Методы исследования в клинической биохимии

Первым этапом будет присоединение антител к носителю. Антитела полученные к тому или иному химическому соединению (антигену) адсорбируются на твердую поверхность планшета. А затем избыток антител удаляют отмыванием.

Вторым этапом является внесение в лунки планшета с адсорбировавшими антителами определяемого соединения (антигена) и раствора конъюгата, представляющего собой молекулы антигена, химически меченые молекулами фермента. В течение некоторого периода инкубации происходит адсорбция как меченых, так и немеченых антигенов. Поэтому после отмывки буферным раствором на поверхности носителя останутся как меченые, так немеченые (определяемые) антигены, соотношение которых зависит от исходной концентрации антигенов определяемого раствора.

Третьим этапом является добавление субстрата, т. е. вещества на который действует фермент. Фермент адсорбированный из раствора конъюгата вместе с меченым антигеном катализирует химическую реакцию превращения субстрата в окрашенное соединение.

Четвертым этапом является добавление в лунки планшета фиксирующего реагента прекращающего ферментативную реакцию.

Измерение оптической плотности содержимого каждой лунки проводится с помощью специального фотометра или визуально.

Одновременно с анализируемым раствором в некоторые лунки одного и того же планшета вносятся стандартные растворы, после измерения оптической плотности которых строится калибровочный график, по которому легко вычисляют концентрацию контролируемого соединения в анализируемой пробе.

Метод в таком варианте может быть широко использован не только для целей серологической диагностики заболеваний, путем обнаружения соответствующих антигенов бактерий и вирусов, но и, например, для экспресс-контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание опасных химических соединений, гормональных препаратов, антибиотиков, микотоксинов, пестицидов, в общем любых веществ, которые могут сыграть роль соответствующих антигенов (гаптенов) к которым могут быть получены антитела.

Необходимо учитывать только, что разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов, препятствует созданию универсальных методик получения антиген-ферментных комплексов. По существу синтез большинства конъюгатов антигенов с ферментами представляет собой отдельную задачу, сложность которой возрастает по мере уменьшения молекулярной массы и растворимости антигена.

Метод конкурентного анализа для определения антигенов можно использовать в другом варианте с использованием меченых ферментами антител. Этот вариант имеет то преимущество, что для конъюгирования антител с разными ферментами существует ряд стандартных методик, позволяющих получить стабильные и активные препараты. Для целей ИФА могут быть использованы меченые глобулиновые фракции или IgG-фракция или аффинно выделенные чистые антитела.

В этом варианте первым этапом является присоединение антигена к носителю (т.е. уже антигены адсорбируются на твердую поверхность планшета) и избыток антигена отмывается буферным раствором. Вторым этапом является внесение в лунки планшета с адсорбированным антигеном меченых ферментами антител и стандартного или исследуемого раствора антигена. Связывание меченых антител конкурентно тормозится определяемым антигеном. При этом количество связанных меченых антител обратно пропорционально концентрации определяемого антигена. Третьим этапом, как и в предыдущем методе, является добавление субстрата, четвертым - фиксирующего вещества, прекращающего ферментативную реакцию и пятым - измерение оптической плотности.

К числу неконкурентных методов анализа относится метод двойных антител или (сэндвич-метод). Данный метод является широко распространенным для определения антигенов обладающих более, чем одной антигенной детерминантой.

Принцип этого варианта метода заключается в том, что на носителе (планшет) фиксируют антитела, затем наносят раствор, содержащий исследуемый антиген, образуется фиксированный на носителе комплекс антиген-антитело, к которому добавляют меченые ферментом антитела. В процессе анализа антиген как бы «зажат» между молекулами антител, что и обусловило название метода - «сэндвич».

Анализаторы, предназначенные для определения сходных по химической природе компонентов. Например, автоматический анализатор аминокислот или автоматический атомно-абсорбционный спектрофотометр.

Многоцелевые биохимические анализаторы, предназначенные для определения большого числа компонентов, различающихся по своей химической природе.

В основе работы автоматических анализаторов положены 2 принципа - поточной и дискретный. В анализаторах поточного типа химические реакции проводятся в потоке транспортируемых по трубкам и разделенных воздушными прослойками проб. Вариантом этого способа является проточно-инжекционный анализ, заключающийся в введении (инжекции) определенного образца в непрерывной поток носителя. При малом объеме анализируемой жидкости, большой скорости движения носителя в капиллярной трубке, отдельные пробы не смешиваются друг с другом, а лишь в небольшой степени разбавляются жидкостью- носителем.

В автоанализаторах, основанных на дискретном принципе работы, в специальную реакционную емкость из пробоотборника вносятся анализируемая проба и химические реагенты. После прохождения химической реакции проводится детектирование ее результатов. Дискретная технология наиболее широко используется в автоанализаторах, предназначенных для клинико-биохимических исследований.

Использование автоматических анализаторов имеет ряд важных преимуществ по сравнению с обычной ручной (мануальной) работой, выполняемой непосредственно лабораторными работниками. Это, во- первых, высокая производительность (до 800 и более исследований в час), использование небольших объемов биологической жидкости (3-7 мкл), экономное расходование реактивов (в 5-10 раз меньше). Применение автоматизированных устройств позволяет использовать различные режимы определения, современную компьютерную технику, возможность выполнения экстренных исследований, обеспечивает высокую надежность определения, связанную с использованием новейших технологий.

Биохимические автоанализаторы характеризуются определенными технико-аналитическими данными (производительностью, последовательностью проведения анализа, системой детектирования светового сигнала и др.), которые необходимо учитывать при выборе прибора, сопоставляя их с целями исследования. При оценке анализаторов следует учитывать также особенности компьютерного обеспечения.

Автоматизация гематологических исследований

В современных автоматических устройствах для гематологического анализа используются в основном два технологических принципа - кондуктометрический и оптический.

Основными параметрами, которые позволяют определять современные гематологические анализаторы, являются: количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, показатель гематокрита, объем эритроцита, содержание гемоглобина в эритроците, лейкограмма и др.

Кондуктометрический принцип определения заключается в изменении сопротивления клетки в постоянном электрическом поле. Технология определения состоит в том, что фиксируется момент прохода через отверстие малого диаметра (апертуру) клеток крови. Для этого по обе стороны отверстия располагаются электроды с поданным на них напряжением. При протекании через отверстие чистого раствора электролита сопротивление в цепи мало, но в момент прохождения через апертуру клетки оно резко возрастает, что приводит к увеличению напряжения в цепи. Импульсы скачкообразного изменения напряжения фиксируются и подсчитываются специальным датчиком. Специальный прибор (дискриминатор) пропускает импульсы заранее заданной амплитуды, что позволяет регистрировать клетки в зависимости от их размера. О количестве однотипных частиц судят по числу импульсов, возникающих при прохождении клеток крови через апертуру строго определенного размера.

Оптический принцип определения в своей основе имеет измерение величины светопоглощения или светорассеивания. В анализаторах этого типа регистрируются электрооптические импульсы, возникающие при прохождении клеток крови в луче светового потока. Интенсивность импульса прямо пропорциональна размеру исследуемых частиц. Световой луч фокусируется на капилляр, через который проходят клетки, в результате чего происходит либо светопоглощение, либо светорассеяние светового потока. Величина светопоглощения или светорассеяния обусловлена размером, формой и структурой клеток крови.

Для дифференциации клеток крови используется также радиочастотный анализ. Под действием токов высокой частоты, клетки в момент прохождения ими апертуры посылают сигналы, амплитуда которых зависит от размеров ядра, его плотности, характера цитоплазматических включений. Перед подсчетом лейкоцитов вызывают гемолиз эритроцитов гипотоническим раствором, подсчет тромбоцитов проводят после осаждения эритроцитов.

В зависимости от типа анализаторов они делятся на полуавтоматические, где подготовка пробы к исследованию (ее взятие, разбавление соответствующими растворами) производится вручную и полностью автоматические, где все эти процедуры проводятся в автоматическом режиме.

К приборам, работающим на принципе кондуктометрии, относятся такие гематологические автоанализаторы как Cobis Micros18, МД-11-18, System 9120, MEDONIK и др. Все они позволяют анализировать до 20 параметров крови.

К приборам, использующим оптический принцип детекции относятся гематологические анализаторы серии Techuicon (Н-1, Н-2, Н-3).

Размещено на Allbest.ru