Вплив стафілококового білка А та його різних форм на імунну відповідь

При дослідженні впливу електромагнітного випромінювання мм-діапазону на морфологічні, тинкторіальні i культуральні властивості, ознаки патогенності та чутливості до антибіотиків штамів стафілокока різного походження, а також на біологічну активність виділеного з них білка А, встановлено, що випромінювання в досліджуваному діапазоні не справляє значного впливу на культуральні властивості стафілококів. Відмічено зміни антибіотикочутливості після опромінення КХЧ. Staph. aureus стає більш чутливим до ампіциліну та бензилпеніциліну. Подібного впливу ультразвуку на антибіотикочутливість штамів стафілокока не виявлено. Крім того, спостерігали зміни в продукції білка А та втрату його здатності неспецифічно зв'язувати сироваткові імуноглобуліни при дії КХЧ опромінення. Не виявлено відмінностей в амінокислотному складі БА, що синтезувався за даних умов.

В світлі вищесказаного варто відмітити, що, як відомо, визначальну роль у неспецифічній взаємодії БА з імуноглобулінами відіграє так звана "тирозинова область" молекули [Li R et al., 1998]. Її хімічна модифікація (нітрування, йодування, алкілування) викликає втрату БА здатності до неспецифічної взаємодії з імуноглобулінами [Sjodahl J.. l977; Seki K. et al., 1998]. Оскільки молекула білка А являє собою коротку витягнуту фібрилу, зі співвідношенням осей рівним 19, то заряджені амінокислотні залишки та фібрилярність обумовлюють її полярність [Kronvall G. еt al., 1999; Graitle M. et al., 2000]. Можливо, опромінення є тим фактором, який модифікує гідрофобність тирозинової області БА або ж впливає на заряджені амінокислотні залишки фібрили, що зумовлює зміну конформації молекули. Не виключено, що відбуваються зміни в структурі сайта, які відповідають за зв'язування з імуноглобулінами. Також не слід відкидати можливість того, що мм-випромінювання діє на активацію синтезу репресорів транскрипції, які здатні блокувати певні індуцибельні метаболічні процеси бактерій.

Отримані результати свідчать про те, що КХЧ опромінення відміняє екрануючий ефект імуноглобулінів. Тобто, стафілококи втрачають здатність неспецифічно зв'язуватись з Fc-фрагментами імуноглобулінів, що, в свою чергу, сприяє їх фагоцитозу макрофагами. При відтворенні таких процесів in vivo це, безумовно, позначається на активації процесів фагоцитозу, сприяє антигенній презентації стафілококів і формуванню повноцінної та ефективної антигенспецифічної імунної відповіді. Під дією ультразвуку не було виявлено статистично вірогідних відмінностей у продукції і активності білка А та інших факторів патогенності стафілококів.

В цій ситуації важливо було з'ясувати, чи відбуваються зміни гену spa за умов дії електромагнітного опромінення, чи така обробка викликає лише конформаційні зміни вже синтезованої молекули білка А. З цією метою застосовувалась полімеразна ланцюгова реакція. При використанні праймерів, специфічних до гену білка А, отримано ампліфікатний продукт, який за своїми характеристиками відповідає гену spa. Цей ген присутній у опромінених штамах стафілококів, що містять білок А (Staph. aureus Cowan-1, Staph. aureus 209), і відсутній у Staph. aureus Wood-46, що не синтезує білок А. Отже, не спостерігається якісних змін порівняно з неопроміненими культурами названих штамів, що свідчить на користь того, що модифікація неспецифічної взаємодії білка А у опромінених стафілококів пов'язана не з генетичними, а з конформаційними змінами.

Так, в ряді досліджень виявлено вплив КХЧ на характеристики водних розчинів електролітів, діелектричну проникність, поглинання структурних елементів, а також на білкові структури мікроорганізмів та продукти їх синтезу [Ляшенко А.К. и соавт., 1997]. Дія мм-хвиль на цвільові гриби, дріжджі та клітини E. coli викликає ряд змін у функціонуванні клітин та стимулює їх ріст [Реброва Т.В., 1992]. Зміни, що відбуваються, стосуються морфологічних, культуральних, фізіологічних і біохімічних властивостей бактерій. Таким чином, вплив міліметровими хвилями дозволяє направлено регулювати метаболічні процеси мікроорганізмів.

Але імунобіологічні властивості білка А не обмежуються лише його здатністю неспецифічно взаємодіяти з імуноглобулінами. Тому, нашою метою було комплексне дослідження імунної відповіді до БА та його різних форм і, в свою чергу, їх впливу на функціональну активність імунокомпетентних клітин.

З'ясування механізмів активації клітин імунної системи під впливом білка А стафілокока.

Як виявилось, БА діє вже на рівні гемопоетичних стовбурових клітин, що було показано з допомогою ендо- та екзоколонієутворення в селезінці опромінених мишей. Спостерігали стимуляцію утворення гемопоетичних осередків в селезінці опромінених мишей (лінії СВА, BALB/c, (CBAxC57BL/6)F1, (C57BL/6хASn)F1), починаючи з 1 доби після опромінення; прискорення регенерації еритропоезу, що досягало рівня інтактних тварин по включенню [⁵⁹Fe] на 7 добу після опромінення мишей (лінії B6AF, (CBAхC57BL/6)F1) (рис. 1). Також відзначено стимулюючий вплив БА на післярадіаційне виживання опромінених мишей (оптимальним виявилося введення антигену за 3-5 днів до опромінення), що свідчить про протипроменевий ефект білка А.

Біологічна активність багатьох токсинів обумовлена їх впливом на функціональну активність біологічних мембран. При дослідженні механізму взаємодії білка А з мембранними структурами нативних та штучних мембран було вперше встановлено, що білок А здатен модифікувати штучні біліпідні мембрани, незворотньо вмонтовуючись в них та формуючи іон-провідникові структури. Поряд з цим, виявлено здатність БА стимулювати транспорт іонів Ca²⁺ через потенціалзалежні кальцієві канали нативної плазматичної мембрани клітин, що, за логікою комплексного універсального механізму внутріклітинної сигнальної трансдукції за участю іонів Са²⁺, повинно відігравати визначальну роль у функціонуванні ранніх молекулярних механізмів активації лімфоїдних клітин під впливом антигену.

Проведено оцінку продукції регуляторних цитокінів, що визначають проліферацію, диференціювання і ефекторні функції клітин імунної системи під впливом різних форм білка А. ІЛ-1, відомий як один з ключових цитокінів, причетних до модуляції імунної відповіді та запальних процесів. Виявлено, що препарати білка А та клітинно-зв'язаного білка А індукують продукцію ІЛ-1 та ІЛ 2 (табл. 1, табл. 2). Встановлено, що БА регулює продукцію цитокінів, що в подальшому призводить до каскадної активації відповідних імунокомпетентних клітин.

ФНП, який продукується в основному макрофагами, є важливим регулятором запальної реакції як форми імунної відповіді та вагомим фактором природної резистентності організму [Вершигора А.Е., 1990;. Ярилин А.А., 1997; Бережная Н.М., 1999]. В світлі цього варто відмітити стимуляцію продукції білком А ендогенного ФНП (табл. 3), адже, наприклад, при терапії злоякісних новоутворень за допомогою ФНП мають місце значні негативні побічні ефекти, пов'язані з коротким періодом деградації препарату та необхідністю застосування великих його доз. Більше того, кількість ФНП, індукованого КЗБА, виявилась дуже великою (активність перевищувала 160 ОД/мл).

Дослідження впливу різних форм білка А на функціональну активність клітин системи імунітету.

Використовуючи для імунізації різні форми БА, спостерігали статистично достовірне зростання титрів специфічних антитіл при імунізації наступними антигенами стафілокока: клітинно-зв'язаним білком А, та білком А, сорбованим силікагелем чи модифікованим опроміненням електромагнітними хвилями мм діапазону (КЗБА, БА КХЧ, КЗБА КХЧ, БА СГ, КАС Cowan-1 КХЧ), що свідчить про посилення імуногенних властивостей білка А в цих формах. Враховуючи викладене, найоптимальнішими для посилення антигенності та простішими у приготуванні, на наш погляд, є клітинно-зв'язаний білок А та БА КХЧ.

Білок А утворював лінію преципітації з нормальною кролячою сироваткою (НКС) та сироваткою кролів, імунізованих Staphylococus aureus Wood-46. При взаємодії білка А з сироваткою кролів, імунізованих Staphylococcus aureus Cowan-1 (ІКС), утворювались дві лінії преципітації, що підтверджує антигенні властивості БА. Білок А, НКС та ІКС до Staph. aureus Cowan-1 при взаємодії утворювали "зірку". При використанні ІКС до Staph. aureus Wood-46, який не містить білок А, подібного явища не спостерігали. Це свідчить про здатність білка А модифікувати імунну відповідь завдяки здатності антигенспецифічно взаємодіяти з Fab фрагментами антитіл та, окрім цього, взаємодіяти з Fc фрагментами антитіл будь-якої специфічності.

Отже, білок А має антигенні детермінанти, які неспецифічно реагують з нормальними IgG і специфічно з імунними, але слід відмітити, що встановлення цього факту все ще не є достатнім для пояснення значення білка А у формуванні протективного антистафілококового імунітету.

На підставі даних по впливу білка А на В-систему імунітету, порівняльної оцінки дії антигенів стафілокока, що відрізняються за вмістом білка А, на Т-залежну гуморальну імунну відповідь, встановлено імуномодулюючу дію білка А. Показано, що введення антигенів стафілокока сприяє появі в селезінці мишей активованих лімфоцитів, які прямо чи опосередковано (через Т-хелпери) впливають на синтез антитіл класів IgM та IgG до Т-залежного антигену.

Проліферація клітин імунної системи є основою формування імунної відповіді як гуморального, так і клітинного типу. Досліджували вплив БА на проліферативну активність лімфоцитів декількох видів тварин і ліній мишей, безтимусних мишей nude.

Білок А володіє мітогенною активністю по відношенню до Т- і В-лімфоцитів та не впливає на синтез ДНК тимоцитами. Білок А проявляє Т-залежні мітогенні властивості при дії на лімфоцити селезінки безтимусних мишей nude (табл. 4). На мітогенну дію білка А не впливає неспецифічна взаємодія з імуноглобулінами сироватки крові. Мітогенний ефект білка А дозозалежний і пов'язаний з продукцією цитокінів та активацією проліферації стовбурових клітин.

Протипроменева дія препаратів білка А стафілокока.

Відомо, що багато речовин з імуномодулюючими властивостями володіють також і протипроменевими ефектами та успішно застосовуються для імунореабілітації [Ковальський О.В. та співавт., 1993; Комиссаренко С.В. и соавт., 1994; Ярилин А.А., 1997]. Важливою також є стимуляція антиінфекційної резистентності за умов радіаційно індукованого імунодефіцитного стану [Андрущенко В.И. и соавт., 1996; Савцова З.Д., 1996]. Тому ведеться пошук таких речовин, які б поряд з імуномодулюючими мали б і протипроменеві властивості, а також могли б забезпечити як загальне відновлення імунореактивності, так і стимуляцію специфічного антиінфекційного імунітету. Ефективним засобом підвищення радіорезистентності організму в цілому та лімфоїдної системи зокрема може бути імуностимуляція. Встановлено, що антигенна та мітогенна стимуляція суттєво модифікує чутливість лімфоцитів до опромінення. Запуск імунологічних реакцій супроводжується проліферацією лімфоцитів та в цілому підвищенням радіостійкості даних клітин у період максимальної експресії імунної відповіді.

Під впливом білка А відбувається стимуляція проліферації лімфоцитів щурів, опромінених в межах доз 0,5 та 1 Гр (потужність дози 0,5 Гр/хв), що може свідчити про його протипроменеву дію.

Білок А та клітиннозв'язаний білок А сприяли стимуляції проліферації спленоцитів щурів, тотально опромінених невисокими дозами радіації. Індекси стимуляції залежали від часу введення антигену після опромінення. Під впливом пептидоглікану золотистого стафілокока спостерігалась стимуляція проліферації В-лімфоцитів, а білок А активував як В-, так і Т- лімфоцити, що поряд з впливом на продукцію цитокінів, неспецифічні фактори резистентності сприяє відновленню В- і Т- систем імунітету у опромінених тварин. Одержані дані свідчать про антипроменеву дію досліджуваних препаратів та підтверджуються результатами експериментів по стимуляції проліферації гемопоетичних стовбурових клітин та регенерації еритропоезу, кооперативної взаємодії Т- і В-лімфоцитів в селезінці опромінених тварин, продукції цитокінів, впливом на неспецифічні фактори резистентності організму.

Вплив білка А на функціональну активність клітин системи неспецифічної резистентності.

Важливою ланкою в елімінації збудника та індукції імунної відповіді є клітини фагоцитарної системи - макрофаги і моноцити. Вони елімінують чужорідні антигени за допомогою ферментативних систем і генерації активних метаболітів кисню, здійснюють свою функцію без участі антигенспецифічних імунних механізмів, але можуть ініціювати і специфічну імунну відповідь, представляючи антиген лімфоцитам. В той же час, багато мікроорганізмів продукують фактори, які зменшують чутливість до бактерицидних систем фагоцитів, ускладнюючи їх розпізнавання та ін.

Виявлено відмінності у фагоцитарній активності макрофагів, отриманих від тварин, імунізованих корпускулами стафілокока та різними формами білка А. При імунізації мишей очищеним, клітинно-зв'язаним білком А та антигенами, що були оброблені електромагнітними хвилями, спостерігали стимуляцію фагоцитарної активності макрофагів по відношенню до різних об'єктів фагоцитозу ([⁵¹Cr]-мічених еритроцитів барана, [³H]-тимідин-мічених корпускул стафілокока), порівняно з відповідним контролем.

Природні кіллери розпізнають та елімінують різні клітини-мішені, виявляють регулюючий вплив на процеси гемо- та лімфопоезу [Семененя И.Н., 1991]. Є дані про позитивну роль природних кіллерних клітин (ПКК) у знищенні бактерій та паразитів [Покровский В.И и соавт., 1999]. ФНП, ІЛ-1, ІЛ-2, -ІФН модулюють активність ПКК. Поряд з цим ряд бактеріальних антигенів також можуть підсилювати функцію ПКК [Возианов А.Ф., Бутенко А.К. и соавт., 1998]. Так, інтраперитонеальне введення мишам БЦЖ підвищує їх цитотоксичну активність. Оцінка функціональної активності природних кіллерів при дії антигенних субстанцій стафілокока дозволила встановити, що БА стафілокока здатен модулювати кіллерну активнічть ПКК периферійної крові мишей. У порівнянні з пептидогліканом, який переважно пригнічував цитотоксичну дію, розчинний та клітинно-зв'язаний білок А, навпаки, підвищували рівень цитотоксичності ПКК.

Гістоморфологічні зміни в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока.

Основними органами імунної системи, які відіграють значну роль в індукції імунної відповіді є селезінка та тимус. Важлива роль в акумуляції імунокомпетентних клітин в процесі розвитку антиінфекційного імунітету належить також лімфатичним вузлам.

В даній роботі представлені матеріали досліджень гістоморфологічних змін в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока. В селезінках тварин, імунізованих корпускулярним антигеном стафілокока (КАС), спостерігалось значне збільшення кількості макрофагів та багатоядерних клітин, що свідчить про підсилення фагоцитарної активності та надмірну функціональну напругу захисних властивостей макрофагальної системи (рис. 2(а)). При імунізації білком А виявлено зміни, що свідчать про підсилення функції ретикуло-гістеоцитарної системи селезінки без порушення структури її білої та червоної пульп (рис. 2(б)). В тимусі тварин дослідної групи відмічено значне розширення коркового та мозкового шару, зменшення кількості тимоцитів, функціональну напругу тілець Гассаля, які, як відомо, берутьучасть у продукції тимічних факторів (рис. 2(в)). В лімфатичних вузлах імунізованих тварин кількість лімфоцитів паракортикального та мозкового шарів також була збільшеною, а в кортикальному шарі - зменшена. Оскільки паракортикальний шар відноситься до Т-залежної зони, то це може свідчити про збільшення кількості Т-лімфоцитів при даному антигенному впливі (рис. 2(г)). Отже, мають місце добре виражені відмінності в гістоморфологічній структурі центральних та периферичних органів імунної системи у імунізованих антигенами стафілокока тварин.

Перебіг експериментальної стафілококової інфекції у мишей під впливом стафілококового білка А.

В ході проведених досліджень по впливу препаратів очищеного і клітинно-зв'язаного білка А на перебіг експериментальної стафілококовій інфекції та деякі показники імунного статусу організму дослідних мишей, зокрема на функціональну активність перитонеальних макрофагів і ПКК селезінки, персистенцію збудника в нирках тварин, а також на рівень ІФН та ФНП в сироватці крові, встановлено, що досліджувані препарати мають значну імунорегулюючу та протекторну дію. Профілактичне застосування названих препаратів забезпечувало значне (4-кратне) підвищення вмісту ІФН в сироватці крові (рис. 3) та дозозалежне зростання рівня ФНП (рис. 4).

Важливою ланкою неспецифічної резистентності організму є система мононуклеарних фагоцитів. Її функціонування залежить від багатьох факторів, в тому числі і від продукції ІФН та ФНП (Ершов Ф.И., 1996; Esepchuk Y.V. et al., 1996).

Результати визначення функціональної активності перитонеальних макрофагів хемілюмінесцентним методом дозволили констатувати їх пригнічення під час розвитку стафілококової інфекції, особливо на 1 добу, що узгоджується з даними інших авторів [Лазаренко Л.Н., Спивак Н.Я. и соавт., 1992]. Під впливом БА спостерігали підсилення функціональної активності перитонеальних макрофагів (табл. 6). Виявлено існування кореляції між ступенем активації макрофагів і вмістом ІФН в сироватці крові хворих тварин з експериментальною стафілококовою інфекцією: зниження рівня ІФН на 3-5 добу супроводжувалось зниженням активності макрофагів (МФ) і, навпаки, його підвищення на 1-3 добу співпадало з посиленням виділення активних форм кисню макрофагами.

Білок А модифікує фагоцитарну активність МФ. Стимуляція їх бактерицидної активності на 1 добу розвитку стафілококової інфекції може бути зумовлена стимуляцією фагоцитозу при безпосередній взаємодії білка А з МФ [Вихоть Н.Е., 1981]. Для препарату КЗБА спостерігалась подібна до БА динаміка впливу на МФ мишей при експериментальній стафілококовій інфекції. На 5 добу розвитку інфекції не відбувалось пригнічення бактерицидної активності МФ, що узгоджується з даними літератури [Ефремова В.И., Шкурат О.Е. и соавт., 1982]. Важливо, що білок А забезпечує імуностимуляторну дію в перші 5-7 днів після інфікування. Більш тривалу активацію процесів фагоцитозу при застосуванні препарату КЗБА можна пояснити наявністю в його складі компонентів клітинної стінки стафілокока, зокрема пептидоглікана.

Результати дослідження природної кіллерної активності (ПКА) лімфоїдних клітин селезінки мишей при стафілококовій інфекції за умов профілактичного застосування БА і КЗБА свідчать про її посилення на 3 добу розвитку інфекційного процесу.

Для з'ясування протекторних властивостей досліджуваних антигенів аналізували персистенцію збудника в організмі мишей лінії СВА, яким з профілактичною метою вводили препарати БА, що призводило до зниження персистенції збудника.

Таким чином, одержані результати свідчать про те, що препарати білка А впливають на перебіг стафілококової інфекції та володіють протекторними властивостями.

Вплив білка А на клітинну імунну відповідь. Індукція та імунологічні властивості фактора переносу клітинної імунної реактивності, специфічного до різних форм білка А.

Під впливом досліджуваних антигенів стафілокока спостерігаються зміни імунної реактивності імунокомпетентних клітин, які виявляються як in vitro, так і in vivo. Так, після імунізації білком А в різних формах у тварин формується стан гіперчутливості сповільненого типу до антигенів стафілокока.

Механізм гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) є одним з базових в процесі розвитку клітинної імунної відповіді [Пол У., 1987; Ройт А., 1999]. ГСТ визначає зміни у функціональній активності популяцій імунокомпетентних клітин, що призводять до істотних змін в імунній реактивності організму до певних антигенів [Медуницын Н.В. и соавт., 1980, 1999]. З урахуванням цього нами проведено вивчення стану ГСТ до білка А та його різних форм на декількох видах тварин. Одноразова сенсибілізація тварин білком А та клітинно-зв'язаним білком А призводила до розвитку стану ГСТ, який виявлявся за допомогою шкірних проб і корелював зі стимуляцією продукції міграцію інгібуючого фактора (МІФ) спленоцитами сенсибілізованих тварин. Нами проаналізовані популяції лімфоцитів, що індукують продукцію МІФ, під впливом різних форм білка А. Встановлено, що розвиток стану ГСТ до стафілококових антигенів можна модифікувати при використанні для імунізації білка А, опроміненого електромагнітними хвилями мм-діапазону, та застосуванні в якості ад'ювантного засобу силікагелю. Введенням тваринам циклоспорину А також можна змінювати розвиток реакції ГСТ до досліджуваних стафілококових антигенів, впливаючи на Tхелпери-1 і продукцію ІЛ-2. Останнє не виключає суперантигенних властивостей білка А. Виявлено, що клітинна імунна відповідь до стафілокока ефективно стимулюється БА та КЗБА.

Багато інфекційних агентів за допомогою різних пристосувань супресують клітинну ланку імунної відповіді [Endo N. et al., 1997; Мац А.Н. и соавт., 1998] і в цьому випадку стимуляція клітинно-опосередкованого імунітету по відношенню до антигенів збудника сприяє відновленню специфічної імунної реактивності. В наших дослідженнях було виявлено, що БА в різних формах індукує стан ГСТ, який відображає високу ступінь імунної реактивності до даного антигену. Стан ГСТ до БА також можна відтворити за допомогою адаптивного переносу, але в цьому випадку виникає проблема гістосумісності лімфоцитів донора та тканин реципієнта. Одним із шляхів вирішення цієї проблеми є використання фактора переносу імунної реактивності, який забезпечує безклітинний перенос ГСТ від сенсибілізованого організму до інтактного [Kirkpatrick C.H., 1994; Fudenberg H.H., Pizza G., 1994]. З цією метою з лейкоцитів імунізованих тварин, які знаходились в стані ГСТ до різних форм білка А, одержано специфічний фактор переносу клітинної імунної реактивності, за допомогою якого експериментальним тваринам було успішно перенесено стан ГСТ до БА. Це є одним з перспективних засобів антигенспецифічної імуномодуляції.

Фармакологічні властивості різних форм білка А та індукованого фактора переносу до антигенів стафілокока.

Нами була проведена оцінка фармакологічних властивостей використаних в роботі препаратів. Досліджено мутагенні властивості препаратів білка А та КЗБА та індукованих ними препаратів ФП, їх алергенність, токсичність, пірогенність. Не виявлено ніяких негативних побічних ефектів. На протязі часу спостереження у тварин не відзначали запальних та алергічних реакцій, падіння маси тіла, зміни реактивності (p0,01 між дослідними та контрольною групами).

Отже, одержані результати вказують на імунорегулюючий вплив досліджуваних препаратів різних форм білка А і дозволяють охарактеризувати основні механізми індукції імунної відповіді до отриманих антигенних субстанцій стафілокока.

Враховуючи протективну дію препаратів очищеного та клітинно-зв'язаного білка А при експериментальній стафілококовій інфекції, їх можна рекомендувати для імунізації і створення превентивного протистафілококового імунітету. Також можна рекомендувати і інший шлях стимуляції клітинної імунної реактивності по відношенню до стафілококових антигенів - за допомогою специфічного фактора переносу, що може знайти своє застосування у вирішенні проблеми розробки методів ефективної стимуляції пригніченого протистафілококового імунітету та пошуку препаратів, здатних переносити/стимулювати специфічний імунітет швидко та ефективно, минаючи стадію вакцинації.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає у визначенні ефектів впливу стафілококового білка А та його різних форм на основні етапи становлення та розвитку імунної відповіді, формування імунологічної пам'яті, у з'ясуванні основних механізмів імуномодулюючої дії, впливі досліджуваних антигенів на функціональну активність окремих популяцій імунокомпетентних клітин, системи неспецифічної резистентності, можливості індукції продукції цитокінів, у визначенні протекторних властивостей, а також показаних напрямках їх практичного застосування.

Досліджено ряд факторів, які впливають на продукцію та активність білка А стафілокока, його патогенність. Встановлено, що склад поживного середовища суттєво позначається на продукції білка А. Серед досліджених факторів електромагнітне випромінювання мм-діапазону змінює чутливість стафілококів до антибіотиків, модифікує продукцію та активність білка А, що впливає на антигенність та формування імунної відповіді до нього. Індуковані опроміненням зміни не пов'язані з модифікацією гену spa, що підтверджується результатами полімеразної ланцюгової реакції.

Білок А стафілокока в різних формах модифікує функціональну активність клітин імунної системи, опосередковуючи її як специфічною, так і неспецифічною взаємодією з імуноглобулінами, модулюючи окремі етапи розвитку імунної відповіді до Т-залежного антигену. Імуностимулююча дія різнопланова, проявляється вже на рівні процесів міграції стовбурових кровотворних клітин, активації Т- і В-клітин і їх взаємодії.

Білок А здатен незворотньо вмонтовуватися та формувати іон-провідникові структури в штучних біліпідних мембранах, стимулювати транспорт Ca²⁺ через потенціалзалежні канали плазматичної мембрани клітин, що можна розглядати як ранні молекулярні механізми активації лімфоїдних клітин під впливом білка А.

Вплив досліджуваних антигенів стафілокока починається вже на рівні стовбурових клітин, про що свідчить стимуляція утворення гемопоетичних осередків в селезінці опромінених мишей незалежно від лінії (СВА, BALB/c, (CBAxC57BL/6)F₁), починаючи з 1 доби після дії опромінення (5,5 - 8,5 Гр) та прискорення регенерації еритропоезу, досягаючи рівня інтактних тварин по включенню [⁵⁹Fe] на 7 добу після сублетального опромінення мишей (лінії B6AF₁, (CBAC57BL/6)F₁, (C57BL/6ASn/F₁)).

Білок А в різних формах є ефективним мітогеном по відношенню до Т- та В-лімфоцитів мишей, морських свинок і щурів як in vitro, так і in vivo. Мітогенний ефект залежить від присутності Т- і В-клітин. Білок А проявляє Т-залежні мітогенні властивості при дії на лімфоцити селезінки безтимусних мишей nude. На мітогенну дію різних форм білка А не впливає неспецифічна взаємодія з імуноглобулінами сироватки крові. Мітогенний ефект дозозалежний, пов'язаний з продукцією цитокінів та активацією проліферації стовбурових клітин.

Різні форми білка А активують продукцію регуляторних цитокінів: інтерлейкінів 1 і 2, інтерферону, викликають значну стимуляцію утворення фактора некрозу пухлин in vitro та in vivo. Такі процеси є важливими факторами регуляції підтримки балансу росту та визначення шляху розвитку клітин, що має значення для регуляції імунного гомеостазу, формування протипухлинного захисту, регенерації лімфопоезу та становлення імунної відповіді.

Виявлено імуномодулюючі властивості очищеного та клітинно-зв'язаного білка А відносно Т- і В-лімфоцитів. Дані субстанції модифікують гуморальну імунну відповідь, стимулюючи синтез IgM та IgG до Т-залежного антигену, впливаючи на Т-хелпери та кооперацію лімфоцитів.

Використані форми білка А стафілокока стимулюють продукцію неспецифічних факторів резистентності організму. У інтактних, імунних тварин та при експериментальній стафілококовій інфекції очищений та клітинно-зв'язаний білок А стимулює фагоцитарну та бактерицидну активність макрофагів і лейкоцитів по відношенню до різних об'єктів фагоцитозу, активує природні кіллерні клітини селезінки та периферійної крові мишей, утворення фактора некрозу пухлин та інтерферону.

Стафілококовий білок А, та в більшій мірі клітинно-зв'язаний білок А, проявляють протективні властивості при експериментальній стафілококовій інфекції за профілактичною схемою застосування (після одноразової імунізації), знижуючи персистенцію збудника.

Білок А, впливаючи на стимуляцію проліферації стовбурових клітин, регенерацію еритропоезу, кооперативну взаємодію Т- і В-лімфоцитів, продукцію цитокінів, мітогенну дію як Т-, так і В-лімфоцитів, неспецифічні фактори резистентності організму, протекторні властивості, сприяє відновленню імунної реактивності організму і виживаності опромінених тварин, що свідчить на користь його протипроменевої дії.

Білок А та його різні форми індукують клітинну імунну відповідь, що підтверджується тестами in vivo та in vitro. В тимусі, селезінці та лімфатичних вузлах імунізованих тварин спостерігаються гістоморфологічні зміни, що свідчать про активацію Т- і В-зон та макрофагів, і пов'язані з розвитком клітинної імунної відповіді до антигенів стафілокока.

Клітинний імунітет до антигенів стафілокока переноситься за допомогою індукованого до білка А та клітинно-зв'язаного білка А фактора переносу клітинної імунної реактивності. Досліджувані антигени білка А та індуковані ними препарати фактора переносу не виявили мутагенної дії. Встановлено відсутність токсичності, пірогенності та алергенності названих препаратів. Препарати фактора переносу, одержані з лейкоцитів донорів, не містять антигенів збудників гепатиту В і С, ВІЛ та сифілісу.

Проведені вперше комплексні експериментальні дослідження імунної відповіді та імуномодулюючої дії різних форм білка А стафілококів та індукованого ними фактора переносу клітинної імунноі реактивності, ефективність антигенспецифічного імунітету та відсутність побічних реакцій на досліджувані препарати дозволяють рекомендувати їх для застосування в якості протистафілококових препаратів для імунізації, здатних ефективно індукувати чи швидко, минаючи вакцинацію, переносити специфічний імунітет.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Холодная Л.С., Хоробрых В.В. Индукция гиперчувствительности замедленного типа белком А и корпускулярными антигенами стафилококка // Иммунология. - 1984. - № 3. - C. 51-54.

2. Хоробрых В.В., Холодная Л.С. Миграция клеток селезенки, сенсибилизированных антигенами стафилококка // Иммунология. - 1984. - № 3. - C. 54-56.

3. Хоробрых В.В., Санин А.В., Холодная Л.С. Влияние S. aureus на образование кроветворных колоний и регенерацию эритропоэза у мышей после облучения // Биологические науки. - 1984. - № 8. - C. 44-47.

4. Хоробрых В.В., Прохоров В.Я., Позур В.К., Холодная Л.С., Симонова А.В., Толовская К.Р. Влияние клеток и компонентов S. aureus на функциональную активность гемопоэтических клеток мышей // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. - 1984. - № 9. - C. 85-90.

5. Хоробрых В.В., Снигерева А.Е., Акатов А.К., Прохоров В.Я., Позур В.К., Холодная Л.С. Митогенная активность антигенов, выделенных из разных штаммов золотистого стафилококка, в отношении спленоцитов мышей и морских свинок // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. - 1986. - № 7. - C. 67-73.

6. Вершигора А.Е., Холодная Л.С. Иммунобиологические свойства белка А стафилококка // Успехи современной биологии. - 1986. - Т. 101, вып. 3. - С. 449-461.

7. Холодная Л.С., Давыдовская Т.Л. Действие белка А и токсина стафилококка на мембранные процессы клеток гладких мышц // Мікробіол. журн. - 1994. - Т. 56, № 4. - C.100-101.

8. Холодная Л.С., Гордиенко В.М., Любченко Т.А. Морфофункциональная характеристика лимфоидных органов мышей после иммунизации антигенами стафилококка // Вестник проблем современной медицины. Харьковский государственный медицинский университет. - 1995. - С. 46-49.

9. Афонін С.Е., Давидовська Т.Л., Шатурський О.Я., Шуба М.Ф., Холодна Л.С. Вивчення мембранної активності білка А стафілокока на бімолекулярних ліпідних мембранах // Вісник Київського університету. - 1996. - вип. 3-4. - C. 30-36.

10. Голева О.Г., Любченко Т.А., Холодна Л.С., Вершигора А.Ю. Одержання Фактора переносу гіперчутливості сповільненого типу морських свинок до антигенних субстанцій Staphylococcus aureus // Фізіол. журн. - 1996. - Т. 42, № 5-6. - C. 58-66.

11. Филипов И.Б., Шуба М.Ф., Давыдовская Т.Л., Холодная Л.С., Позур В.К., Любченко Т.А. Влияние активных субстанций золотистого стафилококка (белка А и пептидогликана) на сокращения гладких мышц, вызванные действием нейромедиаторов //Нейрофизиология.-1996. - Т. 28, № 1. - C. 30-35.

12. Любченко Т.А., Холодная Л.С., Вершигора А.Е. Иммуномодулирующие свойства фактора переноса при онкологических заболеваниях//Иммунология. - 1997. - № 6 .- C. 48-51.

13. Холодна Л.С., Позур В.К., Любченко Т.А., Гриценко Л.М., Голева О.Г., Кучеренко М.Є. Синтез ДНК в лімфоцитах опромінених тварин під впливом мітогенів та антигенів стафілокока // Укр. біохім. журн. - 1998. - Т. 70, № 1. - C. 58-62.

14. Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С., Степанчук В.А., Вершигора А.Ю. Людський специфічний фактор переносу до антигенів Staphylococcus aureus // Фізіол. журн. - 1997. - Т. 43, № 3-4. - C. 25-32.

15. Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С., Смірнов В.В., Вершигора А.Ю. Біологічна активність фактора переносу, індукованого бактеріальними антигенами // Мікробіол. журн. - 1997. - Т. 59, № 5. - C. 83-100.

16. Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С. Фактор переносу як модулятор клітинної імунної відповіді // Биополимеры и клетка. - 1997. - Т. 13, № 5. - C. 345-351.

17. Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С. Продукція інтерлейкіну-1 під впливом фактора переносу// Вісник Київського університету - 1998. - вип. 28. - С. 69-70.

18. Холодна Л.С. Основний фактор патогенності стафілокока - білок А. І. Продукція та властивості// Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 4. - C. 275-279.

19. Голева О.Г., Пастер І.П., Любченко Т.А., Холодна Л.С., Пастер Є.У., Доніч С.Ф., Гродзінський Д.М. Модифікація активності лімфоцитів ксенотрасплантацією тканини щитовидної залози та фактором переносу імунної реактивності за умов радіаційноіндукованого гіпотиреозу //Доповіді НАН України. - 1999. - № 10. - С. 156-160.

20. Холодна Л.С. Основний фактор патогенності стафілокока - білок А. ІІ. Особливості взаємодії з імуноглобулінами // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 5. - С. 360-366.

21. Холодна Л.С., Голева О.Г., Любченко Т.А., Кучеренко М.Є. Мітогенна дія антигенних субстанцій стафілокока на лімфоцити опромінених щурів лінії Вістар // Укр. біохім. журн. - 1999. - Т. 71, № 5. - С. 65-68.

22. Холодна Л.С., Коржик Н.П., Голева О.Г., Любченко Т.А., Голєв Г.В. Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків // Клінічна хірургія. - 1999. - № 8. - С. 25-27.

23. Давидовская Т.Л., Мирошниченко Н.С., Фадеенко Н.П., Давидовская Н.В., Холодная Л.С., Любченко Т.А., Голева Е.Г. Специфический фактор переноса к антигенам Staphylococcus aureus влияет на активацию сокращения гладкомышечных клеток толстого кишечника // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 5. - С. 402-408.

24. Холодна Л.С. Синтез та фізико-хімічна характеристика поверхневого соматичного антигену стафілококів - білка А // Вісник Київського університету. - 2000. - вип. 29. - С. 62-64.

25. Голева О.Г., Пастер І.П., Любченко Т.А., Пастер Є.У., Холодна Л.С., Замотаєва Г.А., Гродзінський Д.М. Фактор переносу імунної реактивності як модулятор функціональної активності лімфоцитів щурів з радіаційноіндукованим гіпотиреозом після ксенотрансплантації органної культури щитовидної залози новонароджених поросят // Фізіол. журн. - 2000. - Т. 46, № 4. - С. 58-65.

26. Холодна Л.С., Любченко Т.А., Голева О.Г., Михальський Л.О. Очищення препаратів фактора переносу імунної сенсибілізації до антигенів стафілокока // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т. 16, № 5. - С. 335-339.

27. Голева О.Г., Любченко Т.А., Холодна Л.С. Імуномодулююча дія препаратів Фактору переноса різного походження // Вісник Київського університету. - 2000. - вип. 31. - С. 56-59.

28. Холодна Л.С., Гордієнко В.М., Гарматіна С.М., Пазюк Л.М., Дзержинський М.Е., Любченко Т.А. Гістологічні зміни в лімфоїдних органах тварин, імунізованих антигенами стафілокока // Доповіді НАН України. - 2000. - № 8. - С. 171-175.

29. Позур В.К., Федорчук А.Г., Самойленко Л.А., Холодна Л.С., Скивка Л.М., Грищенко Л.М. Протипухлинна активність природних кіллерів під впливом пептидоглікану і білка А стафілокока // Вісник Київського університету. - 2000. - вип. 31. - С. 65-67.

30. Lyubchenko T.A., Smirnov V.V., Goleva E.G., Kholodna L.S. Purification and biochemical characterisation of Guinea pig's antistaphylococal transfer factor // Int. J. Clin. Invest. - 2001. - № 4. - P. 106-108.

31. Kholodna L.S., Pozur V.K., Lyubchenko T.A. Modification effects of millimeter waves on immunobiological activity in conditionally pathogenic bacteries // 10^th International Symposium on Millimeter waves in Biology and Medicine. - Moscow (Russia). - 1995. - P. 100.

32. Lyubchenko T.A., Goleva E.G., Kholodna L.S., Pozur V.K. Studies of mechanism of action of leukocyte dialysates on functional activity of T- and B-lymphocytes // Congress of Moleucular Medicine. - Berlin (Germany). - 1997. - J .Molec.Med. - 1997. - V. 75, № 5. - P. B59.

33. Любченко Т.А., Голева О.Г., Холодна Л.С., Позур В.К. Очистка, тестування та вивчення механізму дії людського та тваринного фактора переносу до бактеріальних антигенних субстанцій // 7 Український Біохімічний з`їзд. - Київ (Україна). - 1997. - Т. 2. - С. 128-129.

34. Холодная Л.С. Влияние КВЧ электромагнитного излучения на иммунную систему // 3 съезд по радиационным исследованиям. - Москва (Россия). - 1997. - т. 3. - С. 78.

35. Lyubchenko T.A., Goleva E.G., Kholodna L.S., Smirnov V.V. Elaborating of effective preparates with immunomodulating properties on the base of transfer factor of cell-mediated immune response// XI-th International Congress on Transfer factor. - Monterrey (Mexico). -1999. - Р. 17.

Размещено на Allbest.ru