Влияние растворов сульфатов меди и кадмия на удельную активность каталазы проростков амаранта сорта Крепыш и щирицы обыкновенной

Рисунок 2.1 ? Амарант сорта Крепыш

Сорт амаранта Крепыш - раннеспелый сорт высотой 120-140 см. По стеблю растения расположены густооблиственные побеги. Листья зеленые с красными прожилками, соцветие прямостоячее.

Рисунок 2.2 ? Щирица запрокинутая

Щирица запрокинутая - однолетнее травянистое растение, густо серовато-пушистое. Стебель растения прямой, ветвистый. Листья яйцевидно-ромбической формы, тупые, по краям волнистые и мелкозубчатые, соцветие зеленое.

2.2 Методика проращивания семян амаранта в растворах солей

Влияние тяжелых металлов на активность ферментов изучалось при проращивании семян в растворах сульфата меди(II) и сульфата кадмия с концентрациями указанными в таблице 1 в течение одних, трех и пяти суток при комнатной температуре.

Таблица 1 ? Концентрации растворов солей, используемые для интоксикации семян амаранта

Контролем служили семена амаранта, выдержанные в дистиллированной воде.

2.3 Приготовление экстрактов растворимых белков семян амаранта

Для получения экстрактов белков семян навеску материала (0.5 г) гомогенезировали в фарфоровой ступке в течение 15 мин. При температуре 0 - 5 0С. Растворимые белки экстрагировали 0,15 М раствором хлорида натрия. Полученный экстракт центрифугировали 15 мин, при 3000 оборотах/мин осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость фильтровали через слой капроновой ткани (мельничный газ) для удаления липидной пленки.

2.4 Определения белка биуретовым методом

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Биуретовая реакция белков не отличается высокой чувствительностью. Поэтому она применяется в тех случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (не ниже нескольких миллиграммов на миллилитр).

Готовили биуретовый реактив, растворяя последовательно в мерной колбе на 250мл 0,375г CuSO45Н2О и 1,5г сегнетовой соли (КООС?СНОН-СНОН - COONa4H2O) в 150мл воды. Медленно при постоянном перемешивании приливали 75мл 10-процентного раствора гидроксида натрия и доводят содержимое до 250 мл водой.

В отдельные пробирки добавляли по 0,1мл экстракта белка и 0,9 мл дистиллированной воды, затем в каждую из них приливали по 8мл биуретового реактива.

Оставляли на 30 минут при комнатной температуре, затем фотометрировали в кюветах при 540 нм с рабочей длинной 10 мм против контроля.

Определение проводили трижды, беря каждый раз новую серию стандартных растворов белка.

2.5 Метод определения удельной активности каталаз семян амаранта манометрическим методом

Метод манометрического определения удельной активности каталаз основан на определении объема кислорода, выделившегося после прибавления пероксида водорода к экстракту растений. В реакционный сосуд прибора наливали 1,5 мл ферментного препарата и 3 мл пероксида водорода 3- процентного раствора. Реакционный сосуд закрывали пробкой с трубкой.

Уровень жидкости в приборе устанавливали на нулевой отметке градуировочной бюретки. После этого реакционный сосуд встряхивали и начинали отсчет времени. Объем выделяющегося газа (Д) определяли через 3 минуты после начала реакции по изменению уровня жидкости в бюретке.

Удельную активность каталаз выражали в миллилитрах кислорода, который выделяется под действием фермента за три минуты на миллиграмм белка.

Ауд.=Д/В

Где Д - количество выделившегося кислорода (мл);

В- количество белка в пробе (мг).

Выводы по главе 2

1. Отработаны методики:

- проращивания семян амаранта в солях тяжелых металлов,

- определения белка биуретовым методом,

- определения удельной активности каталазы семян амаранта манометрическим методом,

- приготовления экстрактов растворимых белков семян амаранта.

3. Техника безопасности при работе с реактивами и оборудованием в химической лаборатории

3.1 Инструкция при работе на фотоэлектроколориметре КФК-2

1. Общие требования

1.1. К работе на фотоэлектроколориметре допускаются лица, прошедшие предварительно инструктаж.

2. Требования безопасности перед началом работы:

– одеть спецодежду;

– проверить заземление;

– проверить исправность и целостность токоведущих частей (розеток, вилок, проводов).

3. Требования безопасности во время работы:

– работа на фотоэлектроколориметре должна производиться в чистом помещении, свободном от пыли, паров кислот и щелочей;

– вблизи колориметра не должны располагаться громоздкие изделия, создающие неудобства в работе оператора;

– регулировочные работы, связанные с проникновением за постоянные ограждения к токоведущим частям колориметра, смена ламп, замена неисправных деталей, должны проводиться после отсоединения колориметра от электросети;

4. Требования безопасности по окончании работы:

– аппарат привести в исходное положение, отключить от электросети тумблером на приборе и из розетки;

– о замеченных недостатках доложить ответственному лицу.

5. Требования безопасности в аварийной ситуации:

– отключить аппарат от сети электропитания;

– сообщить заведующему кафедрой.

3.2 Работа с кислотами и щелочами

К числу крепких кислот относятся: азотная, серная, соляная, "царская водка" (смесь азотной и соляной кислот), паяльная ( раствор хлорида цинка в соляной кислоте), уксусная, щавелевая, фтористоводородная (плавиковая) и др. При попадании на кожу человека они вызывают сильные ожоги, а при попадании в глаза- потерю зрения. На коже появляются эритемы и ожоги II и III степени в зависимости от концентрации кислоты. При обширных ожогах развивается шок.

При действии паров и туманов кислот наблюдается сильное раздражение слизистой оболочки носа, насморк, иногда носовые кровотечения, а также резкая боль в горле, чихание и кашель, чувство удушья, затрудненное дыхание, спазм голосовой щели, чувство стеснения и боль в груди. Могут появиться кровавая мокрота и рвота. В дальнейшем в зависимости от концентрации кислот возникают тяжелые воспалительные заболевания бронхов и легких. Попадая через рот , кислоты вызывают ожоги губ, углов рта, языка и кожи лица. Эти ожоги в зависимости от кислоты несколько отличаются по своей окраске: при ожоге азотной кислотой - желтые, серной - черноватые; уксусной - беловатые.

Особенно тяжелые ожоги слизистой оболочки полости рта, глотки, пищевода и желудка. Пострадавшие жалуются на резкую боль в полости, за грудиной и в надчревной области. Боль сопровождается мучительной рвотой с кровью, охриплостью голоса, иногда спазмом и отеком гортани. При отравлении азотной, серной и соляной кислотами случается даже прободение желудка. Прогноз при отравлении кислотами серьезен. Из щелочей наиболее широко применяются едкий натр, каустическая сода, едкое кали, аммиак, нашатырный спирт, углекислые щелочи и др. Едкие щелочи оказывают выраженное раздражающее и прижигающее действие на кожу и слизистые оболочки. Особенно опасно попадание их в глаза. Опасность отравления обуславливается величиной поражаемой поверхности.

При действии паров едких щелочей на глаза наблюдаются резкий отек и гиперемия конъюнктивы, помутнение роговицы, поражение радужной оболочки; при попадании в глаза химические ожоги, тяжесть которых определяется их распространенностью. Возможна слепота. Если едкие щелочи попадают на кожу, развивается тяжелый химический ожег. Клиническая картина отравлений через дыхательные пути подобна той, которая развивается при воздействии кислот. При поступлении внутрь появляются ожоги губ, слизистой оболочки полости рта, пищевода и желудка, сильная жажда, слюнотечение, а затем тошнота и рвота, часто с кровью, а также кровавый понос. При этом возникает сильная боль в полости рта, желудка, кишках, невозможность глотания. Кожа холодная, наблюдается снижение сердечной деятельности и артериального давления, а затем коллапс.

Для предупреждения ожогов и раздражения слизистых оболочек при работе с кислотами и щелочами все работы нужно проводить в вытяжном шкафу, с включенной вентиляцией, используя спецодежду, очки, перчатки, и другие средства индивидуальной защиты. Концентрированные щелочи в лабораторных помещениях должны храниться в толстостенной стеклянной посуде вместимостью не более 1 л с притертыми пробками на металлических подносах. Одним из главных средств для профилактики отравлений кислотами и щелочами является строгое хранение их в специально отведенных для этих целей местах, в стандартной таре. На емкостях с кислотами и щелочами обязательно должны быть этикетки с четкими надписями с указанием концентрации в процентах. Переноска кислот и щелочей одним человеком разрешается в емкости не более 5 л с установкой в металлическое ведро. Кислоты и щелочи запрещается набирать в пипетку ртом, необходимо применять резиновую грушу, и переливание этих жидкостей следует проводить при помощи стеклянных сифонов грушей.

При приготовлении растворов кислот их следует медленно приливать в воду тонкой струей. Эту работу лучше проводить в фарфоровых стаканах, т.к. она сопровождается сильным разогреванием. Твердые щелочи следует растворить в фарфоровой посуде, медленно прибавляя к воде небольшие кусочки щелочи и непрерывно перемешивая. Кусочки щелочи следует брать только фарфоровым шпателем или фарфоровой ложкой. При дроблении кусочков щелочи надо обязательно пользоваться защитными очками или щитками. Отработанные кислоты и щелочи следует собирать раздельно в специальную посуду и только после нейтрализации (рН=6.5-8.5) сливать в специально отведенное для этих целей место.

При проливе концентрированных растворов щелочей их засыпают песком или древесными опилками, затем песок и опилки собирают в емкость с водой и нейтрализуют. Облитое место обмывают раствором уксусной кислоты. При проливе кислоты ее вначале засыпают песком, затем песок собирают в емкость и нейтрализуют, а место, где была пролита кислота, засыпают известью или содой, промывают водой и вытирают насухо [18].

Изучена техника безопасности при работе с реактивами и оборудованием в химической лаборатории.

4. Экспериментальные данные

Таблица 2 - Фактически полученные данные по результатам изменения удельной активности каталаз Концентрация 0,0001 моль/л

Таблица 3 - Содержание белка в семенах( проращивание в растворах солей) Концентрация 0,0001 моль/л

По завершению работы были составлены диаграммы, в которых отображены результаты исследований, а именно влияние растворов солей тяжелых металлов на культурный и дикорастущий виды амаранта. Проанализируем их.

Рисунок 3.1 ? Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян амаранта сорта Крепыш (А) при интоксикации растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л.

Рисунок 3.2 ? Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян щирицы запрокинутой при интоксикации растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л.

В соответствие с рисунками 3.1 и 3.2 выявлено, что раствор сульфата кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш на 16% при проращивании их в течении суток (по сравнению с контролем). Активность каталазы проростков щирицы также падает по сравнению с контролем, на 8,7 %.

При интоксикации семян исследуемыми растворами в течение трех суток установлено, что раствор сульфата кадмия снижает удельную активность семян амаранта сорта Крепыш на 4,8 % , а у семян щирицы снижается на 6,6 %.

На пятые сутки проращивания значение удельной активности фермента семян амаранта практически сходно с контролем. Так, раствор сульфата кадмия снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш на 2,6% , а удельную активность каталазы семян щирицы на 1,8 %.

Раствор сульфата меди с концентрацией 0,0001 моль/л также снижает удельную активность каталазы при проращивании семян в течение одних суток. Отмечено уменьшение удельной активности каталазы семян амаранта сорта Крепыша на 19,2%, а семян щирицы на 9,8% по сравнению с контролем.

Обработка семян амаранта этим раствором в течение трех суток изменяет удельную активность каталазы семян амаранта сорта Крепыш всего лишь на 6,9%, а семян щирицы на 5%.

На пятые сутки исследования отмечено, что удельная активность каталазы проростков практически схожа с контролем. Так, раствор сульфата меди снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш на 5% а семян щирицы на 4%.

Кроме того, в ходе исследования отмечено, что вышеназванные растворы практически не влияли на развитие проростков: семена прорастали с одинаковой скоростью.

Таким образом, можно сделать вывод, что происходит постепенная адаптация проростков к воздействию растворов сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л, так как удельная активность каталазы прорастающих семян приближается к контролю.

Семена щирицы лучше адаптируется к стрессу. Также не отмечено влияние природы металлов на адаптацию.

Рисунок 3.3 ? Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян амаранта сорта Крепыш (А) при интоксикации растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,001 моль/л.

Рисунок 3.4 ? Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян щирицы при интоксикации расторами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,001 моль/л.

Анализ рисунков 3.3 и 3.4 показывает, раствор сульфата кадмия с концентрацией 0,001 моль/л снижает удельную активность каталазы при проращивании их в течении одних суток на 31% по отношению к контролю. Активность каталазы проростков щирицы также падает по сравнению с контролем на 25,5 %. Проращивание семян в течение трех суток в растворе сульфата кадмия вызывает снижение удельной активности семян амаранта сорта Крепыш на 15,2 % , а щирицы на 14,7 %. На пятые сутки интоксикации отмечено, что удельная активность прорастающих семян щирицы меньше отличается от контроля (на 5,5%) чем у крепыша (на 12,9%). Что также может свидетельствовать о большей устойчивости дикорастущего вида.

Раствор сульфата меди с концентрацией 0,001 моль/л также снижает удельную активность каталазы. Удельная активность каталазы в прорастающих семенах амаранта сорта Крепыш по сравнению с контролем падает на 35,6%, а у проростков щирицы снижается на 28,4 % при проращивании в течение одних суток. При проращивании семян в течение трех суток в растворе сульфата меди(II) удельная активность семян амаранта сорта Крепыш снижается на 21,1 % , а у щирицы - на 18,2 %. На пятые сутки исследования отмечено, что в растворе сульфата меди удельная активность прорастающих семян амаранта сорта Крепыш снижается на 17,4%, а у семян щирицы на 7,1 %.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что прорастающие семена Крепыша не адаптируются к стрессорам. Также, не происходит адаптации к стрессорам и у семян щирицы. Исследования показали, что прорастание семян в растворах сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,001 /л идет дольше, но при этом лучшие результаты отмечены у семян щирицы.

Рисунок 3.5 ? Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян амаранта сорта Крепыш при интоксикации их растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,01 моль/л.

Рисунок 3.6 ? Изменение удельной активности каталазы прорастающих семян щирицы при интоксикации их растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,01 моль/л.

В соответствие с анализом рисунков 3.5 и 3.6 выявлено, что более концентрированный раствор сульфата кадмия (0,01 моль/л) снижает удельную активность каталазы семян амаранта сорта Крепыш на 50 % по отношению к контролю при интоксикации семян в течение суток. Активность каталазы проростков щирицы также падает по сравнению с контролем, на 49,6 %. На третьи сутки проращивания отмечена адаптация, раствор сульфата кадмия снижает удельную активность семян амаранта сорта Крепыш на 43 % , а амаранта сорта щирица превышает удельную активность каталазы на 1,4%. На пятые сутки раствор сульфата кадмия снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш на 44,1% , а у щирицы на 43 %.

Раствор сульфата меди также снижает удельную активность. Удельная активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш в течение одних суток по сравнению с контролем падает на 53,7 %, а удельная активность каталазы проростков щирицы снижается на 52,7%. На третьих сутках раствор сульфата меди снижает удельную активность семян амаранта сорта Крепыш на 52,7 % , а амаранта сорта Щирица повышает на 4,6 %. На пятые сутки семяна практически не прорастают. Так, раствор сульфата меди снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш 48,7% и снижает удельную активность семян сорта Щирица на 48 %.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что прорастающие семена Крепыша не адаптируются к стрессорам.

Также, не происходит адаптации к стрессорам и у семян щирицы, так как, несмотря на то, что удельная активность каталазы превышает контроль, на пятые сутки отмечается резкое падение удельной активности по отношению к контролю. Согласно закону Селье, это может свидетельствовать об истощении организма в целом.

Выводы по главе 4

1 Исследовано влияние растворов сульфатов меди(II) и кадмия на удельную активность каталаз прорастающих семян амаранта в зависимости от концентрации и от продолжительности воздействия стрессоров. Отмечен сходный характер влияния сульфатов на удельную активность каталазы проростков амаранта, наблюдается угнетающее действие.

2 Установлена различная устойчивость каталаз прорастающих семян Крепыша и щирицы к действию данных стрессоров. Дикорастущий вид лучше адаптируется к стрессорам по сравнению с культурным сортом.

Литература

1. Алексеев, Ю.В. Тяжелые металлы в почвах и растениях / В. Ю. Алексеев. ? Л.: Агропромизд., 1987. - 142 с.

2. Алехина Н.Д. Физиология растений. Учебник для студентов вузов./Н.Д. Алехина, Ю.В. Балнокин, В.Ф. Гавриленко и др ? М.: Издательский центр «Академия», 2005, 640 с.

3. Анисимов. А.А. Основы биохимии: Учебник для студентов биологической специальности университетов / А.А. Анисимов, А.Н. Леонтьева, И. Ф. Александрова и др. ; под общ. ред. А.А. Анисимова. - М.: Высшая школа, 1986. - 551

4. Варфоломеева С.Д. Химическая энзимология / С.Д. Варфоломеева. - М.: Академия, 2005. - 480с.

5. Гусев, В.Д. Обзор рода Amaranthus в СССР : Амарант в СССР : [пер. с англ.] / В.Д. Гусев. - Ботанический журнал, Т.57, №5, 1972.-457-464 с.

6. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. - М. : Иностранная литература, 1996. - 814 с

7. Ежедневный познавательный журнал [Электрон. ресурс] - Режим доступа http://shkоlаzhizni.ru/wоrld/аrtiсlеs/16618/ - 25.12.17.

8. Ермолаев М.В. Биологическая химия / М.В. Ермолаев. - М.: Медицина, 1983. - 288с.

9. Жизнь растений. В 6?ти т. Гл. ред. чл. кор. АН СССР, проф. Федоров, А.А. Т. 2. Грибы. Под.ред. проф. Горленко, М.В. / М В. Горленко. - М.: Просвещение, 1976. - 479 с.

10. Иванов, В.Б. Сравнение влияния ТМ на рост корня в связи с проблемой специфичности и избирательности их действия / В.Б. Иванов, Е.И. Быстрова, И.В. Серегин // Физиология растений. - 2003. - 454 с.

11. Иванова, Елена Михайловна. Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса: диссертация кандидата биологических наук / Иванова Елена Михайловна, 2005 - 125 с.

12. Иваченко, Л.Е. Методы изучения полиморфизма ферментов сои: учебное пособие / под редакцией Л. Е. Иваченко [и др.]. - Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2008. - 142 с

13. Ильин, В.Б. Тяжелые металлы в системе почва - растения / В. Б. Ильин,И. Л. Илевенская. - Новосибирск : Наука. 1991. ? 148 с.

14. Кадмий [Электрон. ресурс] - Режим доступа http://www.pharmacognosy.com.ua/index.php/makro-i-mikro-chudesa/kadmiy-ubijtsa-immuniteta-ili-stimulator-rosta/kadmiy-dlya-rasteniya-razrushitel - 23.12.17.

15. Карапетьянц, М.Х. Общая и неорганическая химия / М.Х. Карапетьянц, С.И. Дракин - М.: Химия, 1992. - 125c.

16. Классификация ферментов [Электрон. ресурс] - Режим доступа http://5ка.рф/catalog/view.download/33/1956- 20. 03.18.

17. Медведев С.С. Физиология растений: Учебник. - СПб.: Изд-во С.- Петерб. ун-та, 2004. - 336 с.

18. Меры безопасности при работе с химическими веществами и оказание первой доврачебной помощи.

19. Петров, Б.А. Минеральное питание растений. Справочное пособие для студентов и огородников/ Б.А. Петров, Н.Ф. Селиверстов: Екатеринбург, 1998. -79с.

20. Полевой В.В. Физиология растений: Учеб. для биол. спец. вузов. - М.: Высш. шк., 1989. - 464 с.

21. Пятыгин, С.С. Стресс у растений: физиологический подход Журнал общей биологии / Пятыгин, С.С., 2008 - 298 с. - 20.12.17.

22. Свойства ферментов [Электрон.ресурс] - Режим доступа , http://dendrit.ru/page/show/mnemonick/svoystva-i-klassifikaciya-fermentov/ - 24.12.17.

23. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1990, 212 с.

24. Трофимцова И.А. Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. Материалы ХII международной конференции (Ялта, 6-10 июня 2016г.). (ВНИИССОК), Ялта, 2016. № 12. С. 154-157. (РИНЦ)/ Трофимцова И.А, Мартыненко Н.В , 2016 - 154 - 157с.

25. Тяжелые металлы как фактор экологической опасности: Методические указания к самостоятельной работе по экологии для студентов 3 курса дневной формы обучения / Составитель: Ю.А. Холопов. - Самара:СамГАПС, 2003. - 16 с.

26. Удивительный мир растений [Электрон.ресурс] - http://www.valleyflora.ru/fermenty-i-prevrashcheniye-veshchestv.html - 20.05.18.

27. Усманов И.Ю., Рахманкулова З.Ф., Кулагин А.Ю. Экологическая физиология растений: Учебник. - М.: Логос, 2001. - 224 с

28. Фитопатология / П.Н.Головин, М.В. Арсеньева, З.Н. Халеева, З.И. Шестиперова; Под ред. М.В. Горленко. - Л.: Колос. Ленингр. отд-ние, 1980. - 319 с.

29. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы: пер. с англ. / П. Фридрих. - М. : Мир, 1986. - 374 с.

30. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений: Учебное пособие. Изд. С.-Петерб. ун-та, 2002, 240 с.

31. Ягодин, Б.А. Агрохимия / под редакцией Б.А. Ягодина [и др.]. - М.: Колос, 2002. - 584 с.

Приложение А

Рисунок 1 - График зависимости содержания белка в пробе (мг) от показателя преломления

Размещено на Allbest.ru