с = , (2.3)

Исследования методом полярометрии осуществляют с помощью прибора поляриметра или его разновидностью сахариметра, с помощью которого можно определять содержание сахарозы в растворе неизвестной концентрации без предварительного взятия навески.

2.3 Хроматография

Хроматографические методы широко применяют при исследовании состава и свойств пищевых продуктов. Они позволяют проводить исследования, не выполнимые другими инструментальными методами.

В основе хроматографических методов лежит широкий круг физико-химических процессов: распределение, адсорбция, ионный обмен, диффузия, комплексообразование и др.

В зависимости от природы процесса, обуславливающего механизм разделения, т.е. от типа взаимодействия между компонентами разделяемой смеси, подвижной и неподвижной фазами различают следующие основные варианты хроматографии: распределительную, адсорбционную, ионообменную и гель-фильтрационную.

Хроматографические методы также принято классифицировать в соответствии с выбранным типом подвижной и неподвижной фаз. Газовая хроматография (ГХ) объединяет те методы, в которых подвижной фазой является газ; жидкостная хроматография (ЖХ) - методы, в которых подвижной фазой служит жидкость.

В зависимости от агрегатного состояния обеих фаз различают следующие виды хроматографии: твердо-жидкостную хроматографию (ТЖХ), жидкость-жидкостную (ЖЖХ), газо-адсорбционную (ГАХ), газо-жидкостную (ГЖХ).

В настоящее время преимущественное развитие получила газовая хроматография (ГХ), чему способствовало создание чувствительных и универсальных газовых хроматографов с автоматическим детектированием. Этот метод предназначен для разделения и анализа летучих (в том числе и летучих при высоких температурах) соединений. На сегодняшний день - это один из наиболее эффективных способов анализа органических компонентов. Применяется при контроле качества, сертификации продукции, технологическом контроле и экологической безопасности.

Метод ГХ хорошо поддается автоматизации, в чем его неоспоримое преимущество перед другими современными физико-химическим исследованиями. Будучи одновременно и качественным и количественным методом анализа сложных смесей различных органических и неорганических соединений, ГХ используется и для комплексного изучения пищевых продуктов.

Газовая хроматография отличается от других хроматографических методов тем, что газ используется как подвижная фаза, а растворенное вещество перемещается по колонке в виде газа или пара, частично растворенного или адсорбированного в неподвижной фазе.

Разделение компонентов смеси основано на различной адсорбируемости или растворимости анализируемых компонентов при движении их газообразной смеси вдоль поверхности твердого тела или неподвижной жидкости в колонке.

При прохождении через колонку отдельные компоненты улавливаются (адсорбируются) активным адсорбентом или растворяются в пленке неподвижной жидкой фазы, нанесенной на поверхность инертного носителя. В результате неодинаковой адсорбируемости или различного взаимодействия с жидкой фазой компоненты смеси продвигаются по колонке с различными скоростями. Движение молекул веществ, обладающих более высокой сорбируемостью в жидкой фазе, замедляется, а неадсорбируемые или нерастворимые компоненты выходят из колонки первыми.

2.4 Реологические методы исследования

Пищевое сырье растительного и животного происхождения при заготовке (уборка урожая, убой скота, лов рыбы и.т.д.), транспортировании, хранении и особенно при переработке в продукты питания подвергается различным механическим воздействиям. При этом производственные процессы должны быть организованы так, чтобы обеспечить максимально высокий уровень качества готовой продукции. Успешному решению этой задачи способствует знание реологических свойств и текстуры пищевых продуктов.

Пищевое сырье, полуфабрикаты и продукты относятся к реальным телам, которые обладают упругостью, пластичностью и вязкостью. В зависимости от вида, продолжительности и скорости нагружения реального тела некоторые из реологических свойств проявляются особенно ярко, в то время как другие едва заметны, и поэтому при выбранном нагружении ими можно пренебречь. Для инструментального определения реологических характеристик наиболее пригодны простой сдвиг (сдвиговой течение), одноосное растяжение и одноосное растяжение и одноосное сжатие (компрессия).

Наиболее сложными реологическими свойствами обладают высококонцентрированные дисперсные системы с пространственными структурами.

По классификации, предложенной академиком П.А.Ребиндером структуры дисперсных систем в состоянии термодинамического равновесия, делятся на две группы:

1 - коагуляционные структуры, в которых взаимодействие между элементами происходит через тонкий слой дисперсионной среды и обусловлено силами Ван-дер-Ваальса (эти структуры могут проявлять свойства ньютоновских жидкостей (тиксотропию, пластичность, а также способны сильно изменять свои свойства при нагреве, введении ПАВ и других факторов);

2 - конденсационно-кристаллизационые структуры, которые возникают при сцеплении однотипных элементов на границе раздела фаз. Такие структуры обладают относительно высокой прочностью, упругостью и хрупкостью. После разрушения они не восстанавливаются.

Под действием внешней нагрузки в любом продукте возникают деформации и напряжения, которые зависят от состава и строения выбранных объектов исследования, являясь мерой сил внутреннего взаимодействия между элементами их структуры.

Структурно-механические характеристики (СМХ) используют для оценки консистенции продукта как одного из основных показателей его качества. Оценка консистенции продукта осуществляется либо путем измерения СМХ на специальных приборах (реометрах), либо путем сенсорной (органолептической) оценки, т.е. субъективной оценки сопротивляемости и деформации продукта.

Таблица 2.2 - Типы дисперсных систем пищевых продуктов

Дисперсионная среда	Дисперсная фаза	Дисперсная система	Продукт (в том числе сырье, полуфабрикат)
Газ	Жидкость	Жидкий аэрозоль	Экстракт кофе при распылительной сушке
	Твердое тело	Твердый аэрозоль	Мука при пневмотранспортировании
Жидкость	Газ	Пена	Белковая пена
	Жидкость	Эмульсия	Молоко, майонез
	Твердое тело	Золь	Какао-масса
		Суспензия	Фруктовый сок
Твердое тело	Газ	Твердая пена, пористое твердое тело	Мороженое, безе, сухари
	Жидкость	Твердая эмульсия	Масло, маргарин
		Пористое твердое тело, заполненное жидкостью	Овощи, фрукты
	Твердое тело	Твердая суспензия	Макаронные изделия, шоколад, карамель

Сенсорная оценка консистенции, которую можно характеризовать как эмпирическую характеристику деформационного поведения продукта, была известна до широкого применения реологического анализа и используется до настоящего времени. Однако результаты сенсорной оценки зависят от квалификации дегустатора, тщательности проведения контроля с условием выполнения определенных правил, гарантирующих точность и воспроизводимость результатов, и при отсутствии специально подобранных и обученных экспертов, часто носят субъективный характер.

Таблица 2.3 - Сложные дисперсные системы пищевых продуктов

Продукт	Дисперсная фаза	Дисперсионная среда
Шоколад	Кристаллы сахара, твердые частицы какао, пузырьки воздуха	Кристаллическая форма какао-масла
Мороженое	Пузырьки воздуха, капельки жира, белковые макромолекулы	Кристаллическая водянистая фаза
Мякиш хлеба	Пузырьки воздуха, частично кристаллические молекулы крахмала, частицы отрубей	Крахмальный и белковый гель
Фрукты, овощи, картофель, зерно, масличные семена	Капельки жидкости, пузырьки воздуха, крахмальные зерна	Целлюлоза, белковая оболочка
Мясо	Капельки жидкости, кости, капельки жира	Белковые макромолекулы

Оценку консистенции продукта инструментальными методами (измеряя его СМХ) проводят следующим образом:

1.В зависимости от видов и интенсивности механического воздействия (нагружения во времени) определяют различные СМХ, из которых выбирают наиболее чувствительную к изменению структуры продукта при его деформации. Выбранная СМ является реологическим показателем консистенции (измеряемой величиной) для данного продукта.

2.Предварительно проводят определение «эталонного» значения СМХ для каждого вида продукта по существующим методикам оценки качества продукта. При этом в качестве «эталонного» принимают значение СМХ продукта высшего качества.

3.Сравнивают величину выбранного реологического показателя для исследуемого образца продукта с «эталонным» для него значением СМХ и по их разности судят о консистенции продукта.

Реометрия имеет целью определить все наиболее существенные реологические константы посредством специального механического воздействия на исследуемое тело.

Так как не всегда при определенном виде деформации тела одновременно появляются все его реологические свойства, то для полной количественной оценки реологических свойств тела необходимо применять различные методы нагружения. Инструментальное определение реологических констант требует правильного выбора методов измерений и приборов (реометров). Большинство приборов, их теория действия и примерный спектр изучаемых материалов широко освещены в справочной литературе.

В зависимости от поставленной задачи полученные результаты могут быть использованы для определения качества готового продукта, регулирования параметров технологического процесса производства, служить исходными данными при конструировании технологического оборудования и т.п.

Глава 3. ПРИКЛАДНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРИ ОЦЕНКЕ КАЧСТВА СЫРЬЯ И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ

Рассмотрим наиболее важные прикладные методы оценки качества и готовой продукции.

3.1 Относительная плотность

Относительная плотность определяется как отношение плотности исследуемого вещества к плотности «стандартного» вещества в определенных физических условиях:

d = , (3.1)

где с - плотность данного вещества (кг/м3);

с0 - плотность «стандартного» вещества (кг/м3).

Плотность вещества, р, кг/м3, определяется как отношение покоящейся массы, m (кг) к ее объему v(м3):

с = , (3.2)

Для жидких пищевых веществ «стандартным» веществом является чистая вода при температуре 3,98°С и нормальном атмосферном давлении, что соответствует наибольшей ее плотности.

Относительную плотность определяют при температуре продукта 20°С и воды 4°С или 20°С и обозначают символами d или d. Для пересчета значений плотности d в d или наоборот пользуются температурными коэффициентами расширения.

d = 1,00177 d и d = 0,99823 d

Относительная плотность жидких продуктов зависит не только от их температуры, но и от концентрации сухих веществ.

Показатели плотности учитываются при оценке качества молока, определении содержания сухих веществ в плодовых и ягодных экстрактах, содержания поваренной соли в растворах.

Для определения относительной плотности чаще всего применяют пикнометрический или ареометрический метод.

Пикнометрический метод основан на определении массы равных объемов исследуемого продукта и воды при температуре 20°С с помощью прибора пикнометра, который взвешивается, термостатируется вместе с исследуемым продуктов и отдельно с дистиллированной водой.

Плотность исследуемого продукта вычисляется по формуле

d20 = , (3.3)

где m - масса пустого пикнометра, г;

ml - масса пикнометра с исследуемой жидкостью, г;

m2 - масса пикнометра с дистиллированной водой, г.

Ареометрический метод проводят с помощью прибора ареометр со шкалой, показывающей плотность. В исследуемый жидкий продукт погружают ареометр до тех пор, пока масса жидкого продукта, вытесненного им, не станет равной массе ареометра. Плотность жидкого продукта определяют по градуированной шкале ареометра в зависимости от уровня его погружения. Внутри некоторых ареометров имеется термометр, которым можно измерять температуру исследуемого жидкого продукта.

3.2 Кислотность

Кислотность является одним из показателей качества сырья, полуфабрикатов и готовых изделий, в частности, молока и молочных продуктов, соков, сиропов, булочных изделий и др. и характеризует степень их свежести. Под общей кислотностью подразумевается содержание в продукте всех кислот и их кислых солей, реагирующих со щелочью при титровании.

Метод определения титруемой кислотности основан на нейтрализации кислот, содержащихся в продукте, раствором гидроксида натрия в присутствии индикатора фенолфталеина. Титруемую кислотность выражают в градусах Тернера (0Т) или градусах Кеттстофера (0К), а также в процентах какой-либо кислоты.

Один градус Тернера соответствует объему (см3) водного раствора гидроксида натрия концентрацией 0,1 моль/дм3, необходимый для нейтрализации 100 г (100 см3) исследуемого продукта.

Для определения общей кислотности приготавливают вытяжку исследуемого образца, добавляют индикатор 1%-ый фенолфталеин и титруют 0,1 моль/дм3 раствором щелочи до слабо-розового окрашивания, не исчезающего (при спокойном стоянии пробы) 1 мин. Замечают объем раствора щелочи, пошедшего на титрование, и рассчитывают титруемую кислотность по формуле, соответствующей данному виду продукта, указанной в конкретной методике.

Активная кислотность также является показателем качества некоторых видов продукции и сырья, таких как бульоны, мясные полуфабрикаты, охлажденная продукция и др. Определяют ее электрометрически с помощью приборов рН-метров разных марок. В состав приборов входят стеклянный и вспомогательный электрод, при погружении которых в раствор исследуемого образца происходит обмен ионами между поверхностью стеклянного электрода и раствора. В результате этого ионы лития в поверхностных слоях стекла замещаются ионами водорода, и стеклянный электрод приобретает свойства водородного электрода. Показатель рН контролируемого раствора определяют по шкале прибора.

3.3 Сухие вещества и влажность

Вода - одно из самых распространенных веществ на земле, она является необходимым условием жизни и входит в состав всех пищевых продуктов и материалов.

Вода, не являясь собственно питательным веществом, жизненно необходима как стабилизатор температуры тела, переносчик нутриентов (питательных веществ) и пищеварительных отходов, реагент и реакционная среда в ряде химических превращений, стабилизатор конформации биополимеров и, наконец, как вещество, облегчающее динамическое поведение макромолекул, включая проявление ими каталитических (энзиматических) свойств.

Вода - важнейшая составляющая пищевых продуктов. Она присутствует в разнообразных растительных и животных продуктах как клеточный и внеклеточный компонент, как диспергирующая среда и растворитель, обусловливая консистенцию и структуру. Вода влияет на внешний вид, вкус и устойчивость продукта при хранении. Благодаря физическому взаимодействию с белками, полисахаридами, липидами и солями, вода вносит значительный вклад в структуру пищи.

Содержание влаги (%) в пищевых продуктах изменяется в широких пределах: фрукты, овощи - 70-95; мясо - 65-75; молоко - 87; сыр - 37; хлеб - 35;; джем - 28;мука - 12-14; сухое молоко - 4.

Общая влажность продукта указывает на количество влаги в нем, но не характеризует ее причастность к химическим и биологическим изменениям в продукте. В обеспечении его устойчивости при хранении важную роль играет соотношение свободной и связанной влаги.

Связанная влага - это ассоциированная вода, прочно связанная с различными компонентами - белками, липидами и углеводами за счет химических и физических связей.

Свободная влага - это влага, не связанная полимером и доступная для протекания биохимических, химических и микробиологических реакций.

Содержание влаги (сухого вещества) в пищевых продуктах определяют прямыми и косвенными методами. Прямыми методами из продукта извлекают влагу и устанавливают ее количество; косвенными (высушиванием, рефрактометрией, по плотности и электропроводности раствора) - определяют содержание сухих веществ (сухого остатка). К косвенным относят также метод, основанный на взаимодействии воды с определенными реагентами.

Определение содержание влаги высушиванием до постоянной массы (арбитражный метод) основано на выделении гигроскопической влаги из исследуемого объекта при определенной температуре. Высушивание производят до постоянной массы или ускоренными методами при повышенной температуре в течение заданного.

Высушивание образцов, спекающихся в плотную массу, производят с прокаленным песком, масса которого должна быть в 2-4 раза больше массы навески. Песок придает навеске пористость, увеличивает поверхность испарения, препятствует образованию на поверхности корочки, затрудняющей удаление влаги. Высушивание производят в фарфоровых чашках, алюминиевых или стеклянных бюксах в течение 30 минут, при определённой температуре, зависящей от вида продукта.

Массовую долю сухих веществ (Х, %) вычисляют по формуле

Х = , (3.4)

где m - масса бюксы со стеклянной палочкой и песком, г;

m1 - масса бюксы со стеклянной палочкой, песком и

навеской до высушивания, г;

m2 - масса бюксы со стеклянной палочкой, песком и навеской

после высушивания, г.

Высушивание в аппарате ВЧ производится за счёт инфракрасного излучения в аппарате, состоящем из двух соединённых между собой массивных плит круглой или прямоугольной формы (рисунок 3.1).

Рисунок 3.1 - Аппарат ВЧ для определения влажности

1 - рукоятка; 2 - верхняя плита; 3 - блок управления; 4 - нижняя плита; 5 - электроконтактный термометр

В рабочем состоянии между плитами устанавливают зазор 2-3 мм. Температура греющей поверхности контролируется двумя ртутными термометрами. Для поддержания постоянной температуры прибор снабжён контактным термометром, включённым последовательно с реле. На контактном термометре устанавливается заданная температура. Прибор включают в сеть за 20…25 мин до начала высушивания для нагревания до заданной температуры.

Навеску продукта высушивают в пакете из роторной бумаги размером 20х14 см в течение 3 мин при определённой температуре, охлаждают в эксикаторе 2-3 мин и быстро взвешивают с точностью до 0,01 г.

Влажность (Х, %) рассчитывают по формуле

Х = , (3.5)

где m - масса пакета, г;

m1 - масса пакета с навеской до высушивания, г;

m2 - масса пакета с высушенной навеской, г.

Рефрактометрический метод применяют для производственного контроля при определении содержания сухих веществ в объектах богатых сахарозой: сладких блюдах, напитках, соках, сиропах. Метод основан на зависимости между коэффициентом преломления исследуемого объекта или водной вытяжки из него и концентрацией сахарозы. Коэффициент преломления зависит от температуры, поэтому замер производят после термостатирования призм и исследуемого раствора.

Массу сухих веществ (Х, г) для напитков с сахаром рассчитывают по формуле

Х = ,(3.6)

где а - массовая для сухих веществ, определённая

рефрактометрическим методом, %;

Р - объём напитка, см3.

для сиропов, плодово-ягодных и молочных киселей и др. по формуле

Х = , (3.7)

где а - массовая доля сухих веществ в растворе, %;

m1 - масса растворённой навески, г;

m - масса навески, г.

Кроме этих распространённых методов определения сухих веществ применяется ещё ряд методов, позволяющих определить содержание как свободной, так и связанной влаги

Дифференциальная сканирующая колориметрия. Если образец охладить до температуры меньше 0оС, то свободная влага замёрзнет, связанная - нет. При нагревании замороженного образца в колориметре можно измерить тепло, потребляемое при таянии льда. Незамерзающая вода определяется как разница между общей и замерзающей водой.

Диэлектрические измерения. Метод основан на том, что при 0оС значения диэлектрической проницаемости воды и льда примерно равны. Но если часть влаги связана, то её диэлектрические свойства должны сильно отличаться от диэлектрических свойств объёмной воды и льда.

Измерение теплоёмкости. Теплоёмкость воды больше, чем теплоёмкость льда, т.к. с повышением температуры в воде происходит разрыв водородных связей. Это свойство используют для изучения подвижности молекул воды. Значение теплоёмкости, в зависимости от её содержания в полимерах, даёт сведения о количестве связанной воды. Если при низких концентрациях вода специфически связана, то её вклад в теплоёмкость мал. В области высоких значений влажности её в основном определяет свободная влага, вклад которой в теплоёмкость примерно в 2 раза больше, чем льда.

Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР). Метод заключается в изучении подвижности воды в неподвижной матрице. При наличии свободной и связанной влаги получают две линии в спектре ЯМР вместо одной для объёмной воды.

3.4 Активность воды

Состояние воды в продуктах определяется различными характеристиками, среди которых: водосвязывающая способность, энергия вязи влаги и др. В последнее время все большее значение приобретает показатель «активность воды» (бw) как наиболее перспективный и информативный. Это показатель, введенный в 1950-х годах В.И.Скоттом и Х.Салвином, характеризует состояние воды в пищевых продуктах, используемой микроорганизмами для их жизнедеятельности.

По мнению ряда зарубежных авторов, измерение активности воды является одним из необходимых видов контроля качества продуктов, без которого в настоящее время не может обойтись ни одно предприятие пищевой промышленности.

По этой причине показатель активности воды ЕЭС с 1976 г. введен как обязательно для оценки качества пищевых продуктов, а в США он включен в инструкцию Управления по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

Согласно современной классификации пищевые продукты по величине активности воды делятся на три группы:

- продукты с высокой влажностью (бw = 0,9-1,0);

- продукты с промежуточной влажностью ( бw = 0,6-0,9);

- продукты с низкой влажностью (сухие) (бw = 0,6).

Среди многообразия известных методов определения активности воды (бw) часто используется косвенный метод, отличающийся простотой измерения и отсутствием дорогостоящих приборов. Это гравиметрический метод, модифицированный Х.М.Феттом, который предложил измерять бw при помощи эксикаторов. Для этого проводят серию опытов, ставя параллельно 6 (не менее) эксикаторов, в которые заливают насыщенные растворы веществ, имеющие известные значения активности, близкие к ожидаемому значению в продукте. В эксикаторы над растворами на одном и том же уровне помещают сетки из полимерного материала, на которые кладут точно взвешенные образцы продукта (массой около 15-20 г). Эксикаторы помещают в термостат с температурой 250С на 24 ч, после чего образцы быстро вынимают и взвешивают, определяя степень уменьшения или увеличения массы, т.е. степени сорбции и десорбции проб.

Затем по полученным данным путем графической интерполяции устанавливают бw образца, т.е. величину, при которой наступает равновесное состояние между раствором и образцом без изменения массы последнего.

Представленная методика достаточно проста, надежна и доступна любой исследовательской лаборатории.

3.5 Белок

Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, молекулы которых построены из остатков аминокислот.

В природе существует примерно от 1010 до 1012 различных белков, содержание которых в биологических объектах зависит от ряда факторов - климатических условий, урожайности, биологических особенностей. Белки в питании человека занимают особое место. Они выполняют ряд специфических функций, свойственных только живой материи. Белковые вещества наделяют организм пластическими свойствами, заключающимися в построении структур субклеточных включений (рибосом, митохондрий и т.д.), и обеспечивают обмен между организмом и окружающей внешней средой. В обмене веществ участвуют как структурные белки клеток и тканей, так и ферментные и гормональные системы. Белки регулируют и координируют все то многообразие химических превращений в организме, которое обеспечивает функционирование его как единого целого.

Эффективность обмена белков в значительной степени зависит от количественного и качественного состава пищи. При поступлении белков (с пищей) ниже рекомендуемых норм, в организме начинают распадаться белки тканей (печени, плазмы крови и т.д.), а образующиеся аминокислоты - расходоваться на синтез ферментов, гормонов и других, необходимых для поддержания жизнедеятельности организма, биологически активных соединений. Повышенное содержание белков в составе пищи значительного влияния на обмен веществ в организме человека не оказывает, при этом избыток продуктов азотистого обмена выводится с мочой.

Состояние белкового обмена в большей степени зависит от недостатка или отсутствия незаменимых аминокислот. Клетки организма человека не могут синтезировать необходимые белки, если в составе пищи отсутствует хотя бы одна незаменимая кислота.

Средне суточная физиологическая потребность в белке в течении более чем ста лет постоянно исследуется и периодически отражается в решениях ВОЗ, ФАО и национальных организаций различных стран. Эти величины носят ориентировочный характер, так как они находятся в стадии постоянного уточнения в зависимости от возраста человека, пола, климата, индивидуальных и национальных особенностей и степени загрязнения окружающей среды. В соответствии с рекомендациями ВОЗ и ФАО величина оптимальной потребности в белке составляет 60-100 г в сутки или 12-15 % от общей калорийности пищи. В пересчёте на 1 кг массы тела потребность белка в сутки для детей, в зависимости от возраста, колеблется от 1,05 до 4,00 г.

По своему строению белки представляют собой высокомолекулярные соединения, состоящие из аминокислот. Соединенные амидной (пептидной) связью (-СО - NH) аминокислоты образуют полипептиды простого (протеина) и сложного (протеида) строения. В состав протеидов дополнительно входят небелковые вещества (липиды, углеводы и т.д.).

Известно, что в состав белков входят двадцать различных аминокислот, причем восемь из них не могут синтезироваться в организме человека и поэтому являются незаменимыми (валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин).

Полузаменимые аминокислоты синтезируются в организме, но в недостаточном количестве, поэтому частично должны поступать с пищей. К таким аминокислотам относятся аргинин, тирозин, гистидин (последняя аминокислота не синтезируется в организме детей).

Заменимые аминокислоты синтезируются в организме в достаточном количестве. Они представлены девятью аминокислотами, хотя некоторые из них можно отнести к условнозаменимым (например, тирозин образуется в организме только из фенилаланина и при поступлении последнего в недостаточном количестве может оказаться незаменимым; цистин и цистеин могут образовываться из метионина, но необходимы при недостатке этой аминокислоты).

В среднем белковые молекулы содержат (50-54) % углерода; (15-18) % азота; (20-23) % кислорода; (6-8) % водорода и (0,3-2,5) % серы.

Несмотря на огромное разнообразие аминокислотного состава белков, каждому индивидуальному белку характерен только для него строго определенный аминокислотный состав, что обусловлено генетическим кодом, сформированным в процессе эволюции.

Все протеиногенные аминокислоты являются, б - аминокислотами с характерной для них общей структурной особенностью - наличием карбоксильной и аминной групп, связанных с атомом углерода в б - положении.

Часть структуры всех аминокислот одинакова, однако функциональная группа (R - остаток) не одинаков по структуре, электрическому заряду и растворимости. От соответствующего сочетания этих групп зависят свойства белковых молекул.

В зависимости от химических свойств R-групп все протеиногенные аминокислоты подразделяются на четыре основных класса:

- неполярные (гидрофобные);

- полярные;

- отрицательно заряженные;

- положительно заряженные.

По своей стехиометрической конфигурации все аминокислоты, за исключением глицина, имеют ассиметричный атом углерода в б - положении, с которым связаны четыре разные группы (радикал, атом водорода, карбоксильная группа и аминогруппа). Таким образом, аминокислоты обладают оптической активностью (дисперсией оптического вращения).

Присутствие аминокислот, содержащих основные (- NH2) и кислые (-СООН), обуславливает амфотерные (амфолитные) свойства. Они обуславливают высокую буферность водных растворов белков, а следовательно, постоянное значение рН живой клетки. Эти свойства положены в основу методов разделения, идентификации и количественного анализа аминокислот, нашедших широкое использование при определении аминокислотного состава в белковой молекуле.

В таблице 3.1 приведены свойства протеиногенных L- б-аминокислот. Свойства аминокислот определяют функциональные свойства белков, под которыми принято понимать физико-химические характеристики, определяющие их поведение при переработке в пищевые продукты, а так же обеспечивающие желаемую структуру, технологические и потребительские свойства пищевых продуктов.

Эта область научных интересов имеет центральное значение для развития технологии переработки белка в новые формы пищи.

Таблица 3.1- Физико-химические свойства протеиногенных L- б- аминокислот

Название (тривиальное и рациональное)	Сокращённое обозначение	Удельное вращение в водном растворе 25оС [б]д	Константа кислотной диссоциации	Изоэлектрическая точка рI	Растворимость при 25оС, г на 100г воды
			рК1	рК2	рК3
1. Моноаминокарбоновые
1.1.Глицин (б-аминоуксусная)	Gly	-	-	-	-	5,970	24,990
1.2. Аланин (б-аминопропионовая кислота)	Ala	+ 1,8	2,35	9,87	-	6,000	16,510
1.3. Валин (б-аминоизовалериановая кислота)	Val	+ 6,6	2,32	9,62	-	6,000	7,040
1.4. Лейцин (б-аминоизокапроновая кислота)	Leu	- 11,0	2,36	9,60	-	6,000	0,990
1.5.Изолейцин (б-амино-в-метил-Н-валериановая кислота)	Ile	+ 12,4	2,26	9,62	-	5,900	2,230
1.6. Тирозин	Tyr	+ 11,8	2,20	9,21	10,16	7,300	0,035
1.7.Фенилаланин (б-амино-в-фенилпропионовая кислота)	Phe	- 34,5	2,20	9,31	-	3,500	1,420
2.Моноаминодикарбоновые
2.1.Аспарагиновая (б-аминоянтарная кислота)	Asp	+ 6,7	1,88	3,65	9,00	2,800	0,500
2.2.Лизин (б,е-диаминокарбоновая кислота)	Lys	+ 13,5	2,20	8,90	10,28	9,700	-
2.3.Аргинин (б-амино-д-гуанидо-валериановая кислота)	Arg	12,5	2,18	9,09	13,20	10,90	-
3.Гидрокислоты
3.1.Серин (б-амино- в-оксипропионовая кислота)	Ser	- 7,9	2,21	9,35	-	5,700	5,030
3.2.Треонин (б-амино- в-оксимасляная кислота)	Thr	-28,5	2,15	9,12	-	5,800	20,500
4.Тиаминооксикислоты
4.1.Цистеин (б-амино- в-меркапто-пропионовая кислота)	Cys	-16,5	1,71	8,33	10,78	5,000	-
4.2.Цистеин (3,3-ди-тио-бис-2аминопропионовая кислота	(Cys)2	1,4	2,01	8,02	5,00	0,011	-
4.3.Метионин (б-амино-г-метил-меткаптомасляная кислота)	Met	- 10,0	2,28	9,21	-	5,700	3,350
5.Гетероциклические аминокислоты
5.1.Триптофан (б-амино- в-индолилпропи-оновая кислота)	Trp	- 33,7	2,38	9,30	-	5,900	1,140
5.2.Гистидин (б-амино- в-имидозолилпропионовая кислота)	His	- 38,5	1,78	5,97	8,97	7,00	4,290
5.3.Пролин (пирролидин- б-карбоновая кислота)	Pro	- 86,2	1,99	10,0	-	6,300	12,300
			рК1	рК2	рК3
5.4.Гидроксипролин (б-гидроксипирролидин- в-карбоновая кислота)	Hyp	- 59,6	1,82	9,65	-	5,800	36,110

Исследование белковых фракций современным методами (хроматография, электрофорез, ультрацентрифугирование, полярография) показали, что они являются гетерогенными и состоят из субфракций, компонентов и субкомпонентов.

Белковые фракции сортов, их биотипов различаются по числу субфракций, компонентов и их соотношению. Субфракции и компоненты имеют специфический аминокислотный состав.

Все методы определения белковых веществ основаны на свойствах и составе белокобразующих аминокислот. Классификация методов представлена на рисунке 3.2

Присутствие белка в пищевых объектах устанавливается с помощью качественных реакций, которые условно разделяют на две группы: цветные реакции и реакции осаждения.

Среди первой группы наиболее распространёнными реакциями является биуретовая реакция на пептидную (амидную) связь (реакция Пиотровского) и нингидриновая реакция на б - аминокислоты, а также специфические, обусловленные присутствием в белках остатков определённых аминокислот. По результатам специфических реакций ориентировочно можно судить о пищевой ценности белков.

Суть реакции Пиотровского состоит в том, что благодаря присутствию в молекуле белка пептидной связи (-СО-NH-) амидная связь реагирует с раствором гидроксида меди, жидкость окрашивается в фиолетово-синий или фиолетово-красный цвет.

Для наблюдения реакции в пробирки наливают по 1-2см3 белка с равным количеством 4 % раствора щёлочи и добавляют 1-2 капли 0,5% раствора медного купороса.

Реакцию дают все белки, а так же продукты их гидролиза -пептоны и пептиды, начиная с тетрапептидов.

Другой качественной реакцией на белки, содержащие б - аминокислоты является нингидриновая реакция. Нингидрин в концентрации 0,1 % реагирует с равным объёмом раствора белка NН2- группами, содержащимися в б - положении при нагревании с последующим охлаждением придаёт системам синее окрашивание.

Существуют также частные реакции на белки, связанные с присутствием фенольных и гетероциклических групп.

Во второй группе реакций белки осаждают действием солей, органических растворителей, концентрированных кислот, щелочей, ионов тяжёлых металлов, температуры и в изоэлектрической точке. Белки в растворённом состоянии крайне неустойчивы, поэтому при добавлении органических растворителей (спирт, ацетон), концентрированных растворов нейтральных солей щелочных металлов и воздействий физических факторов (нагревание, облучение, ультразвук) гидратная оболочка разрушается и они выпадают в осадок.

Так как белковые вещества сырья (муки, крупы, молока, мяса), включая ферменты, часто являются определяющими в обеспечении качества пищевых изделий, то для изучения физико-химических, биохимических и физиологических свойств этих соединений обязательным условием является получение белков в индивидуальном и, по возможности, неденатурированном состоянии. Белки обычно теряют природные (нативные) свойства (растворимость, гидратацию, ферментативную активность и т.д.), подвергаясь денатурации под влиянием различных факторов.

Наиболее распространённым количественными методами являются метод Кьельдаля, Лоури с реактивом Фолина, Войвуда в модификации Т.А. Глагоревой, К.А. Мерка.

Содержание белка в пищевых объектах обычно определяют по количеству азота с использованием метода Кьельдаля. С целью упрощения и сокращения длительности анализа этот метод с момента его разработки (1983) неоднократно модифицировался с применением различных катализаторов и условий минерализации. На основе модифицированных методов созданы высокопроизводительные автоматические анализаторы типа «Кьельфос», стоимость определения содержания белка на которых и сегодня остаётся высокой.

Метод основан на минерализации навесок при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии катализаторов. Аммиак отгоняют в раствор борной кислоты и оттитровывают его 0,1н. раствором серной кислоты. Объём кислоты, пошедший на титрование, умножают на титр по азоту и узнают содержание азота в пробе.

Химическая реакция аммиака с борной кислотой идёт с образованием метаборной кислоты из ортоборной (Н3ВО3 НВО2 + Н2О). Сама борная кислота очень слабая и не оказывает влияния на концентрацию ионов водорода. Реакция идёт следующим образом: NH3 + HBO2 = NH4+ + BO2-. Полученный в результате анион ВО2- оттитровывают раствором кислоты; при этом происходит восстановление протона в боррат-анион (основание): Н+ + ВО2- = НВО2. Анион ВО2 является сильным основанием и, следовательно, его можно титровать сильной кислотой.

Существует и некоторая условность в методе Кьельдаля при расчёте количества белка, заключающаяся в использовании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля является унифицированным, он включён в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэффициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16 % азота (100:6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как её белки содержат 17,5 % азота. Для других белковых ресурсов коэффициенты перевода приняты следующими: 5,7 - рожь, ячмень, овёс, семена подсолнечника; 5,8 - соя; 6,25 - кукуруза, мясо; 6,38 - молоко.

Колориметрический метод определения белка (Метод Лоури) основан на реакции белков с реактивом Фолина, дающей синее окрашивание. Интенсивность окраски определяют на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (или на спектрофотометре при длине волны 750 нм). Количество белка в растворе находят по калибровочной кривой. Метод применяют для определения белка в растворах с концентрацией от 10 до 100мкг.

В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах. Этот метод определения белка требует для выполнения доступных реактивов и используется для определения белков в растворах, в том числе предназначенных для электрофореза.

Имеются различные методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоридом на приборе «Техникон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органического соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объёма азота (N2). В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядерном реакторе с получением изотопа 13N. Содержание белка рассчитывают по количеству гамма-лучей.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроскопии, в основе которого лежит поглощение белками света с определённой длиной волны и измерение интенсивности его отражения в пробах анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с известным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочёрный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя имеют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури.

Массовую долю белка определяют также колориметрическим методом, который основан на способности белков при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислые красители вследствие образования нерастворимого комплекса. При этом интенсивность окраски раствора уменьшается обратно пропорционально количеству белка. После удаления нерастворимого комплекса измеряют оптическую плотность раствора оставшегося красителя и по градуировочному графику определяют массовую долю белка.

Определение массовой доли белков методом формольного титрования. Этот метод применяют для контроля массовой доли белка в молоке кислотностью не более 22оС. Он основан на реакции щелочных аминогрупп белка с формалином, в результате которой высвобождаются карбоксильные кислые группы белка. При этом повышается титруемая кислотность молока. По приросту которой определяют массовую долю белка в молоке.

Для определения массовой доли белка в молоке применяют также рефрактометрический метод. Он основан на изменении показателей преломления молока и безбелковой молочной сыворотки, полученной из того же образца молока, разность между которыми пропорциональна массовой доле белка в молоке.

При изучении физико-химических свойств белков и их превращении в пищевых системах широко используют методы фракционирования и очистки от небелковых соединений. Они основаны на различии таких свойств белков, как размер молекул, растворимость заряд и сродство к специфическим химическим группам.

Общая схема операций по выделению белков сводится к измельчению биологического материала (гомогенизации), экстрагирования и собственно выделению, то есть очистки и получению белка в индивидуальном состоянии.

Осаждение белков из раствора под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Для высаливания чаще применяются сульфат аммония, под влиянием которого белки, как правило, сохраняют растворимость и ферментативную активность.

Глобулины выпадают в осадок при 50 % насыщении, альбумины при 100 % насыщении растворов солей, а при ступенчатом фракционировании (20-100 % насыщения) выпадают белки и других классов (проламины, глютелины).

В практике выделения и очистки белков используются различные типы хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная и хроматография по сродству.

Адсорбционнная хроматография основана на различиях в полярности белков. В колонке вместе с буферным раствором упаковывают адсорбент, на который в небольшом объёме растворителя наносят исследуемый образец. Компоненты разделяемой смеси адсорбируются, затем элюируются с помощью буферного раствора с увеличивающейся концентрацией или полярностью. Фракции белка собирают с помощью автоматического коллектора фракций.

В распределительной хроматографии, в отличие от адсорбционной, в качестве неподвижной фазы выступает водный слой, удерживаемый твёрдой фазой (силикагель, бумага). Разделяемые вещества многократно распределяются между водным слоем и движущейся фазой растворителя и с разной скоростью перемещаются по длине колонки или бумаге. Распределительную хроматографию на бумаге часто используют для анализа пептидов и аминокислот. Адсорбентом служат нити целлюлозы, а растворителем - смесь органических растворителей, например: бутиловый спирт - уксусная кислота - вода. Хроматограмму проявляют, высушивают и анализируют местонахождение разделяемых компонентов тем или иным способом.

Методом ионообменной хроматографии белки или аминокислоты разделяют на основе различий в общем заряде молекул. Если белок в нейтральной среде (рН 7) имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим фенольные, сульфо- и карбоксильные группы (катионообменник). Чаще всего для фракционирования белков используют производные полистерола и целлюлозы.

Положительно заряженный белок снимается с колонки с помощью раствора хлористого натрия или изменением рН элюирующего буфера. При этом ионы натрия конкурируют с положительно заряженными группами белков. Белки с меньшим положительным зарядом вымываются с колонки первыми, с большим зарядом - последними.

Хроматография по сродству (аффинная хроматография) основана на принципе избирательного связывания белков со специфическими веществами (лигандами) прикреплёнными к носителю. Лиганды (глюкозу) ковалентно присоединяют к носителю (проводя иммобилизацию) и наносят на колонку исследуемую белковую смесь. Несвязавшиеся белки удаляют соответствующим буфером, а нужный белок элюируют раствором, содержащим лиганд в очень высокой концентрации. При этом присоединённые к колонке остатки глюкозы в молекуле белка замещаются на глюкозу, находящуюся в растворе.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит заключается в пропускании белков через колонку с гелем сефадекса или других типов (агарозных, полистирольных). Применяются также пористые стеклянные шарики и пористый кварц (порасил).

Принцип методов электрофоретического разделения заключается в способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде катионов (+) или анионов (-), передвигаться в электрическом поле с определённой скоростью.

Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез, проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения.

В организме синтезируется только часть аминокислот, другие должны доставляться с пищей. Первые из них называются заменимыми, вторые незаменимыми. Заменимые аминокислоты способны заменять одна другую в рационе, так как они превращаются одна в другую или синтезируются из промежуточных продуктов углеводного или липидного обмена.

Жизнедеятельность человека обеспечивается ежедневным потреблением с пищей сбалансированной смеси, содержащей восемь незаменимых аминокислот и две частичнозаменимые. Незаменимые представлены аминокислотами с разветвлённой цепью углерода - лейцином, изолейцином и валином, ароматическими - фенилаланином, триптофаном и алифатическими - треонином, лизином и метионином. К частичнозаменимым относят аргинин и гистидин, так как в организме они синтезируются довольно медленно.

Важным понятием, характеризующим качество поступающего в организм белка, является биологическая ценность, то есть наличие незаменимых аминокислот и степень их усвоения. Чем ближе потребляемый белок по аминокислотному составу подходит к составу белков организма, тем выше его биологическая ценность.

Изучение химического состава пищевых продуктов, закономерностей метаболических превращений в организме каждого из многочисленных белковых веществ, входящих в состав продукта, выявление их участия в жизнедеятельности, а также интегрального биологического эффекта, привело к возникновению научных представлений о биологической ценности, под которой понимают относительную степень задержки азота пищи или эффективность его утилизации для поддержания азотистого равновесия, зависящая от аминокислотного состава и других структурных особенностей белков. Таким образом, термин «биологическая ценность» отражает качество белковых компонентов продукта, связанных как с перевариванием белка, так и со степенью сбалансированности его состава. Биологическая ценность может быть определена химическими и биологическими методами (например, с использованием тест-организмов).

Основываясь на понятии биологической ценности как степени соответствия состава пищи физиологическим потребностям организма, разработаны некоторые принципы биологической оценки качества продуктов питания.

Большинство исследований пришло к единому мнению, что биологическую ценность белков, независимо от использованного варианта проведения эксперимента или метода её расчёта необходимо выражать не в абсолютных, а в относительных величинах (в процентах) то есть в сравнении с аналогичными показателями, полученными с применением стандартных белков.

Химические методы исследования биологической ценности белков разрабатывались на основании результатов изучения состава белков в пищевых продуктах и установленной связи между степенью задержки азота, пищевого белка в живом организме и наличием в нём незаменимых аминокислот.

Наиболее широко используется метод Х. Митчела и Р. Блока, в соответствии с которым рассчитывается показатель аминокислотного скора (а.с.). Скор выражают в процентах или безразмерной величиной, представляющей собой отношение содержания аминокислот (а.к.) в исследуемом белке к её количеству в эталонном белке. При расчёте скора формула выглядит следующим образом:

Аминокислотный скор = , (3.8)

Аминокислота, скор который имеет самое низкое значение, называется лимитирующей аминокислотой.

Таблица 3.2 Содержание аминокислот в 1 г идеального белка

Аминокислота	Содержание, мг	Аминокислота	Содержание, мг
Изолейцин	40	Фенилаланин+тирозин	60
Лейцин	70	Треонин	40
Метионини + цистин	35	Триптофан	10
Валин	50	Всего	360

Другой метод определения биологической ценности белков заключается в определении индекса незаменимых аминокислот (ИНАК). Метод представляет собой модификацию метода аминокислотного скора и позволяет учитывать количество всех незаменимых кислот. Индекс рассчитывают по формуле:

ИНАК = ,(3.9)

где n - число аминокислот;

индексы б, э - содержание аминокислоты в изучаемом и эталоном белке соответственно.

Известны и другие химические методы, которые основаны на исследовании аминокислотного состава белка с последующим расчётом индексов биологической ценности (индексы Озера, Митчела, Корпачи).

Вышеперечисленные методы индексов и скора по стандарту, не позволяют учитывать одну из важнейших характеристик биологической ценности белка, а именно, доступность усвоения в организме аминокислот, входящих в его состав. Например, количество доступного лизина является в настоящее время наиболее ценным показателем «технологического» снижения биологической ценности белков. В литературе описаны различные способы определения доступного лизина в белковых продуктах: химические, биологические и микробиологические.

Особый интерес вызывают у исследователей такие методы определения биологической ценности белков, в которых в какой либо степени имитируются условия пищеварения в организме человека. Метод ферментативного переваривания белков протеолитическими ферментами желудочно-кишечного тракта применяется для изучения скорости расщепления белков, находящихся в составе различных пищевых продуктов.

Для изучения биологической ценности белков наибольшее применение получили биологические методы исследования, результаты которых служат основой для сравнения с данными, полученными при использовании химических методов.

Биологические методы основаны на скармливании изучаемого белка живому организму с последующим выявлением его реакции. Основными показателями оценки при этом являются привес (рост животных) за определённый период времени, расход белка и энергии на единицу привеса, коэффициенты перевариваемости и отложения азота в теле, доступность аминокислот. Биологические методы исследования биологической ценности белков можно классифицировать на росто-весовые и балансовые. Эти методы широко используют для определения различных индексов биологической ценности белков.

Росто-весовые методы основаны на учёте прибавки веса тела на единицу потреблённого белка за определённое время.

Наибольшее распространение получили, разработанные П.Осборном, методы определения коэффициента эффективности белка (КЭБ или PER), которым определяют прибавку веса тела на один грамм потреблённого белка за экспериментальный период. Для сравнения при определении показателя используют контрольную группу животных со стандартным белком - казеином. В количестве, обеспечивающем в рационе 10% белка. Методика определения КЭБ признана оригинальной в ряде стран (США, Канада).

Балансовые методы исследования биологической ценности белка основаны на определении различных реакций организма на потребляемый белок. Методы определения биологической ценности белков, основанные на данных балансовых исследований, считают наиболее точными из всех предложенных.

В настоящее время в исследовательских целях используют метод с реснитчатой инфузорией Tetrahimena pyriformis. Метод был разработан S.A. Stott и H. Smith.

Однако наибольшее распространение получил модифицированный метод определения относительной биологической ценности. В отличие от общепринятого метода Стотта и Смита предлагаемый метод значительно проще и дешевле, производительнее и легко доступен любым лабораториям, которые имеют самый необходимый минимум для проведения микробиологических исследований. Модификация сводится к следующему:

1. Используемые в анализе витамины и нуклеотиды заменяются дрожжевым экстрактом, а соли - морской солью.

2. В 10 раз уменьшается количество всех компонентов анализа (величина навески исследуемого продукта, объём инокулята и т.д.).

3. Вместо специальных плоскодонных колб Элрленмеера, занимающих много места в термостате, что существенно ограничивает производительность анализа, используются флаконы из-под антибиотиков с резиновой пробкой, имеющей срез внутреннего валика для аэрации среды. Флаконы размещают в штативе, что значительно облегчает все манипуляции с пробами.