Метаболическая организация окислительных путей у дрожжей Yarrowia Lipolytica – продуцентов органических кислот

Полученные результаты позволяют предположить следующий механизм биосинтеза кетокислот (рис. 4). При лимитировании роста дрожжей тиамином происходит нарушение метаболического потока через тиамин-зависимые ферменты главных путей катаболизма глюкозы и глицерина. Блокирование пируватдегидрогеназного комплекса делает реакцию окислительного декарбоксилирования пирувата узким звеном метаболизма и приводит к экскреции пирувата. Однако, полного блокирования пируватдегидрогеназного комплекса не происходит, и реакция образования ацетил-КоА продолжает функционировать, хотя и с меньшей скоростью, обеспечивая синтез 2-оксоглутарата в ЦТК. Образовавшийся 2-оксоглутарат не окисляется в дальнейших реакциях ЦТК из-за повреждения 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, вызванного дефицитом тиамина. Результатом разомкнутости цикла на уровне 2-оксоглутаратдегидрогеназы является экскреции в среду кетоглутарата.

Из-за нарущения метаболического потока на уровне трех ферментов, на наш взгляд, клетки испытывают недостаток в восстановительных эквивалентах, что сказывается на работе дыхательной цепи. То есть создается эффект “голодания” по углероду (состояние II по Чансу) (Мецлер, 1980). Для поддержания жизнедеятельности в этих условиях клетки вынуждены активизировать начальные этапы катаболизма глюкозы или глицерина, чтобы получить как можно больший выход энергии именно на этих этапах. Об этом свидетельствуют данные об увеличении активности ряда ферментов первичного окисления глюкозы или глицерина и начальных этапов ЦТК при переходе клеток в фазу активного синтеза кетокислот.

Ресинтез оксалоацетата в этих условиях, вероятно, осуществляется посредством функционирования пируваткарбоксилазной реакции. Определение активности пируват- и ФЭП-карбоксилаз в клетках Y. lipolytica 704 в период роста на глюкозе показало, что ФЭП-карбоксилаза отсутствует, образование оксалоацетата путем гетеротрофной фиксации СО2 осуществляется только вследствие функционирования пируваткарбоксилазы. Активность этого фермента имеет определенную связь с активностью другого анаплеротического пути - глиоксилатного цикла. Участие глиоксилатного цикла в этих процессах практически исключается, т.к. активность изоцитрат-лиазы была низкой.

Рассмотренные выше данные позволяют сделать следующее заключение. Тиамин-ауксотрофные дрожжи Y. lipolytica являются перспективными продуцентами органических кислот - КГК и ПВК. Сверхсинтез кетокислот является результатом возникающего дисбаланса между продолжающимся в клетке активным катаболизмом источника углерода и резким падением активности пируватдегидрогеназы и 2-оксоглутаратдегидрогеназы, вызванным дефицитом доступного кофермента тиаминдифосфата.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Пентозофосфатный путь: Р-5-Ф-рибозо-5-фосфат, Кс-5-Ф - ксилулозо-5-фосфат, С-7-Ф - седогептулозо-7-фосфат, Э-4-Ф - эритрозо-4-фосфат, ГА-3-Ф - глицеральдегид-3-фосфат

Ферменты: ГК - глицеролкиназа; Г-3-Ф-ДГ - глицерол-3-Ф-дегидрогеназа (ФАД- и НАД-зависимая); Г-6-Ф -ДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; ФГДГ - фосфоглюконат-дегидрогеназа; ТК - транскетоолаза; ГК - глицеролкиназа; Г-3-Ф ДГ - глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа; ПВК ДГ - пируватдегидрогеназа; ЦС - цитрат-синтаза; ПВКК пируваткарбоксилаза; МДГ - малатдегидрогеназа

Рис. 4. Механизм биосинтеза кетокислот у Y. lipolytica

Биосинтез лимонной кислоты на разных источниках углерода. Ранее в работах сотрудников ИБФМ РАН показано, что условием сверхсинтеза лимонной кислоты (ЛК) является лимитирование роста дрожжей минеральными компонентами среды - азотом, фосфором, серой или магнием при одновременном содержании в среде избыточного количества источника углерода (Глазунова, 1977; Илларионова, 1977; Финогенова, 1982). Процесс образования ЛК является трехфазным процессом: в первой фазе происходит активный рост культуры и потребление лимитирующего компонента среды, в это время кислоты практически не образуются. Интенсивный синтез кислот начинается после cнижения содержания азота ниже порогового уровня (100 мг/л) и перехода культуры в фазу замедленного роста и далее - в стационарную фазу роста. Синтез кислот продолжается до тех пор, пока в среде присутствует источник углерода, и клетки продуцента остаются жизнеспособными и достаточно активными. Последнее определяется условиями культивирования: pH среды, температурой, аэрацией среды кислородом, составом макро- и микроэлементов. Из-за ауксотрофности Y. lipolytica по пиримидиновому компоненту молекулы тиамина в среду культивирования необходимо вводить избыточные количества тиамина (Мунтян, 1971).

Сравнительными опытами нами показана зависимость биосинтеза ЛК непосредственно от потребляемого источника углерода. Природный штамм Y. lipolytica 704 выращивали в идентичных условиях на средах с разными источниками углерода (этанол, подсолнечное масло, глюкоза и глицерин). Сводные данные представлены в табл. 9. Соотношение продуцируемых кислот ЛК и ее изоформы - трео-Ds-изолимонной кислоты (ИЛК) определяется потреблением С-источника: в средах с подсолнечным маслом и этанолом образуются примерно равные количества ЛК и ИЛК (соотношение ЛК:ИЛК = 1,1:1 - 1,24:1), в то время как в среде с глюкозой и глицерином накапливается преимущественно ЛК (соотношение ЛК:ИЛК = 4,9:1 - 7,7:1 для глицерина и глюкозы, соответственно).

Анализ активности ключевых ферментов биосинтеза ЛК и ее дальнейшего превращения представлен в табл. 10. При росте на всех источниках углерода активность цитратсинтазы значительно превышала активности последующих ферментов цикла: аконитатгидратазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы. Очень высокая по сравнению с другими ферментами активность цитратсинтазы, по-видимому, может быть объяснена следующим: в экспоненциальной фазе роста избыточная активность цитратсинтазы компенсируется потребностями клеток в ацетил-КоА для биосинтетических целей. Когда же в условиях дефицита азота процессы биосинтеза снижаются, то процесс расщепления цитрата также тормозится и он экскретируется из клетки, т.к. не может быть полностью метаболизирован в ЦТК из-за сравнительно низких активностей последующих ферментов.

Таблица 9. Кислотообразование природного штамма Y. lipolytica 704 на разных источниках углерода

Таблица 10. Активность ферментов (мкмоль/мин мг белка) у Y. lipolytica при росте в среде с различными С-источниками в условиях лимитирования роста азотом

На всех субстратах активность б-кетоглутаратдегидрогеназы резко понижена по сравнению с активностью предшествующих ферментов, что, очевидно, вызвано тем, что б-кетоглутарат частично идет на биосинтез глютамата и для дегидрирования той его части, которая подвергается дальнейшему метаболизму в ЦТК, требуется гораздо меньшее количество фермента.

При росте Y. lipolytica на глюкозе и глицерине активно функционирует пируваткарбоксилаза. При ассимиляции этанола и подсолнечного масла анаплеротический ресинтез оксалоацетата осуществляется благодаря функционированию глиоксилатного цикла. На масле также обнаружена более высокая в сравнении с “глюкозными” и “глицериновыми” клетками активность цитратсинтазы. Увеличение активности цитратсинтазы при ассимиляции масла, очевидно, связано с дополнительным участием цитратсинтазной реакции в глиоксилатном цикле.

Соотношение накапливаемых кислот (ЛК и ИЛК) определяется, по-видимому, соотношением активностей ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы, НАД-изоцитратдегидрогеназы и изоцитрат-лиазы. Повышение активности цитратсинтазы и понижение активности аконитат-гидратазы в дрожжевой клетке приводит к преимущественному накоплению ЛК, в то время как высокая активность аконитатгидратазы при одновременно низкой активности изоцитратдегидрогеназы приводит к экскреции как ЛК, так и ИЛК. Изоцитрат-лиаза в период преимущественного сверхсинтеза ЛК должна быть высокой и обеспечивать ресинтез оксалоацетата. Роль аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы в образовании лимонных кислот обсуждалась и в работах других исследователей (Akiyma et al. 1973; Matsuoka et al. 1980; Финогенова, 1982). Если наше представление относительно роли аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы в синтезе кислот справедливо, то, создавая мутантные штаммы с подавленной активностью аконитат-гидратазы, но в то же время высокой активностью изоцитрат-лиазы, можно добиться преимущественного синтеза ЛК.

При комбинированном воздействии ультрафиолетового облучения и N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина на клетки природного штамма Y. lipolytica 704 были получены 1500 колоний, из которых на селективных средах с цитратом (ослаблен рост), сукцинатом (есть рост) и малатом (есть рост) селекционированы мутанты, среди которых мутант N 15 с высокой активностью цитратсинтазы и низкой активностью аконитат-гидратазы. У мутанта изоцитрат-лиаза на всех субстратах была высокой и не репрессировалась глюкозой. Мутант изменял соотношение лимонных кислот в сторону преимущественного накопления ЛК на всех субстратах (табл. 11).

Таким образом, соотношения активностей основных ферментов ЦТК строго закономерны и определяются интенсивностью функционирования связанных с ним метаболических путей (в частности, глиоксилатного цикла) и скоростью использования интермедиатов цикла в анаболических реакциях. Регуляция соотношений активностей ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла происходит, по-видимому, главным образом, путем контроля синтеза ферментов и зависит от природы С-источника.

Исследование внутриклеточного содержания АТФ, АДФ, АМФ, НАД+ и НАДН в условиях лимитирования роста клеток азотом и сверхсинтеза ЛК показало, что в фазе активного роста дрожжей происходит резкое снижение содержания адениновых нуклеотидов и НАД+ (табл. 12). Содержание НАДН изменяется незначительно в течение всего процесса культивирования. Аналогичное снижение содержания адениновых нуклеотидов в период экспоненциального роста наблюдалось и в грибах Neorospora crassa (Slayman, 1973).

Таблица 11. Кислотообразование мутантного штамма Y. lipolytica 704 на разных источниках углерода

Таблица 12. Концентрация нуклеотидов у Y. lipolytica в условиях лимитирования роста источником азота

Дрожжи выращивали в минеральной среде Ридер, в качестве источника углерода использовали глюкозу (20 г/л). Расчет концентраций проводился на основе полученных результатов и литературных данных по содержанию внутриклеточной воды у дрожжей, согласно которым 1 мг сухого веса клеток соответствует 4 мкл воды (Botcham and Ratledge, 1979).

Снижение уровня АТФ может быть обусловлено тем, что активный рост клеток требует повышенных энергетических затрат на биосинтетические цели. Снижение уровней АТФ и АМФ может быть объяснено либо отставанием скорости синтеза этих соединений от скорости роста и деления клеток, либо наличием регуляторного механизма, направленного на поддержание энергетического гомеостаза клетки. Снижение уровня НАД+ по мере перехода культуры в фазу замедленного роста может быть обусловлено снижением окислительной активности клеток. Переход дрожжей в фазу замедленного роста, вызванный исчерпанием азота из среды культивирования, связан с замедлением биосинтетических процессов, а дальнейший выход в стационарную фазу - с их полной остановкой. Изменения в содержании адениновых нуклеотидов в период синтеза ЛК приводят к резкому увеличению соотношения АТФ/АМФ, которое играет важную регуляторную роль в клетках микроорганизмов (Atkinson, 1977; Knowles, 1977).

Очистка и свойства НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Разработанная нами процедура очистки НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ) состояла из четырех стадий. Как видно из табл. 13, после первых двух стадий удалось избавиться от значительного количества балластных белков (общий белок снизился более чем в 18 раз при 67% выходе НАД-ИЦДГ). В процессе гидрофобной хроматографии НАД-ИЦДГ связывалась с октил-сефарозой при концентрации сульфата аммония 2 М. После промывки колонки и выхода несвязавшихся белков, фермент элюировали 1 М раствором сульфата аммония. На заключительном этапе фермент очищали с помощью гель-фильтрации на колонке с сефарозой-CL4B. В результате НАД-ИЦДГ была очищена в 129 раз с выходом 31%; гомогенный препарат фермента имел удельную активность 22 мкмоль/мин мг белка.

Свойства ИДГ. Молекулярный вес порядка 400 кДа. Фермент состоит из 8 идентичных по молекулярной массе. Октамерами являются и НАД-ИЦДГ из пекарских дрожжей (Barnes et al. 1972) и дрожжей Rhodosporidium toruloides (Evans, Ratledge, 1985).

Таблица 13. Очистка НАД+-зависимой изоцитратдегидрогеназы из Y. lipolytica

Максимальную активность в 100 мМ калий-фосфатном буфере НАД-ИЦДГ проявляла при pH=7,2 -7,6. В глициновом буфере (100 мМ) pH-оптимум был сдвинут в щелочную область (8,5 - 9,0). Фермент термолабилен. При прогревании НАД-ИЦДГ в течение 10 мин при температуре выше 300 С происходила быстрая инактивация.

Для выявления возможных регуляторов НАД-ИЦДГ было проверено влияние ряда метаболитов на активность фермента. Ключевые интермедиаты ЦТК (оксалоацетат 10 мМ, цитрат 10 мМ, сукцинат 10 мМ, фумарат 10 мМ, малат 10 мМ, глиоксилат 10 мМ, 2-оксоглутарат 10 мМ, глутамат 10 мМ) оказывали слабое влияние на активность НАД-ИЦДГ. Примечательно отсутствие ингибирования фермента 2-оксоглутаратом.

Отсутствие ингибирования фермента промежуточными метаболитами выявило необходимость детального изучения регуляции НАД-ИЦДГ нуклеотидами, пулы которых, по нашим данным, претерпевают существенное изменение при культивировании Y. lipolytica в условиях сверхсинтеза органических кислот. Для изучения влияния нуклеотидов определяли кинетические параметры фермента. Расчет производился с помощью компьютерной программы.

Для определения параметров фермента по отношению к НАД+ измеряли активность фермента в зависимости от концентрации НАД+. Все остальные компоненты брались в избытке. Расчет производился по уравнению Хилла. Константа Михаэлиса для НАД+ составила 136 мкМ. Коэффициента Хилла равен 1,06, что говорит об отсутствии кооперативности при связывании субстрата реакции НАД+ с ферментом.

При определении кинетических параметров НАД-ИЦДГ по отношению ко второму субстрату - изоцитрату, необходимо учитывать возможное влияние АМФ на его связывание с ферментом. Корнбергом и Прайсом установлено, что НАД-ИЦДГ дрожжей обнаруживает абсолютную потребность в АМФ (Kornberg and Pricer, 1959). Дальнейшие исследования показали, что НАД-ИЦДГ содержит аллостерический центр для связывания АМФ и взаимодействие АМФ с этим центром повышает сродство фермента к изоцитрату (Evans and Ratledge, 1985; Gabriel and Plaut, 1990).

Нами было проведено измерение активности фермента в зависимости от концентрации изоцитрата при отсутствии и наличии АМФ (1 мМ и 0,025 мМ) в реакционной среде (рис. 5). Расчет производился по уравнению Уэбба, в котором заложена возможность анализа влияния эффектора на связывание субстрата с ферментом.

Константа Михаэлиса для изоцитрата в отсутствии АМФ равна 581 мкМ. АМФ усиливает сродство фермента к изоцитрату, не влияя на Vmax. НАД-ИЦДГ обладает низким сродством к эффектору АМФ (Kа = 995 мкМ). По нашему мнению, в условиях сверхсинтеза лимонных кислот, когда пул АМФ существенно снижается, это факт имеет принципиальное значение. Однако, необходимо учитывать полученные данные об отсутствии влияния АМФ на фермент при концентрациях изоцитрата более 1 мМ. Коэффициент Хилла для изоцитрата и АМФ равен 4,164 и 1,991, соответственно, что свидетельствует о высокой кооперативности при связывании изоцитрата и АМФ с ферментом.

Согласно литературным данным, сильным ингибитором НАД-ИЦДГ дрожжей (даже при насыщающих концентрациях АМФ и изоцитрата) является АТФ (Evans and Ratledge, 1985). При исследовании, проведенном ранее на частично очищенном ферменте из Y. lipolytica также было показано ингибирующее действие АТФ на НАД-ИЦДГ (Соколов с соавт. 1995). Однако в этой работе использовались концентрации АТФ (до 10 мМ), которые значительно превосходят физиологические концентрации АТФ (табл. 12), рассчитанные нами на основе экспериментальных данных для клеток Y. lipolytica. В наших исследованиях сравнение кинетических параметров фермента в двух экспериментах (без АТФ и с добавлением АТФ) выявило отсутствие ингибирующего воздействия АТФ. Ингибирование не наблюдалось и в эксперименте по изучению зависимости активности НАД-ИЦДГ от концентрации АМФ при разных концентрациях АТФ. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что регуляция НАД-ИЦДГ у Y. lipolytica осуществляется in vivo не соотношением АТФ/АМФ, а уровнем АМФ в клетке.

В проводимых ранее исследованиях с дрожжами показано, что НАДН является важным регулятором активности НАД-ИЦДГ (Evans and Ratledge, 1985; Соколов с соавт. 1995). Ингибирование происходит из-за снижения скорости диссоциации комплекса фермент-НАДН что в свою очередь определяется соотношением НАД/НАДН в клетке. В случае с Y. lipolytica показано также, что НАДН является сильным ингибитором. Он уменьшает сродство фермента к НАД+, действуя как конкурентный ингибитор. Константа связывания для НАДН равна 63 мкМ, т.е. фермент обладает большим сродством к конечному продукту реакции, нежели к субстрату. На основании этого, очевидно, что регуляция НАД-ИЦДГ в клетках дрожжей может осуществляться изменением соотношения НАДН/НАД+. Увеличение этого соотношения in vitro приводило к полному ингибированию фермента.

Очистка и свойства цитратсинтазы. Метод очистки цитратсинтазы состоит из трех стадий: высаливания сульфатом аммония, гидрофобной и ионообменной хроматографии, процедура суммирована в табл. 14. На стадии высаливания происходит освобождение от значительного количества белка. Отмечено снижение содержания общего белка в 7 раз, выход фермента составляет 77%. В ходе гидрофобной хроматографии, где в качестве носителя использовалась октил-сефароза, основная часть балластного белка сходила острым пиком, когда элюция велась 0,5 М сульфатом аммония в 0,1 М калий-фосфатном буфере. Цитратсинтаза элюировалась 0,1 М калий-фосфатным буфером. Выход фермента после этой стадии составил 28%. Значительная очистка фермента достигалась на стадии ионообменной хроматографии. Используя ДЭАЭ-сефарозу в качестве носителя, удалось увеличить удельную активность цитрат-синтазы с 26,3 до 161,2 мкмоль/мин на 1 мг белка. Согласно литературным данным удельная активность цитратсинтазы, которую удалось достичь в ходе очистки цитратсинтазы из липидных дрожжей Candida 107 (Boulton and Ratledge, 1980), составляет 22,3 Ед./мг белка, выход - 56%, степень очистки 34. Сходная с полученной нами удельная активность очищенного фермента из пекарских дрожжей - 160 Ед./мг белка, при этом выход составляет 5,7% (Parvin and Atkinson, 1968).

Свойства цитратсинтазы. Выделенная нами цитратсинтаза имеет молекулярную массу порядка 70 кДа и состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой порядка 40 кДа. Сходную молекулярную массу имеет фермент из Penicillium spiculisporum (Mahlen, 1972). Молекулярная масса цитратсинтазы из Aspergillus niger равна 80 кДа (Kubicek and Rohr, 1978).

Исследование термостабильных свойств цитратсинтазы показало, что фермент выдерживает инкубацию при 50 0С в течение 10 мин, сохраняя 90% активности, прогрев до 60 0С и более ведет практически к полной потере активности.

Таблица 14. Очистка цитратсинтазы из дрожжей Y. lipolytica

Цитратсинтаза более активна при щелочных значениях pH. Максимальную активность фермент проявляет при pH=8,5. Такой же оптимум pH для фермента из A. niger (Kubicek and Rohr, 1978). Цитратсинтаза из липидных дрожжей Candida 107 (Boulton and Ratledge, 1980) и из E. coli (Weitzman, 1969) максимально активна при pH = 8,0. Для цитратсинтазы из пекарских дрожжей отмечается широкий диапазон pH=7,0 - 8,0 (Parvin and Atkinson, 1968; Weitzman and Danson, 1976), в котором фермент проявляет высокую активность, со слабым максимумом при pH=7,5. Цитратсинтаза Y. lipolytica, как и фермент из других источников, обладает большим сродством к ЩУК, чем к ацетил-КоА (Km для ЩУК равна 5 мкМ, для ацетил-КоА - 10 мкМ). Несмотря на то, что, согласно Вейтзман и Дансон (Weitzman and Danson, 1976) у дрожжей не наблюдается ингибирования цитратсинтазы никотинамидными нуклеотидами, мы показали ингибирование фермента из Y. lipolytica 1 мМ НАДН на 10% и 1 мМ НАДФН на 45%. Также как и у традиционных продуцентов ЛК A. niger (Kubicek et al. 1995) АТФ ингибирует цитратсинтазу Y. lipolytica, а цитрат в концентрации 10-15 мМ ингибирует активность очищенного фермента на 50% и в концентрации 50 мМ - на 80%.

Биохимический механизм сверхсинтеза органических кислот у Y. lipolytica. Очевидно, что для процесса синтеза лимонных кислот из глюкозы важно обеспечение высокой концентрации глюкозы и создание потока углерода через гликолиз (рис. 6). Одна из ключевых реакций гликолиза катализируется 6-фосфофруктокиназой (ФФК) (К.Ф. 4.1.2.13). ФФК является ключевым регуляторным ферментом гликолиза практически у всех организмов, включая дрожжи (Salas et al. 1965), и увеличение концентрации цитрата по механизму отрицательной обратной связи ингибирует активность ФФК и, в целом, снижает скорость трансформации субстрата через гликолиз.

Проведенное нами исследование регуляторных свойств частично очищенной ФФК у Y. lipolytica - продуцентов лимонных кислот в сравнении с C. maltosa (дрожжами-непродуцентами) показало, что ФФК у Y. lipolytica была менее чувствительна к ингибированию цитратом по сравнению с дрожжами-непродуцентами. Подобная устойчивость ФФК к действию цитрата не отмечалась ни для традиционных продуцентов лимонных кислот A. niger, ни для липидных дрожжей (у которых цитрат является предшественником в биосинтезе липидов) (Habison et al. 1983; Evans and Ratledge, 1984). Ионы NH4+ (10 мМ) существенно повышали активность ФФК у Y. lipolytica (в 3 раза) и эффективно противодействовали ингибирующему действию цитрата. АТФ в концентрации 5 мМ не оказывал ингибирующего действия на активность ФФК, однако при совместном действии с цитратом ингибирующий эффект высоких концентраций АТФ резко возрастал.

Однако понимание механизма синтеза ЛК у Y. lipolytica не может быть полностью сведено только к нерегулируемости ФФК цитратом. Факт активного синтеза лимонных кислот при росте на этаноле, н-алканах и маслах (исключающих участие ФФК) свидетельствует как раз о том, что механизм сверхсинтеза лимонных кислот не может быть сведен только к особой регулируемости одного из ферментов гликолиза.

Рис. 6. Биохимический механизм синтеза лимонной кислоты у Y. lipolytica

На основании полученных данных может быть предложен следующий механизм сверхсинтеза органических кислот у Y. lipolytica. В условиях лимитирования роста источником азота изменяется энергетическое состояние клеток - резко снижается уровень АМФ, АДФ и НАД, в результате чего происходит возрастание соотношений АТФ/АМФ и НАДН/НАД+, что приводит к накоплению в этих условиях энергетических и восстановительных эквивалентов. Такая ситуация, в первую очередь, приводит в блокировке ЦТК на уровне НАД-ИЦДГ. Первоначальным фактором, определяющим снижение активности этого фермента выступает падение содержания АМФ, который является аллостерическим активатором этого фермента и к которому НАД-ИЦДГ имеет низкое сродство. В условиях накопления изоцитрата этот эффект может нивелироваться. Однако в результате происходящего далее повышения соотношения НАДН/НАД+ происходит усиление ингибирования фермента. В результате этого образуются избыточные количества изоцитрата и, через аконитазное равновесие,цитрата и выделение этих метаболитов из клетки.

Напротив, в условиях лимитирования роста дрожжей тиамином клетки находятся в состоянии низкой обеспеченности энергетическими и восстановительными эквивалентами. НАД-ИЦДГ активна вследствие высокого содержания в клетках АМФ и низкого соотношения НАДН/НАД+, а также отсутствия ингибирующего воздействия 2-оксоглутарата. Блокирование метаболического потока осуществляется на уровне тиаминзависимых ферментов: 2-оксоглутаратдегидрогеназы и пируватдегидрогеназы. Поэтому в среду культивирования выделяются пируват и 2-оксоглутарат.

Надмолекулярная организация ЦТК.

После разрушения эукариотических клеток и последующего дифференциального центрифугирования ферменты обнаруживаются как в различных фракциях осадка, так и в надосадочной жидкости. Надосадочная жидкость содержит так называемые "растворимые" ферменты, т.е. ферменты, которые могут быть экстрагированы водными растворами в виде отдельных единиц, сохраняющих каталитическую активность. Относительная легкость выделения и кристаллизации сделала эти белки популярными объектами исследований, и большая часть наших сведений о структуре и функциях ферментов получена именно при изучении растворимых ферментов.

Согласно современным представлениям, ферменты ЦТК внутри нативных митохондрий способны связываться между собой и с поверхностью мембран, образуя высокоорганизованные комплексы (Srere, 1985). Для обозначения комплексов, объединяющих ферменты одного метаболического пути, П. Шрере предложил термин метаболон (Srere, 1985; Robinson and Srere, 1985). Организация ферментов в метаболоны дает клетке некоторые кинетические преимущества в сравнении с системой со свободными ферментами (Welch, 1977; Spivey, Merz, 1989). Одно из возможных преимуществ состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических последовательностях.

Изучение регуляции цитратсинтазы Y. lipolytica в условиях in situ. Как показано в предыдущих разделах, дрожжи Y. lipolytica в условиях лимитированного роста могут накапливать в среде 100 г/л ЛК и более. Активный транспорт для цитрата у Y. lipolytica не обнаружен (Кулаковская с соавт., 1993; 1994). Если же цитрат транспортируется из клетки способом простой или облегченной диффузии, то в условиях сверхсинтеза внутриклеточная концентрация цитрата может достигать значительных величин. Это может ингибировать активности ферментов, участвующих в синтезе цитрата. В частности, нами показано, что цитрат в концентрации 10 - 15 мМ ингибирует активность очищенной цитратсинтазы (ЦС) на 50%, а в концентрации 50 мМ - на 80%. Если бы внутри клетки концентрация цитрата была такой же, как в среде культивирования, ЦС проявляла бы лишь небольшую часть от максимальной активности. В таких условиях эффективный синтез цитрата вряд ли был бы возможен. Также нами было показано ингибирование очищенного препарата ЦС из Y. lipolytica АТФ.

Очевидно, что внутри клетки существуют определенные защитные механизмы, предохраняющие ферменты от ингибирующего действия высоких концентраций метаболитов. Было сделано предположение о том, что внутриклеточное микроокружение ЦС делает ее менее чувствительной к ингибирующему влиянию интермедиатов ЦТК. Для проверки этого предположения было проведено сравнительное изучение кинетических свойств ЦС в условиях in vitro и in situ (с пермеабилизованными клетками).

Показано, что ЦС пермеабилизованных клеток менее чувствительна к ингибирующему влиянию цитрата и АТФ, по сравнению с ферментом в бесклеточном экстракте. В условиях in situ цитрат в концентрации 300 мМ ингибировал ЦС только на 50 % , в то время как в условиях in vitro цитрат в концентрации 50 мМ ингибировал ЦС на 80 %. Ингибирующий эффект АТФ на ЦС пермеабилизованных клеток был также менее выражен.

Подобные эффекты не могли быть объяснены изменениями кинетических свойств ЦС в условиях in situ. Км для ацетил-КоА очищенной ЦС и фермента в пермеабилизованных клетках составляла 5 и 7 мкмоль соответственно; Км для оксалоацетата в условиях in situ была в 4 раза выше, чем в очищенном препарате и составляла 40 мкмоль. Следовательно, в клетке возможно существование структурно-физиологической организации ферментов ЦТК по типу метаболона.

Связывание цитратсинтазы с внутренней мембраной митохондрий.

В данном разделе работы нами продемонстрирована способность ЦС, выделенной из Y. lipolytica, связываться с внутренней мембраной митохондрий этих дрожжей. Сорбция ЦС из раствора на “вывернутые” субмитохондриальные частицы СМЧ и митопласты оценивалась посредством измерения активности ЦС в указанных препаратах. После инкубации мембран с раствором ЦС, 61% ЦС осаждалось с препаратом СМЧ. Связывание фермента с СМЧ является специфичным, так как ЦС не взаимодействовала с интактными митопластами, т.е. с внешней стороной внутренней мембраны. На специфичность связывания ЦС с СМЧ указывало и то, что оно практически не изменялось с увеличением ионной силы и pH среды.

Кроме физико-химических подходов, для демонстрации связывания ЦС с СМЧ был использован иммунноцитохимический метод (рис. 7). СМЧ последовательно обрабатывали в растворе ЦС, в растворе первичных антител и вторичных антител, меченных коллоидным золотом. Метка коллоидного золота обнаруживалась на мембранах СМЧ, предварительно инкубированных с ЦС. В качестве контроля препараты мембран, не обработанные ЦС, инкубировали с антителами; на этих препаратах частицы коллоидного золота не обнаруживались.

Таким образом, полученные результаты показывают, что ЦС внутри митохондрий может находится не в свободной форме в растворе, а способна связываться с внутренней мембраной, сохраняя при этом свою специфическую активность.

Рис.7. Связывание ЦС с внутренней мембраной митохондрий

А- схема мечения ЦС антителами с частицами коллоидного золота

Б - электронная микроскопия СМЧ с метками коллоидного золота

Фермент-ферментные взаимодействия между цитратсинтазой и малатдегидрогеназой в полиэтиленгликоле. Необходимо отметить, что существует ряд методологических проблем в демонстрации фермент-ферментных взаимодействий. Большинство этих взаимодействий очень слабо, и это часто приводит к разрушению метаболонов во время изоляции комплекса при сильном разбавлении или изменениях в ионной силе буфера.

Целью данного раздела работы являлось изучение возможности образования комплекса между митохондриальными ферментами ЦС и малат-дегидрогеназы (МДГ) в присутствии неионного детергента - полиэтиленгликоля (ПЭГ). Использование растворов неионных полимеров, таких как ПЭГ, моделирует условия митохондриального матрикса. Для регистрации фермент-ферментного взаимодействия между ЦС и митохондриальным или цитоплазматическим изоферментами МДГ (мМДГ или цМДГ, соответственно) применяли метод фронтальной равновесной гель-фильтрации в ПЭГ. Колонка Superdex S-200 была уравновешена 10 мM калий фосфатным буфером (pH=8,0), содержащим 10 % ПЭГ. На колонку наносили мМДГ, объем фронтальной элюции мМДГ составлял 15 мл (рис. 8). Затем колонку уравновешивали с тем же буфером, содержащим 0,2 мг/мл ЦС. На колонке, уравновешенной ЦС, объем фронтальной элюции мМДГ понижался до 5 мл. То есть мМДГ элюировалась в объеме, соответствующем белку с большей молекулярной массой, чем молекулярная масса свободного фермента. Это позволяло предположить образование комплексов между молекулами ЦС и мМДГ. Аналогичные эксперименты были проведены с цМДГ, комплексов между ЦС и цМДГ не образовывалось, цМДГ элюировались в одном и том же объеме вне зависимости от отсутствия или присутствия ЦС на колонке.

Рис. 8. Влияние ЦС на профили элюции в присутствии 10% ПЭГ мМДГ (А) и цМДГ (B) на колонке Superdex 200, уравновещщеной фосфатным буфером с ЦС. Колонка Superdex 200 была калибрована с помощью молекулярных маркеров (1 - тироглобулин (669 кДа), 2 - апоферритин (443 кДа), 3 - ЦС (100 кДа) и 4 - миоглобин (17,6 кДа) в присутствии 10% ПЭГ (С). Стрелки указывают объем элюции калибровочных белков в 100 мМ фосфатном буфере без ПЭГ

Таким образом, снижение объема фронтальной элюции мМДГ в присутствие ЦС демонстрирует специфическое взаимодействие между мМДГ и ЦС. Необходимо отметить, что ферменты, по-видимому, формируют комплексы, состоящие из нескольких молекул. Объем элюции мМДГ в присутствие ЦС был меньше, чем объем элюции калибровочного белка с наибольшей молекулярной массой - тироглобулина (М.м.=669 кДа).

Также было проведено изучение комплексов ЦС/МДГ в ПЭГ, образцы комплексов ЦС/МДГ (с концентрациями белков 2 мг/мл) инкубировали в средах с различными концентрациями ПЭГ (0-30%) и ионной силы (10 мМ KH2PO4 или 200 мМ KH2PO4) в течение 2 мин. После этого диссоциацию комплекса ЦС/МДГ оценивали как уменьшение плотности суспенции при 650 нм (рис. 9). Следует отметить, что комплексы ЦС/МДГ быстро диссоциируют при инкубации без добавления ПЭГ (ОП при 650 нм быстро понижается). Однако, когда твердо-фазную суспензию ЦС/МДГ инкубировали в присутствии 30% ПЭГ при низкой ионной силе (10 мМ KH2PO4) изменения в мутности суспензии не было обнаружено. Увеличение в ионной силе (200 мМ KH2PO4) при 30% ПЭГ вызывало диссоциацию комплекса ЦС/мМДГ.

Чтобы показать кинетические преимущества комплекса ЦС/МДГ, ассоциированного в ПЭГ, мы использовали два фермента - “ловушки” - аспартат-аминотрансферазу (ААТ) и оксалоацетат-декарбоксилазу (OAДК). Общим субстратом для этих ферментов является оксалоацетат (ОАА), следовательно в сопряженных реакциях ААТ и ОАДК могут конкурировать за субстрат с ЦС.

Однако в течение первых 2-х мин (время, требуемое для кинетических измерений) большинство комлексов ЦС/мМДГ (около 90 %) находились в твердо-фазном состоянии даже при высокой ионной силе. Аналогичные эксперименты провели с комплексом ЦС/цМДГ, и также было показано, что твердо-фазные комплексы ЦС/цМДГ были стабильны в присутствии 30% ПЭГ даже при высокой ионной силе. Такие условия делают возможным изучать кинетические свойства этих комплексов.

Рис. 9. Влияние концентрации ПЭГ и ионной силы на диссоциацию комплексов между ЦС и мМДГ (А) и ЦС и цМДГ (В)

Схема конкурентных взаимоотношений МДГ/ЦС, ААТ и OAДК за ОАА представлена на схеме:

Рис. 10. Схема конкурентных взаимоотношений между МДГ/ЦС, ААТ и ОАДК за ОАА

В сопряженных системах мы проверяли полноту превращения малата до цитрата через OAА, катализируемое ферментами МДГ и ЦС. Сначала в реакционную смесь, содержащую малат, НАД, глутамат, ацетил-КоА и ЦС/мМДГ или ЦС/цМДГ добавляли избыточное количество ААТ. Затем тот же эксперимент повторяли с ОАДК. Следующее соотношение ферментов было использовано во всех экспериментах: 1:2:50 для ЦС-МДГ-ААТ или ЦС-МДГ- OAДК. Концентрации ферментов - 0,2 Ед./мл ЦС, 0,4 Ед./мл мМДГ или цМДГ и 10 Ед./мл ААТ или OAДК. Начальная скорость сопряженной реакции в 20% ПЭГе была в 4 раза меньще по сравнению с реакционной смесью без ПЭГ (контроль). Концентрация ПЭГ, изоформы МДГ (мМДГ или цМДГ) и ионная сила показывали различное кинетическое поведение сопряженных систем ЦС/мМДГ и ЦС/цМДГ с ААТ. В случае реакционной смеси без ПЭГ (т.е. когда не образуется фермент-ферментного комплекса МДГ/ЦС), скорость сопряженной реакции (т.е. образование коэнзима А), была снижена до 26 - 28% от контроля в присутствии ААТ, что демонстрировало хорошее улавливание ОАА ферментом-ловушкой. В 30% ПЭГ, скорость сопряженной реакции снижалась только на 40% в присутствии ААТ для комплекса ЦС/мМДГ, и только - на 78 % в комплексе ЦС/цМДГ (рис. 10).

Рис. 10. Влияние ААТ и ОАДК на сопряженную реакцию, катализируемую мМДГ или цМДГ

Результаты свидетельствовали о том, что ОАА не выходил в реакционную смесь из комплекса, образуемого мМДГ и ЦС, а передавался с одного фермента на последующий. Следовательно, можно предположить наличие субстратного канала для ОАА внутри комплекса мМДГ/ЦС. В тоже время, внутри комплекса цМДГ/ЦС ОАА не удерживался и мог быть захвачен ферментом-ловушкой. То есть в данной системе субстратный канал для ОАА между цМДГ и ЦС отсутствовал.

Увеличение ионной силы (добавлением KН2PO4 до концентрации 200 мM) приводило к 3-х кратному снижению скорости сопряженной реакции с ААТ в комплексе ЦС/мМДГ. При высокой ионной силе ОАА, образованный в маладегидрогеназной реакции, не передавался на активный центр ЦС, а выходил в раствор и превращался в реакции с ААТ. Это могло свидетельствовать о том, что субстратный канал для ОАА внутри комплекса ЦС/мМДГ имеет электростатическую природу. Подобные результаты были получены и с другим ферментом - “ловушкой” - OAДК.

Можно было предположить, что причина снижения чувствительности ЦС/мМДГ к ферментам - “ловушкам” заключается в том, что диффузия OAA из ферментных комплексов в ПЭГ затруднена. Однако мы показали, что твердо-фазный комплекс ЦС/цМДГ проявляет такую же чувствительность к AAT и ОАДК, как и свободные ферменты. Поэтому можно сделать вывод, что внутри комплекса, образуемого ЦС и мМДГ существует специфический субстратный канал, по которому ОАА передается с активного центра одного фермента на активный центр другого без выхода в раствор. Это может предоставлять клетке кинетические преимущества, так как субстрат одного метаболического пути не может быт захвачен ферментами другого пути и выведен из метаболического потока.

Субстратный канал для ОАА внутри слитого белка ЦС-МДГ. Возможность существования субстратного канала для ОАА между ЦС и МДГ была подтверждена нами при изучении слитого белка, содержащего два дрожжевых митохондриальных фермента ЦС и МДГ.

Был сконструирован рекомбинантный белок (рис. 11), в котором С-конец ЦС был слит с N-концом МДГ. Полученная плазмида pODC29/ЦС1/МДГ1 кодировала последовательность из шести гистидиновых остатков СS1, линкер (Gly-Ser-Gly) и MDH1. Для наработки фьюжн-протеина вектор pODC29/ЦС1/МДГ1 был трансформирован в E. coli BL21/DE3.

Рекомбинантный белок ЦС/МДГ был очищен с помощью хроматографии на никель-агарозе и последующей гель-фильтрации. Удельные активности в очищенном препарате составляли 71 мкмоль/мин мг белка для ЦС и 910 мкмоль/мин мг белка для МДГ.

Наличие пространственной близости между ЦС и МДГ в слитом белке позволяло предположить формирование комплекса между ферментами и, как следствие, возникновение внутри этого комплекса субстратного канала для ОАА.

Сопряженную реакцию проводили также, как в случае с комплексами ферментов в ПЭГ. Слитый белок был менее чувствителен к влиянию ААТ по сравнению со свободными ферментами (рис. 12). При проведении сопряженной реакции в условиях высокой ионной силы кривые зависимости скорости реакции от коцентрации ААТ были практически одинаковы как для слитого белка, так и для свободных ферментов. Полученные результаты могут служить подтверждением предположения о наличие электростатического канала для ОАА внутри комплекса, образуемого ЦС и МДГ.

Рис. 11. Схема конструирования слитого фьюжен-белка ЦС/МДГ

Метаболические эффект дислокализации цитрат-синтазы в клетках дрожжей. В клетках млекопитающих ЦС, по-видимому, локализована исключительно в митохондриях. В клетках дрожжей и растений, второй изофермент, локализованный в пероксисомах, вовлечён в глиоксилатный цикл (ГЦ) - анаплеротический путь ЦТК. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae, активности митохондриальной и внемитохондриальной ЦС кодируются определёнными ядерными генами, CIT1 (Suissa, Sude, Schatz, 1984) и CIT2 (Kim, Rosenkrantz, Guarente, 1986; Rosenkrantz et al. 1990), соответственно. Пероксисомальная локализация Сit2p опосредована наличием С-терминального трипептида SKL (Lewin, Hines, Small, 1990; McCammon et al. 1990; Singh, Small, Lewin, 1992). Белок Cit1p, на 81%, идентичный по аминокислотному составу Cit2p, имеет на С-конце трипептид SKN, который определяет митохондриальную локализацию белка. Кроме того, показано, что третий ген СIT3 кодирует вторую митохондриальную изоформу ЦС у S. cerevisiae, но условия функционирования и экспрессии cit3p не были объяснены (Jia, Becam, Herbert, 1997). Мутант, с делецией гена CIT2 абсолютно жизнеспособен и не проявляет каких-либо особых фенотипических отличий от родительского типа. Мутант, лишенный CIT1 не растёт в среде с ацетатом в качестве единственного источника углерода. Это представлялось неожиданным, поскольку внутренняя мембрана митохондрий обеспечена транспортёром цитрата (Chapell and Haaroff, 1967), который позволяет Cit2р заменить Cit1p.

Рис. 12. Влияние ААТ на сопряженную реакцию, катализируемую свободными ферментами ЦС и МДГ и слитым белком ЦС/МДГ

Целью данного раздела работы было дальнейшее изучение идеи о мультиферментном комплексе внутри ЦТК и оценка способности изоферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но имеющих структурное различие, функционировать в альтернативных клеточных компартментах и метаболических путях. Мы исследовали способность белка Сit1p, обычно обнаруживаемого в митохондриях, функционировать в цитозоле, и способность белка Сit2p, обычно обнаруживаемого в пероксисомах, функционировать в митохондриях. Более того, мы очистили белки Сit1p, Сit2p и Mdh1р с тем, чтобы проверить способность Сit1p и Сit2p взаимодействовать in vitro с митохондриальной малатдегидрогеназой (Mdh1р) в твердо-фазном комплексе в присутствии ПЭГ, как это было проведено с коммерческими ферментами в предыдущем разделе.

Дрожжевые null-мутанты Дcit1 и двойной мутант Дcit1Дcit2 были не способны расти в среде, содержащей ацетат в качестве единственного источника углерода. Путем трансформации в них встроены плазмиды: pRS-C-CIT1 кодирует нативный белок Cit1p; pRS-C-дLSCIT1- белок Cit1p без SKN, ответственной за локализацию в митохондрии; pRS-Е-дLSCIT1- мультикопийный Cit1 без SKN; pRS-C-LSCIT2дSKL - белок Cit2p без SKL, pRS-C-LSCIT2SKN - белок Cit2p с SKN вместо SKL.

Селекцию трансформантов проводили в синтетической полной среде с глюкозой без триптофана и проверяли их на способность к росту в среде с ацетатом (рис. 13). Трансформант не восстанавливал способности к росту на ацетате при экспрессии CIT2, не способной проникать в митохондрии, 2) При экспрессии в мутантном штамме CIT2 с лидерной последовательностью способность к росту на ацетате восстанавливалась.

Рис. 13. Способность плазмид-несущих конструкций восстанавливать рост мутантных штаммов на среде с ацетатом

Описанные выше результаты показали, что цитозольный белок Cit2p, когда локализован в митохондриях, способен метаболически подражать митохондриальному белку Cit1p. Согласно идеи мультиферментого комплекса ЦТК, эти данные позволяют предположить, что как Cit2p, так и Cit1p, могут встраиваться в этот комплекс.

Для проверки способности дрожжевых ферментов ЦС, митохондриальной (Cit1p) и цитозольной (Cit2p) локализации, взаимодействовать с дрожжевой митохондриальной МДГ (Mdh1p) в присутствии ПЭГ, кодирующие области генов CIT1, CIT2, и MDH1 клонировали в бактериальный вектор pPROEX-1 (где они были встроены в рамку считывания с 5?конца в последовательность, кодирующую шесть последовательных гистидиновых остатка). Все три гистидин-меченных белка были экспрессированы в бактериях и очищены на никель-агарозе. Как показано на рис. 14, как Cit2p, так и Cit1p, взаимодействовали с Mdh1p в присутствии 14% ПЭГ, и это даёт основание предположить, что пероксисомальная изоформа ЦС, при дислокации в митохондрии, может принимать участие в работе мультиферментного комплекса ЦТК.

Способность двух изоферментов ЦС замещать друг друга внутри пространственной структуры требует того, чтобы эти два белка проявляли высокое структурное сходство их внешней поверхности. На рис. 15 представлены молекулярные поверхности изоформ ЦС в трёх различных положениях. На этих моделях чётко видно, что два изофермента имеют высокое сходство в структуре внешней поверхности, так, что они почти неразличимы друг от друга. Существует подавляющее сходство между двумя электростатическими профилями этих двух изоферментов.

Рис. 14. Способность Cit2p взаимодействовать с Mdh1p в ПЭГ

Смеси белков, содержащих 0,2 мг/мл либо Mdh1p или БСА (в качестве негативного контроля) инкубировали в присутствии избыточных количеств Cit1p или Cit2p в течение 1 ч при 10 0 С в 500 мМ фосфатном буфере (pH=7,0), содержащем 14% ПЭГ. Мутность суспенции была оценена спектрофотометрически при 650 нм.

Рис.15. Структура поверхностей и электростатические заряды ЦС1 и ЦС2

Красные области - положительно-заряженные участки; синие - отрицательно

Каждый белок представлен в трех ориентациях, полученных последовательным вращением молекул на 90 0. Стрелка указывает на активный центр.

Одно из возможных преимуществ организации ферментов в метаболоны состоит в том, что непосредственная близость ферментов, ответственных за последовательные шаги метаболического пути, увеличивает утечку интермедиата именно через этот путь и предотвращает выход интермедиата в раствор, где он может быть использован другими ферментами в других метаболических путях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлены пути метаболизма триглицеридов и продуктов их гидролиза у дрожжей Y. lipolytica. Первым этапом вовлечения триглицеридов в метаболизм является их гидролиз внеклеточными липазами. Продукты гидролиза триглицеридов - жирные кислоты и глицерин потребляются клетками одновременно. Вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорилирования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы.

2. Изучены механизмы регуляции сверхсинтеза органических кислот у

Y.lipolytica. Ключевая роль отводится регуляции НАД- изоцитратдегидрогеназы уровнем АМФ и соотношением НАДН/НАД+. Лимитирование роста дрожжей азотом приводит к остановке биосинтеза азотсодержащих соединений и снижению их содержания в клетке. В результате этого происходит возрастание соотношений АТФ/АМФ и НАДН/ НАД+, что свидетельствует о повышенном обеспечении клеток энергетическими и восстановительными эквивалентами и блокировке изоцитратдегидрогеназы. В результате образуются значительные количества лимонных кислот в клетке и выделение этих метаболитов в культуральную жидкость. При лимитировании роста тиамином клетки находятся в состоянии низкой обеспеченности энергетическими и восстановительными эквивалентами. Блокирование метаболического потока осуществляется на уровне тиаминзависимых ферментов: 2-оксоглутарат-дегидрогеназы и пируватдегидрогеназы, в среду выделяются кетокислоты.

3. Липаза (КФ 3.1.1.3), глицеролкиназа (КФ 2.7.1.30), НАД+-зависимая изоцитратдегидрогеназа (КФ 1.1.1.41) и цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7) Y. lipolytica выделены, очищены и охарактеризованы. Исследованы механизмы регуляции этих ферментов интермедиатами ЦТК. Показано, что свойства цитратсинтазы в условиях in vitro и in situ существенно различаются; фермент in situ оказался более устойчивым к ингибирующему воздействию цитрата и АТФ.

5. Установлены новые принципы метаболической организации дрожжей. Между ферментами существуют фермент-ферментные взаимодействия. Такие взаимодействия выявлены между двумя последовательными ферментами ЦТК - цитратсинтазой и малатдегидрогеназой. Фермент-ферментный комплекс образует электростатический субстратный канал для оксалоацетата. На примере пероксисомальной цитрат-синтазы впервые показана важность третичной структуры фермента для его функционирования в составе метаболона.

6. Ферменты ЦТК способны связываться как между собой, так и с внутренней мембраной митохондрий, образуя надмолекулярные комплексы (метаболоны). Такая организация метаболического пути способствует 1) формированию субстратных каналов, при котором субстраты передаются от одного фермента к последующему без выхода в раствор; 2) созданию микроокружения, в котором концентрация субстратов существенно повышается и 3) эффективной и направленной регуляции клеточного метаболизма.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзоры

1. Anasstasiadis S., Morgunov I.G., Kamzolova S.V., Finogenova T.V. Citric acid production patent review // Recent Patents on Biotechnology. 2008. V. 2. N 3. P. 103-120.

2. Anasstasiadis S., Kamzolova S.V., Morgunov I.G. and H.J. Rehm. Comparative study of the effect of iron on citrate-producing yeast growing on different substrates // In: Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology. Eds. Antonio Mendez-Vilas. 2007.V. 1. P. 308-314.

3. Финогенова Т.В., Моргунов И.Г., Камзолова С.В., Чернявская О.Г. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41. N 5. C. 478-486.

Статьи в рецензируемых журналах

4. Ермакова И.Т., Моргунов И.Г. Пути метаболизма глицерина у дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica // Микробиология. 1988. Т. 57. N 4. C. 533-537.

5. Моргунов И.Г., Ермакова И.Т. Механизм биосинтеза пировиноградной кислоты из глицерина дрожжами Yarrowia lipolytica // Микробиология. 1989. Т. 58. N 1. С. 26-30.

6. Моргунов И.Г., Ильченко А.П., Шарышев А.А. Ферменты метаболизма глицерина у дрожжей Candida lipolytica // Биохимия. 1991. Т. 56. N 2. С. 258-266.

7. Ильченко А.П., Фаусек Е.А., Моргунов И.Г., Шишканова Н.В., Финогенова Т.В. Возможные пути окисления этанола в клетках дрожжей Candida lipolytica // Микробиология. 1994. Т. 63. N 3. С. 442-449.

8. Моргунов И.Г., Шарышев А.А., Микулинская О.В., Соколов Д.М., Финогенова Т.В. Выделение. очистка и некоторые свойства цитрат-синтазы дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica - продуцентов лимонной кислоты // Биохимия 1994. Т. 59. N 9. С. 1320-1329.

9. Моргунов И.Г., Ильченко А.П. Выделение, очистка и некоторые свойства глицеролдегидрогеназы // Биохимия. 1995. Т. 60. N 6. С. 883-891.