2.2 Методики, определяющие предельно допустимые уровни для сырья и кормов для животных

Предельно допустимые уровни содержания микотоксинов в сырье растительного происхождения для комбинированных кормов нормирует Технический Регламент таможенного союза «О безопасности зерна».

Данный технический регламент разработан в соответствии с Соглашением о единых принципах и правилах технического регулирования в Республике Беларусь, Республике Казахстан и Российской Федерации от 18 ноября 2010 г[33].

Технический регламент «О безопасности зерна» разработан с целью установления единых требований к зерну на единой территории Таможенного союза, обеспечения свободного перемещения зерна, которое выпускается в обращение на территории Таможенного союза[33].

Настоящий технический регламент распространяется на зерно, выпускаемое в обращении на территории Таможенного союза, которое используется для пищевых и кормовых целей, при этом не распространяется на зерно, которое предназначено для семенных целей[33].

Этот документ устанавливает обязательные требования к зерну и связанные с ним требования к процессам производства, хранения, перевозки, реализации и утилизации зерна, в целях защиты жизни и здоровья человека, имущества, окружающей среды, жизни и здоровья животных и растения[33].

Маркировка зерна, помещенного в потребительскую упаковку (зерно на кормовые цели), и зерна в транспортной таре должна содержать информацию о виде зерна, годе урожая, месте происхождения, назначения зерна (на пищевые или кормовые цели, на хранение и (или) обработку, на экспорт), количестве зерна (в единицах массы), наименовании и месте нахождения заявителя, о наличии в зерне генно-модифицированных организмов в случае если содержание указанных организмов в зерне составляет более 0,9%, о сроке годности и условиях хранения зерна (для зерна, предназначенного на кормовые цели и упакованного в потребительскую упаковку)[33].

Партия поставляемого зерна, не отвечающая требования данного регламента, подлежит возврату или утилизации. Уполномоченный орган государства - члена Таможенного союза, на территории которого выявлено зерно, не соответствующее требованиям настоящего технического регламента, принимает решение о проведении экспертизы зерна и формирует комиссию в составе представителей уполномоченного органа, изготовителя (собственника) и получателя зерна, которая отбирает образец и направляет ее в аккредитованную испытательную лабораторию (центр), включенную в Единый реестр органов по сертификации и испытательных лабораторий (центров) Таможенного союза, для проведения испытаний. Выбор аккредитованной лаборатории (центра) осуществляется комиссией. На основании результатов испытаний комиссия принимает решение о возврате или утилизации зерна. Возврат и утилизация зерна осуществляются в соответствии с требованиями национального экологического законодательства и национального законодательства в области карантина растений государства - члена Таможенного союза. При утилизации зерна, не соответствующего требованиям настоящего технического регламента, изготовитель (собственник) обязан представить в уполномоченный орган государства - члена Таможенного союза документ, подтверждающий факт утилизации такого зерна, в порядке, установленном национальным законодательством государства - члена Таможенного союза[33].

Оценка соответствия зерна требованиям данного документа проводится в формах подтверждения (декларирования) соответствия зерна; государственного контроля (надзора) за соблюдением требований настоящего документа в отношении зерна и связанных с требованиями к нему процессов производства, хранения, перевозки, реализации и утилизации зерна. Заключается в осуществлении производственного контроля, проведении испытаний образцов зерна и формировании и анализе документации[33].

Содержание микотоксинов в комбикормах для крупного рогатого скота и птицы нормирует ГОСТр 51899-2002 «Гранулированные комбикорма; Общие технические условия».

Данный документ разработан ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»); Научно-исследовательским институтом пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева (НИИПЗК); Всероссийским научно-исследовательским и технологическим институтом птицеводства (ВНИТИП). Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы". Настоящий стандарт распространяется на гранулированные комбикорма для сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, овцы, птицы), а также для непродуктивных животных (кошек, собаки др.)[25].

Контроль за содержанием микотоксинов осуществляется в соответствии с порядком, установленным производителем продукции по согласованию с территориальными органами государственного ветеринарного надзора Минсельхоза России и гарантирующим их безопасность[25].

Содержание микотоксинов в комбикормах для свиней нормирует ГОСТ 51550-2000 «Комбикорма-концентраты для свиней; Общие технические условия»[26].

Разработан ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»); Всероссийским научно-исследовательским институтом животноводства (ВИЖ); Всероссийским научно-исследовательским институтом свиноводства (ВНИИС). Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"[26].

Настоящий стандарт распространяется на комбикорма-концентраты для поросят-сосунов в возрасте до двух месяцев и отъемышей в возрасте от двух до четырех месяцев, ремонтного молодняка свиней в возрасте от четырех до восьми месяцев, холостых, супоросных и подсосных маток, хряков-производителей, мясного. Беконного откорма и откорма свиней до жирных кондиций[26].

Содержание микотоксинов в комбикормах для пушных зверей, кроликов и нутрий нормирует ГОСТ р 51166-98 «Комбикорма для пушных зверей, кроликов и нутрий; Технические условия»[27].

Данный стандарт разработан ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»). Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"[27].

Настоящий стандарт распространяется на комбикорма для пушных зверей (лисиц, песцов, соболей, норок), кроликов и нутрий, вырабатываемые на предприятиях всех форм собственности[27].

Таблица 2 Сводная таблица максимально допустимых уровней микотоксинов в сырье и кормах для животных [25],[26],[27],[33]

2.3 Методики определения концентрации микотоксинов

Для определения микотоксинов существует два распространенных метода:

· Хроматографический анализ

· Иммуноферментный метод

Хроматографический метод анализа основан на распределении компонентов смеси между двумя фазами: неподвижной и подвижной. Для определения микотоксинов используют жидкостную или газовую хроматографию. Выбор хроматографического метода анализ основан на агрегатном состоянии исследуемой пробы и вида определяемого микотоксина. Нормативные документы, определяющие хроматографический метод анализа: ГОСТ 28001-88, ГОСТ 28038-89, и др.

Однако наиболее распространенным методом является иммуноферментный метод. Его основные преимущества заключаются в том, что за один эксперимент можно проверить большое количество проб, а также этот метод существенно дешевле.

Иммуноферментный метода анализа основан на использовании моноклональных антител (антитела, реагирующие на один определенный вид микотоксина). Нормативные документы, определяющие хроматографический метод анализа: ГОСТ Р 52471-2005.

Этапы проведения иммуноферментного метода определения микотоксина[31],[34]:

1. Подготовка проб

Подготовка пробы заключается в измельчение исследуемого продукта до порошкообразного состояния и дальней шей экстракции.

2. Экстракция пробы

Навески пробы массой 10 г помещают в конические колбы, далее к ним добавляют 50 см3 смеси ацетонитрила и воды. Колбы закрывают пробками и интенсивно встряхивают 3-4 раза так, что бы избежать попадания содержимого на горлышко и пробку, далее оставляют на 16 часов при комнатной температуре (18-22°С). Затем колбу вновь встряхивают 3-4 раза и содержимое фильтруют через бумажный фильтр в другие колбы. Полученные фильтраты являются экстрактами

3. Добавление конъюгата

В лунки планшета( которые содержат связанное антитело, которое является спецефическим для определяемого вещества) добавляется 100 мкл коньюгата. Количество добавляемых лунок зависит от количества исследуемых проб + количества лунок, в которых будут находится контрольные образцы

4. Добавление контрольных и исследуемых образцов

Для построения калибровочной кривой используются контрольные образцы с известной концентрацией (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 мг/кг) исследуемого микотоксина (как правило, такие растворы предварительно закупаются, а не подготавливаются перед проведением исследования). Далее добавляется 100 мкл исследуемого образца (в другие лунки планшета).

5. Перемешивание и инкубация

В лунки, заполненные образцами, погружается пипетка или многоканальный дозатор (для каждой лунки используется свой наконечник). Ими осуществляется перемешивание проб (около 5 раз). Далее планшет закрывается стеклянной или пластиковой крышкой, соответствующего размера, и пробы инкубируют в течение 5 минут. На этом этапе исследуемые и контрольные образцы конкурируют за участки связывание с антителами. Соответственно, чем больше определяемого микотоксина в образце, тем меньше конъюгата связывается в лунках.

6. Промывание

После инкубации для удаления несвязанных веществ лунки промываются дистиллированной водой (около 5 раз). Это осуществляется либо ручным способом с помощью пипетки, либо автоматически в специальном устройстве для мойки планшетов «Washer».

7. Добавление субстрата

В лунки планшета добавляется 100 мкл субстрата (как правило, 3, 3', 5, 5'-тетраметилбензидин) с помощью пипетки или многоканального дозатора (для каждой лунки используется свой наконечник).

8. Инкубация

Далее пробы инкубируют в течение 5 минут. На этом этапе субстрат изменяет цвет( окрашивается в синий)в присутствии конъюгата. Таким образом, наблюдается зависимость - чем больше конъюгата свяжется, тем более синей будет окраска, то есть, чем больше исследуемого микотоксина в образце, тем менее синей будет окраска пробы.

9. Добавление стоп-раствора

В лунки планшета добавляется стоп-раствор (прозрачная жидкость, содержащая H2SO4) по 100 мкл для остановки ферментативной реакции. При этом окраска раствора меняется с синей на желтую.

10. Анализ оптической плотности в спектрофотометре

Далее спектрофотометр определяет оптическую плотность растворов при длине волны 650 нм. То есть, прибор определяет степень окрашенности растворов.

11. Анализ результатов

В результате того, что на планшете присутствуют контрольные образцы, по ним строится калибровочная кривая для количественного определения микотоксинов. Далее с этой калибровочной кривой сравнивают полученные измерения оптической плотности и определяют точную концентрацию микотоксина в исследуемых образцах.

Глава 3. Оценка экологической опасности микотоксинов, содержащихся в пробах сырья и комбинированных кормов для животных

В результате прохождения практики в испытательной лаборатории «Тест-Пущино», крупнейшая частная независимая испытательная лаборатория в России, специализирующаяся на анализе пищевой продукции, продовольственного сырья, кормов для животных и воды, аккредитованная Росстандартом РФ в системе ГОСТр ИСО/МЭК17025 с 1994 года, были получены результаты анализа сырья и кормов для сельскохозяйственных животных. По просьбе вышеуказанной лаборатории невозможно указать реальные названия компаний, предоставивших свою продукцию для анализа, но обозначим их как «А» и «Б». Компания «А» является крупным поставщиком комбинированных кормов для сельскохозяйственных животных, а компания «Б» помимо производства кормов, занимается свиноводческой, птицеводческой деятельностью и мясопереработкой. Обе компании имеют филиалы в западной и центральной части России (Брянск, Курск, Липецк, Пенза и т.д.).

Компания «А» предоставила на анализ 229 проб кукурузы, 4 пробы сои и 7 проб пшеницы, используемой в качестве сырья для кормов. Ниже представлена таблица с пробами, имеющими превышение ПДУ по содержанию в них микотоксинов. Полная таблица с результатами анализа данных проб приведена в приложении.

Таблица 3 Сводная таблица проанализированных проб Компании "А", имеющих превышение ПДУ

Таблица 9 Результаты расчетов проб подсолнечного шрота

Таблица 10 Результаты расчетов проб пшеницы

Таблица 11 Результаты расчетов проб подсолнечного жмыха

Таблица 12 Результаты расчетов проб сои

Таблица 13 Результаты расчетов проб комбикорма для птицы

Как видно из расчетов:

· В проанализированных пробах кукурузы было выявлено превышение предельно допустимых уровней только по содержанию Т-2 токсина, оно составило 80% от всех проанализированных проб

· В проанализированных пробах подсолнечного шрота превышений предельно допустимых уровней содержания микотоксинов не было обнаружено

· В проанализированных пробах пшеницы превышений предельно допустимых уровней содержания микотоксинов не было обнаружено

· В проанализированных пробах подсолнечного жмыха превышений предельно допустимых уровней содержания микотоксинов не было обнаружено

· В проанализированных пробах сои превышений предельно допустимых уровней содержания микотоксинов не было обнаружено

· В проанализированных пробах комбикорма для птицы было обнаружено одно превышение предельно допустимых уровней содержания Т-2 токсина, что составило 20% от всех проанализированных проб

В результате, сырье, а также потенциальный корм от компании «А» гораздо более загрязнен, чем от компании «Б». Но при этом в сырье и корме от компании «Б» также есть пробы, содержание микотоксинов в которых превышает предельно допустимый уровень. Заметим, что превышение в этом случае наблюдается только по содержанию Т-2 токсина. Таким образом, Т-2 токсин можно считать наиболее вероятным потенциальным загрязнителем сырья и кормов для животных.

Основными негативными воздействия у Т-2 токсина на животных являются снижение прироста веса, поражение клюва, слабое оперение; у людей и животных - нарушение двигательных функций, гематологические и сердечные последствия; у людей - алиментарно-токсическая алейкия, лихорадка, снижение веса.

По трофическим цепям Т-2 токсин от зараженного корма может дойти и до человека. Опираясь на правило биологического усиления, которое гласит, что концентрация токсических веществ увеличивается, по крайней мере, в десятикратном размере при переходе на следующий трофический уровень, при подобном уровне загрязнения сырья и кормов для сельскохозяйственных животных неизбежны негативные последствия в виде болезней и даже смерти животных и людей.

Главной причиной загрязнения микотоксинами кормов для животных является использование загрязненного микотоксинами сырья. А причиной загрязнений микотоксинами сырья является его неправильное хранение. ГОСТ 26791-89 и Технический Регламент «О безопасности зерна» устанавливают условия хранения сырья для кормов, при которых не будет происходить заражение микотоксинами:

· Хранение зерна осуществляется в зернохранилищах, обеспечивающих безопасность зерна и сохранность его потребительских свойств, при соблюдении требований к процессам хранения зерна, установленных настоящим техническим регламентом

· Продукты переработки зерна хранят в сухих, хорошо вентилируемых, не зараженных вредителями хлебных запасов, складах с соблюдением санитарных правил, утвержденных в установленном порядке

· Поверхности стен, потолков, несущих конструкций, дверей, пола производственных помещений, а также силосов и бункеров должны быть доступными для их очистки и обеззараживания. Состояние кровли и стен зернохранилищ, конструкции входных отверстий каналов активной вентиляции должны обеспечить предотвращение попадания в них атмосферных осадков и посторонних предметов

· В зернохранилищах не допускается хранить совместно с зерном токсичные, горючие химические вещества, горюче-смазочные материалы и нефтепродукты, а также пищевую продукцию иного вида и непищевую продукцию в случае, если это может привести к загрязнению зерна

· Процесс обеззараживания зараженного вредителями зерна должен обеспечивать безопасность зерна в соответствии с требованиями, установленными настоящим техническим регламентом

· В зернохранилище в течение всего периода хранения зерна должна быть организована проверка условий его хранения (влажность, температура), а также показателей зараженности вредителями, цвета зерна и наличия постороннего запаха

При соблюдении этих правил минимизируется возможность заражения сырья, а впоследствии и корма микотоксинами.

Выводы