Цитогенетичні аспекти розвитку in vitro доімплантаційних зародків ссавців, отриманих біотехнологічними методами

В наших дослідженнях, як реципієнтів, використовували ооцити, що культивувались in vitro тривалий час - протягом 41 години (24 години - дозрівання ооцитів до метафази II і 17 годин - старіння цитопластів), на відміну від запліднення ооцитів in vitro, яке здійснювали відразу після дозрівання яйцеклітин до метафази II. Дані нашої роботи свідчать, що цитоплазма енуклейованого ооцита корови після 17 годин культивування in vitro при 38,5^IС здатна до ремоделювання ядра 12-16-клітинного зародка, при цьому реконструйовані зародки розвиваються in vitro до стадії бластоцисти.

Висновки

1. На основі досліджень in vitro процесів дозрівання і запліднення ооцитів, розвитку ранніх зародків різного походження у великої рогатої худоби та інших видів ссавців, поглиблені загальні уявлення про закономірності раннього ембріогенезу ссавців.

2. Розроблені нові теоретичні і методичні підходи щодо питань клонування у великої рогатої худоби.

3. Комплексний метод оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів бугаїв за гетеро- і гомологічним тестом на пенетрацію дозволяє здійснити селекцію бугаїв для дослідів по одержанню ембріонів великої рогатої худоби поза організмом.

4. Гетерологічна пенетрація яйцеклітин золотистого хом'ячка і гомологічна пенетрація незрілих ооцитів корів дозволяють одержати метафазні хромосоми сперматозоїдів бугая.

5. Встановлено позитивний вплив еструсної сироватки крові корів і клітин гранульози на дозрівання ооцитів і отримання ранніх зародків великої рогатої худоби in vitro, вища ефективність відбору сперматозоїдів бугая в градієнтах перколу порівняно з методом swim-up.

6. Часткове розсічення прозорої оболонки ооцитів корів підвищує частоту запліднення ооцитів in vitro при зниженій концентрації сперматозоїдів.

7. Доведена можливість вилучення незрілих ооцитів з яєчників живих не оброблених гормонами телиць і корів методом OPU, одержання після запліднення таких ооцитів in vitro придатних для нехірургічної трансплантації зародків майже з тією ж частотою, як для ооцитів з яєчників забитих тварин. Використання цієї методики дозволить значно прискорити генетичний прогрес у молочному і м'ясному скотарстві порівняно зі штучним осіменінням і МОЕТ внаслідок збільшення кількості телят від генетично цінних донорів, скорочення генераційного інтервалу, прискорення оцінки плідників за якістю потомства.

8. Трансвагінальна пункція фолікулів під контролем ультразвуку (OPU) не вливає негативно на стан піхви, матки і яєчників тварин-донорів ооцитів, не зменшує при наступній аспірації кількості придатних для пункції фолікулів, покращує якість отриманих ооцит-кумулюсних комплексів через 3-4 взяття від початку аспірацій. Встановлена різниця між донорами за середньою кількістю пункційованих фолікулів, аспірованих ооцитів, частотою отримання in vitro ранніх зародків та бластоцист.

9. Показана перевага двоступеневої еквілібрації при вітрифікації бластоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro, порівняно з одноступеневою.

10. Ефективність партеногенетичної активції дозрілих до метафази II ооцитів корів підвищується при їх "старінні" поза організмом, що забезпечує більшу частоту формування 2-4-клітинних гаплоїдних і диплоїдних партеногенетичних зародків, при цьому важливим показником придатності яйцеклітин до партеногенетичної активації є фактор хромосомних порушень ооцитів.

11. Вперше у сільськогосподарських тварин (великої рогатої худоби) доведена можливість одержання партеногенетичних зародків після активації ооцитів на стадії, яка за часовими параметрами відповідає повноцінній фізіологічній зрілості ооцитів, але за умови пригнічення виділення першого полярного тіла. Отримані партеногенетичні зародки мають морфологічно нормальні ядра з ядерцями і здатні до розвитку in vitro до стадії ранньої морули.

12. З метою розробки методу "химерного клонування" удосконалені способи отримання химерних і тетраплоїдних зародків ссавців.

13. Мікрохірургічний поділ свіжоотриманих морул-бластоцист великої рогатої худоби на половинки дозволяє отримати монозиготних близнят і порівняно з пересадкою цілих ембріонів значно збільшує кількість телят від донорів ембріонів. Приживлення половинок ембріонів залежить від стадії розвитку ембріонів перед поділом, якості половинок та жовтого тіла реципієнта; попарна пересадка половинок значно підвищує рівень тільності тварин.

14. Цитогенетичний аналіз однієї половинки або четвертинки ембріона дозволяє визначити стать ембріона великої рогатої худоби до трансплантації. Мікрохірургічний поділ зародків не призводить до змін у співвідношенні статі потомства порівняно з пересадкою цілих ембріонів.

15. Методом пересадки ядер ранніх зародків отримані клони реконструйованих ембріонів, здатних до розвитку in vitro до стадії бластоцисти у кроля та великої рогатої худоби. NT-бластоцисти великої рогатої худоби, що походили від зародків, отриманих in vitro, мали морфологічно нормальні ядра, кількість яких була вірогідно меншою порівняно з IVF-бластоцистами.

Практичні пропозиції

1. Комплексний метод оцінки запліднювальної здатності сперматозоїдів бугаїв за гетеро- і гомологічним тестом на пенетрацію доцільно застосовувати в селекційних програмах при відборі плідників для штучного осіменіння.

2. Пропонується запровадити в практику нехірургічної трансплантації ембріонів великої рогатої худоби, одержаних після індукції суперовуляції (МОЕТ), методику розділення свіжоотриманих пізніх морул-бластоцист на половинки.

3. Рекомендується удосконалити і впровадити в системі Національного об'єднання по племінній справі в тваринництві методику багаторазового вилучення ооцитів з яєчників живих генетичне цінних корів і телиць (без гормональної обробки тварин) для отримання in vitro та нехірургічної трансплантації реципієнтам пізніх морул і бластоцист великої рогатої худоби. Цей метод доцільно використовувати для підвищення ефективності селекційного процесу в скотарстві, як такий, що забезпечить прискорене розмноження тварин, скорочення генераційного інтервалу, більш швидку оцінку бугаїв за якістю потомків.

4. З метою підвищення життєздатності ембріонів великої рогатої худоби, одержаних in vitro, рекомендуємо в середовище дозрівання ооцитів додавати еструсну сироватку крові корів і додаткову кількість клітин гранульози, а культивування зародків здійснювати в середовищі Менезо Б2 на моношарі клітин BRL.

5. Отримані дані щодо аналізу мейотичних та мітотичних перетворень хромосом гамет і ембріонів, цитоморфологічних характеристик та особливостей розвитку in vitro ембріонів, одержаних біотехнологічними методами, можуть бути використані в учбових курсах університетів по генетиці і біології розвитку ссавців.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Кузнецов В.Е. Биотехнология в племенном скотоводстве // В кн. М.В. Зубец и др. "Генетика, селекция и биотехнология в скотоводстве" /Ред. М.В. Зубец, В.П. Буркат. -К., БМТ. - І997. - С. 599-702.

2. Кузнецов В.Е. Методические рекомендации по микрохирургическому делению эмбрионов крупного рогатого скота. - Киев, 1991. - 24 с.

3. Кузнецов В. Є., Єфіменко М.Я., Кузнецова І. Б., Подоба Б. Є. Рекомендації по одержанню ембріонів великої рогатої худоби in vitro. -К.: ТОВ "Міжнар.фін. агенція", 1998. - 33 с.

4. Кузнецов В. Є., Романко В.М., Романко В.В., Расенко І. А., Рябчук О.А. Мікрохірургічне розділення ранніх ембріонів великої рогатої худоби // Вісн. с.-г. науки. - 1988. - 8. -С. 45-47.

5. Кузнецов В. Є., Єлізарова І. Б. Розробка методу одержання препаратів хромосом сперміїв бугая // Вісник с.-г. науки. - 1988. - № 8.- С. 53-55.

6. Кузнецов В.Е. Определение пола 7-дневных эмбрионов крупного рогатого скота после микрохирургического деления // Цитология и генетика. - 1991. -25,1.- С. 11-13.

7. Кузнецов В. Клітинна інженерія у скотарстві // Тваринництво України. - 1991. -№ 7. - С. 16.

8. Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б. Визуальный метод определения готовности сперматозоидов быка к оплодотворению in vitro // Бюлл.ВНИИРГЖ. - 1991. - Вып. 129. - С. 18-21.

9. Редина 0. Е., Амстиславский С.Я., Максимовский Л.Ф., Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б. Суперовуляция у двух видов лабораторных животных при введении им гонадотропина СЖК в разные фазы эстрального цикла // Сиб.биол.журн. - 1992. - Вып. 2. - С. 24-28.

10. Буркат В.П., Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б. Биотехнологические методи оценки и прогнозирования оплодотворяющей способности сперматозоидов быков // Вісн.агр. науки. - 1992. - № 11. - С. 22-26.

11. Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б. Партеногенетическая активация ооцитов коров, созревших in vitro // Онтогенез. - 1992. - Т. 23, 6. - С. 650-653.

12. Зубец М.В., Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б. Оплодотворение in vitro ооцитов коров с частично рассеченной прозрачной оболочкой // Вісн.агр. науки. - 1993. - № 7. - С. 47-54.

13. Зубец М.В., Кузнецов В.Е., Елизарова И.Б., Шеховцов С.Ю., Шеховцова Е.Ю. Трансплантация половинок - эффективный способ увеличения количества телят от доноров эмбрионов // Вісн.агр. науки. - 1994. - № 7.- С. 67-73.

14. Зубець М.В., Буркат В.П., Кузнецов В. Є., Єлізарова І. Б., Шеховцов С.Ю., Шеховцова 0. Ю. Одержання монозиготних телят від половинок ембріона // Вісн.агр. науки. - 1994. - № 8.- С. 57-59.

15. Кузнецов В. Методи клітинної інженерії в селекції великої рогатої худоби // Тварин. Укр. - 1996. - № 1. - С. 28-29.

16. Зубець М.В., Буркат В.П., ЄфіменкоМ.Я., Кругляк А.П., Кузнецов В. Є., Подоба Б. Є. Шляхи та методи збереження і раціонального використання генофонду сільськогосподарських тварин // Наук.-вироб. бюл. "Селекція". - 1997. -4.4. - С. 40-42.

17. Кузнецов В. Є. Біотехнологія в селекції великої рогатої худоби // Наук.-вироб. бюл. "Селекція". - 1997. - №.4. - С. 43-44.

18. Зубець М.В., Буркат В.П., Єфіменко М.Я., Кузнецов В. Є. Використання досягнень репродуктивної біотехнології в селекції великої рогатої худоби // Вісн.агр. науки. - 1997. - № 5.- С. 50-52.

19. Буркат В., Кузнецов В. Біотехнологічна селекція: етичні аспекти // Твар. Укр. - 1998. - 4. - С. 17-19.

20. Кузнецов В. Є., Зубець М.В., Буркат В.П. Трансвагінальна пункція фолікулів яєчників корів і телиць під контролем ультразвуку - прижиттєвий метод отримання ооцитів генетично цінних тварин // Вісн.агр. науки. - І998. - 4. - С. 5-8.

21. Kuzniecov V. Е. Biotechnologiczne metody rozrodu zwierzat w Ukrainskim Instytucie hodowli і genetyki zwierzat //Biul. informac. IZ. - 1998. - 1 (216). - Р.11-14.

22. Smorag Z., Gogol P., Kuznetsov V. Transwaginalna metoda uzyskiwania oocytow bydiecych: efektywnosc aspiracji, mozliwosci rozwojowe oocytow oraz zastosowanie w hodowli //Biotechnologia. - І998. - 2 (41). - S.153-160.

23. Кузнецов В. Є., Басовський Д.М., Ткаченко С.В. Мікрохірургічне ділення ембріонів та одержання химерних зародків як способи клонування у ссавців // Вісн.Білоц. держ. агр.універ. - І998. -Вип.4, ч. 1. - С. 254-258.

24. Кузнецов В. Є., Басовський Д.М., Ткаченко С.В. Отримання клонів у ссавців методом пересадки ядер // Вісн.Білоц.держ.агр.універ. - 1998. - Aei.4, ч. 1. - С. 258-263.

25. Кузнєцова І.Б., Кузнєцов В.Є., Ковтун С.І. Особливості кріоконсервування ембріонів та ооцитів ссавців методом вітрифікації // Вісн.агр.науки. - 1999. - ? 2. - N.42-45.

26. Кузнецова И.Б., Кузнецов В.Е., Ковтун С.И. Факторы, влияющие на получение биологически полноценных зародышей крупного рогатого скота in vitro // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т.15, № 1. - С. 49-56.

27. Kuznetsov V. Е. Possible use of parthenogenetic cow embryos for animal cloning //In Proc.Eur.Conf. Embryo Techn. & Genet. Engin. in Cattle & Sheep, 1994 Krakow, Poland. - 1994. - P. 220.

28. Kuznetsov V. Е., Yelizarova I. В. In vitro production of bovine embryos using a microsurgery method //In Proc.Eur.Conf. Embryo Techn. & Genet. Engin. in Cattle & Sheep, 1994 Krakow, Poland. - 1994. - P. 221.

29. ZubetsM.V., Kuznetsov V. Е., Shechovtsov S.U. Production of bovine monozygotic twins //In Proc.Eur.Conf. Embryo Techn. & Genet. Engin. in Cattle & Sheep, 1994 Krakow, Poland. - 1994. - P. 289.

30. Smorag Z., Gogol Р., Kuzniecov V. Pobieranie i mozliwosci rozwojowe oocytow bydiecych uzyskiwanych pod kontrola USG //Tr.Konf.nauk.''BiotechnologIa rozrodu zwierzat gospodarskich - stan badan oraz mozliwosci praktycznego zastosowania". Balice, 4-5 grudnia 1997 r. - Krakow, 1997. - Str. 42-44.

31. Kuznetsov V. Preimplantation development of bovine reconstituted embryos after transfer of nuclei of embryos produced in vitro //In Proc. 14th scientific meeting AETE, Venice, 11-12th September 1998. - P. 190.

32. Kuznetsov V., Kuznetsova I., Lukashenko H. Activation of cow oocytes with ethanol after inhibition of extrusion of the first polar body //In Proc. 14th scientific meeting AETE, Venice, ll-12th September 1998. - P. 192.

Размещено на Allbest.ru