервованих еритроцитів на етапах зберігання має негативний кореляційний зв'язок з відносною кількістю необоротно змінених еритроцитів. Зниження рівня аденозинтрифосфату і внутрішньоклітинне накопичення катіонів кальцію дестабілізують фосфоліпідну складову мембрани консервованих еритроцитів, тож існує взаємозв'язок енергетичної забезпеченості, транспортування катіонів і фізіологічного розподілу фосфоліпідів у плазматичній мембрані.

5. Підвищення концентрації катіонів натрію збільшує вміст глюкози й води в консервованих еритроцитах, впливає на їх морфометричні характеристики і сприяє накопиченню популяції клітин зі збільшеним діаметром. Катіони натрію й кальцію, діючи аддитивно з водою, мають причетність до прогресування дисксферотрансформації еритроцитів. Вивчення гідроосмотичних ефектів у консервованому еритроциті з використанням методу ЯМР-релаксометрії сприяє розумінню сутності конверсії дискоїдної форми еритроцита в сферичну.

6. Підвищення рівня глюкозо-6-фосфатдегідрогенази й лактатдегідрогенази у плазмі консервованої крові може служити показником дезінтеграції консервованих еритроцитів. Активність лактатдегідрогенази у плазмі є не тільки достовірним, але й більш раннім, у порівнянні з гематокритом, показником адаптованості/ушкодження еритроцита в умовах консервації. Зберігання еритроцитів при позитивній температурі супроводжується елюацією у плазму структурних фосфоліпідів внутрішнього моношару мембрани - фосфатидилетаноламіну й фосфатидилсеріну, що є наслідком порушення фізіологічної транслокації фосфоліпідів. Втрата фосфатидилетаноламіну й фосфатидилсеріну мембраною консервованих еритроцитів приводить до зменшення діаметра останніх і сферуляції.

7. Ланка сигнального шляху запрограмованої загибелі клітини, якою є експресія фосфатидилсеріну на поверхні плазматичної мембрани, притаманна і консервованому еритроциту, що було підтверджено за допомогою біохімічного набору для детекції апоптозу.

8. Високий показник парціальної напруги вуглекислого газу в момент консервування крові є результатом взаємодії цитрату натрію/лимонної кислоти (складових гемоконсервантів) з бікарбонатами плазми. Зниження цього показника та підвищення парціальної напруги кисню під час зберігання консервованої крові свідчать про поступове витискання кисню з оксигемоглобіну діоксидом карбону. Крім того, накопичення молекулярного кисню є наслідком його заміщення у молекулі гемоглобіну на оксид азоту, монооксид карбону, а також перекісного окислення ліпідів мембрани.

9. Оксид азоту справляє біфункціональний вплив на структури консервованого еритроцита. У першій половині строку спостерігання підвищення рівня стабільних метаболітів оксиду азоту є свідченням зростання його концентрації внаслідок активного функціонування L-аргінін-NO-системи, спрямованого на модуляцію кисневотранспортної функції еритроцита. Поступове підвищення концентрації метаболітів оксиду азоту здійснює цитотоксичний вплив на консервований еритроцит, що підтверджується зростанням кількості клітин із включенням тілець Гейнца-Эрліха.

10. Консервованому еритроциту притаманні такі шляхи загибелі, як эриптоз - без'ядерна стадія апоптозу, та осмотичний гемоліз. Використання люмінесцентного барвника Lucifer yellow є об'єктивним методом індикації клітин з високим ступенем дезінтеграції, специфічним для еритроцитів, які зазнають апоптичних змін мембрани.

11. Консервований еритроцит використовує для захисту від оксидативних впливів природні антиоксиданти, такі як ферменти (супероксиддисмутаза, глутатіонпероксидаза, каталаза, глутатіонредуктаза) та речовини неферментної природи (глутатіон, білірубін, монооксид карбону, сечовина).

Список опублікованих робіт

1. Бондарь С.И., Малыш П.Н. Адглюфоцит - первый отечественный гемоконсервант. Проблемы и перспективы внедрения в работу учреждений службы крови Украины // Український журнал клінічної та лабораторної медицини. Луганськ, 2006. Т.1, №2. С. 77-82.

2. Гудзенко О.П., Малиш П.М. Новий вітчизняний гемоконсервант і очікувана ефективність його впровадження // Вісник фармації. Харків, 2005. № 4 (44). С. 56-57.

3. Комаревцева И.А., Малыш П.Н., Письменная Т.В., Золотаревская М.В. Изучение проявлений оксидативного стресса в эритроцитах консервированной крови на этапах хранения // Укр. мед. альманах. Луганськ, 2005. Т.8, №4. С. 95-98.

4. Малыш П.Н. Билирубин и антиоксидантная защита консервированных эритроцитов // Медико-социальні проблеми сім'ї. Донецьк, 2006. Т.11, №2. С. 143-148.

5. Малыш П.Н. Кальций и консервированные эритроциты // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2006. Т.7, №1. С. 76-79.

6. Малыш П.Н. Консервированная кровь: катионтранспортная функция мембраны эритроцита // Український морфологічний альманах. Луганськ, 2005. Т.3, № 4. С. 58-60.

7. Малыш П.Н. Лактатдегидрогеназа как показатель дестабилизации консервированных эритроцитов в процессе хранения // Проблеми військової охорони здоров'я. Зб. наук. пр. Укр. військ.-мед. акад. Київ, 2006. Вип.17. С. 586-592.

8. Малыш П.Н. Некоторые показатели дестабилизации консервированных эритроцитов // Український журнал гематології та трансфузіології. Київ, 2007. №2(7). С. 34-37.

9. Малыш П.Н. Реологический статус консервированной крови на этапах хранения // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2007. Т.8, №1. С. 58-62.

10. Малыш П.Н. Эритроптоз - миф или реальность? // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2006. Т.7, №2. С. 62-65.

11. Малыш П.Н. Фосфолипиды мембраны консервированного эритроцита и зависимость их стабильности от энергетического статуса клетки // Український журнал клінічної та лабораторної медицини. Луганськ, 2007. Т.2, №1. С. 65-71.

12. Малиш П.М., Гаврик С.Ю., Гусакова В.Я., Ласточкіна О.В. Досвід роботи Луганської обласної станції переливання крові по підвищенню інфекційної безпеки засобів гемокомпонентної терапії // Лабораторна діагностика. Київ, 2005. №3(33). С. 19-22.

13. Малиш П.М., Комарєвцева І.О., Золотаревська М.В. Вивчення рівня глюкози в еритроцитах консервованої донорської крові на етапах зберігання при позитивній температурі // Галицький лікарський вісник. Івано-Франківськ, 2005. Т.12, ч. 4. С. 60-62.

14. Малыш П.Н., Комаревцева И.А., Золотаревская М.В. Изучение уровня монооксида углерода в эритроцитах консервированной крови на этапах хранения при позитивных температурах // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2005. Т.6, №3. С. 62-65.

15. Малыш П.Н., Комаревцева И.А., Золотаревская М.В. Консервированные эритроциты и гликозилированный гемоглобін // Український медичний альманах. Луганськ, 2005. Т.8, № 6. С. 47-49.

16. Малыш П.Н., Комаревцева И.А., Золотаревская М.В. Монооксид углерода как показатель антиоксидантной защиты консервированных эритроцитов // Український морфологічний альманах. Луганськ, 2005. Т.3, №3. С. 45-47.

17. Малыш П.Н., Комаревцева И.А., Золотаревская М.В. Углеводный обмен в эритроцитах донорской крови, консервированной рецептурами, содержащими аденин // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2005. Т.6, №4. С. 66-69.

18. Малиш П.М., Комаревцева І.О., Климочкіна О.М. та співавт. Дослідження рівня похідних оксиду азоту в консервованій крові донорів на етапах зберігання при позитивних температурах // Медична хімія. Київ, 2005. Т.7, №3. С. 92-94.

19. Малиш П.М., Комарєвцева І.О., Письменна Т.В. Вивчення резистентності еритроцитів консервованої крові на етапах зберігання при позитивних температурах // Український медичний альманах. Луганськ, 2005. Т.8, №3. С. 125-129.

20. Малыш П.Н., Комаревцева И.А., Торопцева Е.Л., Гусакова В.Я. Кальций, магний и запрограммированная гибель консервированных эритроцитов // Медико-социальні проблеми сім'ї. Донецьк, 2005.Т.10, №3,4. С. 72-76.

21. Малыш П.Н., Новак В.Л., Гусакова В.Я., Письменная Т.В., Примак С.В. Изменение концентрации АТФ и 2,3-БФГ в аспекте эритроптоза // Український медичний альманах. Луганськ, 2006. Т.9, №3. С. 87-90.

22. Малиш П.М., Орлова О.А., Комарєвцева І.О., Письменна Т.В., Гусакова В.Я. Вивчення фізико-хімічних процесів в консервованих донорських еритроцитах на етапах зберігання при позитивних температурах // Український медичний альманах. Луганськ, 2004. Т.7, № 6. С. 100-102.

23. Малиш П.М., Письменна Т.В., Гусакова В.Я., Оленич В.В., Якубенко О.Д. Вивчення рівня аденіну в плазмі донорської крові, стабілізованої рецептурами “Глюгіцир” та “ЦФДА-1” // Медико-социальні проблеми сім'ї. Донецьк, 2005. Т.10, №2. С. 116-120.

24. Малиш П.М., Письменна Т.В., Гусакова В.Я. Морфометричні зміни в консервованих донорських еритроцитах на етапах зберігання при позитивних температурах // Український морфологічний альманах. Луганськ, 2005. Т.3, №1. С. 48-52.

25. Малыш П.Н., Письменная Т.В., Гусакова В.Я. Неорганический фосфор и органические фосфаты на этапах хранения консервированной крови // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2006. Т.7, №3. С. 26-30.

26. Малиш П.М., Письменна Т.В., Торопцева О.Л., Самуйлова О.Л., Гусакова В.Я. Перспективи розвитку методів консервування донорської крові в закладах служби крові Луганської області // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2005. Т.6, №1. С. 80-84.

27. Малыш П.Н., Торопцева Е.Л., Самуйлова Е.Л., Джевага Ю.В., Письменная Т.В., Гусакова В.Я. Изучение электролитного обмена эритроцитов донорской крови // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2005. Т.6, №2. С. 62-65.

28. Малыш П.Н., Фролова Е.В. Клиническая эффективность применения эритроцитной массы для коррекции анемического синдрома при множественной миеломе // Український медичний альманах. Луганськ, 2007. Т.10, №1. С. 99-101.

29. Малыш П.Н., Фролова Е.В. Некоторые аспекты трансфузионной терапии ДВС-синдрома в акушерстве // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О. Можаєва. Луганськ, 2005. Т.6, №1(Д). С. 46-51.

30. Новак В.Л., Бондарь С.И., Малыш П.Н. К вопросу о применении тары из пластифицированного поливинилхлорида в практической деятельности учреждения службы крови // Вестник гигиены и эпидемиологии. Донецьк, 2004. Т.8, №2. С. 293-297.

31. Малыш П.Н. К вопросу о повышении инфекционной безопасности гемотрансфузионной терапии // Сучасні проблеми трансфузіології: Матеріали науково-практичної конференції (3-4 червня 2004 р.). Харків, 2004. Гематологія і переливання крові. 2004. №32. С. 75-77.

32. Малыш П.Н., Фролова Е.В. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа как показатель жизнеспособности консервированных эритроцитов // Гемостаз - проблеми та перспективи: Матеріали II міжнародного симпозіуму (8-9 листопада 2006 р.). Київ, 2006. Гематологія і переливання крові.- 2006. №33. С. 129-133.

33. Малыш П.Н., Новак В.Л., Гусакова В.Я., Письменная Т.В., Золотаревская М.В. Билирубин и антиоксидантная защита консервированных эритроцитов // Актуальні та невирішені питання гематології та трансфузіології: Матеріали V міжнародного симпозіуму (1-2 червня 2006 р.). Київ, 2006. Нове в гематології та трансфузіології. 2006. Вип. 5. С. 49-57.

34. Гудзенко А.П., Малыш П.Н., Агафонова Е.В., Могильникова И.В. Луганская область: проблемы и перспективы инфекционной безопасности препаратов из донорской крови // Державна реєстрація, технологія виробництва, контроль якості і клінічне застосування препаратів крові: Матеріали Всеукраїнського семінару з міжнародною участю (2-3 листопада 2006 р.). Луганськ, 2006. Український журнал клінічної та лабораторної медицини. 2006. Т.1, №2. С. 73-76.

Анотація

Малиш Павло Миколайович “Біохімічні, структурно-функціональні та метаболічні зміни консервованої крові людини в процесі зберігання при позитивній температурі”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеню доктора медичних наук, за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. - Луганський державний медичний університет, м. Луганськ, 2007 р.

Дисертацію присвячено визначенню альтераційних та регуляторних систем, сигнальних шляхів ушкодження та загибелі консервованих еритроцитів людини. В основі роботи лежить вивчення біохімічних, структурно-функціональних та метаболічних змін консервованої крові в процесі зберігання.

Встановлено тригери загибелі консервованих еритроцитів: механічна травма клітин крові при вилученні з кровообігу донора та переміщенні до штучного середовища; вплив інгредієнтів гемоконсерванту, таких як глюкоза в високій концентрації (розвиток осмотичного стресу, глікозування гемоглобіну), стабілізатори системи згортання (вступаючи до реакції з бікарбонатами плазми, останні створюють надмірну кількість вуглекислоти, що є пусковим моментом для витискання кисню із зв'язку з гемоглобіном, індукції активних форм кисню та розвитку оксидативного стресу).

Робота є першою, в якій виявлено ознаки апоптичних процесів в консервованих еритроцитах, такі як екстерналізація фосфатидилсеріну та фосфатидилетаноламіну на поверхні мембрани, внутрішньоеритроцитарне накопичення катіонів кальцію, зниження об'єму клітини. Вперше встановлено, що в консервованому еритроциті функціонує система захисту від оксидативного впливу активних форм кисню та азоту, що включає високо- та низькомолекулярні речовини. Отримані результати надають можливості розвитку наукових уявлень про бажану композицію гемоконсервантів та сприяють новим дослідженням щодо розробки антиоксидантних стимулів для консервованих еритроцитів людини.

Ключові слова: кров, гемоконсервант, ЯМР-релаксація, оксид азоту, еритроцит, мембрана, фосфатидилсерін, фосфатидилетаноламін, ериптоз.

Аннотация

Малыш Павел Николаевич “Биохимические, структурно-функциональные и метаболические изменения консервированной крови человека в процессе хранения при позитивной температуре”. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук, по специальности 14.01.32 - медицинская биохимия. - Луганский государственный медицинский университет, г. Луганск, 2007 г.

Диссертация посвящена определению альтерационных и регуляторных систем, сигнальных путей повреждения и гибели консервированных эритроцитов человека. В основе работы лежит изучение биохимических, структурно-функциональных и метаболических изменений консервированной крови в процессе хранения при позитивной температуре.

Результаты исследований показали, что эритроциты с момента изъятия из кровеносного русла донора и перемещения в искусственную среду гемоконсерванта испытывают осмотические, механические, химические и температурные влияния, нефизиологичные для живой клетки. Эритроциты противостоят этим влияниям, используя природную систему защиты, по мере истощения которой повреждаются метаболические пути, нарастают морфологические (дисксферотрансформация) и морфометрические изменения, конечным итогом которых является деструкция клеток.

Впервые установлено, что основные пути гибели консервированных эритроцитов инициируются несколькими триггерами: механической травматизацией при извлечении клеток крови из кровеносного русла донора и перемещении в искусственную среду; влиянием на компоненты крови ингредиентов гемоконсерванта, таких как глюкоза в высокой концентрации, стабилизаторы свертывающей системы (цитрат натрия, лимонная кислота). Последние, вступая в реакцию с бикарбонатами плазмы, образуют избыточное количество углекислого газа, что является пусковым моментом для вытеснения кислорода из связи с гемоглобином, индукции активных форм кислорода и развития оксидативного стресса в консервированных эритроцитах.

Впервые обнаружено, что накопление молекулярного кислорода в консервированной крови по мере её “старения” является следствием перекисного окисления липидов мембраны, а также замещения кислорода в молекуле гемоглобина на углекислый газ, монооксид углерода, оксид азота. Показано, что последний оказывает бифункциональное воздействие на структуры консервированного эритроцита. На ранних этапах повышение уровня его стабильных метаболитов свидетельствует об активном функционировании L-аргинин-NO-системы, направленном на модуляцию кислородтранспортной функции эритроцита. В дальнейшем достигнутая высокая концентрация метаболитов оксида азота оказывает цитотоксическое влияние на консервированный эритроцит, что подтверждается поэтапным нарастанием количества эритроцитов с включениями телец Гейнца-Эрлиха.

С 21-х - 28-х суток хранения консервированных эритроцитов выявлены альтерации трансмембранного перехода катионов, что нашло выражение в потере калия и магния и накоплении натрия и кальция. Последние, действуя аддитивно с водой, способствуют дисксферотрансформации эритроцитов. Впервые выявлена взаимосвязь нарушений транспорта катионов, энергетической обеспеченности, физиологического распределения фосфолипидов в плазматической мембране и морфометрических показателей эритроцитов консервированной крови. Установлено, что снижение уровня АТФ и внутриклеточное накопление катионов кальция способствуют потере мембраной фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина, что приводит к уменьшению диаметра и сферуляции консервированных эритроцитов. Следовательно, в путях гибели консервированного эритроцита присутствуют признаки апоптических процессов, такие как экстернализация фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина на поверхности мембраны, внутриэритроцитарное накопление катионов кальция, снижение объема клетки.

Впервые установлено, что в консервированном эритроците функционирует система защиты от оксидативных воздействий активных форм кислорода и азота, используется работа высокомолекулярных веществ (гемоглобин, ферменты супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, каталаза), а также низкомолекулярных веществ (глутатион, билирубин, мочевина, монооксид углерода).

В работе показано, что усовершенствование гемоконсервантов имеет значение для эффективной трансфузиологической коррекции гематологических патологий. Так, введение в консервант аденина и фосфата натрия не только оказало благоприятное воздействие на морфофункциональное состояние эритроцитов донора, но также имело позитивное влияние на эритропоэз и синтез гемоглобина в специализированных клетках эритроидного ряда у реципиентов гемотрансфузионных эритроцитсодержащих сред - больных множественной миеломой с анемическим синдромом.

Результаты настоящего исследования, подтвердив эффективность нового отечественного гемоконсерванта “Адглюфоцит” в обеспечении морфофункциональной полноценности консервированных эритроцитов, могут быть использованы при создании усовершенствованных консервирующих растворов для крови и взвешивающих растворов для эритроцитов донора. Полученные результаты, анализ и оценка многообразия выявленных альтераций донорских эритроцитов развивают научные представления о композиции гемоконсервантов и могут быть использованы в поиске антиоксидантных стимулов для консервированных эритроцитов человека.

Ключевые слова: кровь, гемоконсервант, ЯМР-релаксация, оксид азота, эритроцит, мембрана, фосфолипиды, катионы, эриптоз.

Summary

Malysh Pavel Nikolaevich. Biochemical, structured-functional and metabolic changes of the human canned blood in the process of keeping under positive temperature. - Manuscript.

Dissertation for a Doctor's of medical science degree on speciality 14.01.32 - medical biochemistry. - Lugansk state medical university, Lugansk, 2007.

The thesis is dedicated to determination of alterative and regulatory systems, signal ways of canned human erythrocytes damage and ruins. This work is based on the studying of biochemical, structured-functional and metabolic changes of canned blood in process of keeping.

There are installed triggers of canned human erythrocytes death: the mechanical trauma of the blood cells at the time of extraction from donor's circulatory system and displacement to the artificial ambience; the influence of haemo-conserving agent ingredients such as glucose in high concentration (the development of osmotic stress, glicateness of hemoglobin), the stabilizers of the rolling up systems (taking part in the reaction with bicarbonate of the plasma that form the surplus amount of the carbonic acid that is an activate moment for displacing the oxygen from bonding with hemoglobin and for induction of the active forms of the oxygen and development of oxidative stress in canned human erythrocytes).

Work is the first determination of apoptotic processes signs in canned human erythrocytes such as phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine externalization on the membrane surface, calcium ions intracellular accumulation, the cell volume reduction. It is for the first time installed that in canned human erythrocytes the system of protection from active forms of the oxygen and nitrogen oxidative influence functions, that includes the high-molecular (the hemoglobin, superoxide dismutase, cathalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase) and low-molecular (glutathione, bilirubine, urea, carbon monoxide) substances.

The got results develop the scientific conceptions about haemo-conserving agent's composition and promote new studies on the antioxidant stimulus development for human canned erythrocytes.

Key words: blood, haemo-conserving agent, NMR relaxation, nitrogen oxide, erythrocyte, membrane, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, eryptosis.

Список скорочень

Размещено на Allbest.ru