Кінетичні властивості плазматичної мембрани гладеньком’язових клітин

8. На підставі тлумачення результатів кінетичного аналізу, проведеного в рівноважному режимі, запропоновано кінетичну модель можливого механізму реакції Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР, який передбачає наявність на ферменті двох окремих центрів зв'язування для іонів Mg та вільного АТР^4- (реальний субстрат).

Список робіт за темою дисертації

1. Данилович Г.В., Костерін С.О. Ідентифікація та характеристика “базальної” Са²⁺-незалежної Mg²⁺-залежної АТР-гідролазної ферментативної активності у фракції плазматичних мембран гладеньком'язових клітин // Укр. біохім. журн. -2001. - Т. 73, № 6. - С. 30-40.

2. Данилович Г.В. Вплив еозину Y на Са²⁺-незалежну Mg²⁺-залежну АТР-азну активність плазматичних мембран гладеньком'язових клітин // Укр. біохім. журн. -2004. - Т. 76, № 2. - С. 48-52.

3. Данилович Г.В., Костерін С.О. Кінетичні закономірності перебігу та можливий механізм реакції Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР у фракції плазматичних мембран гладеньком'язових клітин // Укр. біохім. журн. -2004. - Т. 76, № 6. - С. 142-150.

4. Данилович Г.В., Грузина Т.Г., Ульберг З.Р., Костерін С.О. Ідентифікація та каталітичні властивості Mg²⁺-залежної АТР-гідролази цитоплазматичної мембрани Bacillus sp. В4253, здатних до накопичення золота // Укр. біохім. журн. -2004. - Т. 76, № 5. - С. 45-51.

5. Данилович Г.В. “Базальна” Mg²⁺-АТР-азна активність у сарколемі гладеньком'язових клітин та деякі її характеристики // Тези доповідей ІІІ з'їзду Українського біофізичного товариства з міжнародною участю. - Львів. - 2002. - С. 110.

6. Данилович Г.В. Вплив неспецифічних інгібіторів транспортних АТР-аз на “базальну” Mg²⁺-АТР-азну активність сарколеми міометрія // Матеріали VIIІ Українського біохімічного з'їзду. Чернівці. - Укр. біохім. журн. -2002. - Т. 74, № 4а. - С. 37.

7. Danylovych H.V. Effect of eosin Y on the kinetic parameters of Mg²⁺-dependent hydrolysis of ATP in the plasma membrane of myometrial cell // II международный симпозиум “Физиология и биофизика гладких мышц”. - Киев, Украина. - Нейрофизиология.- Т.35.- № 3/4.- 2003. - С. 339.

8. Данилович А.В. Механизм действия эозина Y на Mg²⁺-зависимый ферментативный гидролиз АТР в плазматической мембране клеток миометрия // ІII съезд биофизиков России. Тезисы докладов. - Воронеж. - 2004. - С. 206-207.

9. Данилович Ганна. Кінетична інтерпретація можливого механізму реакції гідролізу АТР, яка каталізується “базальною” Mg²⁺-АТРазою плазматичної мембрани гладеньком'язових клітин // Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології. Тези доповідей. - Львів. - 2004. - С. 241.

Анотація

Данилович Г.В. Кінетичні властивості Mg²⁺-залежної АТРази плазматичної мембрани гладеньком'язових клітин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню кінетичних, каталітичних властивостей та механізму реакції Mg²⁺-залежного гідролізу АТР, що каталізується “базальною” Mg²⁺-АТРазою плазматичної мембрани клітин міометрія.

Із використанням флуоресцентного зонду 9-аміноакридину, дигітоніну та протонофору СССР показано, що “базальна” Mg²⁺-АТРаза сарколеми, яка є резистентною до дії оуабаїну, азиду натрію та тапсигаргіну, здатна забезпечувати утворення рН на плазматичній мембрані.

Виявлено лінійну залежність між активністю “базальної” Mg²⁺-АТРази та збільшенням рН в діапазоні 6,0-8,0.

“Базальна” Mg²⁺-АТРазна активність сарколеми міоцитів ефективно інгібується еозином Y (К_і=45,30±14,50 мкМ) та о-ванадатом (К_і=1,35±0,28 мМ). В основі кінетичного механізму впливу еозину Y лежить зниження максимальної початкової швидкості реакції ферментативного гідролізу АТР, визначену як за Mg²⁺, так і за АТР, а також зменшення спорідненості Mg²⁺-АТРази до Mg²⁺ і АТР. Виявлено тенденцію до стимуляції Mg²⁺-АТРазної активності сперміном, спермідином та путресцином в концентраціях 0,05-10 мМ у середньому на 20-30 %.

На підставі результатів кінетичного аналізу, проведеного в рівноважному режимі, запропоновано модель можливого кінетичного механізму Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР, який передбачає існування на ферменті двох окремих центрів зв'язування іонів Mg та вільного АТР^4-.

Аннотация

Данилович А.В. Кинетические свойства Mg²⁺-зависимой АТРазы плазматической мембраны гладкомышечных клеток. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертационная работа посвящена исследованию кинетических и каталитических свойств, а также механизма реакции Mg²⁺-зависимого гидролиза АТР, катализируемого “базальной” Mg²⁺-АТРазой плазматической мембраны клеток миометрия.

С использованием флуоресцентного зонда 9-аминоакридина, дигитонина и протонофора СССР показано, что “базальная” Mg²⁺-АТРаза сарколеммы, резистентная к действию оуабаина, азида натрия и тапсигаргина (11,8±1,2 мкмоль Р_і/мг белка в час) обеспечивает образование трансмембранного протонного градиента.

Величины константы активации ионами Mg K_Mg и константы Михаэлиса K_m для АТР равны 286,7±27,6 та 48,5±8,0 мкМ соответственно, а величины начальной максимальной скорости гидролиза для Mg²⁺ V_Mg и для АТР V_ATP равны 34,6±4,3 та 33,1±4,8 мкмоль Р_і/мг белка в час соответственно.

Показано, что во фракции плазматических мембран в присутствии ионов Mg гидролизуется АТР, CTP, GTP и UTP. Катионы Ca²⁺ > Mg²⁺ > Co²⁺ > Cd²⁺ > Mn²⁺ Zn²⁺ Ni²⁺ > Sr²⁺ активируют гидролиз АТР. Величина Mg²⁺-АТРазной активности не изменялась при изотонической замене в среде инкубации одновалентных катионов или анионов и не зависела от химической природы аниона в составе магниевой соли (Cl^- или SO₄^2-).

Показано, что активность Mg²⁺-АТРазы возрастает линейно с увеличением рН в диапазоне 6,0-8,0.

“Базальная” Mg²⁺-АТРазная активность эффективно ингибируется эозином Y (К_і=45,30±14,50 мкМ) и о-ванадатом (К_і=1,35±0,28 мМ). В основе кинетического механизма действия эозина Y лежит снижение начальной максимальной скорости реакции гидролиза АТР V_Mg и V_ATP, а также уменьшение сродства ферментативной системы к ионам Mg и АТР^4-.

В присутствии спермина, спермидина и путресцина в физиологических (до 1 мМ) и выше (до 10 мМ) концентрациях наблюдалась тенденция к стимуляции Mg²⁺-АТРазной активности в среднем на 20-30 %.

На основании результатов кинетического анализа, проведенного в равновесном режиме, предложена модель возможного кинетического механизма Mg²⁺-зависимого ферментативного гидролиза АТР, который предполагает существование двух отдельных центров связывания для ионов Mg и свободного АТР^4-.

Полученные данные расширяют современные представления о свойствах реакции “базального” Mg²⁺-зависимого гидролиза АТР в плазматической мембране гладкомышечных клеток и возможной роли этой реакции в обеспечении электро- и фармакомеханического сопряжения в миометрии.

Summary

Danylovych H.V. Kinetic properties of smooth muscles plasma membrane Mg²⁺-dependent ATPase.- Manuscript.

The thesis for PhD scientific degree in biology by speciality 03.00.04 - biochemistry. O.V. Palladin Institute of Bochemistry of Ukraine NAS, Kyiv, 2005.

The dissertation is devoted to the study of kinetic and catalytic properties and mechanism of Mg²⁺-dependent enzymatic hydrolysis of ATP, caused by “basal” Mg²⁺-ATPase of uterus smooth muscle's plasma membrane.

The fluorescent zond 9-aminoacridine, digitonin and protonofor CCCP application has shown that sarcolemmal “basal” Mg²⁺-ATPase (11,2±1,2 mol P_i/mg of protein per 1 hour) provides the transmembrane proton gradient (pH) formation.

The sarcolemmal Mg²⁺-ATPase activity has leanary increased with pH raising within the pH range of 6,0-8,0.

The “basal” Mg²⁺-ATPase activity was shown to be efficiently inhibited by eosin Y and o-vanadat, and the inhibition constant (K_i) was 45,30±14,50 M and 1,35±0,28 mM respectively. The eosin Y effect manifests in both the initial V_max decline in ATP hydrolysis (V_Mg and V_ATP), and the reduction in Mg²⁺-ATPase for ATP and Mg²⁺ affinity.

Spermin, spermidin and putrescin in physiological (up to 1 mM) and higher (up to 10 mM) concentration show a tendency in Mg²⁺-ATPase averadge activation by 20-30 percent.

The kinetic data of the experiments having been performed under the equilibrium conditions allowed one to model the kinetic mechanism of Mg²⁺-dependent enzymatic reaction for ATP-hydrolysis. This mechanism suggests the existence two independent binding sites for Mg ions and free ATP as well.

Размещено на Allbest.ru