4.7 Методы разделения

Из физико-химических методов разделения в фармацевтическом анализе в основном используют хроматографию, электрофорез и экстракцию.

Хроматографические методы разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами: подвижной и неподвижной. Подвижной фазой может быть жидкость или газ, неподвижной -- твердое вещество или жидкость, адсорбированная на твердом носителе. Относительная скорость перемещения частиц вдоль пути разделения зависит от взаимодействия их с неподвижной фазой. Это приводит к тому, что каждое из веществ проходит определенную длину пути на носителе.

Хроматография дает возможность наиболее эффективно осуществлять избирательное распределение компонентов анализируемого образца. Это имеет существенное значение для фармацевтического анализа, объектами исследования в котором обычно являются смеси нескольких веществ.

По механизму процесса разделения хроматографические методы классифицируют на ионообменную, адсорбционную, осадочную, распределительную, окислительно-восстановительную хроматографию. Хроматографические методы классифицируют также по агрегатному состоянию анализируемого вещества. К ним относятся различные методы газовой и жидкостной хроматографии.

Адсорбционная хроматография основана на избирательной адсорбции отдельных компонентов из раствора смеси веществ. Стационарной фазой служат такие адсорбенты, как оксид алюминия, активированный уголь и др.

Ионообменная хроматография использует ионообменные процессы, происходящие между адсорбентом и ионами электролита в анализируемом растворе. Стационарной фазой служат катион обменные или анионобменные смолы, содержащиеся в них ионы способны обмениваться на одноименно заряженные противоионы.

Осадочная хроматография основана на различии в растворимости веществ, образующихся при взаимодействии компонентов разделяемой смеси с осадителем.

Распределительная хроматография заключается в распределении компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (подвижной и неподвижной). Стационарной фазой служит пропитанный растворителем носитель, а подвижной фазой -- органический растворитель, практически не смешивающийся с первым растворителем. При выполнении процесса в колонке происходит разделение смеси на зоны, содержащие по одному компоненту. Распределительная хроматография может выполняться также в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография) и на хроматографической бумаге (бумажная хроматография).

Электрофорез -- метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к перемещению в электрическом поле. Электрофорез позволяет разделять и идентифицировать компоненты различных смесей. Скорость перемещения ионов при электрофорезе зависит от напряженности электрического поля, величины заряда, размера частицы, вязкости, рН среды, температуры и других факторов.

Фронтальный электрофорез проводят в свободной незакрепленной фазе в кювете, представляющей собой разборный U-образный канал. В кювете исследуемую смесь и буферный раствор располагают так, чтобы между ними была четкая граница, которая затем в процессе электрофореза расходится на ряд границ, соответствующих числу компонентов.

Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, которая выполняет роль стабилизатора электрофоретических зон. Зональный электрофорез имеет много вариантов: электрофорез в свободной жидкости, на крупнопористых носителях (на бумаге, проточных установках, колонках, в блоке), на мелкопористых носителях (в тонком слое, крахмальном геле, в полиакриламидном геле, диск-электрофорез, изотахофорез).

Экстракцию как метод разделения применяют в фармацевтическом анализе, особенно для разделения компонентов, входящих в состав лекарственных форм. В зависимости от исходной фазы различают экстракцию из твердого вещества и экстракцию из раствора (жидкостную), а по количеству операций -- однократную и многократную экстракции. Основное условие разделения -- выбор экстрагента, не смешивающегося с исходной фазой и легко отделяющегося от нее и от экстрагируемого вещества. Экстракцию как метод разделения сочетают с фотометрией.

Экстракционно - фотометрический метод основан на образовании цветных продуктов, способных экстрагироваться каким-либо органическим растворителем. Этот метод используют для анализа многих препаратов и лекарственных форм.

Окрашенные вещества экстрагируют в органическую фазу (обычно в хлороформ) и измеряют оптическую плотность с помощью спектрофотометра или фотоколориметра.

4.8 Термические методы анализа

Нагревание лекарственных веществ до температуры, не вызывающей термического разложения, приводит к ряду изменений в их физических свойствах. Происходят полиморфные превращения, растворение в кристаллизационной воде, удаление сорбционной и кристаллизационной воды, сублимация, плавление, кипение. В зависимости от природы вещества, температуры и условий нагревания могут происходить химические превращения: структурирование, термическая, окислительная или гидролитическая деструкция. Термическая деструкция веществ сопровождается поглощением или выделением теплоты, а также образованием газообразных продуктов. Поэтому наиболее информативными и экспрессными методами оценки термической стабильности являются термография и термогравиметрия.

Термография позволяет оценить термическую стабильность по температурам термоэффекта, связанного с деструкцией исследуемого вещества.

Термогравиметрия дает возможность определить термическую стабильность по температуре, при которой наблюдается уменьшение массы вещества.

Характерная особенность термометрического титрования -- его универсальность. Один и тот же прибор можно использовать для различных видов определений, для анализа не требуются специфические индикаторы, селективные электроды. Область применения метода -- реакции нейтрализации, окисления -- восстановления и др.

Термический анализ основан на точной (до 0,1°С) регистрации равновесного состояния между кристаллической и жидкой фазами анализируемого вещества. Медленно нагревая или охлаждая сплав, устанавливают температуру, при которой появляются и исчезают кристаллы.

Термофрактография -- метод, основанный на нагревании сырья в определенном температурном интервале и улавливании образующихся продуктов по фракциям.

В последние годы проводятся исследования по комплексному применению физических и физико-химических методов. Это обеспечивает возможность получения новых характеристик и констант, позволяющих дать всестороннюю оценку лекарственного вещества или группы препаратов сходной химической структуры.

Глава 5. Биологические методы анализа

5.1 Биологический контроль качества лекарственных средств

Биологическую оценку качества лекарственных препаратов обычно проводят по силе фармакологического эффекта или по токсичности. Применяют биологические методы, когда с помощью физических, химических или физико-химических методов не удается сделать заключение о чистоте или токсичности лекарственного препарата или когда способ получения препарата не гарантирует постоянства активности (например, антибиотики).

Проводят биологические испытания на животных (кошки, собаки, кролики, лягушки и др.), отдельных изолированных органах (рог матки, часть кожи), отдельных группах клеток (форменные элементы крови), а также на определенных штаммах микроорганизмов. Активность препаратов выражают в единицах действия (ЕД).

Испытание на токсичность. Для выполнения испытания отбирают по два флакона или ампулы от каждой серии, содержащей не более 10000 флаконов или ампул. Из партий с большим количеством отбирают по три ампулы (флакона) от каждой серии. Содержимое проб одной серии смешивают и испытывают на здоровых белых мышах обоего пола массой 19--21 г. Испытуемый раствор вводят в хвостовую вену пяти мышей и ведут наблюдение за животными 48 ч. Препарат считается выдержавшим испытание, если ни одна из подопытных мышей не погибнет в течение указанного срока. В случае гибели даже одной мыши испытание повторяют по определенной схеме.

Испытания на пирогенность. Бактериальные пирогены представляют собой вещества микробного происхождения, способные вызвать у человека и теплокровных животных при попадании в кровяное русло повышение температуры тела, лейкопению, падение кровяного давления и другие изменения в различных органах и системах организма. Пирогенную реакцию вызывают грамотрицательные живые и мертвые микроорганизмы, а также продукты их распада. Допустимо содержание, например, в изотоническом растворе натрия хлорида 10 микроорганизмов в 1 мл, а при введении не более 100 мл допускается 100 на 1 мл. Испытанию на пирогенность подвергают воду для инъекций, инъекционные растворы, иммунобиологические лекарственные средства, растворители, используемые для приготовления инъекционных растворов, а также лекарственные формы, вызывающие, пирогенную реакцию.

Также для проведения испытаний на пирогенность используют микробиологический метод, основанный на подсчете общего числа микроорганизмов в исследуемой лекарственной форме до ее стерилизации; химический метод, основанный на обработке растворов, содержащих пирогенны хиноном; спектрофотометрический, основанный на определении пирогенных веществ в УФ-области спектра; люминесцентный метод, основанный на способности пирогенов увеличивать интенсивность люминесценции указанных красителей и др.

Испытание на содержание веществ гистаминоподобного действия.

Данному испытанию подвергают парентеральные лекарственные средства. Выполняют его на кошках обоего пола массой не менее 2 кг под уретановым наркозом. Вначале животному, находящемуся под наркозом, вводят гистамин, проверяя его чувствительность к этому веществу. Затем с интервалом 5 мин продолжают повторные введения (0,1 мкг/кг) стандартного раствора гистамина до тех пор, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимается за стандартное. После этого с интервалом 5 мин животному вводят испытуемый раствор с той же скоростью, с которой вводили гистамин. Препарат считают выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг в стандартном растворе.

5.2 Микробиологический контроль качества лекарственных средств

Существует такой вид биологического контроля как определение микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств, т.е. установление состава и количества имеющейся в препарате микрофлоры и ее соответствие нормам, ограничивающим микробную обсемененность (контаминацию). Патогенные микроорганизмы (синегнойная палочка, кишечные бактерии) способны находиться в таблетках и гранулах от 6 до 18 мес., сохраняя морфологические и биохимические свойства. Микробиологическая чистота нестерильных лекарственных средств находится в зависимости от санитарно-гигиенических условий производства, дополнительной обработки сырья с целью его деконтаминации и состояния микробиологического контроля на всех этапах производства.

Испытание на микробиологическую чистоту. Необходимость проведения этого испытания вызвана тем, что лекарственные средства, в том числе выпускаемые в виде таких лекарственных форм, как таблетки, капсулы, гранулы, растворы, сиропы, мази, не стерилизуются в процессе производства. Поэтому они могут быть загрязнены микроорганизмами. Испытание включает количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов и выявление некоторых видов микроорганизмов, представителей кишечной флоры и стафилококка, содержание которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.

Выполняют испытание на микробиологическую чистоту в асептических условиях. Количественное определение микроорганизмов выполняют двухслойным агаровым методом в чашках Петри. Образец лекарственного средства в количестве 10 г (мл) растворяют, суспендируют или эмульгируют в фосфатном буферном растворе (рН 7,0) с таким расчетом, чтобы конечный объем раствора был 100 мл. Затем по 1 мл образца смешивают с питательной средой (4 мл).

Через 5 сут инкубирования при 30--35° С подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках и вычисляют число бактерий в 1 г (мл) образца.

Испытания на стерильность. Целью этого испытания является доказательство отсутствия в лекарственном средстве жизнеспособных микроорганизмов любого вида с максимально возможной достоверностью. Результаты испытания на стерильность -- один из важнейших показателей безопасности лекарственных средств.

Этому испытанию подвергаются все лекарства для парентерального введения, глазные капли и мази, лекарства, наносимые на открытую рану, и др. Эффективность данного вида контроля определяют такие факторы, как отбор образца для анализа, техника посева лекарственного средства, состав питательных сред, время инкубации посевов, интерпретация и учет результатов испытания.

Приведенные методы контроля применяют для испытаний всех лекарственных средств независимо от их химической природы и лекарственной формы.

Для установления стерильности лекарства вначале определяют его антимикробное действие. Для контроля стерильности применяют биогликолевую среду и жидкую среду Сабуро, используя при этом метод прямого посева на питательные среды. Если лекарственное средство обладает выраженным антимикробным действием или разлито в емкости более 100 мл, то для контроля его стерильности используют метод мембранной фильтрации. Испытание выполняют на фильтрационной установке, включающей фильтродержатель с мембранным фильтром и колбу-приемник. фармацевтический анализ лекарственный препарат

Несмотря на отдельные недостатки, этот метод имеет целый ряд преимуществ в отличие от прямого посева. Он устраняет антимикробное действие препаратов, которое при прямом посеве может исказить результаты определения, дает возможность исследовать большие объемы лекарственного средства, сократить время инкубации посевов, экономить питательные среды и т.д.

Заключение

Анализ лекарственных препаратов - важный этап в производстве и возможности реализации любого лекарственного препарата. Устанавливая качественный и количественный состав лекарственных препаратов, используют различные физические, физико-химические, химические, а так же биологические методы анализа.

Физические и физико-химические методы включают в себя:

• определение температур плавления и затвердевания, а также температурных пределов перегонки; определение плотности; определение показателей преломления (рефрактометрия); определение оптического вращения (поляриметрия); спектрофотометрия (ультрафиолетовая, инфракрасная); фотоколориметрия; эмиссионная и атомно-абсорбционная спектрометрия; флуориметрия; спектроскопия ядерного магнитного резонанса; масс-спектрометрия; хроматография (адсорбционная, распределительная, ионообменная, газовая, высокоэффективная жидкостная);
• электрофорез (фронтальный, зональный, капиллярный); электрометрические методы (потенциометрическое определение рН, потенциометрическое титрование, амперометрическое титрование, вольтамперометрия).
• К химическим методам анализа лекарственных препаратов относятся: качественные реакции на подлинность, растворимость, определение летучих веществ и воды, определение содержания азота в органических соединениях, титриметрические методы (кислотно-основное титрование, титрование в неводных растворителях, комплексонометрия), нитритометрия, кислотное число, число омыления, эфирное число, йодное число и др.
• Биологические методы контроля качества лекарственных препаратов весьма разнообразны. Среди них испытания на токсичность и стерильность, микробиологическую чистоту.

Литература

1. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 частях. Часть 1. Общая фармацевтическая химия: Учеб. для фармац. ин-тов и фак. мед. ин-тов. -- М.: Высш. шк., 1993. - 432 с.

2. Глущенко Н. Н. Фармацевтическая химия: Учебник для студ. сред. проф. учеб. заведений / Н. Н. Глущенко, Т. В. Плетенева, В. А. Попков; Под ред. Т. В. Плетеневой. -- М.: Издательский центр "Академия", 2004. -- 384 с.

3. Драго Р. Физические методы в химии - М.: Мир, 1981

4. Коренман И.М. Фотометрический анализ - М.: Химия, 1970

5. Логинова Н. В., Полозов Г. И. Введение в фармацевтическую химию: Учеб. пособие - Мн.: БГУ, 2003.-250 с.

6. Мелентьева Г. А., Антонова Л. А. Фармацевтическая химия. -- М.: Медицина, 1985.-- 480 с.

7. Фармацевтический анализ лекарственных средств / Под общей редакцией В.А.Шаповаловой - Харьков: ИМП "Рубикон", 1995

8. Халецкий A.M. Фармацевтическая химия - Ленинград: Медицина, 1966

Размещено на Allbest.ru