Центромерна нестабільність та поліморфізм хромосом в нормі і при патології людини

В спеціальній літературі представлено лише 2 роботи, в яких постулюється позитивний зв'язок між індукцією повного ПРЦ під впливом солей миш'яку та напруженістю апоптозу в трансформованих клітинах HeLa (S. Huang et al., 2000) і фібробластах людини (L.H. Yih, T.C. Lee, 2003). В нашій роботі закономірність даного зв'язку обґрунтовано для короткочасних культур гемопоетичних клітин людини, що є максимально наближеним до практики медико-генетичних досліджень.

Обов'язковою умовою ефективної індукції апоптозу в G1 фазі циклу є збереження функціональної активності білка-супресора пухлин P53 дикого типу, дисфункція якого асоціюється з формуванням анеуплоїдних клітин з високою онкогенною здатністю (K. Matsumoto, T. Ohta, 1993; M. Castedo et al., 2004). За сучасними поглядами, які розвивають концепцію B. Dutrillaux (1991), найбільш вірогідним джерелом утворення анеуплоїдних клонів є поліплоїдія, що виникає внаслідок ендоредуплікації диплоїдного набору хромосом. Питання про цитогенетичні ознаки клітини-попередника ендоредупліканта було нез'ясованим. Ми припустили, що найбільш вірогідним кандидатом на цю роль є фенотип повного ПРЦ. Якщо уявити, що клітина з повним ПРЦ увійде в наступний мітотичний цикл, то після реплікації вона з високою ймовірністю набуде вигляду, який відповідає класичній конституції ендоредуплікованої поліплоїдної клітини (рис. 3).

За повної відсутності поліплоїдії в контролі, такі клітини зареєстровано в усіх випадках, які відзначились достовірною маніфестацією повного ПРЦ: 0,6-1,8 на 100 м.п. в культурах крові і кісткового мозку хворих на гемобластози і СХН та 0,7-8,2 на 100 м.п. в культурах пренатальних тканин. Зразки пренатального матеріалу продемонстрували значну міжтканинну варіабельність за рівнем маніфестації повного ПРЦ і поліплоїдії. Так, при 15% повного ПРЦ в ГЕПК рівень поліплоїдних клітин не перевищував 1%, тоді як в цитотрофобласті хоріону удвічі нижчий рівень індукції повного ПРЦ асоціювався з підвищеною продукцією поліплоїдії: 7,4±1,7 і 2,2±0,8 на 100 м.п. відповідно. Найбільш парадоксальні відмінності за рівнем індукції повного ПРЦ і поліплоїдії зареєстровано в амніоцитах: 2,1±0,5 та 8,2±1,0 на 100 м.п. відповідно. Ми припустили, що причиною виявлених відмінностей за частотою появи поліплоїдних клітин в тканинах з виразною індукцією повного ПРЦ може бути різниця в експресії білка P53 дикого типу - провідного індуктора апоптозу клітин в G1 фазі циклу. За результатами порівняльно-імуногістохімічних досліджень зразків цитотрофобласту хоріону і ембріональної печінки людини, нами вперше встановлено достовірну експресію P53 в 60%-70% ГЕПК, тоді як клітини цитотрофобласту хоріону відзначились значною експресією його антагоніста Bcl-2. Отримані результати дозволяють пов'язати різницю у ступені поліплоїдизації клітин цитотрофобласту хоріону і ГЕПК з тканиноспецифічним профілем експресії індукторів та протекторів апоптозу. В ГЕПК, клітини з повним ПРЦ вірогідно завершують свій життєвий цикл шляхом індукції p53-залежного апоптозу і тому не вступають в подальший редуплікаційний цикл з відтворенням поліплоїдного каріотипу. Правомірність даного положення засвідчують і найвищі показники індукції апоптозу в ГЕПК порівняно з іншими модельними об'єктами, зареєстровані за результатами застосування 3-х незалежних методів детекції апоптозу (табл. 2). В цитотрофобласті хоріону частка клітин з повним ПРЦ вірогідно уникає апоптозу за рахунок експресії Bcl-2, що надає їм можливість ендоредуплікації в наступному мітотичному циклі з відтворенням поліплоїдних клітин. Отже, індукція повного ПРЦ асоціюється з апоптичною загибеллю постмітотичних клітин, а в поєднанні із зниженою експресією P53 дикого типу загрожує продукцією поліплоїдії в наступному мітотичному циклі.

Узагальнюючі проведені дослідження центромерної нестабільності в короткочасних культурах соматичних клітин людини, ми вважаємо, що індукція передчасного розділення центромер (ПРЦ) мітотичних хромосом - це закономірна реакція геному у відповідь на екзогенне або ендогенне пошкодження ДНК, а також вірогідний елемент генетичних програм, пов'язаних з процесами тканинної диференціації, онкогенної трансформації та клітинної загибелі. Часткове ПРЦ є вірогідним наслідком генотоксичного впливу і маніфестує послідовно з індукцією хромосомних аберацій, а його виникнення можна розглядати як результат інактивації центромерного білкового комплексу внаслідок локальної хромосомної ламкості. Індукція часткового ПРЦ загрожує клітині втратою хромосом та утворенням анеуплоїдії і асоціюється з ризиком онкогенної трансформації. Індукція повного ПРЦ відбувається в клітинах з нестабільним геномом, які не змогли здійснити ефективну репарацію пошкоджень ДНК або індукцію апоптозу в G2 фазі циклу і увійшли в мітоз. Індукція повного ПРЦ попереджує ефективний перебіг мітотичного поділу, через що клітина опиняється в G1 фазі з тетраплоїдним вмістом ДНК, де за умов повноцінної експресії P53 дикого типу, гине шляхом апоптозу. Аномальна експресія P53 асоціюється з уникненням апоптозу та вступом клітини з повним ПРЦ в подальший мітотичний цикл, що загрожує продукцією поліплоїдії та утворенням анеуплоїдних дочірніх клітин з високою онкогенною здатністю.

Основні характеристики С-поліморфізму хромосом в пренатальний та постнатальний період нормального онтогенезу людини

При аналізі С-поліморфізму хромосом 1, 9, 16 і Y в лімфоцитах in vitro здорових осіб, які представляли досліджену популяцію, виявлено 5 класів С-варіантів. Модальним класом виявились С-сегменти 3-бальної величини, які зустрічались на 55-66% досліджених хромосом 1, 9, 16 пар та 80% Y-хромосом. 2-бальні та 4-бальні С-варіанти склали 10-20% та 8-30% хромосом відповідно, тобто зустрічались практично з однаковою частотою. С-сегменти розмірами 1 і 5 балів та випадки повних перицентричних інверсій 9 хромосоми розглядались як екстраваріанти С-поліморфізму (ЕВП) і були зареєстровані 7,8% обстежених осіб, з них 5,8% виявилися носіями одного і 2% - двох ЕВП в каріотипі. Отримані дані вказують на нормальний розподіл С-поліморфних варіантів в дослідженій популяції і незначну частку носіїв екстраваріантів, що узгоджуються з результатами інших досліджень, виконаних із застосуванням аналогічного методу (Т.Г. Цветкова, 1981; О.А. Подугольникова с соавт., 1981).

Достовірно підвищену частоту С-сегментів 4-бального розміру виявлено в клітинах цитотрофобласту ex vivo та амніоцитах in vitro порівняно з лімфоцитами постнатально обстежених осіб на хромосомах 9 пари (56-70% і 34% відповідно, P<0,01) і 16 пари (23-30% і 9% відповідно, P<0,01). За результатами напівкількісного та кількісного аналізу С-поліморфізму в ГЕПК встановлено достовірне зменшення лінійних розмірів С-сегментів на хромосомах 1, 9 та 16 порівняно з лімфоцитами постнатально обстежених осіб, що узгоджується з даними власних попередніх досліджень (Г.Р. Акопян, 1988). ГЕПК і клітини цитотрофобласту також відзначились достовірним вкорочення гетерохроматинової ділянки довгого плеча Y-хромосоми (Yqh-), про що свідчила достовірно підвищена частота реєстрації невеликих 2-бальних С-сегментів: 40-53% та 11% в лімфоцитах відповідно (P<0,01). Частота реєстрації 1- і 5-бальних С-сегментів та повних перицентричних інверсій виявилась однаковою в клітинах пренатального і постнатального походження, тоді як рівень часткових перицентричних інверсій достовірно перевищував показники лімфоцитів: у цитотрофобласті на хромосомах 1 пари (13,3% та 0% відповідно, P<0,01) та в цитотрофобласті і амніоцитах на хромосомах 9 пари (33,3-46,8% і 6,7% відповідно, P<0,01). Отже, за результатами порівняльно-онтогенетичних досліджень не виявлено відмінностей за частотою носійства класичних екстраваріантів С-поліморфізму хромосом 1, 9, 16 і Y (1- і 5-бальних С-сегментів та повних перицентричних інверсій). При цьому, клітини цитотрофобласту і амніоцити відзначились достовірно більш високою частотою реєстрації 4-бальних макроваріантів і часткових перицентричних інверсій, а гемопоетичні ембріональні печінкові клітини - 2-бальних мікроваріантів С-поліморфізму.

Абсолютні розміри С-сегментів хромосом 1, 9, 16 і Y в ГЕПК ex vivo виявились відповідними до параметрів фібробластів in vitro спонтанних і артифіціальних абортусів, визначених С.А. Назаренко (1992) на основі запропонованого нами методу. Це вказує на закономірний характер виявленої різниці у розмірах гетерохроматинових районів в ГЕПК та лімфоцитах постнатально обстежених осіб. Вірогідною причиною відносного зменшення розмірів С-сегментів в ГЕПК ми вважаємо прискорення клітинного циклу в попередниках ембріональних еритроцитів, спрямоване на підвищення їх проліферативної активності в процесі реалізації програми печінкового еритропоезу. Це не виключає можливості стадіоспецифічної мінливості балансу конститутивного гетерохроматину в ранньому онтогенезі людини, яку пов'язують з необхідністю активації ембріоспецифічних генів (А.А. Прокофьева-Бельговская, 1986; О.А. Подугольников; В.Г. Солониченко, 1994; Т.В. Кузнецова, 2000).

Потребували пояснення знахідки підвищеної частоти носійства макроваріантів і часткових перицентричних інверсій в матеріалі цитотрофобласту і клітин амніотичної рідини. Відмінності за їх частотою порівняно з лімфоцитами постнатально обстежених осіб були настільки значними, що виключали можливість успадкування, а відтак, вказували на високу ймовірність утворення згаданих С-варіантів в соматичних клітинах de novo. Зважаючи на відсутність повідомлень про можливість локальної ампліфікації сателітних ДНК в нетрансформованих клітинах людини, ми припустили, що причиною формування фенокопій макроваріантів і часткових перицентричних інверсій в культивованих клітинах цитотрофобласту і амніотичної рідини є деконденсація прицентромерного гетерохроматину. Це узгоджується з результатами досліджень, в яких доведено мінливість ступеня деконденсації прицентромерного гетерохроматину в культурах цитотрофобласту і амніотичної рідини (D. Cruz et al., 1999; M. Ehrlich et al., 2001; F. Tsien et al., 2002), виникнення якої в клітинах цитотрофобласту зумовлене гіпометильованим станом С-гетерохроматину (Т.В. Кузнецова, 2000; А.А. Пендина, 2002, F. Tsien et al., 2002). Отже, значна частка макроваріантів С-поліморфізму і часткових перицентричних інверсій в досліджених зразках цитотрофобласту хоріону ex vivo та амніоцитах in vitro є вірогідними фенокопіями конститутивних С-варіантів, які формуються в соматичних клітинах внаслідок деконденсації прицентромерного гетерохроматину. Відтак, представлялось доцільним оцінити структуру хромосомного поліморфізму при патологічних станах у людини в аспекті вірогідної деконденсації ділянок конститутивного гетерохроматину.

С-поліморфізм хромосом при патологічних станах у людини

При порівнянні з контролем не виявлено відмінностей за частотою екстраваріантів С-поліморфізму хромосом 1, 9, 13-16, 21, 22 та Y в контингенті пацієнтів з невиношуванням вагітності (табл. 3). В групі подружніх пар з непліддям, серед чоловіків достовірно переважали носії Y-хромосоми із вкороченою гетерохроматиновою ділянкою (Yqh-), за повної відсутності таких випадків в контролі (10,2%, ч2=6,0, P<0,02). Підвищений відсоток носіїв Yqh - також виявлено серед пацієнтів з азооспермією і нормальним каріотипом (17,9%, ч2=16,8; P<0,01), серед жінок з псевдочоловічим гермафродитизмом і каріотипом 46, XY (18,2%, ч2=7,69, P<0,01), а також в контингенті пацієнтів з трисомією-21 та серед їх батьків (10% та 6% відповідно, ч2=11,3 та 7,3; P<0,01). Отримані результати узгоджуються з даними літератури про підвищену частоту високої делеції Y-хромосоми серед пацієнтів з непліддям і азооспермією та доцільність врахування даного С-поліморфного варіанта для визначення причини репродуктивних порушень в родині.

Значна поширеність високої делеції Y-хромосоми в контингенті пацієнток з чоловічим псевдогермафродитизмом виявлена нами вперше і потребує подальших досліджень. Пацієнти чоловічої статі з порушеннями фертильності та батьки дітей з трисомією-21 також відзначились достовірно підвищеною частотою повної перицентричної інверсії 9 хромосоми: 15,4% та 12,3% носіїв відповідно при 2,2% в контролі (ч2=6,5, P<0,02). Отже, за результатами дослідження С-поліморфізму хромосом 1, 9, 16, Y, D, G в контингентах високого ризику за народженням анеуплоїдного потомства, високовірогідну асоціацію з нерозходженням хромосом та формуванням клініки непліддя і народження дітей з трисомією-21 продемонстрували С-поліморфні варіанти Yqh - та 9ph+, тобто висока делеція довгого плеча Y-хромосоми та повна перицентрична інверсія гетерохроматину на хромосомах 9 пари.

Випадки верифікованих хромосомних анеуплодій (трисомія-21, X-моносомія, синдром Клайнфельтера) та батьки пацієнтів відзначились підвищеною частотою носійства макроваріантів С-поліморфізму, розміри яких перевищували 4-бальні: 42,5-44,4% носіїв при 4,5% в контролі (ч2=19,5-28,2; P<0,01). Найбільш часто великі С-сегменти локалізувались на хромосомах 9 пари (42,7% всіх зареєстрованих ЕВП), наступним за частотою виявилось збільшення коротких плеч акроцентричних хромосом, переважно Dph+ (18,2% всіх ЕВП), і порівняно рідко ЕВП локалізувались на хромосомах 1 і 16 пар (9,4% та 8,7% відповідно). Якщо здорові особи переважно були носіями 1 ЕВП, то в контингентах пацієнтів і їх батьків достовірно переважали носії декількох макроваріантів (10,8-28,6% носіїв при 2,2% в контролі, ч2=4,1-19,1; 0,001<P<0,05). Виявлене нами майже 10-кратне перевищення популяційних показників за частотою реєстрації макроваріантів С-поліморфізму та випадків носійства декількох макроваріантів серед пацієнтів з хромосомними анеуплоїдіями та їх батьків суперечили можливості їх успадкування і дозволяло розглядати як вірогідні фенокопії макроваріантів, що утворилися de novo в соматичних клітинах.

Відомо, що деконденсація С-гетерохроматину може бути індукована гормональними чинниками і притаманна для гормон-продукуючих тканин плаценти та щитоподібної залози. Це підтверджується результатами наших досліджень стосовно достовірно підвищеної реєстрації макроваріантів та часткових перицентричних інверсій в клітинах цитотрофобласту хоріону. Аналогічні параметри С-поліморфізму виявлено в лімфоцитах пацієнтів з порушеннями статевої диференціації, фертильності та схильності до народження анеуплоїдного потомсва, у яких дисбаланс гонадотропних, стероїдних або тиреоїдних гормонів відіграє провідну роль в патогенезі захворювання. Згідно гіпотези D. D'Souza із співавторами (1988), існує висока ймовірність «ендогенного мутагенезу», зумовленого гормональним дисбалансом. Все це створює підстави для асоціації явища деконденсації прицентромерного гетерохроматину з індукцією нестабільності геному внаслідок тривалого гормонального дисбалансу, а з іншого боку, дозволяє розглядати фенотип макроваріанту та часткової перицентричної інверсії як прояви хромосомної нестабільності.

Дане положення підтверджується результатами реєстрації підвищеного рівня хромосомної нестабільності в культивованих лімфоцитах носіїв макроваріантів, встановлених за даними літератури (В.Г. Дружинин, 1991) та власних досліджень. Парадоксально високий рівень часткових перицентричних інверсій знайдено нами в матеріалі цитотрофобласту хоріону, для якого доведено прямий зв'язок між деконденсацією гетерохроматину та індукцією хромосомної нестабільності (F. Tsien et al., 2002; T. Suzuki et al., 2002). В досліджених нами випадках порушень статевої функції у чоловіків з нормальним каріотипом 40% виявились носіями макроваріантів (4,5% в популяції), а в 10% досліджених культур відмічено достовірну індукцію хромосомної нестабільності з реєстрацією хромосомних аберацій та (або) ПРЦ більше ніж в 4% м.п. Часткові перицентричні інверсії 9 хромосоми зареєстровано у кожної другої пацієнтки з вторинною аменореєю та нормальним каріотипом і лише у 4-6% випадках первинної аменореї та популяційного контролю. При цьому, групи пацієнток з первинною аменореєю різного ґенезу (в асоціації з нормальним каріотипом, X-моносомія, XY-жінки) не відрізнялись за параметрами С-поліморфізму, хоча в усіх випадках продемонстрували достовірне перевищення популяційних показників за частотою реєстрації макроваріантів. Отримані результати узгоджуються з даними літератури стосовно високої частоти носійства макроваріантів і часткових інверсій С-сегментів, а також щодо підвищеної індукції хромосомної нестабільності при порушеннях менструальної функції різного генезу (И.Г. Дзенис, 1982; H.-A. Freye, K. Zernahle; И.П. Кривич, 1990; Е.А. Кириллова, Т.Г. Цветкова, 1994) і підтверджують правомірність положення про неспецифічність фенотипу С-поліморфізму у випадках поліетіологічного гормонального дисбалансу (Е.А. Кириллова, Т.Г. Цветкова, 1994).

Узагальнюючі все вище викладене, ми вважаємо, що фенотип макроваріанту хромосомного С-поліморфізму може перманентно виникати в соматичних клітинах людини під дією чинників, здатних порушувати метаболізм гетерохроматину та індукувати його деконденсацію. Зважаючи на вагому роль метилювання гетерохроматину у збереженні його конститутивного фенотипу та функціональних властивостей (M. Ehrlich, 2003; T. Cheutin, 2003), можна припустити зв'язок індукції макроваріантів С-поліморфізму в соматичних клітинах з локальним дефіцитом метилювання або гіпометилюванням геному в цілому. Беручи до уваги достовірну асоціацію гіпометилювання ДНК геному з онкогенною трансформацією клітин, ми пропонуємо відносити носіїв 2-х та більше великих гетерохроматинових районів та часткових перицентричних інверсій до групи ризику підвищеної індукції хромосомної нестабільності, яка підлягає цитогенетичному моніторингу.

Переважна більшість знахідок асоціації екстремальних С-поліморфних варіантів з патологічним фенотипом у людини пов'язана з видовженням лінійних розмірів прицентромерного гетерохроматину 9-ої хромосоми. При цьому, можливість перманентної мінливості розмірів прицентромерного гетерохроматину хромосоми 9 в соматичних клітинах практично не розглядалася. Доведено, що послідовно з індукцією термального шоку в мітотичних клітинах людини, в ділянці прицентромерного гетерохроматину 9-ої хромосоми з'являються білкові гранули із вмістом фактору термального шоку HSF1, з яким пов'язують реалізацію генетичної програми адаптативно-стресової реакції (M. Denegri et al., 2001; C. Jolly et al., 2002). Це вказує на високу ймовірність деконденсації прицентромерного гетерохроматину 9 хромосоми у відповідь на індукцію стресових реакцій, зокрема, для збільшення площі складування HSF1. Відповідно, знахідки великих блоків гетерохроматину на 9 хромосомі з набагато більшою ймовірністю свідчать про його перманентну деконденсацію в процесі реалізації адаптативно-стресових реакцій ніж про специфічну асоціацію з окресленим патологічним фенотипом. В даному контексті проглядається більш вагомий патологічний вплив мікроваріантів та повної перицентричної інверсії 9 хромосоми, що реалізується через обмеження ділянки складування активних сполук, асоційованих з HSF1.

Ми також пропонуємо власну концепцію щодо можливого залучення конститутивного гетерохроматину 1-ої хромосоми в реалізацію впорядкованого розділення хромосом в мітозі. На наш погляд, збереження критичної кількості прицентромерного гетерохроматину на згаданій хромосомі є необхідною умовою повноцінної реалізації затримки анафази (spindle checkpoint), до моменту повноцінної фіксації всіх хромосом набору на мітотичному веретені. Відомо, що пізнє розділення хромосоми 1, 9 і 16 пов'язують з великою кількістю локалізованого на них гетерохроматину (B.K. Vig et al., 1989). Периферичне розташування ділянок С-гетерохроматину в інтерфазному ядрі обумовлює більш пізню міграцію хромосом до центру і пізню фіксацію на мітотичному веретені, що підтримує сигнальну активацію механізму spindle checkpoint і сприяє вивільненню часу для повноцінної фіксації решта хромосом набору. Особлива роль 1-ої хромосоми в підтримці spindle checkpoint проглядається в тому, що вона належить до найдовших хромосом каріотипу і потребує найбільше часу для мітотичної конденсації перед зв'язуванням з веретеном. Оскільки швидкість конденсації прицентромерного гетерохроматину є набагато нижчою ніж еухроматинових плеч, це надає додатковий резерв для затримки фіксації хромосоми 1 на веретені порівняно з іншими представниками групи A, що є рівнозначними за довжиною, проте не містять прицентромерного гетерохроматину. Отже, пізня фіксація хромосом 1-ої пари на веретені з високою ймовірністю попереджує формування анеуплоїдної клітини і, в першу чергу, втрату великих хромосом, приналежних до груп A і B.

Узагальнюючі результати проведених досліджень, слід відзначити, що фенотип хромосомної нестабільності соматичних клітин ex vivo та in vitro, поряд з індукцією хромосомних аберацій і порушень плоїдності геному, характеризується достовірною маніфестацією явища центромерної нестабільності у проявах повного та часткового передчасного розділення центромер, формування псевдомакроваріантів хромосомного С-поліморфізму і часткових перицентричних інверсій прицентромерного гетерохроматину. Ми пропонуємо розглядати прояви центромерної нестабільності як достовірні ознаки хромосомної нестабільності і враховувати їх в практиці медико-генетичних досліджень та цитогенетичного моніторингу генотоксичних впливів.

Висновки

1. Сформовано концепцію про передчасне розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ) як закономірний прояв індукованої хромосомної нестабільності проліферуючих клітин.

2. Спонтанний рівень центромерної хромосомної нестабільності в короткочасних культурах крові і кісткового мозку людини характеризується відсутністю ознак хромосомної ламкості, індукцією явища передчасного розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ) у 0-3% мітотичних клітин, відсутністю клітин з передчасним розділенням 3-х і більше хромосом набору та його вибірковим відтворенням хромосомами груп С і E.

3. Явище часткового ПРЦ стабільно відтворюється в межах 4% мітотичних клітин в різних тканинах та на різних етапах нормального онтогенезу людини, тоді як індукція повного ПРЦ є типовою ознакою гемопоетичних ембріональних печінкових клітин (ГЕПК) ex vivo (14,9±2,2 на 100 м.п.), клітин цитотрофобласту хоріону і плаценти ex vivo (7,4±1,7 на 100 м.п.) та амніоцитів in vitro (2,1±0,5 на 100 м.п.) і практично не зустрічається в культурах крові і кісткового мозку постнатально обстежених здорових осіб (0,06±0,04% на 100 м.п.).

4. Індукція часткового ПРЦ більше ніж в 4% мітотичних клітин, що супроводжується ознаками передчасного розділення 3-х і більше хромосом каріотипу, приналежних до всіх хромосомних груп, асоціюється з маніфестацією гемобластозів і характеризується позитивною лінійною залежністю із вмістом бластів у крові та регресією на стадії ремісії.

5. Індукція часткового ПРЦ маніфестує послідовно з індукцією хромосомних аберацій і є вірогідним наслідком генотоксичного впливу, а його виникнення загрожує клітині втратою хромосом, формуванням анеуплоїдії та підвищеним ризиком онкогенної трансформації.

6. Індукція повного ПРЦ більше ніж у 2% мітотичних клітин крові і кісткового мозку асоціюється з маніфестацією гемобластозів, інфекційно-токсичних захворювань, екологічно-детермінованої патології та синдромів хромосомної нестабільності (СХН), а в ремісії гемобластозів демонструє достовірну регресію з досягненням показників здорових осіб у випадках повної ремісії.

7. Індукція повного ПРЦ в ГЕПК асоціюється з достовірною експресією P53 та підвищеною інтенсивністю апоптозу, що обумовлює низький рівень поліплоїдії, тоді як підвищена продукція поліплоїдних клітин в цитотрофобласті хоріону і плаценти є вірогідним наслідком блокади апоптозу в клітинах з повним ПРЦ внаслідок експресії Bcl-2.

8. Підвищений рівень апоптозу в культурах клітин з високою продукцією повного ПРЦ (ГЕПК, випадки СХН, гемобластозів та екологічно детермінованої патології) та позитивна лінійна залежність між рівнем індукції повного ПРЦ та апоптозу, дозволяють розцінювати фенотип повного ПРЦ як індикатор інтенсивності апоптозу в популяції проліферуючих клітин.

9. Індукція передчасного розділення центромер (ПРЦ) сестринських хроматид - це закономірна реакція геному у відповідь на екзогенне або ендогенне пошкодження ДНК та вірогідний елемент генетичних програм, пов'язаних з процесами тканинної диференціації, онкогенної трансформації і клітинної загибелі.

10. Відсоток реєстрації макроваріантів С-поліморфізму та часткових перицентричних інверсій в клітинах цитотрофобласту і амніотичної рідини та в лімфоцитах пацієнтів з хромосомними анеуплодіями і порушеннями статевої функції виявився невідповідним до їх поширення в популяції, що заперечує вірогідність утворення згаданих С-поліморфних варіантів за рахунок збільшення вмісту макросателітних ДНК.

11. Сформовано концепцію про неконститутивну природу значної частки макроваріантів С-поліморфізму і часткових перицентричних інверсій, що реєструються в практиці медико-генетичних досліджень та обгрунтовано вірогідність їх виникнення внаслідок перманентної деконденсації прицентромерного гетерохроматину за умов гормонального дисбалансу та реалізації адаптативно-стресових реакцій.

Практичні рекомендації

1. Розроблено алгоритм оцінки центромерної хромосомної нестабільності соматичних клітин, який відзначився високою інформативністю в діагностиці та прогнозуванні синдромів хромосомної нестабільності, поширених гемобластозів дітей і дорослих та екологічно детермінованого захворювання, обумовленого впливом фтору і солей важких металів.

2. Достовірними ознаками індукованої центромерної нестабільності в соматичних клітинах людини слід вважати індукцію хромосомних аберацій в перицентромерних ділянках більше ніж в 2% м.п., повного ПРЦ - у 2% м.п. і більше, часткового ПРЦ - у 4% м.п. і більше, а поряд з цим, наявність м.п. з ПРЦ 3-х і більше хромосом набору та передчасним розділенням представників груп A, B, D, F, G; реєстрацію 2-х і більше макроваріантів С-поліморфізму та часткових перицентричних інверсій в частині досліджених клітин.

3. Запропоновано враховувати рівень індукції центромерної хромосомної нестабільності в практиці цитогенетичного моніторингу генотоксичних впливів та для прогнозування онкогенетичної трансформації клітин. Вірогідними цитогенетичними ознаками гострого періоду гемобластозів слід вважати появу в культурах крові та кісткового мозку клітин з повним і частковим ПРЦ (>2% та >10% м.п. відповідно) та наявність м.п. з ПРЦ більше 3-х хромосом каріотипу і передчасним розділенням хромосом груп G, A, B, D, F. Досягнення повної ремісії асоціюється з регресією параметрів повного ПРЦ до показників спонтанного рівня, тоді як індукція часткового ПРЦ може залишатися підвищеною. Відсутність реєстрації повного ПРЦ в гострому періоді гемобластозів асоціюється з поганим прогнозом і потребує корекції лікування за протоколом.

4. В практику медико-генетичного консультування населення України вперше впроваджено алгоритм цитогенетичної та молекулярно-генетичної діагностики синдромів Ніймеген (NBS) та атаксії-телеангіектазії, що дозволило встановити значну поширеність NBS у Львівській області, виявити перші випадки в Івано-Франківської, Волинської, Тернопільської, Рівненській та Запорізькій областях та обґрунтувати доцільність впровадження селективного скринінгу NBS в усіх регіонах країни.

5. Сформовано реєстр сімей високого ризику відтворення синдромів Ніймеген та атаксії-телеангіектазії, що дозволяє ефективно спостерігати за репродуктивною функцією в родинах, своєчасно здійснювати заходи пренатальної діагностики, запобігати радіаційному опроміненню гомозиготних і гетерозиготних носіїв мутацій, проводити лікувальну корекцію вродженого комбінованого імунодефіциту та профілактику онкологічної патології в родинах.

6. В практиці медико-генетичного консультування пропонується враховувати носійство повної перицентричної інверсії 9-ої хромосоми (9ph+) та високої делеції довгого плеча Y-хромосоми (Yq12-) як фактори ризику порушень статевої диференціації, фертильності та формування анеуплоїдних гамет в осіб чоловічої статі. Факти поєднання в каріотипі двох і більше великих гетерохроматинових районів та часткових перицентричних інверсій з ознаками хромосомної нестабільності вказують на високу ймовірність реєстрації фенокопій С-поліморфних варіантів, індукованих внаслідок змін гомеостазу соматичних клітин.

Список основних наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Созанский О.А., Гулеюк Н.Л., Акопян Г.Р., Забродский Б. Некоторые аномалии хромосом при азооспермии у мужчин // Генетика. - 1988. - Т. ХХIV, №7. - С. 1299-1303.

2. Созанський О.О., Гулеюк H.Л., Акопян Г.Р. Додаткова маркерна на бісателітна хромосома у дівчинки з передчасним статевим дозріванням // Педіатрія, акушерство та гінекологія. - 1989. - №6. - С. 25.

3. Лозинская М.Р., Акопян Г.Р. Состояние метафазных хромосом лимфоцитов и фибробластов эмбрионов человека как показатель мутагенного влияния на плод // Медицинская генетика. Республиканский межведомственный сборник. Выпуск 1. Киев. - 1990. - C. 93-96.

4. Акопян Г.Р., Созанський О.О., Гаврилюк, Ю.Й. Кількісна характеристика районів гетерохроматину метафазних хромосом людини на різних етапах її онтогенетичного розвитку // Цитология и генетика. - 1992. - Т. 26, №4. - С. 50-55.

5. Гаврилюк Ю.Й., Созанський О.О., Акопян Г.Р., Лозинська М.Р., Сєднева І.А., Глинка П.А., Яворівська О.М., Грицюк І.І. Генетичний моніторинг в аспекті Чорнобильської катастрофи // Цитология и генетика. - 1992. - Т. 26, №4. - С. 15-20.

6. Шлома Д.В., Созанський О.О., Гулеюк H.Л., Акопян Г.Р., Hевзгода H.В. Особливості хромосомного апарату та функціонального стану щитовидної залози при аменореях у жінок // Цитология и генетика. - 1993. - Т. 27, №4. - С. 55-61.

7. Акопян Г.Р., Созанський О.О., Гаврилюк Ю.Й. Гетерохроматинові райони хромосом у ранньому онтогенезі людини // Медична генетика. Республіканський міжвідомчий збірник. Випуск 2. Київ. - 1994. - С. 3-11.

8. Акопян Г.Р., Кодунов Л.А., Гулеюк H.Л., Гнатейко О.З., Мале П. Передчасне розділення центромер в пренатальній діагностиці синдрому Робертса // Ехографія в перинатології, гінекології та педіатрії. IV збірник наукових праць української асоціації лікарів ультразвукової діагностики в перинатології та гінекології. Кривий Ріг. - 1997. - C.171-172.

9. Акопян Г.Р., Баранова О.В., Hевзгода H.В., Макух Г.О., Мале П. Висока частота Y - специфічних повторів ДHК у осіб з первинною аменореєю та реверсією статі // Ехографія в перинатології, гінекології та педіатрії. IV збірник наукових праць української асоціації лікарів ультразвукової діагностики в перинатології та гінекології. Кривий Ріг. - 1997. - С. 172-173.

10. Акопян Г.Р., Сиренко А.Г., Гнатейко О.З., Петрух А.В., Стойка Р.С. C-анафаза как цитогенетический маркер апоптоза клеток при остром лимфобластном лейкозе у детей // Экспериментальная онкология. - 1999. - Т. 21, №2. - С. 127-132.

11. Акопян Г.Р., Гнатейко О.З., Сіренко А.Г., Поліщук Р.С., Логінський В.Є., Hовак В.Л. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом при гострій лімфобластній лейкемії у дітей // Онкология. - 1999. - Т. 1, №4. - С. 283-289.

12. Сіренко А.Г., Акопян Г.Р. Передчасне розділення центромер як цитогенетичний маркер гострої лейкемії у дітей // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збірник наукових праць. Вип. 4 (24). Київ-Луганськ-Харків. - 1999. - С. 122-133.

13. Акопян Г.Р., Сіренко А.Г., Поліщук Р.С. Прогнозування сімейних випадків лейкемії на основі нових цитогенетичних маркерів онкотрансформації клітин // Укр. Мед. Вісті. - 1999. - №. 3. - С. 123-124.

14. Akopyan H.R., Sirenko A., Sedneva I., Kluchivska O., Yakimovich M., Stoyka R., Hnateyko O. Cytogenetic assay in apoptosis investigations // Folia Histochemica et cytobiologica. - 2001. - Vol. 39. - Suppl. 2. - P. 158-160.

15. Akopyan H.R. Perspectives of premature anaphase's molecular evaluation // Proceedings of the Second Euroconference on Quantitative Molecular Cytogenetics. Salamanca, Spain. - 2001. - P. 31-34.

16. Акопян Г.Р. Частота варіантів поліморфізму хромосом в контингенті пацієнтів Львівського міжобласного медико-генетичного центру // «Акт. пробл. акуш. і гінек., клін. імунол. та мед. генетики». - Київ-Луганськ, 2003. - Вип. 9. - С. 211-215.

17. Печеник С.О., Акопян Г.Р., Сєднєва І.А., Ключівська О.Ю. Цитологічне та цитогенетичне дослідження явища апоптозу в клітинах крові при екопатології // Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики. Збірник наукових праць. Київ-Луганськ. Випуск 9. - 2003. - Вип. 9. - С. 269-274.

18. Гулеюк Н.Л., Заставна Д.В., Безкоровайна Г.М., Акопян Г.Р. Ефективність пренатальної діагностики хромосомної патології та цитогенетичні особливості амніоцитів в різних обстежуваних групах вагітних жінок // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2003. - Т. 24, №3. - С. 7-14.

19. Акопян Г.Р., Костюченко Л., Безкоровайна Г., Седнева І., Маркевич Н. Центромерна нестабільність хромосом як ранній ефект радіаційного ушкодження ДНК у клітинах хворих на атаксію-телеангіектазію // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2004. - Т. 25, №1. - С. 71-78.

20. Кіцера Н.І., Акопян Г.Р., Поліщук Р.С., Гельнер Н.В. Особливості менструальної функції у матерів дітей з гострою лімфобластною лейкемією // Одеський медичний журнал. - 2004. - №5. - С. 49-52.

21. Акопян Г.Р., Костюченко Л.В., Безкоровайна Г.М., Сєднєва І.А., Маркевич Н.В., Гнатейко О.З. Цитогенетичні дослідження атаксії-телеангіектазії та синдрому Ніймегена // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. Випуск 13 (5). Київ. - 2004. - С. 9-19.

22. Акопян Г.Р., Савицький В., Федоришин З., Седнева І., Маркевич Н., Кашин О., Кіцера Н., Поліщук Р. Костюченко Л., Шуварська В., Безкоровайна Г., Лотоцька Л., Варон Р., Хжановська К. Селективний скринінг мікроцефалії в популяції Львівської області з метою ранньої діагностики та профілактики онкологічної патології // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Збірник наукових праць. Вип. 7 (60). Київ-Луганськ-Харків. - 2004. - С. 21-26.

23. Печеник С.О., Акопян Г.Р., Сєднєва І.А., Лук'яненко Н.С., Ключівська О.Ю., Храновська Н.М. Особливості каріотипу та рівень апоптозу лімфоцитів периферійної крові у дітей із регіону, забрудненого солями важких металів та фтору // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. Випуск 13 (5). Київ. - 2004. - С. 162-173.

24. Школьник О.С., Маланчук О.М., Акопян Г.Р. Дослідження поліморфних варіантів хромосом в контингенті подружніх пар з репродуктивними втратами // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. Випуск 13 (5). Київ. - 2004. - С. 213-217.

25. Гнатейко О.З., Лук'яненко Н.С., Акопян Г.Р., Печеник С.О., Ковалів І.Б., Косцик Н.Р., Чайковська Г.С. Принципи медико-генетичного консультування сімей, що проживають на території, забрудненій солями важких металів та фтору // Вісник наукових досліджень. - 2004. - №2 (35). - С. 150-152.

26. Поліщук Р.С., Кіцера Н.І., Цимбалюк І.П., Акопян Г.Р., Трояновська О.О., Скоропад Л.Л., Степанова О.І., Дорош О.І., Козлова О.І. Клініко-гематологічні особливості мієлодиспластичного синдрому у дітей // Онкология. - 2004. - Т. 7, №1. - С. 34-38.

27. Кіцера Н.І., Поліщук Р.С., Акопян Г.Р., Маркевич Н.В., Костюченко Л.В., Трояновська О.О., Скоропад Л.Л. Клініко-генеалогічні дослідження в сім'ях з синдромом Ніймеген // Цитол. Генет. - 2005. - Т. 39, №2. - С. 72-78.

28. Костюченко Л.В., Акопян Г.Р., Поліщук Р.С., Маркевич Н.В., Кіцера Н.І., Троянівська О.О. Синдром Ніймегена: клінічна характеристика, діагностика та можливості терапії // Перинатология и педиатрия. - 2005. - Т. 23, №1/2. - С. 105-112.

29. Акопян Г.Р., Гулеюк Н.Л., Сєднєва І.А., Сіренко А.Г., Гнатейко О.З. Індукція передчасного розділення центромер метафазних хромосом в культурах соматичних клітин з ознаками нестабільності каріотипу // Гігієна населених місць. Збірник наукових праць. Київ. - 2005. - Вип. 45. - С. 480-489.

30. Акопян Г.Р. Деконденсація конститутивного гетерохроматину як вірогідна причина формування фенокопій С-поліморфних варіантів хромосом // Педіатрія, акушерство та гінекологія. - 2005. - №6. - С. 37-43.

31. Акопян Г.Р., Баранова О.В., Безкоровайна Г.М., Гулеюк Н.Л., Гельнер Н.В., Гнатейко О.З. Молекулярно-генетичні дослідження при порушеннях статевої диференціації та функції // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2005. - №4. - С. 90-94.

32. Акопян Г.Р., Гулеюк H.Л., Седнева И.А., Созанский О.А. Y-хромосома при нарушении дифференцировки пола по мужскому типу // Современные проблемы в клинической цитогенетике. Сборник научных трудов. Москва. - 1991. - С. 4.

33. Созанский О.А., Акопян Г.Р., Гулеюк H.Л., Забродский Б.Т. Случай кольцевой Y-хромосомы у мужчин с азооспермией (I) // Современные проблемы в клинической цитогенетике. Сборник научных трудов. Москва. - 1991. - С. 59.

34. Созанский О.А., Акопян Г.Р., Гулеюк H.Л., Забродский Б.Т. Случай кольцевой Y-хромосомы у мужчин с азооспермией (II) // Современные проблемы в клинической цитогенетике. Сборник научных трудов. Москва. - 1991. - С. 59.

35. Созанский О.А., Гулеюк H.Л., Акопян Г.Р., Забродский Б.Т. Случай сбалансированной транслокации 1:15 // Современные проблемы в клинической цитогенетике. Сборник научных трудов. Москва. - 1991. - С. 59.

36. Акопян Г.Р., Шлома Д.В., Гнатовська М. Підвищена частота часткових інверсій прицетромерного гетерохроматину 9-ої хромосоми в клітинах плаценти другого триместру вагітності // Тези доповідей II з'їзду медичних генетиків України. Львів, Україна. - 1995. - С. 6.

37. Акопян Г.Р., Сіренко А.Г., Гулеюк H.Л., Петрух А., Мале П. Передчасне розходження центромер метафазних хромосом та баланс гетерохроматину в геномі клітин із різним ступенем диференціації // Тези доповідей II з'їзду медичних генетиків України. Львів, Україна. - 1995. - С. 6.

38. Sirenko A.G., Akopyan G.R., Petruch A. Premature centromere division of metaphase chromosomes and blood cell differentiation / Abstr. XVIII Congress of International Society for analytical cytology. Rimini, Italy, 1996 // Cytometry. - 1996. - №8. - P. 99.

39. Sirenko A., Akopian G. Premature centromere division of the chromosomes at the different stages of acute lymphoblastic leukemia in infants / Abstracts of XVI European Congress on hematology and immunology. Tessaloniki, Greece, 1997 // Pediatr. Res. - 1997, Vol. 41, №5. - P. 774.

40. Akopian G.R., Huleyuk N.L., Havryluk Y.J., Hnateyko O.Z. Embrional liver cells: the possible association of PCD phenomenon, heterochromatin balance and cell cycle time // Falk Symposium: new trends in diagnosis and treatment of liver and colon Diseases. Lviv. Ukraine. - 1997. - P. 59.

41. Akopian G.R., Huleyuk N.L., Sedneva I.A., Nechay O.S, Havryluk Y.J., Hnateyko O.Z., Malet P. Premature centromere division of the chromosomes and prenatal diagnosis of hereditary pathology // Cesko-Slovenska Pediatria. - 1997. - Vol.52. - №7. - P. 497.

42. Akopian G.R., Sirenko A., Huleyuk N., Hnateyko O., Malet P. Premature anaphases as a possible cytogenetic indicator of apoptosis // Cytogenet. Cell Genet. - 1997. - Vol. 77, №1-2. - P. 186.

43. Akopian G.R., Sirenko A.G., Hnateyko O.Z., Stoyka R.S. Premature anaphase possibly relates to apoptosis // Cytogenet. Cell Genet. - 1999. - Vol. 77, №1-2. - P. 34.

44. Akopyan H.R., Sedneva I.A., Sirenko A.G., Nevzgoda N.V. Chromosomal evaluation of apoptosis in embryonic tissues and placenta // Placentologic monitoring studies and ecotoxicologic aspects of genetic diseases. International Conference. Krakow, Poland. - 2000. - P.8.

45. Akopyan H., Sirenko A., Sedneva I., Yakimovich M., Stoyka R., Hnateyko O. Cytogenetic assay in apoptosis investigations / Abstracts of Endocrine Disrupters and Carcinogenic Risk Assessment. NATO Advanced Research Workshop. Bialostok, Poland, 2001 // Folia Histochemica et cytobiologica. - 2001. - Vol. 39, Suppl. 1. - P. 31.

46. Акопян Г.Р. Аномальне розходження хромосом при гемобластозах у дітей / Матеріали ІІІ науково-практичної конференції «Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти». Київ, Україна, 2002 // Онкология. - 2002. - №.4. - С. 4.

47. Акопян Г.Р., Сєднєва І.А., Печеник С.О., Сіренко А.Г., Ключівська О.Ю., Петрух А.В. Особливості каріотипу та цитометричні параметри апоптозу гемопоетичних ембріональних клітин та диференційованих лімфоцитів людини // ІІІ з'їзд медичних генетиків України з міжнародною участю. Львів. Україна. - 2002. - С. 82.

48. Акопян Г.Р., Безкоровайна Г.М., Сєднєва І.А., Лозинська М.Р., Гулеюк Н.Л., Заставна Д.В. Структурно-функціональні особливості центромерних районів хромосом в нормі і при патології людини // ІІІ з'їзд медичних генетиків України з міжнародною участю. Львів. Україна. - 2002. - С. 38.

49. Гулеюк Н.Л., Заставна Д.В., Безкоровайна Г.М., Акопян Г.Р. Ефективність пренатальної діагностики хромосомної патології та цитогенетичні особливості амніоцитів в різних обстежуваних групах вагітних жінок // ІІІ з'їзд медичних генетиків України з міжнародною участю. Львів. Україна. - 2002. - С. 24.

50. Акопян Г.Р., Гнатейко О.З., Полищук Р.С., Кіцера Н.І., Маркевич Н.В., Безкоровайна Г.М., Костюченко Л.В., Скоропад Л.Л., Степанюк А.И., Varon R., Sperling K. Синдром Ніймегена (NBS) у західному регіоні України // Тези доповідей I-го Українського конгресу з клінічної генетики з міжнародною участю. Харків, Україна. - 2003. - С. 45-46.

51. Костюченко Л.В., Акопян Г.Р., Маркевич Н.В., Лига О.В., Савчак І.Я. Імунодефіцитні стани при синдромах хромосомної нестабільності / Тези доповідей III Всеукраїнської науково-практичної конференції «Питання імунології в педіатрії» Київ, Україна, 2003 // Перинатологія і педіатрія. -2003. - №3. - С. 74.

52. Акопян Г.Р., Гнатейко О.З., Полищук Р.С., Кицера Н.И., Маркевич Н.В., Безкоровайная Г.М., Костюченко Л.В., Скоропад Л.Л., Степанюк А.И., Varon R., Sperling K. Диагностика синдрома Ниймегена (NBS) в западном регионе Украины / Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики». Москва, Россия, 2003 // Медицинская генетика. - 2003. - Т. 2, №10. - С. 402.

53. Kitsera N.I., Akopyan H.R., Polishchuk R.S., Markevych N.V., Hnateyko O.Z., Varon R. Clinical analysis and genealogical peculiarities in families with Nijmegen breakage syndrome // Abstr. Human Genome Meeting. Berlin, Germany. - 2004. - P. 119.

54. Акопян Г.Р., Гречаніна О.Я. Зміни метаболізму конститутивного гетерохроматину як вірогідна причина формування фенокопій С-поліморфних варіантів хромосом / Тези доповідей II Українського конгресу з клінічної генетики з міжнародною участю. Харків, Україна, 2005 // Ультразвукова перинатальна діагностика. - 2005. - №20. - С. 83.

55. Гулеюк Н.Л. Заставна Д.В. Безкоровайна Г.М. Акопян Г.Р. Козаревська І.С. Спосіб отримання препаратів метафазних хромосом із культури амніоцитів: Деклараційний патент на винахід UA58404А. - 2003. - Бюл. №7.

Размещено на Allbest.ru