Нерадиоактивно меченые олигоэлектроны

В некоторых случаях искомая нуклеотидная последовательность присутствует в недостаточном для обнаружения количестве. Содержание отдельных уникальных последовательностей в геноме может быть недостаточным для выявления гибридизацией in situ. Иные последовательности нуклеотидов могут присутствовать лишь в небольшой доле клеток пациента (например, ДНК и РНК вируса иммунодефицита человека - ВИЧ). Недостаточным может быть само количество ткани, доступной для проведения анализа. Во всех этих случаях перед нанесением образца на фильтр прибегают к процедуре амплификации (умножения) нуклеотид-ного материала с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2]. Последняя возможна, если известна первичная структура хотя бы небольшого участка (порядка сотни нуклеотидов) анализируемой ДНК-мишени. На автоматическом синтезаторе получают олигонуклеотиды из 15-25 звеньев, комплементарные краям известной последовательности, гибридизуют их с денатурированной ДНК из анализируемого образца и с помощью термостабильного фермента - Taq-полимеразы, - выделенного из термофильной бактерии Termus aquaticus, проводят многократное удвоение синтезируемых цепей ДНК, до нескольких десятков циклов (принципиальная схема полимеразной цепной реакции будет рассмотрена ниже). За 2-3 ч работы на коммерческих амплификаторах можно достичь увеличения количества интересующей последовательности в десятки миллионов раз. Ее содержание при этом растет в геометрической прогрессии, в то время как содержание последовательностей, прилегающих к ней, - лишь в арифметической (рис.3, а).

Амплификация ничтожных количеств исходного биологического материала в сочетании с молекулярной гибридизацией позволяет обнаружить одну клетку, инфицированную ВИЧ, среди 105 неинфицированных клеток носителя СПИДа. Применение ПЦР делает возможным однозначное установление личности преступника по одному волосу, засохшей капле спермы, слюны или крови с использованием метода "геномной дактилоскопии", также основанного на принципах молекулярной гибридизации [2].

С помощью ПЦР можно не только нарабатывать ДНК-мишень в количестве, достаточном для анализа с использованием меченых олигонуклеотидных зондов, но и получать значительные количества полинуклео-тидных зондов, несущих радиоактивную или нерадиоактивную метку.

Ферментативные способы получения меченых полинуклеотидных зондов.

Среди методов нерадиоактивного мечения полинуклео-тидных зондов наибольшее распространение получили хорошо отработанные ранее для радиоактивного мече-ния процедуры удлинения затравки (рис.3, б), ник-трансляции (рис.3, в) или полимеразной цепной реакции (см. рис.3, а). Все эти способы основаны на способности ДНК-полимераз синтезировать полинуклео-тидную цепочку, комплементарную одноцепочечной матрице, используя З'-гидроксильный конец спаренного фрагмента ДНК в качестве затравки [3].

Удлинение затравки. Химическим путем синтезируют олигонуклеотид (менее 20 звеньев), комплементарный какому-либо известному участку анализируемой ДНК, гибридизуют его с денатурированной ДНК, по матрице которой синтезируется зонд, после чего в реакционную смесь добавляют ДНК-полимеразу и набор всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), один из которых несет метку. Используя оли-гонуклеотид в качестве затравки, полимераза удлиняет его, встраивая в растущую цепь меченый нуклеотид. В результате образуется полинуклеотидный меченый зонд (см. рис.3, б).

Полимеразная цепная реакция. ПЦР предусматривает наличие двух олигонуклеотидных затравок, комплементарных участкам, фланкирующим выбранный район ДНК. После денатурации двуцепочечной матрицы и гибридизации олигонукдеотидов с каждой из двух однонитевых цепей проводится полимеразная реакция, результатом которой является удвоенное количество последовательностей ДНК, заключенных между затравками (см. рис.3, а). При повторении процедуры денатурации, гибридизации и полимеризации получают четыре копии, а за 30 циклов можно получить несколько миллионов меченых полинуклеотидов, используемых в качестве зондов.

Ник-трансляция. Если последовательность нуклео-тидов в анализируемой ДНК неизвестна, то меченый зонд получают процедурой, называемой ник-трансляцией (от англ. nick - разрез) (см. рис.3, в). В ДНК вносят некоторое количество одноцепочечных разрывов путем обработки ферментом ДНКазой. Образующиеся в местах разрезов свободные 3'-ОН концы используются ДНК-полимеразой для их наращивания. Фермент при этом расчищает себе дорогу, удаляя дНМФ с 5'-конца стоящего рядом фрагмента ДНК. При этом он включает в растущую цепочку меченые нуклеотиды, идентичные только что отщепленным немеченым. В результате получают меченые полинуклеотиды, которые могут служить зондами для выявления ДНК, первичная структура которой неизвестна.

В том случае, когда нужно получить большое количество нерадиоактивно меченого зонда, например, для проведения массовой диагностики, прибегают к химическим, а не ферментативным способам включения метки. В ДНК - или РНК-полинуклеотиды вводят ре-акционноспособные группы, к которым присоединяют тот или иной репортер. Химический способ более воспроизводим, так как не зависит от удельной активности лабильных ферментов; он не требует также синтеза дорогостоящих нуклеозидтрифосфатов, несущих сигнальное соединение.

Нерадиоактивные метки и их выявление.

Биотин. Наиболее распространенной нерадиоактивной репортерной группой, включаемой в состав олиго - и полинуклеотидных зондов, является витамин биотин (природный кофактор группы ферментов - карбоксилаз). Биотинилированное производное дУТФ (био-УТФ) включается в образуемые ДНК-полимера-зами цепи вместо тимина и способно к комплементарным взаимодействиям с аденином. Биотин обладает чрезвычайно высоким сродством к содержащемуся в курином яйце белку авидину, а также к его бактериальному аналогу - стрептавидину (константа диссоциации комплекса биотин-авидин 10"15 М). Эти белки ковалентно сшивают (конъюгируют) либо с флуорохромами, либо с ферментами, катализирующими образование окрашенных продуктов. Как флуорохромы, так и ферменты можно сшивать и с антителами к (стрепт) авидину (рис.4, а). Такие конъюгаты, прочно связываясь с биотином, введенным в олиго - или полинуклеотидный зонд, позволяют выявлять до 0,1 пг (1 пикограмм = = 10"12 г) ДНК-мишени. Наличие в биотине карбоксильной группы, не участвующей во взаимодействии со (стрепт) авидином, позволяет легко присоединять его ковалентно к различным молекулам, в том числе к мононуклеотидам и синтетическим олигонуклеотидам [4].

Помимо использования ДНК-полимеразы есть и другие способы введения биотина в зонд. Это может быть осуществлено при помощи терминальной дезок-синуклеотидилтрансферазы. Этот фермент, подобно

Рис. 4. Различные способы выявления зондов, не-сущих биотин (а) и дигоксигенин (б). Б - биотин; (С)А - (стрепт)авидин; ДГ - - анти-тело; Ф - фермент, катализирующий образование окрашенного продукта; Фл - флуорохром, излучаю-щий свет опредленной длины волны

ДНК-полимеразе, удлиняет олигонуклеотид, однако осуществляет это при отсутствии матрицы. Кроме того, разработаны способы химического введения биотина в полинуклеотиды, содержащие модифицированные гетероциклические основания. Его присоединяют по таким положениям оснований, которые не принимают непосредственного участия в образовании водородных связей с комплементарными нуклеотидами [5].

Дигоксигенин. Подобно биотину, нерадиоактивной репортерной группой может служить дигоксигенин - стероид из растения наперстянки (Digitalis purpurea). Основной способ введения в зонд дигоксигенина такой же, как для биотина, - включение дНТФ, несущего это соединение, в полинуклеотид в ходе полимеразной реакции. И дигоксигенин и биотин являются гаптенами, то есть антигенными детерминантами, с которыми специфично и прочно связываются соответствующие антитела, конъюгированные с ферментом, образующим окрашенный продукт, или с каким-либо флуоро-хромом (рис.4, б).

Флуорохромы. В отличие от биотина и дигоксигенина флуорохромы сами по себе являются сигнальными соединениями. Они способны излучать свет определенной длины волны при возбуждении их более коротковолновым светом. Так, флуоресцеин, один из наиболее распространенных красителей, при возбуждении ультрафиолетом с длиной волны 485 нм имеет максимум испускания в видимой области - 515 нм и светится зеленым. Тот факт, что одна молекула флуоресцентного красителя способна многократно претерпевать цикл "возбуждение-излучение", обеспечивает высокую чувствительность зондов, меченных флуорохромами.

Использование нескольких зондов, несущих флуо-рохромы с отличающимися спектрами испускания, позволяет одновременно локализовать в хромосомах разные нуклеотидные последовательности гибридизацией in situ. Это невозможно проделать с радиоактивно мечеными зондами, выявляемыми авторадиографией. В качестве аналогии сравните цветную и черно-белую фотографии радуги.

При кариологическом анализе пациентов с хромосомной патологией метод FISH позволяет надежно идентифицировать метафазные хромосомы и наличие в них перестроек (рис.5, а), выяснять происхождение лишнего хромосомного материала (рис.5, б).

В том случае, если необходимо избавиться от фоновой флуоресценции подложки, на которую нанесен анализируемый образец, используют разрешенную во времени флуориметрию. Она основана на том, что хелаты некоторых редкоземельных металлов характеризуются относительно долгим периодом затухания флуоресценции. Так, ионы европия сохраняют возбужденное состояние на несколько порядков дольше, чем большинство органических флуорофоров. Поэтому если возбуждать анализируемый образец короткими (наносекундными) лазерными импульсами, а регистрацию излучения начинать с задержкой в 100 нс, то будет регистрироваться лишь излучение возбужденных ионов Eu3+.

В олигонуклеотидные зонды флуорохромы вводятся различными химическими способами [4], а в по-линуклеотидные - либо химическим путем после модификации гетероциклических оснований [5], либо ферментативным в полимеразных реакциях, аналогичных описанным выше, с использованием флуорохро-мированных аналогов НТФ или дНТФ.

Ферменты, используемые в качестве репортерных групп. В качестве репортерной группы используют также некоторые ферменты, способные катализировать образование большого числа молекул окрашенного продукта. Широко применяют, например, пероксидазу и щелочную фосфатазу. Первый фермент в присутствии перекиси водорода окисляет некоторые ароматические соединения до нерастворимых в воде темноокрашен-ных продуктов. Второй способен дефосфорилировать органические соединения, которые при этом превращаются в окисленные кислородом сильноокрашенные продукты. Если эти ферменты конъюгированы с синтетическими олигонуклеотидами, то они выступают

Рис.5. Флуоресцентная гибридизация in situ: а - анализ сбалансированной транслокации хромосом 5 и 20 человека. Зонды к хромосоме 5 мечены биотином и выявлялись конъюгатом авидин-флуоресцеин (зеленое свечение); зонды к хромосоме 20 мечены дигоксигенином и выявлялись конъюгатом антите-ло-цианиновый флуорохром (красное свечение). Стрелки указывают на нормальные хромосомы 5 и 20, а также на хромосомы, являющиеся результатом транслокации. Хромосома der (20) t (5; 20) содержит короткое плечо и небольшой прицентромерный район длинного плеча хромосомы 20, а также часть длинного плеча хромосомы 5. Хромосома der (5) t (5; 20) содержит материал хромосомы 5, за исключением части длинного плеча, а также часть длинного плеча хромосомы 20.

Выявленная хромосомная аномалия у здорового мужчины указывает на необходимость дородовой диагностики его будущего ребенка. Любезно предоставлено Н.Б. Рубцовым (Институт цитологии и генетики, Новосибирск); б - анализ происхождения малой сверхчисленной хромосомы (МСХ) у человека. ДНК МСХ была амплифицирована с включением биотина, гибридизована на метафаз-ные хромосомы пациента и детектирована конъюга-том авидин-флуоресцеин. Сигнал (зеленое свечение) был выявлен как на МСХ, так и в прицентромерных районах обеих хромосом 4. Любезно предоставлено Н.Б. Рубцовым непосредственно как нерадиоактивные метки [4]. Однако их чаще используют для непрямого выявления зондов, меченных биотином или дигоксигенином (см. рис.4). При дот-гибридизации темноокрашенные продукты видны невооруженным глазом, при гибридизации in situ - в световом микроскопе. Если нужна количественная оценка образовавшегося продукта, то проводят колориметрическую детекцию на фотоколориметре или денситометре.

Наибольшая чувствительность (до 10"19 М) достигается с нерадиоактивными зондами, выявляемыми с помощью щелочной фосфатазы, в варианте хемилюми-несценции. Субстрат щелочной фосфатазы адамантил-1,2-диокситанфосфат после дефосфорилирования распадается с испусканием света при длине волны 470 нм. Детекция осуществляется предельно просто - экспозицией фотопленки от нескольких минут до нескольких часов.

Литература

1. Кнорре Д.Г. ДНК - и РНК-зонды как альтернатива и дополнение иммунохимического анализа // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им.Д.И. Менделеева. 1989. Т.34, № 1. С.52-60.

2. Янковский Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива, или опыт исследования останков семьи последнего российского императора // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 2. С.21-27.

Размещено на Allbest.ru