Исследование влияния донора оксида азота на гибель опухолевых клеток

Экзогенный оксид азота

В изучении влияния NO на клетки значительную помощь оказывают экзогенные доноры NO. Эти вещества широко используются в настоящее время для создания модельных систем in vitro, на которых можно изучать эффекты влияния NO на культуры различных клеток, или на отдельные компартменты клеток (изолированные митохондрии, ядра). Эти модели весьма популярны, поскольку значительно упрощают имеющуюся в организме систему взаимодействия NO с клетками. Так как оксид азота здесь поступает извне, то система оказывается независимой от NO-синтаз и их регуляции, а значит, результаты действия NO легче интерпретировать. Очевидно также, что в этом случае в значительной отсекаются эффекты других сигнальных веществ, которые могут сопутствовать биогенному NO (известно, например, что NOS в определенных условиях могут синтезировать О2-; с другой стороны, сигналы, активирующие NOS, могут активировать и пути, ведущие к появлению различных дополнительных медиаторов).

Экзогенные доноры, в отличие от L-Arg, содержат NO в структуре молекулы, и их действие заключается в высвобождении этой молекулы в чистом виде. По химической природе среди NO-доноров можно выделить следующие группы:

Нитраты (такие как широко используемые в клинике нитроглицерин, нитропруссид натрия, нитросорбид),

Нитриты (амилнитрит, NaNO2),

Нитрозотиолы и вещества, образующие различные комплексы с NO: S-нитрозоглутатион (GSNO), S-нитрозо-N-ацетилпеницилл-амин (SNAP), диэтиламин-NO (DEA-NO), соль Руссина.

По механизму действия NO-доноры делятся на спонтанно (неферментативно) высвобождающие NO и на доноры, которым для выделения оксида азота необходимо взаимодействие с ферментами. На данный момент не существует доноров, которые можно было бы назвать идеальными для исследований. Во-первых, NO-доноры различаются по эффективности высвобождения NO и в разной степени способны влиять на клетки. Во-вторых, эти вещества могут являться источниками побочных соединений, часто обладающих токсичностью (выделяемый нитропруссидом цианид).

К числу перспективных доноров NO и потенциальных лекарственных препаратов относятся гетероциклические азотсодержащие соединения. Производные 1,2,5-оксадиазол-2-оксида (фуроксана) являются спонтанными или тиолзависимыми донорами оксида азота. Они генерируют NO при реакции с тиолами (Feelisch et al., 1992; Medana et al., 1994) или другими нуклеофилами (Sorba et al., 1997). При этом предполагается, что важную роль в активации продукции NO играют внутриклеточные тиолы.

Фуроксаны представляют собой высокоактивные вазодилятаторы и стимуляторы рГЦ (Ferioli et al., 1995). Эти соединения активируют рГЦ, ингибируют аггрегацию тромбоцитов и генерируют NO. Так, например, описана эндотелий-независимая спазмолитическая активность 3-фенил-4-фенилсульфонилфуроксана на препаратах аорты кролика, ингибирование активности тромбоцитов по цГМФ-зависимому механизму и тиолзависимая генерация NO (Civelli et al., 1994). Среди более чем 20 производных фуроксана наибольшей вазодилятационной активностью обладают CN-замещенные соединения (Ferioli et al., 1995). В этой же работе отмечено, что не во всех случаях NO-донорные свойства коррелируют с активацией рГЦ, ингибированием агрегации тромбоцитов и спазмолитическими характеристиками.

Таким образом, всестороннее исследование других видов активности, проявляемых соединениями фуроксанового ряда, в частности цитотоксической и апоптогенной, является необходимым компонентом комплексного подхода к изучению фармакологических характеристик этих биологически-активных соединений.

Изучение in vitro цитотоксической активности нового соединения из фуроксанового ряда - 3-нитро-4-фенилфуроксана и было целью данной работы.

Итак, несмотря на интенсивные исследования апоптоза, детальная картина путей регуляции этого процесса по-прежнему требует прояснения. Становится очевидно, что различные механизмы, активирующие или подавляющие клеточную гибель, очень тесно переплетены, и в действии какой-либо сигнальной молекулы часто трудно выделить про- или антиапоптотические составляющие. Ярким примером может служить монооксид азота, исследование свойств которого является центральным в данной работе. К настоящему времени в научной литературе можно найти почти равное количество свидетельств, как цитотоксического действия, так и защитных эффектов этого соединения. Все это очень осложняет переход от теоретических разработок к практическому использованию подобных веществ, поскольку при таком разнообразии эффектов in vitro трудно предсказать их воздействие на уровне многоклеточного организма. Таким образом, именно из узко направленных работ по выявлению воздействия конкретного соединения в конкретных условиях на развитие определенного сигнального пути строится целостная картина регуляции жизненных функций клетки.

Экспериментальная часть

Материалы и методы.

Использовались следующие реактивы для культивирования клеток: среда DMEM, сыворотка крупного рогатого скота (фирма "Агат-Мед", Россия), L-глутамин.

Все прочие реактивы для культивирования клеток от фирмы “Serva” (Германия).

Донор оксида азота 3-нитро-4-фенил-(1,2,5-оксадиазол-2-оксид) (3-нитро-4-фенилфуроксан) и его изомер, не высвобождающий NO, 4-нитро-3-фенилфуроксан любезно предоставил научный сотрудник Лаборатории химии ферментов кафедры биоорганической химии Биологического факультета МГУ А.Я.Коц.

Исходный раствор флуоресцентного (ех= 485 нм еm= 530 нм) красителя Родамин 123 (“Sigma”, США) имел концентрацию 1 мг/мл и разводился в эксперименте средой DMEM без сыворотки до концентрации 5 мкМ.

Фосфатидилсерин-связывающий белок Аннексин V, меченный флуорохромом ФИТЦ (ех= 492 нм еm= 520 нм) был предоставлен в.н.с кафедры молекулярной биологии В.И.Мельгуновым.

Каспазный субстрат PhiPhiLux G2D2 был получен от фирмы OncoImmunin, Inc., США. Каждая молекула PhiPhiLux G2D2 содержит 2 флуорохрома. Расщепленный субстрат имеет ех= 552 нм еm=580 нм. Основная последовательность пептида PhiPhiLux GDEVDGI, место расщепления каспазой-3 подчеркнуто. Концентрация стокового раствора 10мкМ PhiPhiLux G2D2 в среде RPMI 1640. Для постановки эксперимента исходный раствор разводили в 4 раза средой без сыворотки. Перед добавлением к клеткам раствор центрифуговали.

Остальные реактивы были получены от фирм “Sigma” (США), “Serva” (Германия) и “Реахим” (Россия).

Клеточные линии HeLa, HeLa/Bcl-2, несущая ген bcl-2, и HeLa/puro, несущая пустой аденовирусный вектор, были любезно предоставлены сотрудником Института Полиомиелита РАМН Г.Беловым.

Пластиковая посуда для культивирования клеток была от фирм Costar (США) и Linbro (Великобритания).

Таблица 1 - Приготовление раствора Рингера-Кребса

Флуоресцентная микроскопия

Для микроскопических исследований использовался микроскоп Leitz Diaplan с объективами Leitz NPL Fluotar Phaco 2 Fluoreszenze c увеличением Х25 (NA=0,75), NPL Fluotar Phaco 3 Fluoreszenze Х40 (NA=1,3) и EF Phaco 3 c увеличением Х100 (NA=1,25). Все объективы использовались с масляной иммерсией. Для флуоресцентной микроскопии использовалась эпифлуоресцентная система Leitz с освещением препарата падающим светом, оснащенная ртутной лампой постоянного тока HBO 50W. Отраженный свет (флуоресценция) проходил через систему стандартных запирающих светофильтров Leitz (светоделительное зеркало) для ФИТЦ (зеленая флуоресценция) и ТРИТЦ (красная флуоресценция). Цифровое изображение получали с помощью цифровой видеокамеры Watec WAT-902H, и IBM-совместимого персонального компьютера с операционной системой Windows NT, оснащенного платой видеоввода FlyVideo соединенным с камерой через низкочастотный видеовход с использованием фирменной программы FlyVideo. Камера соединялась с вертикальным тубусом микроскопа без дополнительного окуляра, и при этом микроскопическое изображение с тубусной линзы проецировалось непосредственно на приемную мишень камеры, для снижения оптических аберраций. При получении статического видеоизображения, с цифровым усилением сигнала (VIM-метод), собирали кадры (30 сек, по 3 кадра в сек) в виде *.avi файлов, которые обрабатывались с помощью программного обеспечения Phob (автор к.б.н. А.В.Киташов, каф. Клеточной физиологии и иммунологии Биофака МГУ). С целью усиления сигнала и улучшения отношения сигнал/шум интеграцию собранных кадров в статичное видеоизображение проводили по пикселям по формуле:

y = a * xb,

апоптаз митохондрия клеточный гибель

где х - исходное (суммарное) значение цвета, y - конечное значение цвета, а и b - коэффициенты оптимизации. Коэффициент а в данных экспериментах равен нулю.

В каждом отдельном эксперименте обработка кадров проводилась одинаковым способом, с использованием одинакового коэффициента оптимизации.

Условия культивирования клеточных линий

Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамина (полная среда) в полистироловых флаконах для культуры клеток при 37о С в инкубаторе с влажной атмосферой, содержащей 5% СО2. Культуры поддерживались на логарифмической стадии роста. При этом клеточные линии HeLa/puro и HeLa/Bcl-2 выращивались в присутствии пуромицина, устойчивость к которому служит маркером трансфекционного вектора.

При пассировании и для проведения экспериментов прикрепленные к пластику клетки снимали обработкой 0,2% раствором версена в среде DMEM, и затем центрифугировали в полной среде DMEM при 1200 об/мин.

Методы культивирования клеток для последующей постановки эксперимента

1. Постановка экспериментов по оценке цитотоксичности и степени фрагментации ДНК. Клетки высевались в концентрации 100000 кл/мл в объеме 1 мл в лунки 24-х луночных планшетов для микрокультивирования (эксперименты по определению фрагментации ДНК), или 0,1 мл в лунки 96-и луночных планшетов для микрокультивирования (цитотоксический тест). Число повторностей было не менее 3-х в цитотоксическом тесте и не менее 2-х при определении фрагментации ДНК.

2. Постановка эксперимента для микроскопического изучения клеток. Клетки высевались в концентрации 100000 кл/мл в объеме 2 мл в лунки 6-ти луночных планшетов для микрокультивирования, на дно которых были положены покровные стекла для прикрепления клеток. Планшеты инкубировали в описанных выше условиях до достижения клетками на стеклах монослоя.

Индукция теплового шока

Термическая предобработка клеток в условиях мягкого теплового стресса проводилась при 42оС в течение 3 часов в термостате, через 16-18 часов после начала культивирования в микропланшетах, но не позже чем за 12-14 часов до добавления к клеткам донора оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана. Контрольные культуры, при этом, находились в стандартных условиях - при 37оС в инкубаторе с влажной атмосферой, содержащей 5% СО2.

Инкубация клеток с исследуемыми веществами

Исходный раствор 3-нитро-4-фенилфуроксана (3NPF) готовился растворением сухого вещества в диметилсульфоксиде до концентрации 50 мМ. Аналогично готовился исходный раствор 4-нитро-3-фенилфуроксана (4NPF) с концентрацией 50 мМ. Маточные растворы 3NPF и 4NPF в ДМСО хранились при -70оС.

Обработка клеток проводилась инкубацией с различными концентрациями веществ (3NPF и 4NPF) в течение 2 часов в среде без сыворотки при 37оС в атмосфере 5% CO2, при этом к контрольным культурам вещества не добавлялись. После 2-х часовой инкубации среда, содержащая 3-нитро-4-фенилфуроксан, удалялась и к клеткам добавлялась полная среда. В зависимости от типа эксперимента клетки исследовали либо сразу после этого, либо через 4 часа, либо через 16-18 часов.

Определение цитотоксической активности

Цитотоксичность оценивалась с использованием стандартного метода колориметрического MTT-теста (восстановление дегидрогеназами жизнеспособных клеток бесцветного производного тетразолия МТТ - бромида 3-(4,5-диметилтиа-зол-2-ил)-2,5-дифенил тетразоля до окрашенного продукта - формазана). Использовалась микромодификация метода (Denizot F. and Lang R., 1986) в 96-луночных планшетах для микрокультивирования, причем число повторностей составляло не меньше трех.

При определении жизнеспособности клеток, к 100 мкл клеточных культур добавляли 50 мкл раствора МТТ в среде культивирования (концентрация раствора МТТ - 5 мг/мл) на 1 час. После окончания инкубации с МТТ, среду удаляли и накопившийся в жизнеспособных клетках, окрашенный продукт реакции - формазан растворяли в 50 мкл диметилсульфоксида. Реакцию учитывали на многоканальном фотометре Labsystems Multiscan plus (Wallac, Turky, Финляндия), при длине волны 540 нм.

Определение фрагментации ДНК.

Получение образцов ДНК: Клетки культивировали и обрабатывали донором NO как описано выше. Культуральную среду из каждой лунки собирали в микропробирки и клетки (1) осаждали центрифугированием 5 минут при 1400 об/мин, а затем удаляли супернатант. Для полного снятия клеток (2) со дна лунки использовали 0,2% раствор версена. Обработка версеном длилась в течение 1-2 мин. За это время все клетки (2) откреплялись от пластика и переходили в суспензию. Суспензию (2) собирали и объединяли с осадком клеток (1) из культуральной среды и суспендировали. Снова осаждали клетки центрифугированием 5 минут при 1400 об/мин и удаляли супернатант. К осадку добавляли лизирующий буфер (10 мМ ЭДТА, 50 мМ ТрисНCl, 0,5% лаурилсаркозил Na) по 18 мкл на пробирку. Суспендировали клетки в буфере и добавляли по 2 мкл раствора протеиназы К (5 мг/мл). Инкубировали при 50С в течение 1 часа. Затем добавляли 5 мкл раствора РНКазы (1 мг/мл) и инкубировали при 50С в течение 1 часа. Затем нагревали образцы до 65С и разбавляли буфером для образцов (10 мМ ЭДТА, 30% сахарозы, 0,025% бромфенолового синего) в соотношении 1:1.

Приготовление геля для электрофореза: К 50 мл буфера для геля (0,1 М ТрисНCl, 0,4 М борной кислоты, 0,01 М ЭДТА, 0,0001% бромистого этидия) добавляли 1 г агарозы и расплавляли на кипящей водяной бане. После плавления агарозы гель слегка охлаждали и заливали в заливочный столик камеры для электрофореза, вставив гребенку для формирования лунок. После застывания геля гребенку вынимали и заливали камеру электродным буфером (0,1 М ТрисНCl, 0,4 М борной кислоты, 0,01 М ЭДТА, 0,0001% бромистого этидия).

Ход электрофореза: В лунки геля наносили по 25 мкл образца ДНК. Электрофорез вели при напряжении 90 В в течение 1 часа. Результаты просматривали в УФ-свете (254 нм).

Прижизненное окрашивание хроматина

Для прижизненного окрашивания ядерного хроматина клеток с целью выявления апоптотических изменений использовался флуоресцентный краситель Hoechst 33342. Этот краситель является производным бензоимидазола и при облучении УФ-лучами с =350 нм флуоресцирует в голубой области. Hoechst 33342 специфически связывается с клеточной ДНК, накапливаясь преимущественно в ядре. Для проведения окрашивания Hoechst 33342 клетки выращивались на стеклах как описано выше до достижения монослоя. После этого клетки обрабатывали веществами (3NPF и 4NPF оба в концентрации 50 мкМ) в течение 2 часов. Затем препараты промывали 3 раза средой без сыворотки и инкубировали в среде без сыворотки с Hoechst 33342 (конечная концентрация 5 мг/мл) в течение 30 минут при 37С (по методике McGahon A.J. et al., 1995). После этого клетки промывали 3 раза раствором Рингера-Кребса и фиксировали в 4%-ном формалине в течение 10 мин. После фиксации клетки отмывали от формалина раствором Рингера-Кребса. Затем стекла с фиксированными клетками обсушивали фильтровальной бумагой и клали на предметное стекло клетками в сторону стекла. Приготовленный таким образом препарат использовали для флуоресцентной микроскопии по методике описанной выше. Получали изображение в видимом свете и флуоресценцию Hoechst 33342 (голубая флуоресценция), связавшегося с ядерной ДНК клеток.

Определение мембранного потенциала митохондрий

Митохондриальный трансмембранный потенциал может быть визуализован в живых клетках с использованием потенциал-чувствительной краски родамин 123 (Kroemer G. et al., 1998). Этот краситель имеет липофильную поликатионную структуру, благодаря чему он проникает в митохондриальный матрикс в соответствии с градиентом . Для проведения окрашивания родамином клетки выращивались на стеклах как описано выше до достижения монослоя. После этого клетки обрабатывали веществами (3NPF и 4NPF) в течение 2 часов. Затем промывали 3 раза средой без сыворотки и инкубировали в среде без сыворотки с родамином 123 (5 мкМ) в течение 20 минут при 37С по методике описанной у Mattson M.P. et al., 1995. Затем родамин отмывался раствором Рингера-Кребса (табл. 1) 3 раза. Затем стекла с прикрепленными клетками обсушивали фильтровальной бумагой и клали на предметное стекло клетками в сторону стекла. Приготовленный таким образом препарат использовали для флуоресцентной микроскопии по методике описанной выше. Получали изображение в видимом свете и флуоресценцию родамина 123 (фильтр для ТРИТЦ (красная флуоресценция)) в митохондриях клеток.

Исследование активности каспаз в клетках.

Клетки выращивались на стеклах как описано выше до достижения монослоя. После этого клетки обрабатывали веществами (3NPF и 4NPF) в течение 2 часов. Затем промывали 3 раза средой без сыворотки и инкубировали в среде без сыворотки с каспазным субстратом PhiPhiLux-G2D2 (Hirata H. et al., 1998) в течение 60 минут при 37С. Затем PhiPhiLux-G2D2 отмывали раствором Рингера-Кребса 3 раза. Затем стекла с прикрепленными клетками обсушивали фильтровальной бумагой и клали на предметное стекло клетками в сторону стекла. Приготовленный таким образом препарат использовали для флуоресцентной микроскопии по методике описанной выше. Получали изображение в видимом свете и флуоресценцию расщепленного PhiPhiLux-G2D2 (фильтр для ТРИТЦ (красная флуоресценция)) в цитоплазме клеток.

Исследование изменений асимметрии плазматической мембраны.

Клетки выращивались на стеклах как описано выше до достижения монослоя. После этого клетки инкубировали с веществами (3NPF и 4NPF) в течение 2 часов. Затем промывали 3 раза раствором Рингера-Кребса и инкубировали в растворе Рингера-Кребса (с добавлением NaN3 до 0,002%) с Аннексином V, меченным ФИТЦ (исходный раствор Аннексина V-ФИТЦ разводился в 40 раз) в течение 30 минут при 4С. После этого клетки промывали 3 раза раствором Рингера-Кребса с азидом и фиксировали в 4%-ном формалине в течение 10 мин. После фиксации клетки отмывали от формалина раствором Рингера-Кребса. Затем стекла с фиксированными клетками обсушивали фильтровальной бумагой и клали на предметное стекло клетками в сторону стекла. Приготовленный таким образом препарат использовали для флуоресцентной микроскопии по методике описанной выше. Получали изображение в видимом свете и флуоресценцию Аннексина V-ФИТЦ (фильтр для ФИТЦ (зеленая флуоресценция)), связавшегося с мембранами клеток.

Результаты

Цитотоксическое действие 3NPF и 4NPF

Для оценки цитотоксичности соединений по отношению к человеческим клеточным линиям HeLa и HeLa/Bcl-2 использовался колориметрический MTT-тест, основанный на накоплении окрашенного формазана, восстановленного жизнеспособными клетками из бесцветного производного тетразолия МТТ-бромида (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразоля). Использовалась микромодификация метода (Denizot F. and Lang R., 1986). Цитотоксичность выражалась в процентах (%) по отношению к контролю, за который принимались культуры, не обработанные веществами.

Было выявлено (рис. 4А), что оба соединения проявляют токсичность по отношению к клеткам HeLa, но при этом токсичность 3NPF на 20% выше в диапазоне концентраций от 5 мкМ до 20 мкМ. На рис. 4Б видно, что 50%-ное снижение жизнеспособности клеток составляет для линии HeLa 5 мкМ при обработке 3NPF и 20 мкМ при обработке 4NPF.

С использованием цитотоксического МТТ-теста также установлено, что экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 в клетках HeLa приводит к существенному повышению их резистентности к оксиду азота (рис. 5А) по сравнению с родительской линией, не несущей трансгена. Это выражается в том, что не наблюдается снижения жизнеспособности клеток HeLa/bcl-2 в диапазоне концентраций до 60 мкМ включительно, тогда как у клеток HeLa в этом интервале жизнеспособность снижается почти на 60%. На рис. 5Б видно, что экспрессия белка Bcl-2 защищает и от цитотоксичности 4NPF, при этом снижение жизнеспособности клеток HeLa достигает 50% по сравнению с клетками HeLa/bcl-2.

Конденсация хроматина под действием 3NPF

Так как ранее было установлено, что в данных условиях проведения эксперимента гибель клеток наступает спустя 8-12 часов культивирования (К.В.Фрезе, персональное сообщение), в работе были собраны доказательства в подтверждение именно апоптотического характера гибели клеток в данных экспериментальных условиях.

Для исследования состояния хроматина в ядрах обрабатываемых клеток использовалась прижизненная окраска клеток флуоресцентным красителем Hoechst 33342, специфично связывающимся с ДНК. При флуоресцентной микроскопии таких препаратов можно изучать морфологию ядер. В этом эксперименте была выявлена конденсация ядерного хроматина (рис. 6) в клетках HeLa после обработки 3NPF (50 мкМ), но не 4NPF (50 мкМ).

Для установления характера гибели клеток линии HeLa/Bcl-2, также как и для клеток HeLa, использовалась прижизненная окраска клеток флуоресцентным красителем Hoechst 33342. Обнаружено (рис. 6), что характерная для апоптоза конденсация хроматина в ядрах клеток при обработке 3NPF (50 мкМ) выражена в клетках линии HeLa/bcl-2 значительно слабее, чем в клетках HeLa. При обработке клеток HeLa/bcl-2 контрольным веществом 4NPF (50 мкМ) подобные апоптотические изменения вообще не наблюдаются.

Индукция фрагментации ДНК NO-донором 3NPF

Одновременно с конденсацией хроматина в ядрах апоптотических клеток происходит также энзиматическая деградация ядерной ДНК и расщепление ее на кратные 180-200 п.н. фрагменты. С целью выявления фрагментации ядерной ДНК из лизатов клеток после обработки их 3-нитро-4-фенилфуроксаном выделялась ДНК, которая анализировалась с помощью электрофореза в агарозном геле. Этот электрофоретический анализ ДНК из клеточных лизатов показал, что после обработки клеток 3NPF происходит расщепление ДНК, на электрофореграмме при этом образуются характерные олигонуклеосомальные «лестницы» (рис. 7). Было выявлено, что в клетках со сверхэкспрессией Bcl-2 в условиях предварительной тепловой обработки фрагментация ДНК после инкубации с 3NPF выражена значительно меньше, чем в клетках HeLa.

Экспозиция фосфатидилсерина на внешней стороне мембраны клеток после инкубации с донором NO

Одним из ранних событий, происходящих в клетках при реализации апоптотической программы, является исчезновение асимметрии фосфолипидных слоев в цитоплазматической мембране клеток и экспозиция фосфатидилсерина на внешней поверхности мембраны. Это явление широко используется для детектирования клеток, уходящих в апоптоз. Меченный ФИТЦом аннексин V специфично связывается с фосфатидилсеринами на поверхности клеток и по интенсивности свечения клеток можно судить о степени апоптотических изменений в их цитоплазматической мембране.

В данном эксперименте было показано, что при обработке клеток донором оксида азота 3NPF увеличение количества фосфатидилсерина в наружном слое плазматической мембраны (рис. 8). В то же время при обработке 4NPF подобные изменения выражены в меньшей степени.

В случае клеточной линии HeLa/Bcl-2 (рис. 9) экспозиция фосфатидилсерина на внешней стороне цитоплазматической мембраны клетки при обработке 3NPF происходит в меньшей степени, чем в случае клеток HeLa. При обработке 4NPF выраженность этих изменений становится еще меньше.

Изменения трансмембранного потенциала митохондрий после инкубации с 3NPF и 4NPF

Одним из первых изменений в митохондрии при апоптозе является падение трансмембранного потенциала . Поэтому в данной работе исследовались изменения , происходящие при обработке 3NPF и 4NPF, с целью доказательства апоптотического характера клеточной гибели. Для этого использовался поликатионный флуоресцентный краситель родамин 123. Он накапливается в функционально активных митохондриях, закачиваясь в них, в соответствии с уравнением Нернста, по градиенту электрохимического потенциала. При падении в митохондрии родамин не входит в митохондрии. Таким образом, по степени свечения митохондрий после обработки родамином можно судить о изменениях .

Для доказательства чувствительности накопления родамина 123 к трансмембранному потенциалу были поставлены эксперименты с веществами, специфично снижающими : цианидом (ингибитор окислительного фосфорилирования) и м-хлоркарбонил-цианид-фенилгидразоном (разобщитель). Было показано (рис. 10) сильное снижение в митохондриях клеток HeLa в случае цианида и практически полное в случае м-хлоркарбонил-цианид-фенилгидразона (СССР). Одновременно, было выявлено, что Bcl-2 защищает клетки и от этих митохондриальных ингибиторов, поскольку падение при обработке NaCN и СССР в клетках HeLa/Bcl-2 выражено меньше (рис. 11).

В дальнейших экспериментах было показано (рис. 12, рис.13), что при обработке клеток HeLa донором NO (3NPF) происходит некоторое снижение , что выражается в уменьшении накопления родамина 123 в митохондриях клеток. При обработке клеток HeLa веществом 4NPF снижения трансмембранного потенциала практически не заметно.

Затем было выявлено, что при обработке клеток HeLa/Bcl-2 3NPF снижение очень незначительно, а в случае 4NPF можно говорить об отсутствии снижения трансмембранного потенциала митохондрий (рис. 14).

Активация каспаз под действием 3NPF

В ходе развития апоптотического процесса в клетке накапливаются активированные формы каспаз, которые гидролизуют многие клеточные белки, приводя к гибели клетки. Одной из основных «исполнительных» каспаз является каспаза-3. Были проведены эксперименты, с целью выяснить степень активации каспаза-3-подобных протеаз под действием исследуемых веществ (3NPF и 4NPF). В экспериментах использовался каспазный субстрат PhiPhiLux, начинающий флуоресцировать после расщепления каспазой-3 или подобными ей протеазами. Показано (рис. 15), что в клетках HeLa NO-донор 3NPF вызывает достаточно сильную активацию каспазы-3, 4NPF активирует каспазы в меньшей степени.

Исследования активации каспазы-3 в клетках линии HeLa/Bcl-2 не выявили существенной разницы (рис. 16) между контрольными клетками и клетками, обработанными 3NPF или 4NPF.

Обсуждение

Оценка цитотоксичности - необходимый компонент комплексного подхода к изучению свойств новых биологически активных соединений. В настоящей работе исследовалась цитотоксическая активность производного 1,2,5-оксадиазол-2-оксида (фуроксана) - 3-нитро-4-фенилфуроксана (3NPF), способного высвобождать NO при взаимодействии с SH-группами белков (Ferioli R, et al, 1995 Br J Pharmacol; 114 (4): 816-20). В качестве контроля в работе использовался 4-нитро-3-фенилфуроксан (4NPF), обладающий сходной с 3NPF реакционной способностью, но не генерирующий NO при взаимодействии с тиолами.

Монооксид азота является одной из эндогенных эффекторных цитотоксических молекул, способной, в физиологических концентрациях вызывать индукцию программы гибели (апоптоза) чувствительных клеток-мишеней. В работе исследовалась способность 3NPF и 4NPF индуцировать in vitro апоптоз и гибель опухолевых клеток, отличающихся по чувствительности к индукции программы клеточной гибели. Работа проводилась с использованием клеточных линий HeLa и HeLa/Bcl-2, несущей bcl-2 трансген. Известно, что протоонкоген bcl-2 является эффективным ингибитором апоптотической гибели клеток в самых различных моделях индукции апоптоза in vitro (Kidd V.J., 1998; Kroemer G. et al., 1998).

В экспериментах по определению цитотоксичности было показано, что оба соединения обладают цитотоксическим эффектом, но при этом токсичность 3NPF значительно выше, чем 4NPF. Поскольку известно, что из этих веществ только 3NPF способен генерировать NO, то можно сделать вывод, что гибель клеток в этом случае обусловлена именно NO (или его производными). Цитотоксичность 4NPF, вероятно, обусловлена его реакциями с тиолами клетки. Поскольку при этом происходит арилирование SH-групп различных соединений клеток, например, функционально важных белков, то можно предположить, что такие модификации могут привести к потере их активности. Разница между токсичностью 3NPF и 4NPF показывает, что значительная часть действия 3-нитро-4-фенилфуроксана обусловлена именно оксидом азота.

В литературе хорошо описан антиапоптотический эффект белка Bcl-2, защищающего клетки различных линий от гибели при действии апоптогенов. В наших экспериментах также показан ярко выраженный защитный эффект белка Bcl-2. Его сверхэкспрессия в клетках HeLa повышает их жизнеспособность в среднем на 50%, причем как в случае 3NPF, так и в случае 4NPF. Таким образом, Bcl-2 обладает протективным действием и при действии на клетки неспецифических стрессорных факторов.

Следующей задачей работы был сбор доказательств для подтверждения апоптотического характера клеточной гибели под действием NO-донора 3NPF. Одним из этих доказательств была обнаруженная при окрашивании Hoechst 33342 конденсация ядерного хроматина. Эта конденсация и изменение морфологии ядра происходило только под действием 3NPF, следовательно, именно оксид азота являлся в данном случае инициатором апоптотических изменений. Данный эксперимент также подтвердил защитные свойства Bcl-2, поскольку апоптотические изменения проявлялись в клетках HeLa/bcl-2 значительно слабее.

Более глубокие изменения в структуре ядерного хроматина в обработанных 3NPF клетках были показаны методом электрофореза клеточной ДНК. Наличие на электрофореграмме характерных «лестниц» ДНК подтверждает протекание апоптотического процесса. Подобные «лестницы» формируются при активации в клетках специфической ДНКазы - фактора фрагментации ДНК (DFF), которая расщепляет нити хроматина по межнуклеосомальным участкам. В данном случае антиапоптотическое действие Bcl-2 проявлялось только в сочетании с предварительной тепловой обработкой клеток. Для данных условий тепловой предобработки документирована (Sapozhnikov A.M. et al., 1999) индукция белков теплового шока, обладающих цитопротекторным действием при различных стрессах. Можно предположить наличие синергичных взаимодействий между Hsp и Bcl-2, однако такие выводы нуждаются в дополнительном экспериментальном подтверждении.

Еще одним критерием апоптоза является нарушение асимметрии липидного бислоя цитоплазматической мембраны. Поэтому следующим подтверждением апоптогенного действия 3-нитро-4-фенилфуроксана явились эксперименты по визуализации фосфатидилсерина на поверхности клетки с помощью аннексина V, меченного ФИТЦом. Была показана существенная степень экспозиции фосфатидилсерина в летках HeLa после инкубации с 3NPF, в клетках HeLa/bcl-2 эти изменения были менее выражены, а при инкубации с 4NPF практически не наблюдались.

Известно, что митохондрия является одним из центральных регуляторных звений апоптотического процесса, в связи с этим любые изменения функционирования митохондрий могут иметь значение для течения апоптотического процесса. Одним из первых нарушений в митохондрии при апоптозе является падение трансмембранного потенциала . Поскольку это явление наблюдается на многих клеточных моделях апоптоза, то именно диссипация может служить достаточно специфичным индикатором программированной клеточной гибели. В данной работе более менее заметное снижение трансмембранного потенциала наблюдалось только в митохондриях клеток линии HeLa, обработанных 3NPF, сверхэкспрессия Bcl-2 в клетках HeLa/bcl-2 почти полностью подавляла диссипацию . Это наблюдение коррелирует с необходимостью достаточного количества АТФ в клетке для протекания апоптоза, сильное падение означало бы прекращение производства АТФ и, как следствие, развитию некроза вместо апоптоза. Вероятно, в данных условиях падение достаточно для инициации апоптотических сигнальных путей, но не достаточно для развития некроза. Действие Bcl-2 приводит в этих условиях к поддержанию трансмембранного митохондриального потенциала и таким образом тормозит активацию апоптогенных путей.

Активация каспаз является одним из наиболее убедительных доказательств апоптоза. в эксперименте с каспазным субстратом PhiPhiLux активация каспаза-3-подобной активности в клетках HeLa, обработанных 3NPF, показана достаточно четко. В клетках HeLa/bcl-2 не было выявлено существенной разницы между контролем и обработкой 3NPF, однако, для достоверного доказательства прерывания каспазной активации белком Bcl-2 требуется провести дополнительные эксперименты.

Выводы

Выявлено in vitro цитотоксическое действие производных фуроксана - 3-нитро-4-фенилфуроксана и 4-нитро-3-фенилфуроксана, при этом цитотоксичность донора монооксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана выше.

Обнаружена характерная для апоптоза конденсация ядер клеток HeLa, но не HeLa/Bcl-2, при обработке 3-нитро-4-фенилфуроксаном, тогда как 4-нитро-3-фенилфуроксан конденсации ядер не вызывает.

При обработке клеток 3-нитро-4-фенилфуроксаном происходит фрагментация ДНК на олигонуклеосомальные фрагменты, при этом защитное действие белка Bcl-2 выявляется в клетках HeLa/Bcl-2 в условиях предварительной обработки клеток в условиях ограниченного теплового стресса.

Выявлена характерная для апоптоза экспозиция фосфатидилсерина с наружной стороны мембраны клеток HeLa при обработке 3-нитро-4-фенилфуроксаном, сверхэкспрессия Bcl-2 снижает этот эффект.

Наблюдается снижение трансмембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий клеток HeLa, но не HeLa/Bcl-2, при обработке 3-нитро-4-фенилфуроксаном. Изменения не наблюдаются при обработке клеток 4-нитро-3-фенилфуроксаном.

Показана характерная для апоптоза активация протеолитических ферментов семейства каспаз в цитоплазме клеток HeLa, при обработке 3-нитро-4-фенилфуроксаном, тогда как 4-нитро-3-фенилфуроксан активирует каспазы в несколько меньшей степени.

Показано протективное действие белка Bcl-2 в клетках HeLa при индукции апоптотической гибели клеток 3-нитро-4-фенилфуроксаном, выражавшееся в уменьшении всех исследованных апоптотических изменений.

Список цитируемой литературы

Приложения

Цитотоксическое действие 3NPF и 4NPF на клетки HeLа

Защитный эффект Bcl-2 при цитотоксическом действии 3NPF (А) и 4NPF (Б)

Морфология ядер клеток линии HeLa и HeLa/Bcl-2 при окраске ДНК витальным флуоресцентным красителем Hoechst 33342 Инкубация с 50 мкМ 3NPF или 4NPF 2 часа

Размещено на Allbest.ru