CTGF*

Insulin-like growth factor binding protein 5

IGFBP5

Імунна відповідь і комплемент

Fc fragment of IgG binding protein

FCGBP*

Major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1

HLA-DQB1*

IMmunoglobulin heavy constant gamma 1 (G1m marker)

IGHG1*

Annexin A1

ANXA1*

Major histocompatibility complex, class I, A

HLA-A**

Interferon, gamma-inducible protein 30

IFI30

Secreted phosphoprotein 1 (osteopontin)

SPP1**

Major histocompatibility complex, class II, DR alpha

HLA-DRA*

CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated)

CD74**

Beta-2-microglobulin

B2M*

Complement component 1, q subcomponent, alpha polypeptide

C1QA

CD99 antigen

CD99*

Передача сигналу

Epidermal growth factor receptor

EGFR**

Chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)

CHI3L1**

CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility Complex, class II antigen-associated)

CD74**

S100 calcium binding protein A10

S100A10*

Стійкість до лікарських засобів

ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 3

ABCC3**

Fibronectin 1

FN1**

Annexin A1

ANXA1**

Некласифіковані

Chitinase 3-like 2

CHI3L2

Glycoprotein (transmembrane) nmb

GPNMB*

Retinoic acid receptor responder (tazarotene induced) 2

RARRES2

Stabilin 1

STAB1

Nicotinamide N-methyltransferase

NNMT**

Tubulin alpha 6

TUBA6

Scavenger receptor class A, member 3

SCARA3

Sec61 gamma subunit

SEC61G**

Moesin

MSN

Nestin

NES**

Apolipoprotein C-I

APOC1*

Після порівняння профілів експресії генів у пухлинних і нормальних клітинах необхідно підтвердити відмінності в експресії генів на незалежних зразках пухлин. Протягом багатьох років Нозерн-блот гібридизація є найпоширенішим методом для кількісної і якісної оцінки рівня експресії генів; вона дозволяє також детектувати альтернативні транскрипти за умови достатнього рівня їхньої експресії. Ми відібрали десять диференційно експресованих транскриптів з найвираженішим підвищенням рівня експресії в гліобластомі за результатами SAGE і проаналізували їхню експресію в гліальних пухлинах за допомогою Нозерн-блот гібридизації. В більшості випадків Нозерн-блот аналіз підтвердив результати SAGE на незалежних зразках пухлин і нормального головного мозку.

Високі рівні експресії цих генів було знайдено в переважній більшості гліобластом. Вони експресувалися на значно нижчому рівні у більшості зразків нормального головного мозку. В дифузних та анапластичних астроцитомах експресія відрізняється в широких межах для різних генів: в одних пухлинах рівні експресії майже такі ж високі, як в гліобластомі, в інших пухлинах рівні експресії значно нижчі, а в деяких пухлинах експресія генів відсутня, як в нормальному головному мозку. Відмінності в експресії генів в індивідуальних пухлинах одного і того ж ступеня злоякісності, очевидно, є відображенням гетерогенності біологічних властивостей, характерних для пухлин певного органа (Owens et al., 1982; Cheng et al., 1999). Отримані результати дають підстави для можливості використання ідентифікованих в даній роботі генів для характеристики різних підтипів гліом однакового ступеня злоякісності.

Для генів, рівні експресії яких були занадто низькими для детекції Нозерн-гібридизацією, ми застосували напівкількісну ЗТ-ПЛР, яка підтвердила підвищену експресію генів ABCC3, COL1A1, COL3A1, EGFR, CHI3L2, FMOD та MFAP2 в 30-80% зразків гліобластом. Відмінності рівнів експресії генів в зразках гліобластом корелюють з клінічними проявами захворювань і можуть бути використані для їхньої молекулярної характеристики.

Одним з генів, для яких характерна надекспресія в гліобластомі, є ген CHI3L1 (HC gp-39/YKL-40), який кодує хітиназоподібний глікопротеїн (лектин). Пухлино-специфічну експресію гена HC gp-39 було підтверджено Нозерн-гібридизацією панелі РНК, виділеної з пухлин та нормального головного мозку (Shostak et al., 2003). Вона виявила високі рівні експресії гена винятково в астроцитомах високих ступенів злоякісності. Крім описаної раніше мРНК розміром 1,7 т. н. в хондроцитах і синовіальних клітинах людини (Hakala et al., 1993), було знайдено транскрипт більшого розміру (близько 3,0 т. н.), головним чином, в анапластичних астроцитомах і гліобластомах. Транскрипт HC gp-39 більшого розміру може бути результатом альтернативного процесингу, використання альтернативних промоторів, селекції альтернативного сайту сплайсингу або сигналу 3'-поліаденілювання. Ці модифікації часто змінюють продукт трансляції або регулюють стабільність мРНК.

За експресією цього гена анапластичні астроцитоми можуть бути поділені на дві групи: в одній групі експресія гена відсутня (16 зразків), а в іншій - він експресований на такому ж високому рівні, як в гліобластомах (8 зразків). Співставлення рівня експресії гена HC gp-39 з періодом ремісії до повторного виникнення пухлин показало, що є тенденція до подовження цього безсимптомного періоду у пацієнтів з анапластичними астроцитомами у разі відсутності експресії HC gp-39 (табл.2).

В різних дослідженнях було знайдено, що підвищений рівень білка HC gp-39 (YKL-40) віддзеркалює запалення або деградацію тканини. Підвищений вміст цього білка було знайдено в сироватці пацієнтів з ревматоїдним артритом, остеоартритом (Volck et al., 2001), фіброзом печінки (Johansen et al., 2001) і атеросклерозом (Boot et al., 1999). Асоціація зміни експресії цього гена з пухлинним процесом підтверджується все більшою кількістю повідомлень про його активацію в різних типах пухлин та підвищеним вмістом в сироватці пацієнтів з пухлинами. Так, імуногістохімічний аналіз виявив продукцію YKL-40 в пухлинах молочної залози (34%), при цьому імунореактивність мала суттєву кореляцію з більшим розміром і нижчим рівнем диференціювання пухлин, а також з вищою вірогідністю відсутності рецепторів естрогену та/або прогестерону (Kim et al., 2007). Підвищений рівень сироваткового YKL-40 був виявлений у 29% пацієнтів з множинною мієломою. Загальний період виживання і період ремісії до повторного рецидиву у таких пацієнтів був коротший (Mylin et al., 2006). Пацієнти з гліобластомами та анапластичними астроцитомами, у яких виявлено високий рівень цього білка в сироватці, також мали несприятливий прогноз (Tanwar et al., 2002; Hormigo et al., 2006). Загалом, придатність сироваткового YKL-40 бути прогностичним біомаркером підтверджено для 13 різних типів раку (див. огляд Johansen et al., 2007). Автори цього огляду, які тривалий час досліджують експресію гена HC gp-39/YKL-40 при різних захворюваннях, висловлюють припущення, що інгібування YKL-40 моноклональними антитілами, пряме або опосередковане через його рецептор, може мати ефективний терапевтичний ефект, як у випадку з антитілами проти HER2, HER1, VEGF або CD20.

Для підтвердження підвищення експресії гена HC gp-39 на рівні білка, ми провели Вестерн-блот аналіз зразків пухлин і нормального головного мозку. Результати проведених досліджень свідчать про підвищення продукції білка HC gp-39 в гліомах. Як видно, рівень синтезу білка HC gp-39 набагато вищий в гліобластомі, ніж в нормальному головному мозку і гліомах нижчого ступеня злоякісності. Крім описаного в літературі (Hakala et al., 1993) білка молекулярною масою 39 кДа ми виявили в гліобластомах білки з нижчою елетрофоретичною рухливістю, що відповідають білкам з уявною молекулярною масою 43 та 55 кДа. Можливо, виявлена нами довша мРНК HC gp-39 є результатом альтернативного процесингу первинного транскрипту гена і кодує білок більший за розміром ніж 39 кДа. Однак свій внесок до зміни молекулярної маси може вносити і пост-трансляційна модифікація білка HC gp-39 - після синтезу попередника від нього відщеплюється сигнальний пептид, і білок глікозилюється.

Таблиця 2

Співставлення рівнів експресії гена HC gp-39 з клінічними даними пацієнтів з анапластичними астроцитомами

Номер зразка	Операція	Вік пацієнта	Стать	Зміна рівня експресії гена	Період ремісії до повторної операції
44 90 162 170 264 314 401 416 92 169 199 228 230 232 236 291 316 341 380 381 388 394 423 456	первинна первинна первинна первинна первинна первинна повторна первинна первинна первинна повторна повторна повторна повторна повторна первична повторна повторна первинна первинна повторна повторна (3-я) первинна первинна	49 44 50 60 22 63 24 72 38 41 40 22 41 52 39 38 39 40 33 31 36 41 54 48	Ж Ж Ж Ж Ж М Ж М М М М М М Ж М Ж Ж М Ж М М Ж Ж Ж	підвищений підвищений підвищений підвищений підвищений підвищений підвищений підвищений нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії нема експресії	нема даних 5 міс. 3,5 міс. 6 міс. 2 р.2 міс. 1 рік 1 міс. нема даних 2 р.5 міс. 2 р. 3 р.11 міс. 2 р.5 міс. помер через 5 міс. 3 р.5 міс. 6 міс. 1 р.6 міс. 2 р.7 міс. 2 р.11 міс. > 1 р.4 міс. > 1 р.4 міс. > 1 р.3 міс. (6 р.3м.) >1 р.4 міс (5 р.5 м.) > 11 міс. > 7 міс.

Отримані нами результати поглиблюють існуюче уявлення про роль гена HC gp-39 в пухлинних патологіях. Найвищий рівень експресії HC gp-39 знайдено переважно в гліобластомах, тому продукт цього гена придатний для використання як молекулярного маркера для аналізу стадії злоякісної прогресії астроцитарних гліом, або для діагностики гліобластом.

Одним із генів, які активуються в астроцитомах низького ступеня злоякісності, є ген SPARC. SPARC/остеонектин - висококонсервативний, багатий на цистеїн антиадгезивний глікопротеїн, який секретується в позаклітинний матрикс, може продукуватися в ендотелії у відповідь на певні ушкодження, інгібує проходження клітинного циклу, впливає на форму клітин та модулює взаємодії клітина-матрикс через зв'язування з компонентами позаклітинного матриксу (Bradshaw et al., 2001). Нозерн-блот гібридизація показала, що рівень експресії SPARC підвищений в астроцитарних гліомах порівняно з нормальним головним мозком, однак не виявила кореляції експресії гена SPARC із злоякісною прогресією астроцитом - він має високий рівень експресії як в дифузних астроцитомах і анапластичних астроцитомах, так і в гліобластомах.

SPARC бере участь у процесах, пов'язаних із від'єднанням клітин від позаклітинного матриксу, таких як міграція та проліферація (Sage et al., 1986; 1989; 1991). Підвищений синтез SPARC індукує продукцію колагену I через збільшення експресії TGF-в та зменшення кількості bFGF (Bradshaw et al., 2001), продукцію матриксних металопротеїназ та інгібітора активатора плазміногену типу 1, які, в свою чергу, прискорюють деградацію базальних мембран та позаклітинного матриксу (Hasselaar et al., 1991; Tremble et al., 1993). Ці процеси стимулюють інвазію та формування метастазів у злоякісних новоутвореннях. Було показано також, що SPARC розщеплюється метало-протеїназою ММР-3 на три основних фрагменти з різною біологічною активністю; принаймні один з них стимулює проліферацію ендотеліальних клітин і ангіогенез (Sage et al., 2003). Отже, зміни експресії гена SPARC можуть відігравати подвійну роль в патології гліальних пухлин головного мозку - одну в ангіогенезі, а іншу в інвазії пухлин.

На прикладі проаналізованих генів видно, що продукти виявлених методом SAGE надекспресованих в гліальних пухлинах генів беруть участь у важливих процесах, що відбуваються в пухлинних клітинах: проліферації і диференціюванні, інвазії, ангіогенезі, апоптозі. Вони залучені до змін у сигнальних мережах, ремоделювання позаклітинного матриксу, зміни рухливості клітин. Це відкриває можливості для визначення нових молекулярних маркерів і терапевтичних мішеней гліом.

Як показали результати SAGE, кількість генів, експресія яких знижується більше ніж у 5 разів, зростає із злоякісною прогресією астроцитарних гліом - 26 генів у дифузній астроцитомі, 48 генів в анапластичній астроцитомі і 85 генів у гліобластомі. Співставлення списків генів із п'ятиразово зниженим рівнем експресії в астроцитарних пухлинах показало, що зміни експресії деяких виявляються на однаковому рівні в астроцитомах різного ступеня злоякісності, а для більшості генів значне зниження експресії відбувається лише в гліобластомі. Проведена Нозерн-блот гібридизація для довільно відібраних генів загалом відповідала результатам SAGE. Зокрема, гени DNM1 і NRGN експресуються на високому рівні у більшості зразків нормального головного мозку, однак в гліобластомах рівень їxньої експресії значно нижчий, або вони взагалі не експресуються. Високий вміст мРНК MBP виявлено в нормальному головному мозку, однак він був набагато нижчим в астроцитарних гліомах II-IV ступенів злоякісності; в більшості гліобластомах ця мРНК зовсім нe виявлялась.

Для визначення в пухлинних клітинах збіднених транскриптів ми використали напівкількісну ЗТ-ПЛР. Для гена FAT2 результати ЗТ-ПЛР загалом відповідають результатам SAGE. Продукт ПЛР був виявлений в п'яти із семи зразків нормального головного мозку і в шести з 14 зразків гліобластом. Результати ЗТ-ПЛР для гена CPNE6 знаходяться навіть у більшій відповідності з результатами SAGE: продукт ПЛР був виявлений у восьми з дев'яти зразків нормального головного мозку і в п'яти з 10 зразків гліобластом, причому лише в одній гліобластомі рівень експресії гена був такий же, як в нормальному головному мозку, а в чотирьох інших зразках - набагато нижчий.

Аналіз баз даних NCBI і публікацій по кожному гену, здійснений для визначення потенційних функцій білкових продуктів генів, дозволив згрупувати гени з потенційно схожими функціями. Білкові продукти більшості з 85 генів, рівень експресії яких знижений більше ніж в 5 разів у гліобластомі, можна віднести до таких функціональних груп: нейрогенезу, мієлінової оболонки, нейрофіламентів, синаптичної передачі, регуляції клітинного циклу, цитоскелету, мембранних білків, зв'язування іонів, регуляції транскрипції/трансляції, передачі сигналу, транспортної активності, апоптозу, ендоцитозу, ГТФазної активності, клітинної адгезії/рухливості, метаболізму ліпідів та гормональної активності.

Гени, які на більш високому рівні експресуються в нормальному головному мозку порівняно з гліальними пухлинами, можуть бути розділені на два великих класи: з характерною експресією в нейронах і з характерною експресією в гліальних клітинах. Як можна було очікувати, значна частина генів із зниженим рівнем експресії в гліомах кодують білки, що беруть участь в процесах нейрогенезу, синаптичної передачі, утворення оболонки нервів та нейрофіламентів. Зниження рівнів експресії генів згаданих функціональних груп можна віднести з великою вірогідністю до класу змін експресії, які прямо не стосуються злоякісної трансформації, хоча не можна відкидати можливості хоча б опосередкованої їхньої участі в розвитку пухлин. Вони експресуються переважно в нейрональних клітинах, тому зниження вмісту такої мРНК, вірогіднo, відображає зменшення відсотку цих клітин, яке відбувається в астроцитомах.

Порівняння результатів аналізу експресії генів в гліобластомі методами SAGE та диференційної гібридизації ДНК-мікрочипів. SAGE і диференційна гібридизація мікрочипів - два найпотужніших методи для профілювання експресії генів у нормальних і пухлинних клітинах і визначення генів, залучених до пухлинного процесу. З метою ідентифікації генів, які можуть бути корисними як молекулярні маркери гліальних пухлин ми порівняли власні результати та опубліковані дані стосовно змін експресії генів в гліобластомі, отримані з використанням SAGE та гібридизаційного аналізу мікрочипів.

Аналіз публікацій показав слабке перекривання результатів, отриманих гібридизацією мікрочипів, навіть у роботах з використанням одного й того ж типу мікрочипів. Ми знайшли лише 35 загальних генів із 849 описаних у цих роботах диференційно експресованих у гліобластомі генів. Частково це можна пояснити різною кількістю досліджуваних генів, нанесенех на мікрочипи. Зокрема, перші кДНК-чипів фірми Clontech містили менше тисячі генів, а сучасні олігонуклеотидні мікрочипи містять до 30 тисяч генів. Велика кількість існуючих платформ мікрочипів і дослідницьких протоколів ускладнює порівняння результатів різних досліджень. Очевидно, незадовільне перекривання генів, виявлених аналізом мікрочипів, обумовлене як методологічними артефактами (наприклад, низькою якістю зондів тотальної кДНК або високим фоном гібридизації, проблемами з контрольними генами домашнього господарства, та ін.), так і біологічними причинами (наприклад, гетерогенністю молекулярних механізмів утворення гліобластом). Дуже великою проблемою є одержання зразків тканини нормального головного мозку. Здебільшого, хірургічні зразки гістологічно нормального мозку, які зазвичай є джерелом РНК, розташовані безпосередньо біля самої пухлини і, як вже зазначалося, в них можуть бути присутні пухлинні клітини.

Більше спільних змін експресії генів у гліобластомах було виявлено при співставленні результатів аналізу мікрочипів з результатами SAGE - загалом 117 генів із зміненим рівнем експресії в гліобластомі були ідентифіковані обома методами. Очевидно, незалежно від того, що SAGE має власні методологічні недоліки і велику залежність від застосованих статистичних методів, він є досконалішим методом для виявлення змін експресії генів, завдяки більшій чутливості, яка дозволяє виявляти різницю в експресії навіть для збіднених транскриптів. Для аналізу мікрочипів також суттєве значення має метод обробки даних при визначенні списків генів, що диференційно експресовані. Зокрема, порівняння 10-ти різних методів показало слабке перекривання результатів (тільки 8-21% загальних генів) при їхньому застосуванні для обробки одних і тих же даних аналізу (Jeffery et al., 2006).

Отже, зважаючи на отримані в цій роботі результати, можна зробити висновок, що зараз відбір потенційних молекулярних маркерів пухлин головного мозку є перспективнішим на основі порівняння всіх наявних даних щодо профілювання експресії генів в пухлинах за умови їхньої відтворюваності в декількох роботах з використанням різних методів. Виявлені нами при співставленні результатів SAGE і аналізу мікрочипів 117 диференційно експресованих генів, спільних для обох методів, можна включити до списку кандидатів для молекулярної характеристики гліальних пухлин. Детальніша функціональна характеристика цих генів визначить придатність їхніх продуктів слугувати молекулярними маркерами пухлин.

Таким чином, характерні біологічні властивості гліальних пухлин мають відображення в профілях експресії генів. Підвищення транскрипційної активності генів асоційоване з такими властивостями пухлинних клітин як посилений ангіогенез і неоваскуляризація, підвищений проліферативний потенціал, висока інвазивність, резистентність до хіміо - і радіотерапії. Зниження транскрипційної активності асоційовано переважно з дедиференціюванням клітин. Систематична характеристика змін експресії генів, які відбуваються в гліомах, поглиблює розуміння їхньої біології та молекулярних основ патогенезу і має практичне значення для ідентифікації нових молекулярних маркерів для вдосконалення діагностики і лікування пухлин головного мозку людини.

Висновки

Профілюванням експресії генів в астроцитарних гліомах різного ступеня злоякісності виявлено і охарактеризовано особливості змін експресії генів у пухлинах, які асоційовані з певними властивостями пухлинних клітин. Зафіксовано кореляцію між збільшенням кількості генів, рівень експресії яких змінюється в пухлинах, та підвищенням ступеня злоякісності астроцитом; виявлено групи генів, зміни транскрипційної активності яких є характерними як для певних, так і для всіх стадій злоякісної прогресії астроцитом.

1. Диференційною гібридизацією бібліотек кДНК у гліобластомі виявлено зміни експресії генів, які кодуються як ядерним, так і мітохондріальним геномами.

2. Серійним аналізом генної експресії знайдено 129 генів з більше ніж 5-кратною зміною експресії в гліобластомах, з яких 44 гени є надекспресованими. Результати SAGE підтверджені Нозерн-блот гібридизацією і ЗТ-ПЛР.

3. Вперше показано підвищення рівня Alu-вмісних високомолекулярних транскриптів у гліобластомах, яке може бути наслідком аномалій синтезу, деградації чи процесингу РНК в пухлинних клітинах, і пов'язане з прогресією астроцитоми в гліобластому.

4. Зниження експресії генів АТР6, СОХІ, СОХІІ, СОХІІІ, ND1 і ND4 вказує на генералізовану інактивацію транскрипції мітохондріального геному в гліобластомі - найзлоякіснішій формі гліальних пухлин.

5. Показано, що білкові продукти надекспресованих в гліобластомі генів можна віднести до обмеженої кількості функціональних груп: ангіогенезу і фібрілогенезу, імунної відповіді і передачі сигналу, позаклітинного матриксу, стійкості до лікарських препаратів та системи інсуліноподібних факторів росту. Підвищення експресії генів відбувається як в трансформованих гліальних клітинах, так і в клітинах мікроглії/макрофагах.

6. У всіх досліджених зразках гліобластом виявлено високий ступінь надекспресії гена YKL-40/HC gp-39, який є функціональним синергістом IGF-I. Показано, що високий рівень експресії гена корелює з несприятливим перебігом захворювання; це дозволяє запропонувати його використання як прогностичного фактора гліом.

7. З'ясовано, що астроцитоми різного ступеня злоякісності характеризуються підвищеним рівнем експресії гена SPARC, який відіграє важливу роль в ангіогенезі та інвазії гліом, і може бути специфічним маркером інвазії.

8. Виявлене в гліальних пухлинах суттєве зниження експресії гена TSC-22 на рівні РНК та білка разом із відомою негативною роллю TSC-22 в регуляції проліферації клітин свідчить про його потенційну пухлино-супресорну функцію. Деякі з 85 генів із зниженою активністю на останніх стадіях злоякісної прогресії астроцитарних гліом можуть належати до пухлиносупресорних генів.

9. Відмінності рівнів експресії генів в індивідуальних зразках астроцитарних гліом ІІ-ІV ступенів злоякісності дозволяють виявити молекулярні варіанти гліальних пухлин, які корелюють з клінічними проявами; це може бути використано в терапії пухлин.

10. Виявлені методами SAGE і аналізу мікрочипів 117 диференційно експресованих генів є кандидатами для молекулярної характеристики гліальних пухлин.

11. Оптимальним підходом виявлення генів, продукти яких можуть бути пухлиноасоційованими маркерами, є комбіноване використання різних методів експресійної генетики з підтвердженням їхніх результатів аналізом експресії генів у індивідуальних зразках пухлин.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Дмитренко В.В., Гарифулин О.М., Смикодуб А.И., Кавсан В.М. Aнализ экспрессии генома человека при помощи библиотек кДНК различных органов // Цитология и генетика. - 1995. - Т.29, №2, С.64-71. Дисертантом виконано експерименти із аналізу експресії генів в різних органах людини диференційною гібридизацією бібліотек кДНК і написано основну частину статті.

2. Дмитренко В.В., Гарифулин О.М., Шостак Е.А., Смикодуб А.И., Кавсан В.М. Характеристика различных типов мРНК, экспрессирующихся в головном мозге человека // Цитология и генетика. - 1996. - Т.30,№1. - С.41-47. Дисертантом виконано більшу частину досліджень із ідентифікації та характеристики виявлених диференційною гібридизацією різних типів мРНК, що експресуються в головному мозку людини і написано основну частину статті.

3. Dmitrenko V., Garifulin O., Kavsan V. Isolation and sequence analysis of the cDNA encoding subunit C of human CCAAT-binding transcription factor // Gene. - 1997. - Vol. 197, №1. - P.161-163. Дисертантові належить ідея написання статті, ним проведено частину роботи із встановлення невідомої на той час нуклеотидної послідовності і характеристики C-субодиниці CCAAT-зв'язувального транскрипційного фактора людини.

4. Дмитренко В.В., Шостак К.О., Гарифулін О.М., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Зміни експресії генів у клітинах астроцитом головного мозку людини // Экспериментальная онкология. - 1998. - Т. 20. - С. 191-197. Дисертант брав основну участь у плануванні робіт, проведенні частини робіт з виявлення і характеристики змін експресії генів у клітинах астроцитом головного мозку людини диференційною гібридизацією, визначенні первинної структури генів та написанні статті.

5. Шостак К.О., Дмитренко В.В., Гарифулін О.М., Розуменко В.Д., Хоменко О.В., Зозуля Ю.П., Цехетнер Г., Кавсан В.М. Потенційна супресорна роль гена TSC-22 в пухлинах головного мозку людини // Біополімери і клітина. - 2001. - Т.17, № 2. - С.152-159. Дисертант брав участь у плануванні і проведенні частини експериментів з характеристики змін експресії потенційного пухлиносупресорного гена TSC-22 в пухлинах головного мозку людини, ним власноруч написано основну частину статті.

6. Шостак К.О., Дмитренко В.В., Гарифулін О.М., Розуменко В.Д., Хоменко О.В., Зозуля Ю.П., Цехетнер Г., Кавсан В.М. Підвищена експресія генів SOX-2 та HC gp-39 в астроцитарних гліомах // Біополімери і клітина. - 2002. - Т.18,№2. - С.324-329. Дисертант брав участь у плануванні робіт, проведенні експериментів з аналізу експресії генів SOX-2 та HC gp-39 Нозерн-блот гібридизацією і написанні статті.

7. Shostak, K. O., Dmitrenko V. V., Garifulin O. M., Rozumenko V. D., Homenko O. V., Zozulya Y. P., Zehetner G., Kavsan V. M. Downregulation of putative tumor suppressor gene TSC-22 in human brain tumors // J. Surgical Oncol. - 2003. - Vol.82. - P.57-64. Дисертантові належить ідея роботи. Ним проведено аналіз делецій в локусі гена TSC-22 в пухлинних клітинах, обговорення результатів і написання статті проведені за його безпосередньої участі.

8. Shostak K., Labunskyy V., Dmitrenko V., Malisheva T., Shamayev M., Rozumenko V., Zozulya Y., Zehetner G., Kavsan V. HC gp-39 gene is upregulated in glioblastomas // Cancer Lett. - 2003. - Vol. 198. - P. 203-210. Дисертант брав участь у розробці стратегії дослідження властивостей гена HC gp-39, проведенні частини експериментів з аналізу експресії гена HC gp-39 Нозерн-блот гібридизацією, обговоренні результатів і написанні статті.

9. Дмитренко В.В., Шостак К. О, Бойко О.І., Хоменко О.В., Розуменко В.Д., Малишева Т.А., Шамаєв М.І., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Зміни експресії мітохондріальних генів в гліобластомі людини // Біополімери і клітина. - 2004. - T. 20, № 1. - C.34-40. Більшу частину експериментів з виявлення змін експресії мітохондріальних генів у гліобластомі диференційною гібридизацією кДНК-бібліотеки проведено за беспосередньої участі дисертанта, ним власноруч написано основну частину статті.

10. Kavsan V., Shostak K., Dmitrenko V., Chausovskiy T., Zozulya Y, Demotes-Mainard J. Peculiarities of molecular events in human glial tumors revealed by serial analysis of gene expression (SAGE) // Experimental Oncol. - 2004. - Vol.26, №3. - P. 196-204. Дисертант брав участь у плануванні робіт, проводив визначення змін експресії генів у гліальних пухлинах методом серійного аналізу генної експресії, ним власноруч написано основну частину статті.

11. Dmitrenko V. V., Shostak K. O., Boyko O.I., Khomenko O. V., Rozumenko V. D., Malisheva T. A., Shamayev M.I., Zozulya Yu. P., Kavsan V. M. Reduction of the transcription level of mitochondrial genome in human glioblastoma // Cancer Lett. - 2005. - Vol.218, №1. - Р.99-107. Експерименти з аналізу транскрипції всіх мітохондріальних генів в гліомах заплановано і проведено за беспосередньої участі дисертанта, ним власноруч написано основну частину статті.

12. Shostak K. O., Dmitrenko V. V., Vudmaska M.I., Naidenov V. G., Malisheva T. A., Semenova V. M., Zozulya Yu. P., Demotes-Mainard J., Kavsan V. M. Detection of TSC-22 protein in astrocytic gliomas // Experimental Oncol. - 2005. - Vol.27,№4. - Р.314-318. Дисертант брав участь у плануванні робіт, проведенні експериментів із клонування гена TSC-22 в експресувальний вектор і отримання рекомбінантного білка TSC-22, обговоренні результатів і написанні статті.

13. Дмитренко В.В., Шостак К. О, Бойко О.І., Симиренко О. Є., Гундоров І.С., Хоменко О.В., Розуменко В.Д., Малишева Т.А., Шамаєв М.І., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Активація експресії гена SPARC на ранніх стадіях розвитку астроцитарних гліом // Біополімери і клітина. - 2005. - T.21, № 2. - C.157-164. Робота запланована дисертантом, за беспосередньої участі дисертанта були проведені експерименти з визначення рівнів експресії гена SPARC аналізом РНК гліальних пухлин, ним підготовлено статтю до друку.

14. Дмитренко В.В., Бойко О.І., Шостак К.О., Симиренко О. Є., Букреєва Т.В., Розуменко В.Д., Малишева Т.А., Шамаєв М.І., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Надекспресія генів на різних стадіях розвитку астроцитарних гліом // Біополімери і клітина. - 2006. - Т.22, №1. - C.38-48. Більша частина експериментів із ідентифікації генів, надекспресованих в астроцитомах, запланована і проведена за беспосередньої участі дисертанта, власноруч написано переважну частину статті.

15. Kavsan V., Shostak K., Dmitrenko V., Zozulya Y., Rozumenko V., Demotes-Mainard J. Characterization of genes with significantly increased expression in human glioblastomas // Цитология и генетика. - 2005. - Т.39, №6. - C.37-49. Дисертант брав безпосередню участь в експериментах щодо характеристики генів з підвищеною експресією в гліобластомі методами Нозерн-блот гібридизації і ЗТ-ПЛР, обговоренні результатів і написанні статті.

16. Дмитренко В.В., Букреєва Т.В., Шостак К.О., Вітак Н.Я., Пекарський Ю.А., Малишева Т.А., Шамаєв М.І., Розуменко В.Д., Кондратюк В.В., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Надзвичайно високий вміст мРНК IGF-II-асоційованого білка в менінгіомах // Укр. біохім. журнал. - 2007. - Т.79,№2. - С.55-61. Дисертант брав участь у виконанні експериментів з клонування кДНК IGF-II-асоційованого білка і аналізу продукції мРНК IGF-II-асоційованого білка в менінгіомах, ним власноруч написано основну частину статті.

17. Дмитренко В.В., Бойко О.І., Шостак К.О., Вітак Н.Я., Букреєва Т.В., Розуменко В.Д., Малишева Т.А., Шамаєв М.І., Зозуля Ю.П., Кавсан В.М. Характеристика генів зі зниженою експресією в гліомах людини - потенційних пухлиносупресорних генів // Біополімери і клітина. - 2007. - Т.23,№4. - С347-362. Дисертантові належить ідея роботи. Дослідження зниженої експресії генів в пухлинах аналізом РНК методами Нозерн-блот гібридизації і ЗТ-ПЛР, обговорення результатів і написання статті проведені під його керівництвом та за його безпосередньої участі.

18. Kavsan V. V., Dmitrenko V. V., Shostak K. O., Bukreieva T. V., Vitak N. Y., Simirenko O. E., Malisheva T. A., Shamayev M.I., Rozumenko V. D., Zozulya Y. A.comparison of microarray and SAGE techniques in gene expression analysis of human glioblastoma // Цитология и генетика. - 2007. - Т.41, №1. - C.36-55. Дисертант брав участь у плануванні робіт, проведенні порівняльного аналізу результатів профілювання експресії генів у гліобластомах методами SAGE і мікроарейного аналізу, написанні статті.

19. Кавсан В.М., Дмитренко В.В., Марусик А.М., Шостак К.О., Зозуля Ю.П. Молекулярна генетика гліом // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. - 2001. - Т.1. - С.333-351. Дисертант брав участь у проведенні експериментів щодо характеристики експресії генів у гліомах, обговорення результатів та написання статті проводилось за його безпосередньої участі.

20. Зозуля Ю.А., Шостак Е.А., Гарифулин О.М., Розуменко В.Д., Хоменко А.В., Дмитренко В.В., Кавсан В.М. Роль изменений экспрессии генов в развитии глиом головного мозга человека // Журн. Вопросы нейрохирургии им.Н. Н. Бурденко. - 2002. - №.2. - С.43-50. Дисертант брав участь у плануванні робіт, проведенні експериментів з виділення диференційно експресованих генів і оцінки ролі змін експресії експресії генів в формуванні гліом, написанні основної частини статті.

21. Kavsan V. M., Dmitrenko V. V., Garifulin O. M., Shostak K. O., Zozulya Yu. A. Identification of differentially expressed genes in gliomas // XV Meeting of European Association for Cancer Research. Stockholm, Sweden. - 1998. - P. 195. Дисертант брав основну участь у плануванні робіт, проведенні робіт з ідентифікації і характеристики генів із зміненою експресією в гліомах.

22. Kavsan V., Dmitrenko V., Shostak K., Garifulin O., Homenko O. Zozulya Yu. Increased expression of heterodisperse Alu-containing transcripts in glioblastoma multiforme // 10^th European Cancer Conference. Vienna, Austria. - 1999. - P.433. Дисертантові належить ідея роботи, ним проведено експерименти з визначення первинної структури Alu-вмісних транскриптів.

23. Кавсан В.М., Дмитренко В.В., Марусик А.М., Шостак Е.А., Хоменко А.В., Розуменко В.Д., Зозуля Ю.А. Изменения экспрессии генов в опухолях головного мозга человека // Онкология 2000. ІІ съезд онкологов стран СНГ. Киев, Украина. - 2000. - 187. Дисертантом проведено частину експериментів з виявлення змін експресії генів, узагальнено експериментальні дані.

24. Kavsan V., Dmitrenko V., Garifulin O., Shostak K., Zehetner G., Homenko O., Gridina N., Zozulya Yu. Changes of gene expression associated with initiation or progression of human brain astrocytic tumours // 16^th Conference of European Association for Cancer Research. Halkidiki, Greece. - 2000. - P.63. Дисертант брав участь у плануванні і проведенні робіт з характеристики змін експресії генів на різних стадіях розвитку астроцитом Нозенрн-блот аналізом гліальних пухлин.

25. Labunskyy V. M., Dmitrenko V. V., Zozulya Yu. A., Rozumenko V. D., Kavsan V. M. Determination of new genetic markers for glial tumors // IIIrd Congress of Ukrainian medical geneticists. Lviv, Ukraine. - 2002. - P.49-50. Дисертантом виконано частину досліджень і узагальнено дані з ідентифікації нових молекулярних маркерів гліальних пухлин диференційною гібридизацією.

26. Kavsan V., Dmitrenko V., Zehetner G., Zozulya Yu. A. Changes of TSC-22 gene expression in human glial tumors // 17^th Conference of European Association for Cancer Research. Granada, Spain - 2002. - P.78. Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експериментів щодо секвенування кДНК TSC-22 і характеристики змін експресії гена TSC-22 в гліомах ЗТ-ПЛР аналізом.

27. Boyko, O.I., Shostak, K. O., Dmitrenko, V. V., Kavsan, V. M. Identification of genes differentially expressed in the normal cells and and brain tumour cells // Тези Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології. Львів. - 2004. - С.42. Дисертантом виконано частину досліджень і узагальнено дані з ідентифікації диференційної експресії генів в астроцитарних пухлинах головного мозку з використанням серійного аналізу генної експресії.

28. Kavsan V. M. Dmitrenko V. V., Shostak K. O., Zozulya Yu. A. Rozumenko V. D. Demotes-Mainard J. Characterization of genes with increased expression in glioblastomas // 13^th European Cancer Conference. Paris, France. - 2005. - P.24. Дисертантом проведено планування досліджень, ним узагальнено отримані дані щодо характеристики генів з підвищеною експресією в гліобластомах.

29. Boyko O.I., Shostak K. O., Dmitrenko V. V., Symyrenko O. E., Zozulya Yu. A., Kavsan V. M. Decreased transcription level of the mitochondrial genome in human glioblastoma // 5^th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling. Kiev, Ukraine. - 2005. - P.101. Дисертантові належить ідея досліджень, він брав участь у проведенні частини експериментів щодо вивчення зниженої транскрипції мітохондріального генома в гліобластомі людини Нозенрн-блот гібридизацією і методами SAGE.

30. Shostak K. O., Dmitrenko V. V., Boyko O.I., Zozulya Yu. A., Kavsan V. M. HC gp-39 as prognosis marker for human glial brain tumors // 20^th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. Kyoto, Japan. - 2006. - P.599. Дисертантом виконано частину досліджень з аналізу експресії гена HC gp-39 Нозерн-блот гібридизацією і імуногістохімічним аналізом, узагальнено отримані дані щодо аналізу експресії гена HC gp-39 в гліальних пухлинах.

31. Kavsan V. M., Dmitrenko V. V., Shostak K. O., Bukreieva T. V., Malisheva T. A., Rozumenko V. D., Shamaev M.I., Zozulya Yu. A., Demotes-Mainard J. Gene expression profiling for identification of molecular markers for human brain // 2^nd International Interdisciplinary Congress "Neuroscience for Medicine and Psychology”. Sudak, Crimea (Ukraine). - 2006. - P.102. Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експериментів щодо профілювання експресії генів в гліальних пухлинах методом SAGE, порівняння з результатами мікроарейного аналізу.

32. Kavsan V. M., Dmitrenko V. V., Shostak K. A., Zozulya Y. A. Activation of signalling pathways by increased expression of HC gp-39 in brain tumors // 14^th European Cancer Conference. Barcelona, Spain. - 2007. - P.76. Дисертантом проведено частину досліджень потенційних взаємодій білка HC gp-39, ним узагальнено результати роботи.

Анотація

Дмитренко В.В. Асоціація змін транскрипційної активності генів із виникненням і прогресією гліальних пухлин головного мозку. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2007.

Серійним аналізом генної експресії (SAGE) і диференційною гібридизацією охарактеризовано зміни експресії генів в астроцитарних гліомах, які асоційовані з певними властивостями пухлинних клітин. За допомогою SAGE ідентифіковано 129 генів, експресія яких істотно змінюється в гліобластомах і які придатні для молекулярної характеристики пухлин головного мозку. Гени віднесено до обмеженої кількості функціональних груп. Диференційна експресія деяких генів показана вперше в пухлинах головного мозку.

В гліобластомі, найбільш злоякісній формі гліом, знайдено акумуляцію гетерогенних Alu-вмісних нуклеотидних послідовностей, а також генералізовану інактивацію транскрипції мітохондріального геному, асоційовану з деструкцією мітохондрій в пухлинних клітинах.

Виявлені співставленням результатів SAGE і мікроарейного аналізу 117 диференційно експресованих генів можна віднести до переліку генів, продукти яких є потенційними молекулярними маркерами гліальних пухлин.

Ключові слова: гліальні пухлини, гліобластома, серійний аналіз генної експресії, диференційна гібридизація, диференційна експресія генів, Alu-вмісні нуклеотидні послідовності, мітохондріальний геном, молекулярні маркери.

Аннотация

Дмитренко В.В. Ассоциация изменений транскрипционной активности генов с возникновением и прогрессией глиальных опухолей головного мозга. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертационная работа посвящена идентификации и характеристике генов, изменения транскрипцийной активности которых ассоциированы с образованием и развитием глиальных опухолей головного мозга человека.

С использованием двух современных методов экспрессионной генетики - серийного анализа генной экспрессии (SAGE) и дифференциальной гибриди-зации - обнаружены и охарактеризованы основные изменения экспрессии генов на разных стадиях злокачественной прогрессии астроцитарных глиом, ассоциированные с определенными свойствами опухолевых клеток.

Дифференциальная гибридизация библиотек кДНК эмбрионального и постнатального головного мозга человека выявила в глиобластоме изменения экспрессии для генов, которые кодируются как ядерным, так и митохондриальным геномами, а также для повторяющихся элементов генома человека, которые относятся к классу коротких рассеянных по геному элементов (SINE, short interspersed nuclear element). Использование Alu-содержащих кДНК в качестве зондов для Нозерн-гибридизации не обнаружило дискретных транскриптов ни в РНК нормального головного мозга, ни в РНК астроцитарних опухолей. Вместо этого, были получены гетерогенные гибридизационные сигналы размером от 0,3 т. н. до более чем 7,0 т. н. Для РНК глиобластомы гибридизация с этими зондами была намного интенсивнее по сравнению с РНК менее злокачественных астроцитом и нормального головного мозга. При использовании в качестве гибридизационных зондов уникальных последовательностей, прилежащих к Alu-повторам, не было найдено повышения содержания соответствующих транскриптов в опухолях. Аккумуляция высокомолекулярных гетерогенных Alu-содержащих нуклеотид-ных последовательностей, очевидно, является следствием аномалий синтеза, деградации или процессинга РНК в опухолевых клетках.

Нозерн-анализ астроцитарных глиом разной степени злокачественности обнаружил существенно сниженное содержание митохондриальных мРНК ATP6, COXIII, COXII, COXI, ND1 и ND4 в глиобластоме сравнительно с нормальным головным мозгом, а SAGE показал снижение уровня транскрипции всех митохондриальных генов в глиобластоме. Эти результаты вместе указывают на генерализованную инактивацию транскрипции митохондриального генома, ассоциированную с деструкцией митохондрий.

Исследования, проведенные с использованием SAGE, показали увеличение количества дифференциально экспрессирующихся генов со злокачественной прогрессией астроцитарных глиом, а также увеличение амплитуды изменений их экспрессии. Идентифицировано 129 генов, уровень экспрессии которых существенно изменяется в глибластоме и которые могут быть пригодными для молекулярной характеристики опухолей головного мозга.44 из 129 генов оверэкспрессированы в опухолях. Большую часть генов с более чем 5-кратно повышенной активностью в глиобластомах можно условно разделить на небольшое количество групп: гены, вовлеченные в ангиогенез и фибрилогенез; гены, кодирующие белки внеклеточного матрикса; гены стойкости к лекарственным препаратам; гены системы IGF (IGF-axis); гены иммунного ответа и гены передачи сигнала.

Нозерн-анализ и обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция подтвердили результаты SAGE для двух десятков дифференциально экспрессирующихся генов с наиболее выразительным повышением уровня экспрессии в глиобластоме на независимых образцах опухолей и нормального головного мозга. Вариации уровней экспрессии генов в хирургических образцах астроцитарных глиом ІІ-ІV степеней злокачественности коррелируют с клиническими проявлениями и могут быть использованы для молекулярной характеристики глиом.

Обнаружено, что около 10 генов с повышенной больше чем в 5 раз активностью в глиобластоме имеют отношение к МАП-киназам - (МАПК) - каскадам. Более детальное исследование этих генов может позволить использование их продуктов в качестве мишеней для химио-, иммуно-, и генной терапии. Показано, что ген YKL-40/HC gp-39, который имеет функцию, синергичную IGF-I и принадлежит к МАПК-каскаду имеет экстремально высокую экспрессию в глиобластоме - наиболее агрессивной форме глиальных опухолей. Увеличение содержания YKL-40/HC gp-39 как в опухолях так и в сыворотке позволяет использовать его как молекулярный маркер злокачественной прогрессии глиом. Уровень экспрессии гена SPARC, который играет важную роль в ангиогенезе и инвазии глиом, повышен на всех этапах злокачественной прогрессии астроцитом и может быть специфическим маркером инвазии.

85 генов со сниженной активностью на последних стадиях злокачественной прогрессии астроцитарных глиом могут относиться к опухоль-супрессорних генам. Обнаруженное на уровне РНК и белка существенное снижение экспрессии гена TSC-22 в глиальных опухолях вместе с показанной другими авторами негативной ролью TSC-22 в процессе пролиферации клеток свидетельствует о его потенциальной опухоль-супрессорной роли.117 дифференциально экспрессирующихся генов, общих для методов SAGE и анализа микрочипов, можно включить в список кандидатов для молекулярной характеристики глиальных опухолей.

Ключевые слова: глиальные опухоли, глиобластома, серийный анализ генной экспрессии, дифференциальная гибридизация, дифференциальная экспрессия генов, Alu-содержащие нуклеотидные последовательности, митохондриальный геном, молекулярные маркеры.

Summary

Dmitrenko V. V. Association of transcriptional activity of the genes with the initiation and progression of human brain glial tumors. - Manuscript.

Thesis for Doctors' degree in Biology, speciality 03.00.03 - molecular biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

Gene expression changes in astrocytic gliomas, associated with definite properties of tumor cells, were characterized by Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) and by differential hybridization.129 genes with changed expression in glioblastoma and useful for the molecular characteristic of brain tumors were identified by SAGE. The genes are attributed to the limited number of functional groups. Differential expression of some genes was demonstrated first in brain tumors.

Accumulation of the heterogeneous Alu-containing nucleotide sequences and generalized inactivation of mitochondrial genome, associated with mitochondria destruction in tumor cells, were revealed in glioblastoma, the most malignant form of the glioma.

117 differentially expressed genes, revealed by the comparison of the results of SAGE and microarray analysis, can be included in the list of genes, whose protein products are candidates into molecular markers of glial tumors.

Keywords: glial tumors, glioblastoma, Serial Analysis of Gene Expression, differential hybridization, differential gene expression, Alu-containing nucleotide sequences, mitochondrial genome, molecular markers.

Размещено на Allbest.ru