Лізогенія і бактеріофаги Erwinia carotovora

Оригінальний характер самоорганізації порожніх поліфутлярів було виявлено після руйнування часток каротоворіцинів штаму ЕСА 62А. Нові надмолекулярні структури TLCA 5-1 і ТLCA 5-2 утворювались через сіткові утвори необмеженої довжини. В центральній області сіток розміщені потовщені S-подібні утвори шириною від 19 до 25 нм. Через півроку від початку формування сіткових агрегатів відмічали появу дуже довгих порожніх поліфутлярів. Розміщення поліфутлярів на площині відповідало конфігурації сіткових структур. Структури EPS-типу обох каротоворіцинів складаються із окремих мономерних ділянок - порожніх футлярів з перегородками. Порожні поліфутляри походять від двох вихідних типів скорочених футлярів бактеріоцинів TLCA 5-1 і TLCA 5-2. В жодному із випадків не виявлено поліфутлярів змішаного типу. Крім довгих поліфутлярів в суспензіях каротоворіцинів штаму ЕСА 62А виявлено нові структури округлої і ламповидної форми з гнучкою оболонкою (структури LS). Їх діаметр складає від 33 до 117 нм. Структури LS-типу не мають відношення до заповнених головок фагового походження і фагових “тіней”. Показана структурна спорідненість скорочених футлярів, порожніх поліфутлярів і часток LS-типу TLCA 5-1 й TLCA 5-2. Допускається, що довгі порожні поліфутляри і ламповидні структури - продукти самоорганізації in vitro, основним вихідним матеріалом для якої служать зруйновані скорочені футляри відростків каротоворіцинів.

Наявність різних часток типу фагових хвостових відростків, головок і базальних пластинок, а також характеристичне самоутворення нових надмолекулярних структур після спонтанного руйнування скорочених хвостових відростків указують на множинність дефектної лізогенії E.carotovora. Доказ цього важливого положення було отримано при аналізі сумарного препарату MCTV із штаму Erwinia sp. 78-3 (Ep78-3). Іонообмінна хроматографія дозволила виявити три біологічно активні фракції (I, II і III). За даними спектрофотометрії кількісне співвідношення між фракціями склало 60, 12 і 28 %, відповідно. Після додаткового седиментаційного очищення у фракціях I і III було виявлено виключно білковий матеріал з однаковими максимумами поглинання при 275,8 нм. Доведено, що фракції I, II і III - мінімальні біологічно активні структури каротоворіцинів TLCA 86-1, TLCA 86-2 і TLCA 86-3 штаму ESP 78-3. Аналіз поліпептидів TLCA 86-1 і TLCA 86-3 в системі ДСН-ПААГ виявив наступі закономірності. Хвостові відростки обох каротоворіцинів складаються з однакових мажорних поліпептидів з молекулярними масами 72,4, 55,0 і 40,3 кД, які входять до складу футляра, стержня і базальної пластинки. Ймовірно, що структурний білок футляра складає 55 кД. До яких компонентів хвостового відростка відносяться мажорні білки ср4 (72,4 кД) і ср9 (40,3 кД), поки що невідомо. На різницю між TLCA 86-1 і TLCA 86-3 вказують деякі неспівпадаючі поліпептиди (сpб, cpв, cpг, cpу і cpе). Відмінність між цими каротворіцинами було виявлено також при визначенні кілерної активності матеріалу окремих хроматографічних фракцій щодо E.coli CR63 і BE і E.carotovora 66А. Різниця в питомій кілерній активності TLCA 86-1 і TLCA 86-3 щодо штамів E.coli була виявлена при 37оС. Вона вища у випадку TLCA 86-3. Каротоворіцин TLCA 86-2 класифіковано як такий, що має родову специфічність і нормально лізує лише індикаторний штамм ЕСА 66А. Отже, прямий біохімічний та біологічний доказ множинності каротоворіцинів повною мірою підтверджує положення про природне існування E.carotovora як дефектно-полілізогенної системи.

РОЗДІЛ 5. СПРАВЖНЯ ЛІЗОГЕНІЯ ERWINIA CAROTOVORA. ПОМІРНІ ТА ВІРУЛЕНТНІ БАКТЕРІОФАГИ

На цей час у E.carotovora, на відміну від інших бактерій, явище бактеріофагії досліджено недостатньо (Perombelon 1992; Chatterjje, Starr 1980). Опис бактеріофагів цих практично значимих фітопатогенів носить спорадичний характер (Toth et al., 1993; Toth et al., 1997). Причини обмеженого розповсюдження ервініафагів порівняно з іншими фагами, поки що невідомі (Perombelon 1992; Chatterjje, Starr 1980). Фагостійкість E.carotovora вивчали із застосуванням помірного бактеріофага ZF40, який було виявлено при дослідженні бактеріоциногенності (розділ 3). На газоні клітин ЕСА 62А фаг утворює два типи колоній - дрібні (м-бляшки) і великі (к-бляшки). Ця гетерогенність не стосується внутріклітинного обмеження репродукції фага, а також не пов'язана з геномними змінами. Її причина була встановлена з допомогою бактеріальних мутантів, стійких до лізису каротоворіцинами (мутанти RC). RC-мутанти було віднесено до трьох видів. На більшості із них ефективність висіву фага помітно не змінювалась, тоді як на кількох мутантах вона мала нульове значення. Тільки на газонах клітин двох мутантів, отриманих селективними MCTV EcaEс153 (мутант RC5297) і EcaМ2-4 (мутант RC5501), бактеріофаг утворює к-бляшки з непрозорим центром. Однією із причин фагостійкості у E.carotovora може бути блокування бактеріофага ZF40 на рівні адсорбції. Різноманітність мутантів, стійких до бактеріоцинів (не менше 5 різних типів), а також підвищена чутливість до дезоксихолату натрію вказувають на зміни в структурі О-ланцюга ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки. Це підтверджується тим, що деякі RC-мутанти здатні підтримувати розвиток фага Т7 E.coli з рецепторним сайтом в R-ЛПС ентеробактерій (Beumer et al., 1984). На клітинах батьківського штаму ЕСА 62А, а також на клітинах мутантів з незначними змінами в структурі ЛПС фаг Т7 не адсорбується через відсутность прямого фізичного контакту зі своїм рецептором. З іншого боку, для фага ZF40 рецептором є S-ЛПС і він здатний прикріплюватися до клітин, які мають цей тип ліпополісахарида. Аналогічне явище описано при взаємодії фагів Т7 і Р22 з клітинами S. typhimurium (Brunovskis, Burns, 1973). Отже, нормальний адсорбційний процес для фага ZF40 можливий лише за наявності проміжного типу S-ЛПС, який входить до складу клітинної оболонки мутантів RC5297 і RC5501 E.carotovora 62А. Далі мутант RC5297 використовували як універсальний індикатор для вивчення фага ZF40.

Два варіанти фага ZF40, одержані на ЕСА 62А і RC5297 (фаги ZF40 і ZF40/5297, відповідно), використовували для вивчення кола його господарів серед штамів пектолітичних ервіній. Більше ніж 13 штамів, із 52 досліджених, чутливі до фага ZF40. На основі ефективності висіву штами Е.carotovora були розділені на 6 груп. Для двох штамів ЕСА M2-4 и 33A, а також для штама ЕАТ 37A ефективність висіву фага склала 10-4 - 10-5, тоді як на штамах 15A, 43A, 53A, 61A, 74A, j15, j22, J2 і g125 вона була ще нижчою - 10-7 - 10-9. Для фагочутливих штамів властиве формування гетерогенної фагової популяції, але на клітинах штамів ЕСА M2-4, 33A і ЕАТ 37A фаг після кількох пересівів утворює бляшки однакового розміру.

Внутріклітинну рестрикцію у E.carotovora досліджували у 4 штамів ЕСА: 62A, RC5297, M2-4 и 33A. Фаги, оодержані на M2-4 и 33A позначали як ZF40/M2-4* і ZF40/33А*, відповідно. Рестрикційний аналіз ДНК ендонуклеазою HpaI показав, що ці фаги гомологічні один одному, а також ідентичні вихідному фагу ZF40/5297. Отже, розвиток фага в клітинах штамів ЕСА M2-4 і 33A обмежується внутріклітинно. Аналогічно іншим ентеробактеріям (Krыger, Bickle, 1983), у E.carotovora внутріклітинна рестрикція тісно пов'язана з протилежним процесом - модифікацією фагової ДНК. Це справедливо і в нашому випадку: фаги ZF40/M2-4* и ZF40/33А* відновлюють вихідну ефективність висіву через 4 - 5 пасажів на відповідних штамах. Системи рестрикції-модифікації (R-M) співпадають для штамів Е.carotovora subsp.carotovora M2-4 і 33A, тоді як така система у штама ЕСА 62А - інша. Можливо, що унікальні системи R-M мають штами ЕАТ 37A, ЕСА 61А і ЕСА J2. Для інших фагочутливих ервіній обмеження развитку фага ZF40 дуже значне, що можна пояснити накладанням двох ефектів - блокуванням адсорбції фагових часток на клітинах і дією внутріклітинної рестрикції.

Імунітет до гомологічних вірусів і наявність спонтанних мутантів сlear-типу - ті особливості ZF40, які дозволяють віднести його до категорії помірних бактеріофагів. Лізогени отримані на основі вихідного фага ZF40-к ведуть себе як класичні і мають рівень спонтанної індукції в середньому рівний 2х105 БОЕ/мл. Доля лізогенів класичного типу (тип I) штамів ЕСА M2-4 і 33A, що несуть модифіковані варіанти фагів ZF40/M2-4* і ZF40/33А*, складає лише 16 - 20 %. У двох інших типів (біля 80% для обох штамів) рівень індукції або незначний, або вона не проявляється. На відміну від лізогенів типу III, лізогени першого типу малочутливі до суперінфекції гомологічним фагом. Лізогени другого типу нечутливі до суперінфікуючого гомологічного бактеріофага. Показники суперінфекції отриманих в роботі лізогенів і природних штамів E.carotovora фагами ZF40 і ZF40/M2-4* часто співпадають. Останнє свідчить про фагостійкість ервіній на рівні імунної відповіді лізогенної клітини, а також про широке розповсюдження гомоіммунних помірних бактеріофагів у цих бактерій. Крім фага ZF40, додатково виявлено 5 помірних фагів - EF444, EF47, EF35, EF19 і EF36. Ці фаги не розмножувались у клітинах лізогенів, про які згадувалося вище, а штучні лізогени, які несли окремі профаги EF444, EF47, EF35, EF19 і EF36, не підтримували розвиток фагів ZF40, ZF40/M2-4* і ZF40/33А*. Як і очікувалось, з допомогою індикатора RC5297 виявляється більше помірних ервініафагів, ніж на вихідному фагочутливому штамі E.carotovora 62А.

Зважаюче на те, що помірний бактеріофаг ZF40 може бути корисним для вивчення справжньої лізогенії E.carotovora, а також молекулярної генетики цих важливих фітопатогенних бактерій, його вивчали більш ретельно. Встановлено, що частки фага ZF40 складаються з ізометричної головки, яка на площині виглядає як правильний шестикутник. В тривимірному просторі головка фага являє собою правильний ікосаедр, грані якого можна спостерігати тільки в нормальних частках. “Тіні” і нормальні частки фага мають конусовидний хвостовий відросток, який через конектор приєднаний до портальної вершини головки. Конектор відділений від футляра відростка тонкою шийкою. Футляр відростка здатний до скорочення. При спостереженні нормальних часток і “тіней” виявляються відростки з хвостовими нитками (фібрилами). В табл. 4 наведено розміри структурних компонентів нормальних часток і “тіней” фага ZF40. Будову хвостового відростка цього фага вивчали, порівнюючи її з такою відростка коліфага Т4. На відміну від футляра фага Т4, поперечне розміщення субодиниць футляра фага ZF40 виражене слабо і його субодиниці утворюють спіралі, які виглядають як диски з “нахилом”. Різниця в організації футлярів відростків фагів, мабуть, зумовлена меншою кількістю субодиниць, які входять до поперечних дисків футляра фага ZF40, а також їх більшим розміром. Футляр відростка фага ZF40 має форму зрізаного конуса; ця структура у фага Т4 - циліндрична. Конусність футляра відростка фага, ймовірно, формується за рахунок додаткових субодиниць в його основі (біля базальної пластинки) і зменшенням їх кількості біля вершини (поряд з шийкою відростка). Підтвердження цього було отримано при електронномікроскопічному аналізі часток фага ZF40, зруйнованих осмотичним шоком (5 М CsCl). Руйнування футлярів включало дві стадії - “набухання” та їх “сповзання” у вигляді покриваючої “шуби” із стержня. В кінцевому підсумку це приводило до утворення неправильних еліпсоїдних структур з полюсами різної ширини. Розміщення структурних субодиниць в еліпсоїдах часто дугоподібне. Отже, утворення еліпсоїдних структур пов'язане з руйнуванням футляра відростка фага вздовж однієї із спіралей “нахилених” дисків. Відросток фага ZF40 має хвостові нитки, довжина яких приблизно в 5 разів менша, ніж довжина фібрил відростка фага Т4 - 31,5 нм, а також базальну пластинку у формі зрізаного конуса.

Рестрикційний аналіз генома бактеріофага ZF40 проведено із застосуванням 7 ендонуклеаз рестрикції: BamHI, BglII, EcoRI, HindIII, HpaI, KpnI і PvuI. Ендонуклеази BglII і HindIII мають по одному сайтові рестрикції на ДНК фага, тоді як EcoRI, HpaI і PvuI утворюють більше, ніж 10 фрагментів. Середній розмір ДНК фага ZF40 за даними рестрикційного аналізу складає 45,8 тпн.

При гідролізі фагової ДНК було виявлено додаткові фрагменти з низькою молярною концентрацією. Ці субмолярні фрагменти зникали при нагріванні інкубаційної суміші протягом 2 хв при 80оС. Доведено, що субмолярні фрагменти - продукти гідролізу відкритої кільцевої форми ДНК фага ZF40, утвореної при спонтанному з'єднанні комплементарних однониткових виступів - липких кінців. За допомогою фізичного картування рестрикційних сайтів ДНК фага для ендонуклеаз BamHI, BglII, HindIII і KpnI було визначено розміщення BamHI-фрагментів, яке має такий порядок розташування фрагментів: CBDA. За рахунок липких кінців бактеріофаг ZF40 використовує cos-механізм при реплікації ДНК і, подібно іншим помірним фагам, володіє генетичною системою інтеграції і вирізання профага (Campbell, 1994).

Фаг ZF40 віднесено до бактеріофагів морфотипу А1 родини Myoviridae. Проведено його порівняння з іншими подібними фагами - цKP E.carotovora; Y64 E.herbicola ; Mu1, P278 і P2 E.coli і Spy-3 Bacillus polymyxa. За розміром головки, розміром геному, а також за структурною організацією скороченого футляра фаг ZF40 близький до фага Spy-3. В літературі поки що не описано фагів ентеробактерій, подібних фагу ZF40 (Ackermann et al., 1997). З цієї причини помірний бактеріофаг ZF40 може розглядатися як новий вид фагів бактерій родини Enterobacteriaceae.

Вважається, що походження близькоспоріднених бактеріофагів пов'язане з горизонтальним переносом генів чи генетичних модулів (Botstein, 1980; Lucchini et al., 1999). Джерелом останніх виступають дефектні профаги або життєздатні фаги, які приймають участь в рекомбінаційних обмінах (Hendrix et al., 1999). Раніше у бактерій роду Erwinia було виявлено два споріднені бактеріофаги - фаги 49 і 59 (Товкач, 1987). Ці помірні фаги утворюються при титруванні мітоміцин-С-індукованих лізатів E.carotovora 268 на деяких штамах E.horticolа. Вони типові представники родини Syphoviridae (морфотип B1). Для того, щоб наблизитись до розуміння справжньої лізогенії у бактерій роду Erwinia, проводили порівняння молекулярно-біологічної організації бактеріофагів 49 і 59.

Серед 100 різних ентеробактерій, фаги 49 і 59 викликають літичну і лізогенну реакцію тільки 5 штамів E.horticolа. Вони відрізняються за параметрами одиночного циклу розмноження в клітинах штамів 450 і 60. Період лізису для фага 49 складає 90 хв. Він в три рази триваліший, ніж для фага 59. Бактеріофаги 49 і 59 - гетероімунні і жодин з них не інфікує лізогени, які несуть гомологічний бактеріофаг, але нормально розвиваються в лізогенних клітинах, які містять відповідний гетерологічний профаг. Подвійні лізогени не спроможні підтримувати розвиток фагів 49 і 59 як окремо, так і при спільному зараженні. С-мутанти помірного фага 49 віднесено до двох незалежних груп, тоді як кількість цистронів в області імунітету фага 59 досягає 4. Поки що невідоме відношення генів СI до формування імунності лізогенів, так як обидва фаги здатні формувати імунітет на рівні фагових прикріпних рецепторів (лізогенна конверсія). Лізогенна конверсія може доповнити дію фагових імунних репресорів. Хоч існує певна ідентичність генів с-області, встановлення і підтримання лізогенного стану в обох фагів істотно відрізняються. Зокрема, частота лізогенізації E. horticola 450 на порядок вища для фага 49, ніж для фага 59. Отримано ряд фактів, які вказують на формування цими фагами іншого типу лізогенії, ніж класичний (фаг лямбда).

Вивчення структурних білків показало, що віріони фагів 49 і 59 містять однакові мажорні поліпептиди ФП8, ФП9 і ФП13 - 32, 26 і 11 кД, відповідно. Крім трьох (49,5, 47,9 і 8,2 кД), інші поліпептиди також співпадають за вмістом і молекулярною масою. Поряд з даними імунної електронної мікроскопії (Товкач, 1987) співпадаючий поліпептидний склад cвідчить про гомологічність структурних білків віріонів фагів 49 і 59. Три мінорні поліпептиди ФП4, ФП5 і ФП15, які відсутні в частках фага 59, можуть характеризувати базальну пластинку (ВР) фага 49, яка складається з трьох (або шести) коротких фібрил. Завдяки цій структурі фаг 49, на відміну від фага 59, може адсорбуватись на клітинах E. horticola 43I і 43II, а також долати імунітет на рівні прикріпних рецепторів у лізогенів E. horticola 450 (59) і 60 (59). Унікальна базальна пластинка фага 49 змінює фізичні властивості його часток у порівнянні з фагом 59. Фаг 49 високочутливий до дії температури й інактивується в розчині 5М CsCl. Фаг 59 дуже стійкий до впливу зазначених факторів. Суттєве зниження плавучої густини віріонів фага 49 у градієнті CsCl пов'язане з модифікацією фагового відростка. Це підтверджують і дані електронної мікроскопії. Допускається, що модифікація може стосуватися зміни структурної конфігурації відростка при приєднанні іншої базальної пластинки, або його структура суттєво змінюється за рахунок включення додаткового білка (чи білків). В будь-якому з цих випадків можна чекати, що структура часток фага 49 порушується при дестабілізації не тільки базальної пластинки, але і хвостового відростка. Отримані дані дозволили прийти до висновку про рекомбінаційне походження фагів 49 і 59. Віріон фага 49 можна уявити як такий фага 59, до капсиду якого приєднаний частково змінений хвостовий відросток з нестабільною (іншою, ніж у фага 59) базальною пластинкою. ВР може походити від іншого фага (чи криптичного профага).

Віріонні ДНК фагів 49 і 59 - лінійні двониткові молекули без липких кінців. За даними електронної мікроскопії і рестрикційного аналізу розмір ДНК фага 59 складає 47,9 тпн. Фаг 59 містить циклічно пермутований геном з кінцевим надлишком (2,2%) і може бути віднесений до групи pac-фагів (Товкач, 1987). Пермутація характерна також і для генома фага 49 - 47,8 тпн. Але тут вона має дискретний характер, що дозволяє допустити наявність значної вставки в геномі 49. За даними рестрикційного аналізу, при збиранні часток фага 49 за pac-механізмом упаковки віріонної ДНК може утворюватися до 4-х дискретних наборів (headfulls). Вставка змінює не тільки характер пермутації, але й загальний вміст ГЦ-пар у віріонній ДНК. Для ГЦ-вмісту ДНК фага 49 отримано значення 57,1%, що значо вище, ніж для фага 59 - 49%. Таким чином, споріднені фаги 49 і 59 могли виникнути в процесі складних рекомбінаційних подій у спільному господарі. Не виключено, що геном фага 49 має мозаїчну структуру, яка утворена значною частиною ДНК-послідовностей генома фага 59 і генома іншого, поки що невідомого, профага(фага)-попередника.

При вивченні природи клітинних рецепторів для помірних фагів 49 і 59 переслідували перспективну мету - дослідити фагову лізогенну конверсію, яка обумовлюється цими фагами, та фагом Е105. Як зазначалося вище, суть явища конверсії полягає в неспроможності адсорбувати гомологічний бактеріофаг лізогенними клітинами. Встановлено, що фаги 49 і 59 не прикріплюються до L-мембран E. horticola 450. В той же час адсорбційну здатність виявляє ЛПС-компонент, отриманий фенольною депротеїнізацією L-мембран. Інкубація ЛПС протягом 3-5 год з фагами 49 і 59 знижує їх титр на 1,5-2 порядки. Високоочищені молекули ЛПС у воді утворюють міцелярні структури різного розміру та конфігурації. Міцели набувають таких форм: кулястих структур (30 нм) і видовжених еліпсоїдів. Товщина бішару для обох видів міцел однакова і складає в середньому 17,5 нм. Дослідження кінетики адсорбції фага 59 на клітинах E. horticola 450 і на очищеному ЛПС показало, що на відміну від адсорбції на нативних клітинах, адсорбція на ЛПС проходить у два етапи. Це можна пояснити неоднорідністю рецепторного сайта на ЛПС (структурно-конформаційною невідповідністю нативному сайту), або відсутністю додаткових хімічних компонентів, які втрачаються в процесі очистки рецептора. Адсорбційна активність для фагів 49 і 59 на очищених молекулах ЛПС майже однакова. Таким чином, рецепторні сайти для цих фагів локалізовані на одній і тій же молекулі ЛПС, хоча їх хімічний склад може відрізнятися. Цікаво, що ліпополісахарид клітин E.horticola 450 здатний ефективно інактивувати фаг Т2 E.coli. Цей фаг, а також фаг Т4 адсорбуються також на клітинах E. horticola 450. Таким чином, в процесі вищенаведених досліджень встановлено, що рецептором для фагів 49 і 59 є ліпополісахарид L-мембрани клітинної оболонки E. horticola 450. У високоочищеному вигляді рецептор проявляє значну адсорбційну активність стосовно досліджуваних фагів, хоча і є “неповним”, порівняно з рецептором нативних клітин E. horticola 450.

В роботі показано, що бактеріофаги T2, T4 і Р1 E.coli здатні взаємодіяти з невеликою кількістю штамів Е.carotovora, які входять до бактеріоцинотипу 1. Але продуктивного розвитку фагів при цьому не відбувається. Пошук інших фагів, які б розмножувалися в клітинах пектолітичних фітопатогенних ервіній (ЦЙЙ, л, Пx2, TuIIb і P22) не мав успіху. Фаг F44, який несподівано було виявлено при взаємодії Т-парних фагів з клітинами E.horticola, ефективно розмножувався в клітинах бактерій родів Erwinia i Pseudomonas та лабораторних штамах E.coli, включаючи і ті з них, які несуть статевий фактор F. Фаг F44 віднесено до поліфагів. На бактеріальних газонах він утворює негативні колонії великого розміру, що важливо для генетичних досліджень. Фаг F44 є типовим представником родини Podoviridae. Його капсид складається з ізометричної ікосаедричної головки діаметром 46,8 нм та короткого конусовидного відростка довжиною 14 нм. Фаг F44 значно менший, ніж ервініафаг Е105 (діаметр головки - 54 нм) та фаг Т7 (діаметр головки - 60 нм). ДНК бактеріофага F44 стійка до гідролізу ендонуклеазами. Поряд з повною відсутністю, сайти для деяких із рестриктаз у фаговій ДНК частково, або повністю модифіковані. Так, наприклад, сайти для PstI частково модифіковані, коли бактеріофаг був одержаний на E.herbicola 60, чи на E.coli C600. Якщо ж фаг репродукується на E.coli BE або L1+, то його ДНК стає чутливою до дії PstI. Вивчення рестрикції свідчать про відсутність спеціального фагового механізму захисту від обмеження розвитку цього фага з боку бактерії-господаря.

За даними рестрикції розмір геному бактеріофага F44 складає 39,2 тпн. За розміром капсиду, а також за розміром геному, бактеріофаг F44 один із найменших бактеріальних вірусів, знайдених у ервіній. Він вірулентний і не утворює стабільної лізогенної асоціації з чутливими бактеріями.

Полівалентність фага F44 дозволила застосувати його для отримання бактеріальних позагенних супресорих мутантів. Питання про позагенну супресію у бактерій роду Erwinia вивчено лише частково (Schonejans et al., 1987), тоді як використання супресорів у E.coli i S.typhimurium відіграло значну роль в дослідженні молекулярної генетики цих бактерій і їх бактеріофагів (Стент, Кэлиндар, 1981). Робота проводилася в два етапи. Спершу одержували ауксотрофні бактеріальні мутанти з допомогою транзиційого мутагенезу. Окремі мутанти перевіряли на точковість мутації і на фенотипове виліковування аміноглікозидними антибіотиками. Коли ці тести були позитивними, відбирали спонтанні ревертанти, які виникали за рахунок супресії. Другий етап включав перевірку ревертантів на позагенну супресію набором мутантів фага F44 amber-типу. Останні можна отримати користуючись здантістю фага F44 репродукуватися в клітинах E.coli gA120 (su-) i HB101 (supE44/su2+). Перевірка ефективності висіву amber-мутантів фагу F44 на різних su- - i su+ -штамах показала, що у E.horticola може існувати не менше двох класів позагенних супресорів, а ефективність супресії досягає 50%. Далі були одержані nonsense-мутанти помірного бактеріофага 59 з використанням як непермісивного господаря - E. horticola 450 так і пермісивного - E. horticola 450 His+1-5 (su+). Це створює передумови для наступного генетичного картування ервініафага 59. Отже, використання фагa F44 як тест-системи для пошуку позагенних супресорів у E.horticola поки що єдиний спосіб для цього виду бактерій.

Таким чином, поширення життєздатних фагів, які б могли формувати справжню лізогенію у E.carotovora обмежене. Це справедливо також і для вірулентних бактеріофагів. Така ситуація багато в чому незрозуміла. Фагостійкість у E.carotovora пов'язана з обмеженням розвитку фагів на рівні адсорбції і забороною їх внутріклітинного розвитку рестрикційною системою господаря. Вона існує також на рівні гомоімунності. Дефектна полілізогенія у пектолітичних ервіній може утворювати надстійкость до гомологічних і гетерологічних фагів.

Помірні фаги 49 і 59 утворюють справжню лізогенію у аміловороподібних бактерій E.horticola. Ця фаго-клітинна система унікальна в наступному. Фаги 49 і 59 мають пермутовану віріонну ДНК і гомологічні геноми. Їх ДНК упакована в капсиди, які побудовані з однакових структурних білків, але їх віріони відрізняються будовою базальної пластинки. За рахунок лізогенної конверсії ервініафаги утворюють надстійку систему, яка забороняє адсорбцію гомологічних фагів на лізогенізованих клітинах. Походження обох фагів, скоріше за все, є результатом рекомбінаційної взаємодії генетичних модулів у системі лізогенних штамів E.horticola, більш детальне вивчення якої може наблизити до розуміння явища справжньої лізогенії у фітопатогенних ервіній.

Нові життєздатні бактеріофаги, виявлені в ході виконання роботи, можуть бути з успіхом використані для вивчення молекулярної генетики ервіній.

РОЗДІЛ 6. ПЛАЗМІДИ E. CAROTOVORA

Для виділення плазмід E.carotovora використовували метод Kado, Liu (1981), який грунтується на обробці бактеріальних клітин 1,5% ДСН з наступною необоротньою денатурацією хромосомної ДНК і ренатурацією кільцевої плазмідної ДНК. В ході експериментів встановлено, що плазміди ервіній мають підвищену ампліфікацію в мінімальному середовищі з 1%-ним пектином. Плазмідні ДНК із клітин, які вирощували в цьому середовищі, не мали домішок хромосомної ДНК, РНК і білків. Ці препарати були використані для гідролізу ендонуклеазами рестрикції. Застосування рестриктаз дозволило встановити молекулярну масу ДНК деяких порівняно невеликих плазмід ервіній. Для визначення розміру великих плазмід і плазмід, які зустрічаються разом з іншими в одному і тому ж штамі-носії, як маркерні були використані загальновідомі плазміди pTi-C58, F, RP4, RSF1010 і pUC18.

Показано, що плазміди широко розповсюджені у E.carotovora. Біля 30% штамів цих бактерій несуть позахромосомні ДНК різного розміру - від 2,5 до 129 тпн. Плазміди частіше зустрічаються у E.carotovora subsp. atroseptica (в 4 із 6 штамів), ніж у E.carotovora subsp. carotovora (12 із 46 штамів). Причому у випадку підвиду atroseptica не спостерігається множинного вмісту плазмід. Кожний окремий штам цих бактерій містить індивідуальну позахромосомну ДНК. По одній плазмідній ДНК мають також штами ЕСА M2-4, 48A, B566, 52A і J2, тоді як у інших представників subsp. carotovora виявлено кілька різних плазмідних ДНК. Так, штами ECA13A і ECA35A несуть по 5 і 4 індивідуальних плазмід, відповідно. Клітини 5-ти інших штамів (33A, C366, 69A, 66A і 55A) мають по 2 плазміди. В клітинах штамів ECA C366 і 33A поряд з невеликими плазмідами (4,3 і 5,3 тпн) виявлені плазміди розміром 129 тпн. Плазміди абсолютно однакового розміру (129 тпн) присутні у штамів ервіній різного походження - ECA (13А, 33А і 366) і ЕАТ g217. У двох штамів E.carotovora subsp. atroseptica 39A і g152, які також різні за походженням, показано наявність двох близьких за розміром плазмід (pAT 33 і pAT 58) - 19 тпн. Рестрикційний аналіз ДНК цих порівняно невеликих плазмід показав їх неідентичність. Однак, три плазміди pCA 25, pCA 19-1 і pCA 47 із штамів ЕСА 48A, 55A і B566, крім однакового розміру ДНК (9,8 тпн), гомологічними за послідовністю і кількістю рестрикційних сайтів. Найменша плазміда (2,5 тпн) була виявлена в клітинах штаму ЕСА J2.

Обробка клітин мітоміцином С і акридін оранжевим не призводила до втрати плазмід. Спроби видалити плазміди, вирощуючи штами при температурах, які значно перевищують оптимальні для E.carotovora, були невдалими. Крім того всі плазміди ервіній стабільно успадковувались клітинами при частих пересівах культур на середовищі LB. При пересівах штама ЕСА 13А на середовищі АП втрачається нетипова плазміда (pCA 6-2, 48 тпн). Відсутність цієї плазміди призводить до збільшення синтезу макромолекулярного каротоворіцина Еса13А при індукції мітоміцином С. В одному із безплазмідних варіантів ЕСА 13А (клон 6/15) утворюється в 2-3 рази більше біологічно активного МCTV, ніж у батьківському штамі. Для інших штамів E.carotovora зв'язку між позахромосомними ДНК і лізисною активністю каротоворіцинів (групою MCTV) не виявлено. Плазмідний склад фітопатогенів не корелює з їх пектолітичною активністю. У плазмідних і безплазмідних штамів не вдалося знайти помітної різниці між такими ознаками як стійкість до антибіотиків, стійкість до дії СCTV і MCTV, здатність до росту на поліпектаті натрію і пектині та патогенність. Виявилося також, що криптичні плазміди не мають відношення до формування стійкості до антибіотиків і, в цьому зв'язку, не можуть розглядатися як R-плазміди (R-фактори) E.carotovora.

У процесі тривалої роботи з E.carotovora ми спостерігали популяційну гетерогенність штамів. При зберіганні колекційних штамів суттєва доля популяції (від 18 до 94% в залежності від штаму) Е.carotovora subsp. atroseptica змінює фенотип. Для штаму ЕАТ 39А ця зміна є множинною і стосується зменшення швидкості росту і забарвлення бактеріальних колоній на ЕМВ-агарі, втрату клітинами стійкості до олеандоміцину і еритроміцину і набуття ними чутливості до дії власних каротоворіцинів - фенотип PoeOmsErsBnsAu. Три інших штами цього підвиду ( ЕАТ 36, g125 і g217) утворюють тільки один тип дисоціантів (фенотип Poe). Їх Poe-варіанти не змінюють сприйнятливості до МСТV і коліфагів, а також до власних ССТV. Перевірка штамів ЕСА показала, що представники цього підвиду пектолітичних ервіній не утворюють Poe-дисоціантів з помітною частотою. Так як поява Рое-фенотипу може зумовлюватися коливаннями навколишньої температури, були проведені відповідні модельні експерименти. Клітини ЕСА і ЕАТ спочатку вирощували при супраоптимальних температурах (31°С для ЕАТ і 37 °С для ЕСА), а потім при 27 °С. Підрахунок Рое-дисоціантів проводили після 1 - 3 циклічних вирощувань клітин при супраоптимальній і оптимальній температурах росту. Було встановлено, що в 4-х штамів ЕАТ поява Рое-дисоціантів відбувається з частотою біля 3 % (після третього циклу). У штамів ЕСА утворення аналогічних фенотипів, крім штама ЕСА J2 (3 %), спостерігається значно рідше (менше 1 %). При цьому множинних дисоціантів серед штамів ЕАТ не спостерігали. Штам ЕСА J2 давав два типи стабільних клонів - з одиничним Poe-фенотипом і клони з потрійним фенотипом PoeАрsOms. При цьому він не змінював чутливості до МСТV, коліфагів і власних ССТV. Отже, гетерогенність штамів E.carotovora виникає як певна популяційна реакція клітин на тривалу дію підвищеної температури. Множинна зміна фенотипу в дисоціантів, можливо, має плейотропну природу (наприклад, стійкість до олеандоміцину й еритроміцину). Досліди показали, що плазмідний склад дисоціантів, у порівнянні з батьківськими штамами, залишається незмінним. Стабільне і незворотнє успадкування означених фенотипів свідчить про істотні зміни в бактеріальній хромосомі, тому ці зміни не можуть розглядатися як точкові мутації. Прояв Рое-фенотипу однаковий як для E.carotovora subsp. atroseptica, так і для E. carotovora subsp. carotovora.

Як було зазначено вище, бактерії роду Erwinia підвиду “carotovora” синтезують різноманітні пектинлітичні і пектолітичні ферменти, кількість яких корелює зі ступенем їх патогенності і є однією із таксономічних ознак цих бактерій. Цю особливість було використано при вивченні транскон'югативного перенесення чужорідних плазмід в клітини пектолітичних ервіній. Вперше для контроселекції клітин донора (E.coli та S.thyphimurium) застосовано селективне середовище з пектином. Додавання до нього відповідного антибіотика дозволяє відбирати лише транскон'югантні клони. Додаткова мета зазначених досліджень - визначення впливу власних плазмід та бактеріоцинів на горизонтальне перенесення чужорідних плазмід в клітини ервіній. При перенесенні плазміди RP4 (група несумістності Р1) в клітини 10-ти різних штамів (9 із яких - плазмідовмістні) показано, що придбання стійкості до ампіциліну штамами E.carotovora має низьку частоту. Частота переносу маркера Apr (стійкість до ампіциліну) для штама ЕСА 35А більше ніж на порядок перевищує частоти для решти штамів і складає 1х10-5 на клітину донора. Аутентична плазмідна ДНК RP4 виявляється тільки в даному штамі та штамі 39А E.carotovora subsp. atroseptica. Низькі частоти переносу ознаки Apr (в средньому 3х10-6 на донорну клітину) і відсутність плазмідної ДНК у більшості транскон'югантів поки що не мають пояснень. Частотні характеристики переносу стійкості до антибіотиків з допомогою плазміди RP4 в різні штами ервіній, одержані нами, добре узгоджуються з такими, що встановлені при вивченні сприйнятливості цими бактеріями плазмід групи несумісності Р (Cho et al., 1975). В подальшому вивчали передачу плазмід R391 і pKM101 в штами E.carotovora з допомогою описаного вище підходу. В результаті досліджень було встановлено, що частоти переносу ознаки Kmr плазмідою R391 в клітини 10-ти штамів E.carotovora є більш низькими, ніж одержані при використанні плазміди RP4 для тих же штамів. Вони знаходились в межах 1 х 10-8 - 1 х 10-6 на клітину донора. Вивчення плазмідного вмісту у більшості штамів транскон'югантів E.carotovora свідчить, що плазміда R391, аналогічно плазміді RP4, не виявляється як незалежна екстрахромосома. Відсутність екстрахромосомальної стадії у R391 в клітинах інших штамів можа пояснити великою ймовірністю інтеграції плазміди в бактеріальну хромосому. При вивченні передачі стійкості до ампіциліну плазмідою рКМ101 в 5 штамах E.carotovora були встановлені вищі частотні характеристики, ніж для плазмід RP4 і R391. Наявність екстрахромосоми рКМ101 в клітинах штамів ECA J2 і ECA 66A проявляється через збільшення частоти передачі Apr при схрещуванні донора та реципієнтів, що аналогічно для випадку RP4 - штам ЕСА 35А. Як аутентична, екстрахромосома рКМ101 виявляється також в штамі ЕАТ 39А. При цьому виявити аналогічну форму рКМ101 в клітинах штамів ЕСА Ес153 і 62А не вдалося. Аналіз частотних характеристик передачі стійкості до антибіотиків у штами E.carotovora з допомогою плазмід RP4, R391 і pKM101 показує, що наявність власних криптичних плазмід не впливає на транскон'югаційний процес. Кореляції між частотою перенесення чужерідних плазмід і лізисною активністю MCTV знайдено не було. У випадку транскон'юганта ЕСА 55А Kmr відбувається виключення двох резидентних гомологічних плазмідних ДНК рСА 19-1 і рСА 19-2, які, ймовірно, можуть бути віднесені до групи несумісності J. Виключення інших резидентних плазмід E.carotovora при переносі плазмід R391, RP4 і pKM101 не виявлено.

Таким чином, власні критичні плазміди зустрічаються доволі часто у пектолітичних фітопатогенних ервіній. Вони не відповідають за прояв антибіотикостійкісті, не мають генетичних структур для синтезу MCTV і CCTV. Популяційна гетерогенність не пов'язана зі зміною плазмідного складу штамів E.carotovora. Запропонований нами підхід для транскон'югативного перенесення плазмід у перспективі дозволить вивчити властивості і встановити екологічне значення даних екстрахромосом. Слід також відмітити очевидну паралель між дефектними фагами і деякими криптичними плазмідами E.carotovora: обидва види генетичних елементів є множинними факторами цих бактерій. Даний феномен множинності доповнюється багатофакторністю патогенності фітопатогенних пектолітичних ервіній, зокрема наявністю кількох ізоферментів пектатліаз ( Barras et al., 1994).

РОЗДІЛ 7. ВЗАЄМОЗВ'ЯЗОК МІЖ БАКТЕРІОЦИНАМИ, БАКТЕРІОФАГАМИ І ПЛАЗМІДАМИ E.CAROTOVORA (УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ)

Згідно літературних даних штами E.carotovora несуть два види бактеріоцинів - коліцинподібні бактеріоцини (CCTV) і макромолекулярні бактеріоцини типу фагових відростків (MCTV) (Лысак с соавт., 1978; Itoh et al., 1978). Екологічна роль MCTV і CCTV невідома, хоч подібні фактори у бактерій беруть участь у міжвидовому і міжштамовому антагонізмі (Прозоров, 1996). В роботі вперше показано, що CCTV виступають кілерами для віддалених родів бактерій і можуть вбивати фітопатогенні агробактерії, псевдомонади і Klebsiella spp. Серед ервіній вони обумовлюють лізис штамів E.chrysanthemi і E.herbicola. Всі ці бактерії можуть бути членами мікробної асоціації, яка заселяє рослину чи рослинний матеріал. Дослідження CCTV показують, що цей вид бактеріоцинів, на відміну від подібних бактеріоцинів ентеробактерій (Пагсли, Оудега, 1990), не має прямого відношення до криптичних плазмід E.carotovora. Ці фактори у пектолітичних ервіній, ймовірно, кодуються генами, які локалізовані в межах бактеріальної хромосоми. Аналогічні генетичні детермінанти виявлено у бактерій роду Pseudomonas. Вони кодують коліцинподібні піоцини типу S (Sano, 1993). При вивченні популяційної дисоціації штамів виявлено, що один і той же штам E.carotovora може нести кілька генетичних детермінант CCTV.

Макромолекулярні бактеріоцини E.carotovora - високоспецифічні кілерні агенти. Вони лізують близькоспоріднені штами фітопатогенних ервіній та штами близьких до них ентеробактерій - E.coli. Вузька специфічність MCTV аналогічна фаговій. Відомо, що майже всі бактеріофаги мають обмежене коло бактерій- господарів (Hendrix et al., 1999). На фагову природу MCTV вказують характерні зони лізису, що утворюються при їх дії на чутливі бактеріальні клітини. Важливим є те, що MCTV, окрім E.carotovora, можуть вбивати інші бактерії родини Enterobacteriaceae, які відносяться до важливих патогенів людини та тварин. Фаготерапія в теперішній час розглядається, як важливий напрямок медицини (Крылов, 2001) і MCTV, специфічні щодо коліформ, могли б бути використані для біоконтролю цих патогенів в оточуючому середовищі та в хворих пацієнтів.

Рецепторами для MCTV виступають молекули ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки E.carotovora subsp. carotovora. Скоріше за все, O-ланцюг ЛПС містить рецепторні ділянки для часток каротоворіцинів. Ця складова частина ЛПС-молекул містить і рецепторні ділянки для помірного бактеріофага ZF40 E.carotovora. У бактерій роду Erwinia наявність ЛПС-рецепторів можна розглядати як певну закономірність. Помірні ервініафаги 49 і 59, а також чужорідний фаг Т2 адсорбуються до високоочищених молекул ЛПС E.horticola 450. Дані, одержані при вивченні кола господарів для вірулентного фага F44, та розширення кола індикаторів серед RC -мутантів E.carotovora вказують на R-ЛПС, як на рецептор цього фага та коліфага Т7. Відомо, що всі складові частини ЛПС можуть виступати рецепторами для бактеріофагів і макромолекулярних бактеріоцинів (Beumer et al., 1984) Ті з них, які прикріплюються до S-ЛПС, вважаються вузькоспецифічними щодо бактерій-господарів. В цьому аспекті MCTV можна розглядати як особливі фактори конкурентних взаємовідносин у системі пектолітичних ервіній, що пояснює відсутність прояву кілерної дії на інші фітопатогенні бактерії.

Для пошуку макромолекулярних бактеріоцинів E.carotovora в роботі запропоновано принципово новий підхід. Суть методу полягає у визначенні бактеріоциногенністі безпосередньо на газоні бактеріальних мутантів, стійких до дії налідіксової кислоти. Дія НК викликає індукцію MCTV, які утворюють зони лізису на газоні. Метод застосовано щодо 104 штамів E.carotovora різного походження. Вперше показано, що 88 % штамів цих важливих фітопатогенів несуть MCTV, які відрізняються між собою за морфологією зон лізису бактеріального газону, його характером та іншими біологічними ознаками. Встановлено незалежність персистенції бактеріоцинів E.carotovora від місця знаходження штамів-носіїв та від рослини-господаря.

Результати вивчення лізогенного стану показують, що у фітопатогенних пектолітичних бактерій E.carotovora бактеріоциногенність і дефектна лізогенія поєднані між собою. Основні кілерні фактори цих бактерій є продуктами збирання дефектних помірних фагів при SOS-індукції лізогенних клітин. При індукції мітоміцином С і налідіксовою кислотою, окрім хвостових відростків, клітини утворюють й інші частинки фагової природи - головки та базальні пластинки. Кількісне співвідношення фагоподібних часток (компонентів фагових часток) в індукованих лізатах дефектно-лізогенних ервіній залежить від роду індуктора. При індукції НК штами E.carotovora дають від 63 до 85% часток типу фагових базальних пластинок. Причина цього явища невідома, але встановлений факт може бути корисним при наступному вивченні дефектних фагів пектолітичних ервіній.

Клітини окремих штамів E.carotovora утворюють при індукції від двох до трьох типів фагових відростків, які відрізняються між собою не тільки за лінійними размірами, але й за морфолого-структурною організацією. Результати, які обґрунтовують множинну лізогенію E.carotovora, були отримані також при вивченні фагових головок. Для всіх штамів ервіній характерна наявність головок 4 типів, при цьому один із штамів (ЕСА 35А) містить три різні типи цих часток. Результати вказують на наявність у фітопатогенних пектолітичних ервіній дефектної полілізогенії і підтверджують множинність MCTV. Природа дефектів у профагових геномах E.carotovora, які приводять до формування тільки компонентів фагових віріонів, а не нормальних помірних бактеріофагів, невідома. Висловлено кілька припущень. Дефектність профагів ервіній пов'язана з порушенням синтезу конекторів фагових часток. У випадку профагів ервіній можливо мають місце дефекти при упакуванні ДНК. І, нарешті, компоненти фагових часток є продуктами окремих генетичних модулів дефектних профагів, які структурно і функціонально не зв'язані між собою і розміщені в різних місцях бактеріальної хромосоми. Головки дефектних помірних фагів пектолітичних ервіній близькі за формою до головок ізометричних фагів, що дозволяє припустити існування дефектних помірних фагів морфотипу А1 у цих бактерій. Бактеріофаг такої морфологічної організації (ZF40) дійсно було знайдено, але за размірами та за структурою скоротливого футляра хвостового відростка він суттєво відрізняється від дефектних фагів E.carotovora.

Розміри нормальних хвостових відростків дефектних помірних фагів 11-ти штамів E.carotovora складають від 128 до 192 нм і близькі до лінійних розмірів хвостових відростків інших штамів цих бактерій (Nguyen et al., 1999). Вони також співпадають з розмірами піоцинів R-типу (Kageyama et al., 1979) і макромолекулярними бактеріоцинами інших бактерій (Boemare et al., 1992). Отже, штами фітопатогенних пектолітичних ервіній зустрічаються в природі як дефектно-полілізогенні системи. Дефектна лізогенія пектолітичних ервіній тісно асоційована із бактеріоциногенністю, носіями якої виступають макромолекулярні каротоворіцини типу фагових хвостових відростків.

В роботі вперше започатковано вивчення процесу самозбирання in vitro таких надмолекулярних структур, як порожні футляри і поліфутляри, після руйнування скорочених футлярів хвостових відростків дефектних фагів E.carotovora. Виявлено центри самозбирання (кристалізації) порожніх футлярів і поліфутлярів каротоворіцинів, які являють собою двохкомпонентну систему. Центри самозбирання, ймовірно, складаються із молекул "затравки" і структурного білка скороченого футляра. Самоорганізація порожніх поліфутлярів каротоворицинов близька до процесу полімеризації за моделлю “риб'ячого хвоста”, яку запропоновано для самозбирання бактеріальних джгутиків (Асакура, 1982). Вона носить ступінчатий характер і призводить до утворення полярних порожніх поліфутлярів, які складаються з мономерних одиниць. Самозбирання порожніх футлярів і поліфутлярів каротоворіцинів - високоспецифічний процес. Кожному футляру і поліфутляру відповідає тільки певний тип скороченого футляра каротоворіцина того чи іншого виду. Структури змішаного типу не виявляються. Процес утворення in vitro нових надмолекулярних структур каротоворіцинів може бути зручною моделлю для вивчення самозбирання елементарних біологічних структур. Значну роль при цьому могли б відігравати центри самозбирання. Очевидно, що їх вивчення як самостійних структур могло б привести до визначення сил міжмолекулярної взаємодії і термодинамічних параметрів процесу самоорганізації.

Наявність справжньої лізогенії з участю помірного бактеріофага ZF40 у пектолітичних фітопатогенних бактерій E.carotovora у нашій роботі встановлена вперше для цих бактерій. Фаги 49, 59 і Е105, які раніше розглядалися як помірні фаги цих бактерій не лізують і не лізогенізують жодного штаму E.carotovora. З цієї причини їх можна розглядати як фаги аміловороподібних фітопатогенів E.horticola.

Основні причини фагостійкості загальновідомі (Krыger, Bickle, 1983) і включають обмеження розвитку фага з боку систем рестрикції-модифікації бактерії-господаря, а також обмеження через відсутність відповідних рецепторів і/або зменшену доступність фага до власного рецептора. Розвиток фага в клітині може заборонятися репресором гомоімунного профага. Як показано в роботі, всі зазначені причини фагостійкості можуть мати місце у E.carotovora. Хоч при дослідженні фагостійкості не було показано абортивного виключення власними плазмідами цих бактерій - фенотип Abi (Deng et al., 1997), деякі дані вказують на можливість існування у ервіній і цього феномену. В ході експериментів було встановлено, що три штами ервіній (ЕСА М2-4, 33А і J2), які фаг ZF40 вражує з низькою ефективністю при першому інфікуванні, несуть плазміди різного розміру.

ZF40 - класичний помірний бактеріофаг. Він здатний формувати правильні лізогени чутливих культур і спонтанно утворювати мутанти clear-типу. Геном фага ZF40 містить липкі кінці і має середній розмір (45,8 тпн), який близький до розміру геномів лямбдоїдних бактеріофагів (Campbell, 1994). Фаг, скоріше за все, використовує cos-стратегію реплікації ДНК. Механізм інтеграції його геному в ДНК бактерії-господаря близький до сайт-специфічної рекомбінації. Структурна організація фагового капсиду і, особливо, хвостового відростка є унікальною і досить складною. Порівнюючи структуру каротоворіцинів E.carotovora і відростка фага можна бачити, що власне цей компонент фагового капсиду є найбільш унікальним утвором як дефектних, так і життєздатних фагів E.carotovora.

Не дивлячись на те, що E.carotovora є занадто шкідливим фітопатогеном й інтенсивно вивчається в різних лабораторіях, кількість її бактеріофагів не нараховує і десяти (Perombelon, 1992). Ця унікальна ситуація не має пояснення. Відповідь на питання про поширення життєспроможних фагів E.carotovora може лежати у площині дефектно-полілізогенного стану цих важливих бактерій. На нашу думку, дефектна полізізогенія у пектолітичних ервіній може призводити до утворення надстійкості до гомологічних і гетерологічних фагів.

Згідно сучасній теорії модульної організації бактеріальних вірусів (Brussow et al., 1998), фагові геноми складаються із наборів (кластерів) генів, які відповідають за кодування структурно і функціонально споріднених білків. Генетичні модулі, які відповідають за синтез структурних білків віріона, включають три головні незалежні набори генів: білків капсида, хвостового відростка і базальної пластинки. Ці модулі були порівняні у споріднених помірних ервініафагів 49 і 59, які мають біля 50% гомології ДНК (Товкач, 1987). Показано, що фаги мають однакові модулі капсида і хвостового відростка. В ідентичні капсиди фагів 49 і 59 упаковується віріонна ДНК однакового розміру - 47,9 тпн. Навпаки, організація генних модулів базальної пластинки в обох фагів різна. Базальноі пластинки обох фагів відрізняються за морфолого-структурною організацією та поліпептидним складом. Вони мають спорідненість до різних рецепторних сайтів, розташованих на ЛПС клітинної оболонки спільного господаря - E. horticola 450. Наявність відмінних ВР змінює коло чутливих бактерій-господарів. Ці факти підтверджують положення про меншу сталість (консервативність) модулів базальних пластинок, особливо хвостових фібрил, порівняно з модулями фагових хвостових відростків (Sandmeier, 1994). Рестрикційний аналіз геномів фагів 49 і 59 показав, що обидва фаги мають циклічно пермутовану ДНК. Проте пермутація ДНК фага 49, на відміну від ДНК фага 59, - дискретна. Отже в геномі фага 49, у порівнянні з таким фага 59, наявна значна зміна нуклеотидної послідовності, що має відношення до рекомбінації. Певно, геном фага 49 є гібридним геномом, походження якого обумовлене рекомбінаційною взаємодією батьківського генома фага 59 і модульного набору генів невідомого партнера фагового чи профагового походження. Новий гібридний помірний фаг (фаг 49) включає модулі капсида і хвостового відростка, а також деяку частину генів с-області, які ведуть своє походження від батьківського фага 59. Дані, одержані при дослідженні L. lactis, показують, що нові фаги, аналогічні фагу 49, можуть виникати як відповідь на селективний тиск абортивної інфекції (Moineau et al., 1994). Висловлено допущення, що помірні фаги 49 і 59, насправді, належать до унікальної полілізогенної системи E.horticola і їх походження пов'язане з наявністю різних профагів в клітинах одного господаря.

В роботі охарактеризовано новий вірулентний бактеріофаг F44. Фаг F44 - полівалентний і здатний розмножуватися в клітинах багатьох представників бактерій роду Erwinia, лабораторних штамів E.coli і деяких псевдомонад. Важлива особливість цого фага - здатність лізувати деякі мутанти фітопатогенних пектолітичних ервіній, стійких до MCTV. При порівняльному вивченні виявлено дві суттєві відмінності між фагом F44 та фагом Т7 E.coli. Фаг F44 не має власної системи захисту від рестрикції з боку бактерії-господаря, аналогічної Orc -системі фага Т7 (Krыger, Schroeder, 1981). З іншого боку, на відміну від фага Т7, розвиток фага F44 не обмежується в клітинах штамів E.coli, які несуть статевий фактор F (Studier, 1979). Відсутність багатьох рестрикційних сайтів на ДНК фагів F44 і Т7 свідчить про їх контрселекційне видалення в процесі адаптації фагів до співіснування з господарем.

Подальший розвиток фундаментальних досліджень в галузі молекулярної генетики бактерій роду Erwinia і їх бактеріофагів неможливий без отримання банку відповідних бактеріальних і фагових мутантів. Для вивчення генетичної організації бактеріофагів, плазмід та бактерій необхідні супресорні мутанти. Так як фаг F44 фактично має властивості полівалентного бактеріофага, він може застосовуватися для вивчення позагенної супресії у E.horticola. При цьому стає можливою надійна селекція su+-мутантів не тільки в аміловороподібних ервіній, а також у E.carotovora (RC-мутанти) і таких важливих епіфітних бактерій як E.herbicola.